pmid: "27246748"
title: "A fração de acetato de etila de Amomum cardamomum L. protege contra lesão hepática induzida por tetracloreto de carbono por meio de um mecanismo antioxidante em ratos."
authors: "Lim DW, Kim H, Park JY, Kim JE, Moon JY, Park SD, Park WH"
journal: "BMC complementary and alternative medicine"
pubdate: "2016 May 31"
doi: "10.1186/s12906-016-1121-1"
source: "PMC Full Text"

A fração de acetato de etila de Amomum cardamomum L. protege contra lesão hepática induzida por tetracloreto de carbono por meio de um mecanismo antioxidante em ratos.

Autores

Lim DW, Kim H, Park JY, Kim JE, Moon JY, Park SD, Park WH

Periodico

BMC complementary and alternative medicine (2016 May 31)

Conteudo

Amomum cardamomum L. fração de acetato de etila protege contra lesão hepática induzida por tetracloreto de carbono via um mecanismo antioxidante em ratos
Fundamentação
O desenvolvimento de medicamentos derivados de ervas medicinais tornou-se importante no alívio de patologias hepáticas. Amomun cardamomum é tradicionalmente utilizado terapeuticamente na Coreia para tratar várias doenças humanas, incluindo dispepsia, soluços e vômitos. Investigamos para avaliar o efeito protetor de A. cardamomum sobre danos hepáticos induzidos por tetracloreto de carbono (CCl4) através da atividade antioxidante em tecidos hepáticos de ratos Sprague–Dawley.
Métodos
As propriedades antioxidantes de diferentes frações de A. cardamomum a partir de extratos etanólicos foram avaliadas por sistemas de captação de radicais livres in vitro. O efeito protetor da fração de acetato de etila de A. cardamomum (EAAC) contra a citotoxicidade induzida por CCl4 foi determinado por um ensaio de viabilidade celular usando células de hepatocarcinoma HepG2. No estudo in vivo, foi avaliada a influência de concentrações de EAAC de 100 e 200 mg/kg após lesão hepática induzida por CCl4. Foram determinados os níveis séricos de transaminase glutâmico-oxaloacética (GOT), transaminase glutâmico-pirúvica (GPT) e fosfatase alcalina (ALP), bem como a peroxidação lipídica (malondialdeído, MDA). O efeito do EAAC sobre as enzimas de desintoxicação hepática, incluindo superóxido dismutase (SOD), glutationa total (GSH) e atividade de glutationa S-transferase (GST), foi medido em homogenatos de fígado de rato. O nível de expressão do citocromo P450 (CYP2E1) hepático foi determinado por quantificação de mRNA.
Resultados
A análise fitoquímica de A. cardamomum indicou que o EAAC foi enriquecido em polifenóis totais e flavonoides totais. A maioria dos taninos estava confinada à fração de hexano. As propriedades hepatoprotetoras do EAAC foram evidentes, com redução significativa dos níveis séricos de GOT, GPT e ALP em comparação com o grupo controle. A melhora do status antioxidante hepático foi evidente pelo aumento das enzimas SOD, GSH e GST no tecido hepático dos ratos. A peroxidação lipídica hepática induzida por CCl4 foi aparente pelo aumento do nível intracelular de MDA. O EAAC suprimiu a peroxidação lipídica, evidenciada pela diminuição significativa na produção de MDA. A expressão de CYP2E1 também foi significativamente diminuída na concentração mais alta de EAAC, indicando a eficácia hepatoprotetora do EAAC no dano hepático agudo.
Conclusão
Esses resultados indicaram que o EAAC possui uma atividade hepatoprotetora significativa na lesão hepática aguda induzida por CCl4 em ratos, que pode ser derivada de suas propriedades antioxidantes e da regulação negativa do CYP2E1.
Fundamentação
O fígado é crucial no metabolismo de xenobióticos através de vários mecanismos que envolvem numerosas enzimas de detoxificação e atividade antioxidante. Consequentemente, o fígado está continuamente exposto a estresses oxidativos prejudiciais que comprometem a função celular, os quais desencadeiam várias doenças hepáticas. As doenças hepáticas continuam sendo um grande ônus global de saúde e um problema médico. O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre a manifestação sistêmica de espécies reativas de oxigênio (ERO) e as defesas antioxidantes. O estresse oxidativo é crucial na patogênese de doenças hepáticas, incluindo fibrose e cirrose hepática. As ERO são moléculas quimicamente reativas contendo oxigênio que normalmente funcionam nas respostas celulares na transdução de sinal para sustentar a vida e como parte das defesas do hospedeiro contra várias infecções. No entanto, a produção excessiva de radicais livres, incluindo superóxido, radical hidroxila, radical livre lipídico e óxido nítrico, leva a danos em certas doenças do fígado. A inibição de radicais livres tem sido associada ao alívio de distúrbios hepáticos.

O tetracloreto de carbono (CCl4) pode induzir toxicidade por radicais livres e tem sido utilizado como hepatotoxina em diversos modelos de doenças hepáticas. O CCl4 é convertido em reagentes através da formação de intermediários reativos, incluindo radicais triclorometil (CCl3·, CCl3OO·) e radicais livres pelo citocromo P450 (CYP 450). Esses radicais livres e os estresses oxidativos relacionados induzem a deformação de macromoléculas celulares e aumentam a peroxidação lipídica, a degeneração proteica e as mutações genômicas no tecido hepático humano. Um membro da família CYP, o CYP2E1, está envolvido nessas reações e no metabolismo de xenobióticos como o etanol. O CYP2E1 é regulado por fatores endógenos e compostos exógenos. A supressão do CYP2E1 reduziu o dano hepático em vários modelos experimentais, incluindo sistemas in vitro e in vivo.
Os efeitos colaterais das drogas sintéticas modernas usadas para tratar doenças hepáticas ainda não são claros. Medicamentos tradicionais e drogas derivadas de plantas podem ser uma alternativa atraente na prevenção e tratamento de distúrbios hepáticos. Amomum cardamomum L., um membro da família Zingiberaceae, pode ser distinguido do cardamomo-grande nativo do sul da Índia e atualmente é amplamente cultivado em regiões tropicais. As sementes da planta são amplamente utilizadas como especiaria em muitos países e tradicionalmente como terapêutico para alívio de dispepsia, soluços, vômitos e desintoxicação alcoólica. Estudos anteriores relataram que a semente de A. cardamomum e seus componentes ativos possuíam atividades antioxidantes e anti-inflamatórias. Constituintes importantes de óleos essenciais, incluindo terpenos, foram relatados nesta planta. Outros relatos sugerem que o tratamento com óleos essenciais contendo α, β-pineno, d-cânfora e 1,8-cineol inibiu a lesão hepática em modelos animais. O 1,8-cineol, o monoterpeno bicíclico rico em A. cardamomum, foi relatado como tendo bioatividade protetora no fígado contra esteatose e 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) in vivo. Outro estudo revelou relação entre atividade antioxidante e hepatoproteção, o que sugere efeito potencial de A. cardamomum na doença hepática relacionada a radicais livres e outras produções de ERO. Os efeitos de A. cardamomum e suas frações na atenuação da hepatotoxicidade induzida por CCl4 são desconhecidos, sem nenhum estudo sobre o envolvimento da atividade antioxidante in vitro e in vivo.
Portanto, neste estudo, avaliamos as possíveis propriedades antioxidantes e efeitos hepatoprotetores da fração acetato de etila obtida de A. cardamomum (EAAC) contra lesão hepática induzida por CCl4 in vitro e in vivo. Além disso, o nível de expressão do gene CYP2E1 foi investigado para demonstrar a atividade de regulação negativa do EAAC; os resultados foram comparados aos efeitos da silimarina, um fármaco comumente usado como agente terapêutico hepático.
Métodos
Produtos químicos
2,2-Difenil-1-picril-hidrazila (DPPH), butil-hidroxitolueno (BHT), d(+)-catequina, ácido gálico, ácido tânico, carbonato de sódio, nitrobluetetrazólio (NBT), xantina, xantina oxidase e reagente de Folin-Ciocalteu, cloreto de ferro(III) (FeCl3), peróxido de hidrogênio (H2O2), ácido ascórbico foram todos adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) ou Merck & Co (Darmstadt, Alemanha). Para estudos in vitro, albumina sérica bovina, Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal bovino (FBS), solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS), penicilina e estreptomicina foram adquiridos da Hyclone (Logan, UT, EUA). Oligonucleotídeos iniciadores foram adquiridos da Macrogen (Seul, Coreia). Para estudos in vivo, silimarina, azeite de oliva, CCl4, Oil Red O, coloração de hematoxilina e eosina (H&E), trietanolamida, ácido 5,5'-ditíobis(2-nitrobenzoico) (DTNB), glutationa (GSH), superóxido dismutase (SOD), ácido 2-tiobarbitúrico (TBA) e azida sódica foram adquiridos da Sigma-Aldrich.
A. cardamomum e extração
Sementes secas de A. cardamomum foram adquiridas da Dongwoodang (Yeongcheon-si, Coreia). As sementes foram finamente moídas usando um moedor misturador e o pó resultante foi extraído por imersão de 3 dias em etanol a 70%. O extrato foi evaporado utilizando um evaporador rotativo (Büchi, Flawil, Suíça) antes do fracionamento sequencial usando hexano, diclorometano e acetato de etila aplicados com um funil de extração. Cada fração foi concentrada e seca utilizando o evaporador rotativo mencionado. O extrato foi coletado e utilizado como amostras.
Cultura celular e ensaio de viabilidade
Células de carcinoma hepático humano HepG2 foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina e estreptomicina. As células foram incubadas a 37 °C em ambiente umidificado contendo 5% de CO2. As células foram subcultivadas a 70-80% de confluência e semeadas a uma densidade de 1 × 105 células/poço em placas de 96 poços. Após 24 h, o meio foi trocado para DMEM sem FBS. Após 24 h de pré-tratamento com amostras de EAAC (dissolvidas em DMSO), o meio foi trocado para DMEM contendo 8 mM de CCl4. As células foram incubadas a 37 °C na incubadora de CO2 umidificada por 2 h, seguidas pela determinação da viabilidade celular usando o kit de ensaio de viabilidade celular EZ-Cytox (Daeil Lab Service, Seul, Coreia) conforme descrito pelo fabricante. Brevemente, 10 μl do reagente EZ-Cytox foram adicionados a cada poço de cultura de uma microplaca de 96 poços e incubados a 37 °C na incubadora de CO2 umidificada por 2 h. Após a incubação, a densidade óptica (DO) do sobrenadante foi medida a um comprimento de onda de 450 nm usando um leitor de microplacas.
Determinação de fenóis totais, flavonoides e taninos
Teor de taninos
O teor de taninos foi medido usando o método de Folin-Denis. Cinquenta microlitros de extrato foram completados até 7,5 ml pela adição de água destilada. Em seguida, 0,5 ml de reagente de Folin Denis e 1 ml de Na2CO3 foram adicionados e misturados. O volume foi completado para 10 ml usando água destilada. A absorção foi registrada a 700 nm. Ácido tânico e água destilada foram usados como padrão e branco, respectivamente.
Teor de fenóis
O teor de fenóis foi medido pelo método de Folin-Ciocalteu. Uma alíquota de 40 μl da amostra foi adicionada a 200 μl de reagente de Folin-Ciocalteu juntamente com 1160 μl de água destilada e misturada. A mistura foi incubada por 3 min em temperatura ambiente antes da adição de 600 μl de carbonato de sódio a 2%. Após 2 h de incubação no escuro, a mistura foi aliquidada nos poços de uma placa de 96 poços e a DO foi medida a 765 nm. Ácido gálico e água destilada foram usados como padrão e branco, respectivamente.
O teor de flavonoides totais das amostras foi determinado pelo método colorimétrico do cloreto de alumínio com pequena modificação. 1 ml de água foi adicionado a 250 μl de amostras em um tubo. No tempo zero, 75 μl de NaNO2 a 5% foram adicionados ao tubo. Após 5 min, 0,3 ml de AlCl3 a 10% foi adicionado e incubado por 6 min. Em seguida, 0,5 ml de NaOH 1 M foi adicionado à mistura. A absorbância foi lida a 510 nm com água como branco. Várias concentrações de solução de (+)-catequina hidratada foram usadas como padrão.

Propriedades antioxidantes in vitro

Para determinar as atividades de sequestro de radicais livres da amostra, 40 μl de várias concentrações da amostra foram adicionados a 760 μl de solução de DPPH 0,3 mM dissolvido em etanol. Uma quantidade igual de etanol e DPPH serviu como controle. Após 30 min de incubação no escuro, a absorbância foi registrada a 517 nm. O experimento foi realizado em triplicata e a atividade foi apresentada como porcentagem de radical sequestrado. Para determinar as atividades de sequestro de ânions superóxido da amostra, foi utilizada uma pequena modificação de um protocolo anterior. Em resumo, cada amostra foi misturada com EDTA 30 mM (pH 7,4), hipoxantina 3 mM em peróxido de sódio 50 mM e NBT 1,42 mM. A mistura foi incubada por 3 min à temperatura ambiente após a adição de xantina oxidase e o volume foi aumentado para 3 ml com tampão fosfato (pH 7,4). A mistura foi incubada por 20 min à temperatura ambiente e a absorbância a 560 nm foi medida usando um espectrofotômetro. Para determinar a atividade de sequestro de radicais hidroxila, foi utilizado DNA plasmidial pBR322 clonado de bactérias transformadas no ensaio. O DNA plasmidial pBR322 superenrolado (SC) (2,0 μg) foi misturado com várias concentrações de EAAC. O reagente de Fenton (FeCl3 80 μM, H2O2 0,3 mM, ácido ascórbico 50 μM) foi adicionado às amostras e o volume foi completado para 20 μl. A mistura foi incubada a 37 °C por 30 min. As amostras foram carregadas em gel de agarose e fotografadas sob iluminador UV.

Animais e delineamento experimental

Ratos Sprague–Dawley machos, livres de patógenos específicos, com seis semanas de idade (n = 30) adquiridos da Koatech (Gyeonggi-do, Coreia) receberam dieta normal padrão e água ad libitum. Os animais foram aclimatados a ciclos de 12 h de luz/escuridão por 7 dias antes dos experimentos. Eles foram divididos aleatoriamente em cinco grupos de seis ratos: controle negativo (óleo de oliva; 1 ml/kg), CCl4 (1 ml/kg, dissolvido 1:1 em óleo de oliva), CCl4 + Silimarina (50 mg/kg, dissolvido em óleo de oliva), CCl4 + dose baixa de EAAC (100 mg/kg, dissolvido em óleo de oliva) e CCl4 + dose alta de EAAC (200 mg/kg, dissolvido em óleo de oliva). Todos os tratamentos foram administrados a cada 72 h durante 5 semanas. O peso corporal foi registrado semanalmente. No dia seguinte ao tratamento final, todos os animais foram mantidos em jejum durante a noite e sacrificados. Sangue total foi coletado da aorta abdominal e o fígado foi removido sob anestesia com zoletil. Todos os protocolos para experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade Dongguk (Nº 2014–09110).

Bioquímica sérica
Após o sacrifício, o sangue coletado foi imediatamente centrifugado a 3000 rpm por 20 min. O sobrenadante foi armazenado a 4 °C até as análises de alanina transaminase (ALT), aspartato transaminase (AST) e fosfatase alcalina (ALP) usando kits comerciais (Company, Asan, Coreia) de acordo com os protocolos do fabricante. Além disso, a DO foi determinada usando um espectrofotômetro.
Determinação da peroxidação lipídica
O nível de peroxidação lipídica do fígado de rato foi avaliado por um protocolo de ensaio de malondialdeído (MDA) previamente descrito, com ligeira modificação. Em resumo, os ratos foram sacrificados e o fígado foi isolado após perfusão sanguínea. O tecido hepático foi homogeneizado com KCl a 1,15% (9:1, p/p). Alíquotas (400 μl) do homogeneizado foram misturadas com TBA até uma concentração final de 8,1%. O reagente foi aquecido a 95 °C por 1 h antes da adição de 1 ml de água destilada e 5 ml de uma solução de n-butanol e piridina (15:1). O reagente foi centrifugado a 3000 rpm por 30 min. O sobrenadante foi transferido para poços de uma placa de 96 poços e a DO foi medida a 532 nm. Diversas concentrações de 1,1,3,3-tetraetoxipropano foram usadas como padrão.
Detecção de enzimas antioxidantes intracelulares
O nível total de sulfidrila (SH) do tecido hepático foi medido usando um protocolo anterior. Em resumo, 20 μl de amostra de fígado ou padrão foram misturados com 75 μl de Tris-HCl (pH 8,2) e 25 μl de DTNB (3 mM) em metanol antes da adição de 400 μl de metanol. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 3000 g por 5 min à temperatura ambiente. A amostra foi transferida para um poço de uma microplaca e a absorbância foi lida a 412 nm. Diferentes concentrações de GSH foram usadas como padrão. Os experimentos foram realizados em triplicata. A atividade da SOD do tecido hepático foi investigada usando NBT. Resumidamente, 0,1 mM de xantina, 0,1 mM de EDTA e 25 μM de NBT foram dissolvidos em tampão de bicarbonato de sódio 60 μM. A amostra e o tampão de reação foram misturados na proporção de 1:9 (p/p). SOD foi usada como padrão. Uma unidade de SOD foi equivalente à quantidade de enzima que inibiu a taxa da reação catalisada por CYP em 50%.
Histologia
Os tecidos hepáticos foram congelados usando um composto de corte congelado (Leica, Jena, Alemanha) e seccionados usando um criótomo modelo CM 1860 (Leica). As secções das lâminas foram fixadas com formaldeído a 10%, desparafinizadas e coradas com H&E ou Oil Red O. Imagens microscópicas foram obtidas sob concentrações de 200× usando um sistema de microscópio DFC 480 (Leica).
Reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (RT-PCR) e PCR convencional
Uma porção de cada tecido hepático foi armazenada em solução RNA Later (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) a –80 °C para investigação da expressão de mRNA. O mRNA hepático foi isolado dos tecidos hepáticos utilizando Trisure (Bioline, Taunton, MA, EUA) seguindo o protocolo do fabricante. O mRNA isolado foi verificado quanto à integridade do RNA e o cDNA foi sintetizado. A amplificação por PCR consistiu em 10 min a 95 °C, 45 ciclos de desnaturação a 95 °C por 10 s, anelamento a 52 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 15 s. Após isso, foi realizada a análise da curva de fusão. Cada valor de Ct e a quantificação da Segunda Derivada Máxima foram verificados. Os resultados foram analisados utilizando o software Light Cycler (Roche Applied Science, Basileia, Suíça). As sequências de primers utilizados para RT-PCR foram as seguintes: GST sense 5’- GCCTTCTACCCGAAGACACCTT - 3’ e antisense 5’ - GTCAGCCTGTTCCCTACA - 3’, SOD sense 5’ - AGGCCGTGTGCGTGCTGAG - 3’ e antisense 5’ - CACCTTTGCCCAAGTCATCTGC - 3’, CYP2E1 sense 5’ - ATGTCATCCCCAAGGGTACA - 3’ e antisense 5’ - AGGCCTTCTCCAACACACAC - 3’, GAPDH sense 5’ - GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG - 3’ e GAPDH antisense 5’ – ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA - 3’.
A PCR convencional para o gene CYP2E1 foi conduzida com 30 ciclos de amplificação de PCR consistindo em desnaturação a 95 °C por 1 min, anelamento a 52 °C por 1,5 min, alongamento a 72 °C por 2 min. Uma quantidade igual de produto de PCR foi então carregada e realizada eletroforese em gel de agarose a 1% por 30 min. O nível de expressão relevante foi então visualizado por iluminador UV (UVP, Cambridge, Reino Unido).
Análises estatísticas
Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (DP). Os dados experimentais foram analisados utilizando o software Graph Pad Prism versão 5.0 (Graph Pad, La Jolla, CA, EUA). Curvas padrão foram construídas utilizando os softwares Excel e PowerPoint (Microsoft, Redmond, WA, EUA). Todas as amostras foram comparadas com um gráfico padrão usando análise de variância e teste t de Student. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
Análise fitoquímica e atividade antioxidante
Conteúdos de fenóis totais, flavonoides e taninos e atividade antioxidante de diferentes extratos de Amomum cardamomum L
Extrato CFT CFT CTT DPPH Redução de NBT IC50 (μg/ml) (mg EAG/g extrato) (mg EC/g extrato) (mg EAT/g extrato) IC50 (μg/ml) Aqua 7,59 ± 0,73 - 13,91 ± 2,43 - - Etanol 24,49 ± 0,13 0,42 ± 0,13 40,78 ± 0,94 249,77 ± 8,09 - Acetato de etila 72,32 ± 1,22 4,03 ± 0,05 51,52 ± 3,32 148,51 ± 6,51 21,35 ± 4,94 Butanol 31,83 ± 0,20 0,42 ± 0,20 20,70 ± 6,31 211,05 ± 2,32 - Diclorometano 38,64 ± 1,17 1,62 ± 0,05 39,81 ± 1,46 163,31 ± 8,60 46,15 ± 5,55 Hexano 29,95 ± 1,12 3,75 ± 0,28 86,12 ± 3,09 224,33 ± 5,01 - BHT - - - 34,78 ± 2,92 - Ácido ascórbico - - - - 22,02 ± 3,25

CFT conteúdo fenólico total, CFT conteúdo de flavonoides totais, CTT conteúdo de taninos totais, EAG equivalente de ácido gálico, EC equivalente de catequina, EAT equivalente de ácido tânico
Entre as frações obtidas, o EAAC apresentou o maior teor de polifenóis (72,32 ± 1,22 mg EAG/g de extrato seco) e flavonoides (4,03 ± 0,05 mg EC/g de extrato seco). Os taninos foram mais abundantes na fração hexânica (86,12 ± 3,09 mg EAT/g de extrato seco), seguida pela fração de acetato de etila (51,52 ± 3,32 mg EAT/g de extrato seco) (Tabela 1).

Atividades antioxidantes das frações de acetato de etila de Amomum cardamomum (EAAC) determinadas pelo ensaio de radical hidroxila. O resultado do ensaio de clivagem de DNA para a atividade de sequestro de radicais hidroxila foi evidenciado pela verificação do DNA em eletroforese em gel. O.C. Forma de DNA circular aberto (nick), S.C. DNA plasmidial superenrolado.

Os extratos de A. cardamomum foram fracionados com vários solventes. O EAAC apresentou a maior eficácia na atividade de sequestro de radicais livres e na atividade de sequestro de ânions superóxido (Tabela 1). O EAAC também exibiu atividade de sequestro de radicais hidroxila. O reagente de Fenton fragmentou o DNA plasmidial em uma banda de tamanho pequeno (Fig. 1). O EAAC apresentou um efeito protetor dose-dependente contra o peróxido de hidrogênio.

Proliferação de células HepG2 na hepatotoxicidade induzida por CCl₄

O efeito hepatoprotetor do EAAC foi avaliado in vitro. a A viabilidade das células HepG2 com diferentes concentrações de EAAC foi determinada após 24 h de incubação. b A viabilidade das células HepG2 recuperadas contra CCl₄ foi obtida pelo tratamento com diferentes concentrações de EAAC e silimarina. O meio de cultura foi alterado para DMEM sem FBS contendo CCl₄ (8 mM) por 2 h. * indica diferenças estatisticamente significativas em p < 0,05 em relação ao grupo CCl₄ e ** em p < 0,01.

Não houve toxicidade significativa demonstrada pelo tratamento com EAAC nas células HepG2 por 24 h sob concentração de 100 μg/mL (Fig. 2a). A alteração do meio de cultura para DMEM com CCl₄ (8 mM) por 2 h reduziu a viabilidade das células HepG2 em 55% (Fig. 2b). O pré-tratamento com silimarina aumentou com sucesso a viabilidade das células HepG2. Além disso, a viabilidade das populações celulares pré-tratadas com EAAC foi aumentada após o tratamento com CCl₄ de forma dose-dependente, com preservação de 90% da viabilidade usando 100 μg/mL de EAAC.

Atividades enzimáticas hepáticas nos níveis séricos de ratos

Efeito do EAAC sobre vários níveis de enzimas hepáticas no soro de ratos SD em estudo in vivo. a concentração da enzima GPT, (b) concentração da enzima GOT, (c) concentração da enzima ALP foram representadas como unidade internacional (U/L). ## indica diferença estatisticamente significativa em p < 0,01 em relação ao grupo não tratado. * indica diferenças estatisticamente significativas em p < 0,05 em relação ao grupo CCl₄ e ** em p < 0,01.
Todas as enzimas séricas dos ratos injetados regularmente com CCl4 foram significativamente aumentadas em comparação com o grupo normal. O grupo da silimarina apresentou reduções significativas nos níveis séricos de GPT, GOT e ALP. A atividade da GPT sérica também foi significativamente diminuída por ambas as concentrações de EAAC, com ambos os resultados sendo significativos (Fig. 3a; ambos p < 0,05). O nível sérico de GOT foi significativamente diminuído no grupo EAAC 200 mg/kg (p < 0,01), mas não no grupo de 100 mg/kg (Fig. 3b). Os níveis séricos de ALP foram marcadamente diminuídos pela administração de EAAC 200 mg/kg (Fig. 3c; p < 0,05).

Avaliação histológica dos tecidos hepáticos

a. Secções de tecido hepático coradas com hematoxilina-eosina (H&E) e (b). Secções de tecido hepático coradas com Oil Red O (ORO) do estudo in vivo com ratos SD. Grupo normal, grupo tratado com CCl4 (1 mL/kg), grupo tratado com Silimarina (50 mg/kg) + CCl4, grupo EAAC (100 mg/kg) + CCl4 e grupo EAAC (200 mg/kg) + CCl4, da esquerda para a direita. As imagens foram obtidas por microscópio sob ampliação de 200×. As imagens mostram a área próxima à veia central (cabeça de seta)

Os fígados foram isolados dos ratos após o sacrifício. A coloração H&E das secções hepáticas de cada grupo revelou danos graves causados pela injeção de CCl4 no tecido ao redor da veia hepática (Fig. 4a). O tratamento com silimarina resultou em relativamente menos necrose e colapso do tecido hepático. Ambas as concentrações de EAAC melhoraram o dano hepático induzido por CCl4. A coloração Oil Red O (ORO) da secção hepática apresenta o acúmulo de lipídios causado pelo CCl4. A coloração ORO apareceu em uma porção menor da secção hepática nos grupos EAAC 200 mg/kg e silimarina em comparação com o grupo CCl4.

Redução da peroxidação lipídica

Efeito do tratamento com EAAC nos níveis de MDA no fígado de ratos. O tecido hepático de cada grupo foi homogeneizado com tampão KCl a 1,15% (9:1, p/p) e centrifugado. Após centrifugação, o sobrenadante foi coletado para investigar o nível de MDA. ## mostra diferença estatisticamente significativa em p < 0,01 em relação ao grupo não tratado. * mostra diferenças estatisticamente significativas em p < 0,05 em relação ao grupo CCl4 e ** em p < 0,01

Para investigar o efeito da administração de EAAC na peroxidação lipídica, um ensaio de MDA foi realizado com tecido hepático de cada grupo. A injeção de CCl4 induziu o acúmulo de lipídios no fígado, produzindo assim produto de peroxidação (Fig. 5). O tratamento com silimarina reduziu significativamente os produtos da peroxidação lipídica. A administração de EAAC diminuiu a quantidade de produtos de peroxidação lipídica no tecido hepático de forma dose-dependente. A administração de EAAC 200 mg/kg diminuiu significativamente o produto MDA (p < 0,01), mas o EAAC 100 mg/kg não.

Desintoxicação do dano hepático induzido por CCl4
Efeito do tratamento com EAAC nos níveis totais de SH, na atividade da SOD e nos níveis de mRNA de genes antioxidantes no fígado de ratos. O tecido hepático foi homogeneizado e centrifugado. Após a centrifugação, o sobrenadante foi coletado para investigar (a) o nível total de SH e (b) a atividade da SOD. Para a análise da expressão gênica, o tecido hepático foi homogeneizado e lisado com Trisure para isolar o mRNA. Após a síntese de cDNA, a PCR em tempo real foi realizada para investigar o nível de expressão do mRNA. c Nível de expressão de GST e (d) nível de expressão de SOD. ## indica diferença estatisticamente significativa em p < 0,01 em relação ao grupo não tratado. * indica diferenças estatisticamente significativas em p < 0,05 em relação ao grupo CCl4 e ** em p < 0,01

Como a toxicidade induzida por CCl4 foi atenuada pela administração de EAAC, a concentração da enzima de detoxificação hepática foi investigada. O efeito do EAAC sobre as atividades de sulfidrila total (SH) e SOD foi avaliado (Figs. 6a e b). A injeção de CCl4 reduziu significativamente as atividades totais de SH e SOD. O tratamento com silimarina recuperou com sucesso ambos os níveis enzimáticos para quase os níveis normais (p < 0,05). No entanto, houve um aumento notável nas atividades totais de SH e SOD em ambas as concentrações de EAAC (p < 0,05). Os níveis de expressão gênica de GST e SOD no fígado foram avaliados por PCR quantitativa em tempo real. A expressão de GST e SOD foi suprimida pela injeção de CCl4, mas foi significativamente elevada nos ratos tratados com silimarina e EAAC 200 mg/kg (Fig. 6c, d; p < 0,05).

Redução dos níveis de expressão de CYP2E1

Efeito do tratamento com EAAC nos níveis de mRNA de CYP2E1 no fígado de ratos. O tecido hepático foi homogeneizado e lisado com Trisure para isolar o mRNA. Após a síntese de cDNA, tanto a PCR convencional quanto a PCR em tempo real foram realizadas para investigar o nível de expressão do mRNA. O resultado da PCR convencional (CYP2E1 e GAPDH) foi visualizado por eletroforese em gel. ## indica diferença estatisticamente significativa em p < 0,01 em relação ao grupo não tratado. * indica diferenças estatisticamente significativas em p < 0,05 em relação ao grupo CCl4 e ** em p < 0,01

Para investigar o mecanismo relacionado ao efeito do tratamento com EAAC, realizamos PCR quantitativa em tempo real. A injeção de CCl4 aumentou a expressão do gene CYP2E1 em 101% em comparação com o grupo normal. O tratamento com silimarina reduziu esse incremento significativamente (p < 0,01). O tratamento com EAAC 100 mg/kg não produziu diferença significativa, mas a concentração de 200 mg/kg reduziu significativamente a expressão de CYP2E1 (Fig. 7; p < 0,01). Isso também foi corroborado por resultado semelhante da PCR convencional carregada em gel de agarose (Fig. 7, painel superior).
Os dados apresentados neste estudo demonstram que A. cardamomum protege contra a lesão hepática aguda induzida por CCl4. O CCl4 é uma hepatotoxina extensivamente estudada que é convertida em radicais livres CCl3, incluindo triclorometil (CCl3·, CCl3OO·). O estresse oxidativo e os radicais livres têm sido associados a inúmeras doenças hepáticas, como cirrose, genotoxicidade do tecido hepático e carcinoma hepático. Vários sistemas endógenos enzimáticos e não enzimáticos são necessários para proteger o fígado dos radicais livres. Antioxidantes naturais derivados de plantas protegem os sistemas de desintoxicação celular das respostas prejudiciais da oxidação excessiva dos radicais livres convertidos do CCl4.

As propriedades antioxidantes do extrato etanólico e das frações orgânicas de A. cardamomum foram testadas usando vários sistemas in vitro. Especialmente, a fração de acetato de etila de A. cardamomum (EAAC) inibiu fortemente a formação de radicais livres DPPH, ânions superóxido e radicais hidroxila. A capacidade antioxidante relativamente alta foi atribuível à abundância de compostos polifenólicos e flavonoides na fração de acetato de etila do extrato bruto de plantas naturais. Similarmente, um estudo recente descobriu que a fração de acetato de etila das folhas e casca do caule de Crescentia cujete possui uma capacidade antioxidante mais forte do que outras frações em um ensaio in vitro rápido. É claro que as frações de acetato de etila de plantas naturais que contêm compostos fenólicos e flavonoides têm propriedades antioxidantes superiores. Além disso, o tratamento de células de hepatocarcinoma HepG2 com CCl4 resultou atualmente na diminuição da viabilidade celular. Esta observação concorda com relatos anteriores usando várias linhagens de células cancerígenas. Por outro lado, o pré-tratamento com EAAC recuperou significativamente a viabilidade celular, talvez devido à redução da citotoxicidade.

Vários estudos recentes demonstraram que fitoquímicos naturais derivados de plantas protegem o fígado contra danos induzidos por CCl4, como cirrose, esteatose e fibrose hepática. Isto foi atualmente indicado pelas diminuições significativas nos níveis séricos de ALT, AST e ALP no tecido hepático que apresentou proteção contra a degeneração induzida por CCl4. A diminuição dos níveis dessas enzimas séricas se correlaciona com menos lesões necróticas ou danos histopatológicos e peroxidação lipídica no tecido hepático. Além disso, a indução de enzimas de fase II, incluindo GSH, GST e SOD, é importante no equilíbrio entre estresse oxidativo e antioxidação em um modelo de lesão hepática aguda induzida por CCl4. Os presentes resultados mostram que a exposição ao CCl4 causou aumentos significativos nos níveis séricos de ALT, AST e ALP devido a danos hepáticos no fígado de ratos. No entanto, a administração de 100 mg/kg e 200 mg/kg de peso corporal de EAAC restaurou marcadamente a fisiologia hepática, o que pode ser devido aos compostos fenólicos e flavonoides totais. Além disso, o tratamento com EAAC aumentou várias enzimas de fase II, incluindo SH total, GST e SOD, que foram reduzidas pelo CCl4, provavelmente devido às propriedades antioxidantes do EAAC.
CYP2E1, a isoforma mais importante do citocromo P450 hepático, é uma enzima conversora de CCl4 que catalisa a produção de radicais livres de triclorometil no fígado. O fígado é um órgão claramente influenciado pelo CYP2E1, portanto, esperava-se a regulação negativa do CYP2E1 pela diminuição da formação de radicais livres de triclorometil e redução do dano hepático, induzindo necrose de hepatócitos e lesão hepatocelular. Neste estudo, o tratamento de ratos com CCl4 levou a uma superexpressão significativa do gene CYP2E1 em comparação com ratos controle. No entanto, o tratamento com 100 mg/kg e 200 mg/kg de peso corporal de EAAC reduziu significativamente a produção de CYP2E1. Portanto, sugere-se que A. cardamomum possui potencial terapêutico valioso para doenças hepáticas causadas pela expressão de CYP2E1, diminuindo a expressão de CYP2E1 no fígado.
Conclusão
O presente estudo demonstra claramente pela primeira vez o efeito hepatoprotetor do EAAC contra lesão hepática aguda induzida por CCl4. O tratamento com EAAC aliviou significativamente o dano oxidativo e a oxidação lipídica através de suas propriedades antioxidantes. Além disso, o EAAC regulou negativamente o CYP2E1 em eventos hepatotóxicos, comparável ao efeito da silimarina no tecido hepático. Esses achados sugerem que A. cardamomum pode ser terapêutico como medicina tradicional em modelos de lesão hepática aguda.
Aprovação ética e consentimento para participar
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Dongguk, e todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Nacional de Cuidado e Uso Animal.
Consentimento para publicação
Não aplicável.
Disponibilidade de dados e materiais
Os conjuntos de dados que suportam as conclusões deste artigo são apresentados neste artigo principal.
Abreviaturas
ALP
fosfatase alcalina
BHT
hidroxitolueno butilado
CCl3
radicais triclorometil
CCl4
tetracloreto de carbono
CYP450
citocromo P450
DMEM
meio essencial mínimo modificado de Dulbecco
DMSO
dimetilsulfóxido
DPBS
solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco
DPPH
2,2-difenil-1-picril-hidrazila
DTNB
ácido 2-nitrobenzóico
EAAC
fração de acetato de etila de A. cardamomum
FBS
soro fetal bovino
GOT
transaminase glutâmico-oxalacética
GPT
transaminase glutâmico-pirúvica
GSH
glutationa total
GST
glutationa S-transferase
H&E
hematoxilina-eosina
MDA
malondialdeído
NBT
nitroazul de tetrazólio
O.D
densidade óptica
ORO
Oil red O
ROS
espécies reativas de oxigênio
RT-PCR
reação em cadeia da polimerase em tempo real
SD
desvio padrão
SOD
superóxido dismutase
TBA
ácido 2-tiobarbitúrico
TCDD
2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina
Interesses concorrentes
Os autores declaram que não possuem interesses concorrentes.
Contribuições dos autores
LDW, KH, PJY, KJE, MJY, PSD e PWH conceberam e delinearam os experimentos. LDW realizou a cirurgia animal, as propriedades antioxidantes, o ensaio quantitativo e gerou as figuras. KH também realizou a cirurgia animal e analisou os dados. PJY determinou a reação em cadeia da polimerase transcriptase reversa em tecido animal. KJE, MJY e PSD analisaram os dados e escreveram o manuscrito. PWH supervisionou o projeto e contribuiu para a versão final do artigo. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Referências
Estresse oxidativo e doença hepática
Antioxidantes na saúde hepática
A carga global da doença hepática: um desafio para métodos e para a saúde pública
O que é estresse oxidativo?
Dano oxidativo e fibrogênese
Moléculas relacionadas ao estresse oxidativo e fibrose hepática
Extrato de folha de Andrographis paniculata previne a cirrose hepática induzida por tioacetamida em ratos
Efeito hepatoprotetor do extrato etanólico de Curcuma longa na cirrose hepática induzida por tioacetamida em ratos
Efeitos antioxidantes do extrato da casca interna da castanha (Castanea crenata) em células HepG2 tratadas com t-BHP, e em camundongos tratados com CCl4 e dieta rica em gordura
Radicais livres e antioxidantes em funções fisiológicas normais e doença humana
Papel dos radicais livres nas doenças hepáticas
Efeitos hepatoprotetores do extrato metanólico de folhas de Carissa opaca no dano induzido por CCl4 em ratos
Mecanismos de toxicidade do tetracloreto de carbono
Efeito hepatoprotetor do extrato aquoso da flor de Chrysanthemum indicum L.
Uma visão geral dos modelos animais para investigar a patogênese e estratégias terapêuticas na insuficiência hepática aguda
O tratamento múltiplo com extrato de própolis melhora a lesão hepática induzida por tetracloreto de carbono em ratos
A superfamília P450: atualização sobre novas sequências, mapeamento genético e nomenclatura recomendada
Citocromos P450 e metabolismo de xenobióticos
Metabolismo oxidativo e redutivo pelo citocromo P450 2E1
Propriedades antioxidantes das proantocianidinas atenuam a esteatose e a lesão hepática induzidas por tetracloreto de carbono (CCl4) em ratos via regulação do CYP2E1
Extrato da esponja suberea mollis do Mar Vermelho protege contra lesão hepática aguda induzida por CCl4 em ratos através de um mecanismo antioxidante
Papel antioxidante de Hatikana (Leea macrophylla Roxb.) melhora parcialmente o dano hepático induzido por CCl4 em ratos albinos Wistar
Efeitos antioxidantes e anti-obesidade do extrato de Amomum Cardamomum L.
Detecção de agentes anti-inflamatórios de produtos naturais como inibidores da ciclooxigenase I e II
Atividade antioxidante do óleo essencial de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e seu potencial hepatoprotetor
O fator de crescimento de hepatócitos medeia a ação antifibrogênica do óleo essencial de Ocimum bacilicum contra a fibrose hepática induzida por CCl4 em ratos
Comparação dos efeitos de alguns óleos essenciais como agentes anti-inflamatórios nas atividades de hidrolases ácidas lisossomais em fígado de rato in vitro
1,8-Cineol melhora a esteatose de camundongos KO hepáticos específicos para pten via inativação de Akt
Efeitos antioxidantes da curcumina, β-mirceno e 1,8-cineol contra o estresse oxidativo induzido por 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina no fígado de ratos
Efeitos hepatoprotetores do extrato etanólico de Micromeria croatica contra a lesão hepática induzida por CCl4 em camundongos
Atividade hepatoprotetora in vivo do extrato aquoso de Artemisia absinthium L. contra lesões hepáticas induzidas quimicamente e imunologicamente em camundongos
Estimativa espectrofotométrica de taninos totais em alguns colírios ayurvédicos
Atividade antioxidante e fenóis totais em diferentes extratos de quatro espécies de Staphylea L.
Determinação dos teores de flavonoides em amora e seus efeitos sequestradores de radicais superóxido
Taxas de interações do superóxido com vitamina E, vitamina C e compostos relacionados medidas por quimioluminescência
O papel crucial das baixas pressões parciais de oxigênio em estado estacionário na peroxidação lipídica mediada por radicais livres de haloalcanos. Possíveis implicações na lesão hepática por haloalcanos
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Efeitos antioxidantes e hepatoprotetores do óleo essencial de ginseng vermelho em células HepG2 tratadas com H2O2 e camundongos tratados com CCl4
Atividades antioxidantes de extratos etanólicos e frações de folhas e casca do caule de Crescentia cujete e o envolvimento de compostos fenólicos
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A curcumina protege o fígado de ratos da lesão e fibrogênese causadas por CCl4 ao atenuar o estresse oxidativo e suprimir a inflamação
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Prevenção da necrose induzida por tetracloreto de carbono por inibidores do metabolismo de fármacos—estudos adicionais sobre seu mecanismo de ação
Estresse oxidativo e regulação de enzimas antioxidantes no modelo de camundongo transgênico para citocromo P4502E1 de fígado gorduroso não alcoólico
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