pmid: "36835337"
title: "Cardamomo ("
authors: "Delgadillo-Puga C, Torre-Villalvazo I, Cariño-Cervantes YY, García-Luna C, Soberanes-Chávez P, de Gortari P, Noriega LG, Bautista CJ, Cisneros-Zevallos L"
journal: "International journal of molecular sciences"
pubdate: "2023 Feb 15"
doi: "10.3390/ijms24043909"
source: "PMC Full Text"

Cardamomo (

Autores

Delgadillo-Puga C, Torre-Villalvazo I, Cariño-Cervantes YY, García-Luna C, Soberanes-Chávez P, de Gortari P, Noriega LG, Bautista CJ, Cisneros-Zevallos L

Periodico

International journal of molecular sciences (2023 Feb 15)

Conteudo

A ingestão de sementes de cardamomo (Elettaria cardamomum (L.) Maton) aumenta o gasto energético e reduz a massa gorda em camundongos, modulando circuitos neurais que regulam a lipólise do tecido adiposo e o metabolismo oxidativo mitocondrial no fígado e no músculo esquelético.
Semente de cardamomo (Elettaria cardamomum (L.) Maton; EC) é consumida em diversos países ao redor do mundo e é considerada uma especiaria nutracêutica, pois exerce atividades antioxidante, anti-inflamatória e metabólica. Em indivíduos obesos, a ingestão de EC também favorece a perda de peso. No entanto, o mecanismo desses efeitos não foi estudado. Aqui, identificamos que a EC modula o eixo neuroendócrino que regula a ingestão alimentar, o peso corporal, a atividade mitocondrial e o gasto energético em camundongos. Alimentamos camundongos C57BL/6 com dietas contendo 3%, 6% ou 12% de EC ou uma dieta controle por 14 semanas. Camundongos alimentados com as dietas contendo EC ganharam menos peso que o controle, apesar da ingestão alimentar ligeiramente maior. O menor peso final dos camundongos alimentados com EC deveu-se a um menor teor de gordura, mas a um aumento de massa magra em relação ao controle. A ingestão de EC aumentou a lipólise no tecido adiposo subcutâneo e reduziu o tamanho dos adipócitos nos tecidos adiposos subcutâneo, visceral e marrom. A ingestão de EC também preveniu o acúmulo de gotículas lipídicas e aumentou o conteúdo mitocondrial no músculo esquelético e no fígado. De acordo, o consumo de oxigênio em jejum e pós-prandial, bem como a oxidação de gorduras em jejum e a utilização de glicose pós-prandial foram maiores em camundongos alimentados com EC do que no controle. A ingestão de EC reduziu o conteúdo de mRNA da pró-opiomelanocortina (POMC) no núcleo arqueado do hipotálamo, sem impacto no mRNA do neuropeptídeo Y (NPY). Esses neuropeptídeos controlam a ingestão alimentar, mas também influenciam os eixos hipotálamo-hipófise-tireoide (HHT) e hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA). A expressão de mRNA do hormônio liberador de tireotropina (TRH) no núcleo paraventricular do hipotálamo (NPV) e a triiodotironina (T3) circulante foram menores em camundongos alimentados com EC do que no controle. Esse efeito foi associado à diminuição da corticosterona circulante e do peso das glândulas adrenais. Nossos resultados indicam que a EC modula o apetite, aumenta a lipólise no tecido adiposo e o metabolismo oxidativo mitocondrial no fígado e no músculo esquelético, levando ao aumento do gasto energético e à menor massa de gordura corporal. Esses efeitos metabólicos foram atribuíveis à modulação dos eixos HHT e HHA. O perfil de LC-MS da EC encontrou 11 compostos fenólicos, entre os quais o ácido protocatecuico (23,8%), o ácido caféico (21,06%) e o ácido siríngico (29,25%) foram os mais abundantes, enquanto o perfil de GC-MS mostrou 16 terpenoides, entre os quais foram identificados costunolida (68,11%), ambrial (5,3%) e cis-α-terpineol (7,99%). A extrapolação da ingestão de EC de camundongos para humanos foi realizada usando a equação de normalização da área de superfície corporal, que forneceu uma dose de ingestão humana diária equivalente de 76,9–308,4 mg de bioativos para um adulto de 60 kg, que pode ser obtida a partir de 14,5–58,3 g de sementes de cardamomo (18,5–74,2 g de vagens de cardamomo). Esses resultados apoiam a exploração adicional da EC como coadjuvante na prática clínica.
A semente de cardamomo (Elettaria cardamomum (L.) Maton; EC) é conhecida como a "rainha das especiarias" devido ao seu aroma agradável, sabor adaptável para uma grande variedade de alimentos e bebidas, e seus supostos efeitos benéficos à saúde. O EC é considerado uma especiaria nutracêutica, pois contém vários compostos fenólicos e terpenoides que exercem efeitos benéficos no humor/comportamento e no metabolismo. Vários estudos descreveram os diversos benefícios à saúde da ingestão de EC em humanos e roedores. A ingestão de EC melhora o metabolismo ao reduzir os níveis circulantes de colesterol, triglicerídeos e índice de massa corporal (IMC). Em ratos alimentados com uma dieta rica em carboidratos e gorduras (HCHF), a ingestão de EC aumenta a tolerância à glicose, melhora a sensibilidade à insulina, reduz o estresse oxidativo e previne a inflamação hepática. Resultados semelhantes são observados em ratos diabéticos e ratos tratados com dexametasona. Ratos alimentados com uma dieta contendo EC também apresentam um índice aterogênico diminuído; o EC regula a pressão arterial tanto em ratos saudáveis quanto hipertensos, e previne a obesidade. Além disso, um extrato de EC é capaz de aumentar a concentração de HDL.

Os polifenóis e flavonoides presentes no EC exercem alta capacidade antioxidante. A neutralização de espécies reativas de oxigênio (ERO) tóxicas previne o estresse oxidativo nos tecidos que, se permitido acumular, leva ao envelhecimento acelerado, resistência à insulina, cirrose, doenças neurodegenerativas e câncer. Compostos individuais do EC, como o 1,8-cineol, foram relatados por diminuir a massa gorda, vasodilatação e exercer efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes. Estudos anteriores sobre o cérebro confirmam que a ingestão de EC mostra proteção contra a peroxidação lipídica nas membranas celulares ao ativar a síntese de fatores antioxidantes como glutationa, catalase e superóxido dismutase, sugerindo que o mecanismo dos efeitos antioxidantes do EC é a neutralização de ERO. Além disso, o EC também modula vias de sinalização intracelular, como a atividade da acetilcolinesterase no hipocampo e córtex cerebral, melhora a memória e os processos cognitivos, reduz a degeneração neuronal por meio da estimulação de fatores tróficos como o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e previne associações da proteína β-amiloide no hipocampo e córtex, interrompendo a progressão da doença de Alzheimer.

Embora vários mecanismos tenham sido propostos para a regulação da glicemia, dislipidemia e estresse oxidativo pelo EC, não há investigações até o momento sobre seus efeitos na regulação do metabolismo energético. Como os eixos hipotálamo-hipófise-tireoide (HPT) e hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) regulam a massa gorda, a tolerância à glicose e o gasto energético total, o presente estudo tem como objetivo obter insights sobre os efeitos endócrinos e metabólicos da ingestão de EC em camundongos através da avaliação de peptídeos hipotalâmicos envolvidos no balanço energético e na regulação dos eixos HPT e HPA, que poderiam ajudar a entender o papel do EC na homeostase energética, peso corporal e ingestão alimentar.
2. Resultados
2.1. Perfil de Fenólicos e Terpenoides por LC-MS e GC-MS
A caracterização de fenólicos e terpenoides das sementes de cardamomo foi realizada por análises de LC-MS e GC-MS, respectivamente. O estudo detalhado das sementes de cardamomo e relatos anteriores sobre fenólicos mostram a identificação de ácido protocatecuico, ácido gentísico, ácido cafeico, ácido vanílico, ácido p-cumárico e ácido ferúlico a partir do cardamomo. Em nosso estudo, encontramos 11 compostos fenólicos, entre os quais o ácido protocatecuico (23,8%), ácido cafeico (21,06%) e ácido siríngico (29,25%) foram os principais fenólicos identificados nas sementes de cardamomo. Além disso, ácido siríngico, ácido 5-O-cafeoilquínico, ácido sinapoilquínico, ácido feruloil quínico e rutina são relatados pela primeira vez em sementes de EC (Figura 1A, Tabela 1). A química volátil dos óleos essenciais das sementes de cardamomo por análise de GC-MS resultou na identificação de 16 terpenoides, entre os quais costunolídeo (68,11%), ambrial (5,3%) e cis-α-terpineol (7,99%) foram os principais terpenoides identificados nas sementes de cardamomo. Por outro lado, α-acorenol, cubebol, isopatulenol, globulol, trans-farnesol, ambrial, eicosano, costunolídeo, coronarina e erucilamida foram alguns dos mono e diterpenos, sesquiterpenos e alcanos relatados pela primeira vez em estudos de óleos essenciais de cardamomo. Também relatamos ésteres de ácidos graxos dos ácidos palmítico e esteárico como β-mono palmitina e β-mono estearina, a amida de ácido graxo erucilamida e o triterpeno β-sitosterol (Figura 1B, Tabela 2). Na literatura, a variedade indiana de cardamomo apresentou como principais compostos caracterizados 1,8-cineol (38,7%), β-pineno (13,6%), α-terpineol (12,6%), espatulenol (8,3%), 4-terpineol (4,5%), germacreno-D (3,0%), α-pineno (2,8%) e β-selineno (2,7%). Em geral, a quantidade de fenólicos (equivalente ao ácido clorogênico) e o teor de óleo essencial (terpenoides) no EC foi de 124,53 mg de fenólicos/100 g de sementes e 404 mg de óleo essencial/100 g de sementes, respectivamente. Assim, a quantidade total de compostos bioativos (fenólicos + terpenoides) no EC é de aproximadamente 528,53 mg de bioativos/100 g de sementes.
2.2. A Ingestão de Cardamomo Reduz o Acúmulo de Massa Gorda em Camundongos
Para avaliar os efeitos metabólicos e endócrinos do EC, alimentamos camundongos com uma dieta controle ou dietas isoenergéticas contendo 3%, 6% ou 12% de EC em pó por 14 semanas. O ganho de peso corporal foi menor nos camundongos alimentados com EC do que no grupo controle a partir da semana 10 até o final do estudo (Figura 2A,B). Inesperadamente, a ingestão alimentar (expressa em gramas ou calorias) foi ligeiramente, mas significativamente, maior nos camundongos alimentados com EC do que nos camundongos alimentados com dieta controle (Figura 2C,D). Para determinar se as diferenças no peso corporal entre os grupos eram devidas a uma variação na massa muscular ou no conteúdo de tecido adiposo, avaliamos a composição corporal usando ressonância magnética. A Figura 2E,F mostra que a ingestão de EC reduziu a massa gorda, mas manteve ou aumentou ligeiramente a massa magra. Esses resultados mostram que a ingestão de EC atenua o ganho de peso corporal ao prevenir o acúmulo de massa gorda.
2.3. Camundongos Alimentados com Dietas Contendo Sementes de Cardamomo Apresentam Tamanho Reduzido de Adipócitos Associado ao Aumento da Lipólise
Para obter insights sobre os mecanismos envolvidos na redução da massa gorda em camundongos alimentados com EC, analisamos as características morfológicas dos tecidos adiposos subcutâneo, visceral e marrom (SAT, VAT e BAT, respectivamente). Camundongos alimentados com EC apresentaram redução do tamanho dos adipócitos no SAT e no VAT em comparação ao controle (Figura 3A,B,D). A análise de distribuição de frequência mostrou que 60% dos adipócitos no SAT e no VAT de camundongos alimentados com EC eram menores que 1500 μm, em comparação com ≈10% nos adipócitos da dieta controle (Figura 3C,E). Para avaliar se a redução no tamanho dos adipócitos dos camundongos alimentados com EC era devida ao aumento da lipólise, determinamos a abundância da lipase sensível a hormônios (HSL) avaliando o conteúdo de HSL e sua forma fosforilada. Camundongos alimentados com 6% e 12% de EC apresentaram aumento na fosforilação da HSL, sugerindo aumento da atividade lipolítica. Da mesma forma, descobrimos que 6% e 12% de EC reduziram o tamanho dos adipócitos do BAT em relação aos outros grupos (Figura 3F,G). No entanto, não encontramos diferenças no conteúdo da proteína UCP-1 (Figura 3H,J). Esses resultados indicaram que a ingestão de EC pode estar estimulando a atividade da HSL nos tecidos adiposos brancos, aumentando a hidrólise de triglicerídeos e consequentemente reduzindo o conteúdo de lipídios nos adipócitos. Por outro lado, o EC não aumentou a atividade termogênica do BAT em nenhuma das doses testadas.

2.4. A Ingestão de Sementes de Cardamomo Aumenta a Atividade Mitocondrial e o Conteúdo de AMPK no Músculo Esquelético
O aumento da lipólise no tecido adiposo eleva a liberação de ácidos graxos livres na circulação e, consequentemente, a captação de ácidos graxos em tecidos metabólicos, como músculo esquelético e fígado. O acúmulo excessivo de ácidos graxos nas fibras musculares esqueléticas leva à disfunção mitocondrial e, consequentemente, ao desenvolvimento de alterações metabólicas. Como o EC aumentou a lipólise no tecido adiposo, investigamos a atividade mitocondrial e o conteúdo de lipídios no músculo esquelético de camundongos alimentados com dietas controle ou EC. A Figura 4A,C mostra uma tendência não significativa de redução dos lipídios no músculo esquelético dos camundongos alimentados com EC em relação ao grupo controle. Como no presente estudo as dietas oferecidas aos animais foram baseadas na formulação AIN93, os camundongos ingeriram a gordura recomendada para uma saúde ideal. Portanto, esperava-se que o conteúdo de lipídios nas miofibras fosse baixo em todos os grupos. No entanto, como os camundongos alimentados com EC apresentaram aumento da atividade da HSL no tecido adiposo, esperava-se um alto acúmulo de gordura no músculo esquelético. Curiosamente, isso não ocorreu, sugerindo que o aumento da capacidade oxidativa mitocondrial do músculo esquelético dos camundongos alimentados com EC impediu o acúmulo intramiocelular de lipídios. Além disso, a Figura 4A,B mostra um aumento significativo na atividade da SDH no músculo esquelético dos camundongos alimentados com EC em comparação ao controle. Para definir se as diferenças observadas na atividade mitocondrial entre os grupos foram mediadas pelo aumento do conteúdo de PGC-1α ou AMPK, determinamos a quantidade dessas proteínas por imunotransferência. Inesperadamente, não observamos diferenças significativas no conteúdo da proteína PGC-1α no músculo esquelético dos camundongos alimentados com EC. No entanto, o conteúdo de AMPK foi maior em todos os grupos de camundongos alimentados com EC em comparação ao controle (Figura 4D–F). Esses resultados indicaram que a ingestão de EC aumenta a atividade mitocondrial ao ativar um mecanismo associado ao aumento do conteúdo de AMPK. Consequentemente, os camundongos alimentados com EC apresentaram maior capacidade oxidativa mitocondrial, o que impediu o acúmulo de lipídios em seu músculo esquelético.
2.5. Camundongos Alimentados com Dietas Contendo Sementes de Cardamomo Apresentaram Alta Atividade Mitocondrial Hepática
Semelhante ao músculo esquelético, o fígado é outro órgão com alta capacidade de eliminar ácidos graxos da circulação. Para avaliar o conteúdo de lipídios hepáticos e a atividade mitocondrial nos grupos EC, analisamos o conteúdo de gotículas lipídicas e a atividade da SDH em cortes de fígado de todos os grupos. A Figura 5A,B mostra que o tamanho das gotículas lipídicas foi menor nos camundongos EC do que no controle. Curiosamente, a atividade da SDH foi maior nos camundongos alimentados com EC (Figura 5A,C), sugerindo que a ingestão de EC também aumentou a atividade mitocondrial no fígado, o que pode evitar o acúmulo excessivo de lipídios hepáticos.
2.6. A Ingestão de Cardamomo Aumentou o Consumo de Oxigênio e a Flexibilidade Metabólica em Camundongos
Para avaliar se o aumento da atividade mitocondrial no músculo esquelético e no fígado de camundongos alimentados com EC pode ser observado em um aumento do consumo de oxigênio corporal total, os camundongos foram transferidos para gaiolas metabólicas com um sistema de troca gasosa de fluxo aberto para medir o consumo de oxigênio e a produção de CO2 durante os estados de alimentação e jejum. Como esperado, os camundongos alimentados com EC apresentaram maior consumo de oxigênio do que os controles durante os períodos de alimentação e jejum (Figura 6A–C). A calorimetria indireta também nos permitiu determinar a proporção de substratos que foram oxidados durante os períodos de jejum e alimentação. Conforme observado na Figura 6D, durante o jejum, o quociente respiratório (RER) de todos os camundongos estava abaixo de 0,8, indicando oxidação exclusiva de gordura; enquanto durante o período de alimentação, o RER aumentou para quase 1, atribuído exclusivamente à utilização de glicose como substrato energético. No entanto, o RER dos grupos EC foi menor e maior do que nos controles durante os períodos de jejum e alimentação, respectivamente (Figura 6E,F). Esses resultados revelaram que os camundongos alimentados com EC apresentaram maior capacidade oxidativa de gordura durante o jejum e uma tolerância à glicose aprimorada durante a alimentação em comparação com o controle, mostrando uma transição adequada da oxidação de gordura para glicose na transição jejum-alimentação, o que é conhecido como flexibilidade metabólica e é a marca registrada da saúde metabólica.
2.7. A Ingestão de Cardamomo Modulou a Expressão de Peptídeos Hipotalâmicos e os Níveis Circulantes de Triiodotironina (T3) e Corticosterona
Para obter insights sobre os mecanismos pelos quais a ingestão de cardamomo influencia o metabolismo energético nos tecidos adiposos, músculo esquelético e fígado, avaliamos a expressão de mRNA de peptídeos centrais envolvidos na regulação do balanço energético. Descobrimos que os camundongos alimentados com EC apresentaram expressão de mRNA de NPY semelhante, mas menor expressão de POMC no ARC hipotalâmico (Figura 7A,B). Camundongos alimentados com 6% ou 12% de EC apresentaram menor conteúdo de mRNA de TRH no PVN do que os camundongos controle (Figura 7C) e níveis reduzidos de T3 circulante (Figura 7D). Também avaliamos o peso das glândulas adrenais e a concentração circulante de corticosterona. Dietas com concentrações de 3%, 6% e 12% de EC induziram uma diminuição de 32%, 26% e 36%, respectivamente, no peso das glândulas adrenais em comparação com o controle (100%, 4,9 mg) (Figura 7E). Como esperado, os níveis plasmáticos de corticosterona foram menores nos camundongos alimentados com 6% e 12% de EC do que nos outros grupos (Figura 7F). Esses resultados revelaram um mecanismo central de ação do EC, regulando a expressão dos peptídeos que controlam a ingestão alimentar e o gasto energético e, como consequência, um ajuste fino do funcionamento dos eixos HPT e HPA.
No presente estudo, descrevemos os efeitos centrais e periféricos da ingestão de sementes de cardamomo que modula o balanço energético em camundongos. Os efeitos centrais da ingestão de EC incluem a regulação da expressão de peptídeos hipotalâmicos envolvidos no controle da ingestão alimentar, do gasto energético e na modulação dos eixos HPT e HPA. Os efeitos periféricos consistem na ativação da lipólise no tecido adiposo e no aumento da atividade mitocondrial no músculo esquelético e no fígado. As ações centrais e periféricas combinadas do EC resultam em aumento do gasto energético e oxidação de gordura, levando a uma menor massa gorda. Os resultados do presente estudo podem ser interpretados de duas maneiras principais: na primeira, os efeitos do EC são atividades centrais e periféricas paralelas (Cenário 1, Figura 8), e na outra, as principais ações do EC ocorrem por meio da modulação dos eixos tireoidiano e adrenal centrais, gerando um "ambiente hormonal ajustado" com atividades periféricas (Cenário 2, Figura 9).

Os presentes resultados mostram que a ingestão de sementes de EC reduz o ganho de peso corporal por meio de uma redução na massa gorda. Esta observação concorda com a diminuição relatada no ganho de peso corporal de ratos alimentados com uma dieta HCHF contendo 1% de pó de cardamomo. A redução na massa gorda provavelmente se deveu ao aumento da mobilização dos estoques lipídicos e ao aumento do gasto energético nos órgãos metabólicos, ao aumento da atividade da lipase sensível a hormônios no tecido adiposo, conforme determinado pelo aumento da ativação da fosforilação de Ser563. A ativação da HSL no tecido adiposo é mediada pelas vias de sinalização AMPK e PKA. Assim, no primeiro cenário proposto, o mecanismo envolvido no aumento da atividade da HSL induzido pelo cardamomo pode incluir a ativação da AMPK pelos terpenos ou flavonoides do cardamomo (Tabela 1 e Tabela 2) no tecido adiposo, como demonstrado com Alecrim (Salvia rosmarinus), Açafrão (Crocus sativus Linn.) e a geinsteína derivada da soja. Outros mecanismos podem incluir a ativação da PKA por um aumento do conteúdo de cAMP induzido por diterpeno (Figura 7).
Os ácidos graxos livres liberados pelo tecido adiposo são prontamente absorvidos pelos tecidos metabólicos, como o músculo esquelético e o fígado. O aumento da expressão proteica da forma fosforilada HSL-Ser563 no tecido adiposo de camundongos alimentados com cardamomo aumentou a liberação de ácidos graxos livres e sua captação por tecidos metabólicos, como músculo esquelético e fígado. Curiosamente, nem os músculos esqueléticos nem o fígado dos camundongos alimentados com cardamomo apresentaram maior acúmulo de lipídios. Em vez disso, apresentaram menor teor lipídico associado a maior atividade mitocondrial, conforme determinado pela atividade da SDH. Assim, os camundongos alimentados com EC apresentaram maior consumo de oxigênio corporal total e maior flexibilidade metabólica, avaliada pela taxa de troca respiratória (RER). A flexibilidade metabólica refere-se à alternância fisiológica entre a utilização de ácidos graxos/glicose durante a transição jejum-alimentação. Portanto, esses resultados são evidências de melhora na função mitocondrial nos grupos alimentados com cardamomo.
A homeostase energética é regulada pela interação entre sinais centrais e periféricos. O hipotálamo é a principal região central que integra os sinais periféricos relacionados à homeostase energética. Esses sinais coordenam a atividade dos diferentes núcleos hipotalâmicos que sintetizam peptídeos orexígenos ou anorexígenos para induzir ou inibir a ingestão alimentar e o gasto energético, respectivamente. A redução nos marcadores do eixo HPT nos camundongos alimentados com EC foi provavelmente uma resposta à diminuição do peso corporal. A perda de peso leva a uma redução na liberação de T3 da tireoide na circulação, que, por sua vez, é incapaz de ativar a síntese de TRH hipotalâmico ou TSH hipofisário, como um bloqueio do mecanismo de feedback negativo do eixo HPT induzido pelo balanço energético negativo (BEN). O bloqueio do mecanismo de feedback negativo induzido pelo BEN resulta de um aumento da atividade da tipo 2-desiodinase no hipotálamo mediobasal, que converte T4 em T3, aumentando assim os níveis hipotalâmicos de T3 e reprimindo a transcrição do gene TRH no PVN. Ainda precisa ser elucidado se o cardamomo é capaz de estimular a atividade da tipo 2-desiodinase. Em condições de homeostase energética (quando os animais mantêm seu peso corporal), por outro lado, níveis baixos de T3 aumentam a taxa de transcrição do gene TRH no PVN e promovem a liberação de TRH no sangue portal, que ativa a liberação de TSH e finalmente recupera a concentração sanguínea de T3 e retorna o eixo HPT ao seu funcionamento basal. Neste estudo, o bloqueio do mecanismo de feedback negativo observado nos grupos alimentados com EC pareceu resultar de uma alteração compensatória à maior degradação de lipídios no tecido adiposo, que evitou a ativação da termogênese no tecido adiposo marrom, principalmente regulada por altos níveis de T3. Os baixos níveis de T3 poderiam ser responsáveis pela falta de aumento no conteúdo de UCP1 do TAM, portanto, a termogênese ativa nos camundongos alimentados com EC deve ser devida a efetores diferentes do T3. Além disso, como ocorre em outras condições de BEN, como jejum ou desnutrição, a perda de peso corporal dos camundongos alimentados com EC foi capaz de modular a expressão de peptídeos reguladores da alimentação hipotalâmicos de tal forma que os animais aumentaram sua ingestão alimentar, em parte devido aos níveis reduzidos resultantes de peptídeos com ações anoréticas, como POMC no ARC e TRH no PVN.
Curiosamente, os níveis plasmáticos de corticosterona não aumentaram no grupo alimentado com EC, apesar da perda de peso corporal, por ser um estímulo estressante. Como elevações sustentadas de corticosterona sérica induzem comportamento ansioso em animais e humanos, sua baixa concentração circulante pode ser um efeito direto da ingestão de cardamomo no hipotálamo. Foi demonstrado que o composto do EC, quercetina, inibe a expressão de mRNA do CRH no PVN por meio da ativação de receptores GABAA e tem efeitos ansiolíticos. Além disso, o aumento da ingestão alimentar dos camundongos alimentados com EC não poderia ser devido aos efeitos hiperfágicos da corticosterona. Isso é apoiado pelos níveis inalterados de mRNA de NPY encontrados nos camundongos alimentados com EC, que aumentam quando a concentração de corticosterona se eleva. Outra possibilidade para a diminuição da expressão de mRNA de POMC no ARC e de TRH no PVN em camundongos alimentados com sementes de cardamomo é por meio de ações diretas nesses neurônios. A quercetina, um composto antioxidante presente no EC, parece atuar por meio de receptores GABAA, uma vez que a administração i.p. de bicuculina (antagonista do receptor GABAA) bloqueou o efeito antinociceptivo da quercetina. Além disso, os neurônios de TRH no PVN e de POMC no ARC recebem entradas GABAérgicas inibitórias, e o receptor GABAA é expresso em neurônios do PVN e do ARC; assim, seria possível que o EC exerça seus efeitos diretamente nos neurônios hipotalâmicos do PVN e do ARC, reduzindo a transcrição de mRNA de TRH e POMC. Essa hipótese necessita de mais investigação. Além disso, foi recentemente revelado em camundongos que o estresse aumenta a expressão de POMC no ARC e está associado à redução da ingestão alimentar. Assim, a redução na expressão de mRNA de POMC no ARC é provavelmente um dos mecanismos pelos quais a ingestão de cardamomo exerce suas atividades metabólicas benéficas. Todas essas descobertas apoiam nossa hipótese de que uma dieta à base de cardamomo estimula o apetite ao atuar na expressão de peptídeos anorexígenos do arqueado e ao reduzir os níveis de mRNA de POMC e TRH, que também têm efeitos anoréxicos. Curiosamente, a alta degradação lipídica observada nesses animais impediu que seu peso corporal aumentasse, mesmo quando aumentaram sua ingestão alimentar.
A sinalização de glicocorticoides e hormônios tireoidianos nos tecidos-alvo é regulada por uma intrincada interação, onde o resultado depende da concentração e atividade de cada hormônio. Algumas atividades são ativadas sinergicamente, enquanto outras são mutuamente excludentes. Esse é o caso da biogênese e função mitocondrial, onde a dinâmica e atividade mitocondrial são aumentadas pelo T3, mas prejudicadas pela exposição contínua à corticosterona. No segundo cenário proposto, o aumento da atividade mitocondrial no fígado e no músculo esquelético em camundongos alimentados com cardamomo se deve a um "ambiente hormonal ajustado", onde o T3 está baixo, mas a corticosterona também está baixa, permitindo a sinalização adequada do T3 nos tecidos metabólicos (Figura 9). Estudos futuros são necessários para investigar essa hipótese.
Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos metabólicos de uma especiaria nutracêutica em camundongos, a fim de avaliar seu potencial terapêutico para ser utilizada como terapia não farmacológica para distúrbios metabólicos. Postulamos dois cenários possíveis de como o EC modula os tecidos metabólicos para ajustar o balanço energético. No entanto, mais estudos são necessários para desvendar os mecanismos intrincados pelos quais uma especiaria nutracêutica exerce seus efeitos metabólicos. Como as sementes de EC contêm uma matriz complexa de fitoquímicos com potenciais efeitos à saúde, não esperávamos que uma única molécula fosse responsável por suas ações metabólicas. Assim, não incluímos um controle positivo, ou seja, um grupo de ratos alimentados com dieta suplementada com um único composto derivado de EC, como fizemos em estudos anteriores. Avaliamos três doses diferentes de sementes de EC para avaliar seus efeitos dose-dependentes. Curiosamente, muitos parâmetros bioquímicos e moleculares foram modulados pelo EC em todas as doses testadas, indicando que o EC pode exercer efeitos metabólicos benéficos quando incluído em uma dieta tão baixa quanto 3%.
Para obter uma dose de referência para futuros estudos clínicos, o método de normalização da área de superfície corporal (ASC) pode ser usado para converter as informações de dose para camundongos em ingestão humana equivalente. Por exemplo, no presente estudo, o consumo de 3 g/dia de ração contendo sementes de cardamomo em três teores de dose (3%, 6% e 12%) em uma dieta forneceu aos camundongos 0,47, 0,95 e 1,90 mg/dia de compostos bioativos (fenólicos + terpenoides), respectivamente (Figura 2C e a tabela na Seção 4.5). Essa quantidade de compostos bioativos para camundongos com peso corporal médio de 30 g corresponde a 15,8, 31,7 e 63,4 mg de bioativos/kg por dia, que, multiplicados pelo fator Km do animal (3) e divididos pelo fator Km humano (37), fornecerão uma dose humana equivalente de 1,28, 2,57 e 5,14 mg de bioativos/kg por dia, respectivamente. O fator Km é obtido dividindo o peso corporal (kg) pela ASC (m²) e utilizado para conversão de doses de medicamentos entre mg/kg e mg/m², e seu valor para diferentes espécies animais está disponível na literatura. Dessa forma, para um adulto humano médio de 60 kg, a ingestão de compostos bioativos das três doses de sementes de cardamomo (3%, 6% e 12%) corresponderia a ~76,98, 154,2 e 308,4 mg de bioativos/dia, respectivamente. Assim, considerando que as sementes de cardamomo contêm ~528,53 mg de bioativos/100 g de sementes, então a ingestão calculada de cardamomo para as três doses (3%, 6% e 12%) corresponderia a 14,5, 29,1 e 58,3 g de sementes de cardamomo, respectivamente. Essa quantidade de sementes de cardamomo poderia ser fornecida pelo uso diário de 18,5, 37,1 e 74,2 g de vagens de cardamomo, respectivamente (1 g de vagem de cardamomo fornece ~0,78 g de sementes) ou, alternativamente, a ingestão diária de sementes de cardamomo também poderia ser fornecida pela extração dos compostos bioativos na forma de um suplemento alimentar.
4. Materiais e Métodos
4.1. Amostras de Cardamomo
As sementes de EC foram colhidas na Guatemala e gentilmente fornecidas pela Heifer International. Utilizamos extração metanólica para polifenóis não voláteis, enquanto para terpenoides voláteis utilizamos destilação a vapor para obter os óleos essenciais de cardamomo. Os perfis dos polifenóis não voláteis foram avaliados por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). Os perfis dos terpenoides voláteis foram determinados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS).
4.2. Preparação de Amostras para Análise de Polifenóis e Perfil de Polifenóis por LC-MS
O pó moído de Elettaria cardamomum EC (1 g) foi dissolvido em metanol (10 mL) e agitado por 15 h a 4 °C. O extrato foi então centrifugado e concentrado a 4000 rpm (2147× g) a 45 °C até que todos os solventes voláteis evaporassem em um concentrador Centrivap conectado a um condensador de vácuo (Labconco, Kansas City, MO, EUA), obtendo-se um rendimento de extrato de 126,2 mg. Os extratos obtidos do EC foram redissolvidos em 10 mL de metanol e a quantidade apropriada de extrato foi retirada (conforme acima) para fazer uma concentração de ~5 mg/mL e filtrada com um filtro de PTFE de 0,22 µm (Agilent, Santa Clara, CA, EUA); e um volume de 10 µL foi injetado no LC-MS em 3 réplicas. A determinação dos compostos fenólicos individuais foi realizada em um sistema Surveyor HPLC/MS equipado com um amostrador automático, uma bomba quaternária Surveyor 2000 e um detector PDA Surveyor UV 2000 usando uma coluna de fase reversa C18 (150 mm × 4,6 mm, Atlantis, Waters, Irlanda; tamanho de partícula = 5 μm) conectada a um sistema LCQ Deca XP Max MSn (Thermo Finnigan, San Jose, CA, EUA) com uma fonte ESI Z-spray operada pelo software Xcalibur, versão 1.3 (Thermo Finnigan-Surveyor, San Jose, CA, EUA). A vazão da fase móvel foi ajustada para 0,25 mL/min, enquanto os gradientes de eluição foram realizados com o solvente A, consistindo de acetonitrila/metanol (1:1) (contendo 0,5% de ácido fórmico); e o solvente B, consistindo de água (contendo 0,5% de ácido fórmico). As condições de eluição aplicadas foram: 0–2 min, 2% A, 98% B; 3–5 min, 5% A, 95% B; 5–7 min, 25% A, 75% B; 7–12 min, 55% A, 45% B; 12–24 min, 55–80% A; 24–27 min mantido isocrático a 80% A, 28–30 min 90% A, 10% B; 31–33 min mantido isocrático, 100% A; e 34–40 min, 2% A, 98% B, até a condição inicial. Os cromatogramas foram monitorados a 280 nm, e os dados espectrais completos foram registrados na faixa de 200–600 nm. A ESI foi realizada no modo de ionização negativo, nitrogênio foi usado como gás de bainha com fluxo de 59 unidades arbitrárias, e gás He foi usado como gás de amortecimento. A voltagem capilar foi de −4,17 V; voltagem do spray, 5 kV; temperatura capilar, 275 °C; e a voltagem da lente do tubo foi ajustada para −55 V. Energias de colisão de 30% foram usadas para a análise de MSn. A quantificação fenólica—usando picos de área do cromatograma PDA e uma curva padrão de ácido clorogênico—é relatada como mg equivalentes de ácido clorogênico por 100 g de sementes por pico individual, e a soma como fenólicos totais.
4.3. Preparação da Amostra para Análise de Terpenoides e Perfilagem por GC-MS
O óleo essencial foi extraído tomando-se aproximadamente 5 g de amostra, aos quais foram adicionados 500 mL de água destilada, e submetido à destilação a vapor para obter os óleos essenciais com um rendimento de cerca de 20,2 mg. O óleo obtido foi seco sobre sulfato de sódio anidro e armazenado em frascos âmbar hermeticamente selados a 0 °C até ser analisado e testado.
As análises por GC-FID foram realizadas em um cromatógrafo gasoso Trace GC Ultra equipado com um amostrador automático e uma coluna capilar RX-5MS (60 m × 0,25 mm, espessura de filme de 0,25 μm) acoplado a um espectrômetro de massas (Thermo Scientific, West Palm, FL, EUA). A temperatura da coluna foi programada para aumentar de 50 a 280 °C a uma taxa de 3 °C/min. O gás de arraste foi hélio com fluxo de 1,5 mL/min. O tempo de varredura e a faixa de massa foram de 1 s e 50–550 m/z, respectivamente, e os dados adquiridos foram processados usando o software Xcalibur (Thermo Fisher Scientific, versão 2.0.7). Os picos obtidos foram identificados tentativamente pela comparação de seus espectros de massa com aqueles incluídos no NIST-05a. Os óleos essenciais foram injetados a uma concentração de 2,0 mg/mL.
4.4. Animais
Camundongos C57BL/6 machos com 5 semanas de idade e pesando 20–25 g (n = 32) foram obtidos do Departamento de Pesquisa Experimental e Instalação de Cuidados com Animais do Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (DIEB-INCMNSZ) e alojados em gaiolas de microisolamento (3 camundongos por gaiola) com temperatura controlada a 23 °C e ciclo claro-escuro de 12 h ligado/12 h desligado (7:00–19:00). Os animais foram alimentados com dieta com ou sem sementes de cardamomo, conforme descrito na Seção 2.5. Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as recomendações e procedimentos do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Institute for Laboratory Animal Research. O Comitê de Cuidados com Animais do Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (CINVA-INCMNSZ. Ref. NAN-1992-20-21-1) aprovou o estudo.
4.5. Dietas Experimentais
Os animais (32 camundongos no total) foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos (n = 8 por grupo) que receberam, respectivamente, uma dieta controle ou uma dieta contendo 3%, 6% ou 12% de cardamomo (p/p) administrada na forma seca. Todas as dietas experimentais foram isoenergéticas e baseadas na fórmula AIN 93 (Tabela 3). O estudo teve duração de quatorze semanas, e todos os animais tiveram acesso ad libitum à água e à sua respectiva dieta experimental. O peso corporal foi medido uma vez por semana. O consumo de alimento por gaiola foi determinado subtraindo-se o peso da dieta do dia anterior do peso da dieta. O consumo diário de alimento por camundongo foi estimado dividindo-se o consumo de alimento por gaiola pelo número de camundongos na gaiola. A composição corporal e o gasto energético foram avaliados na 11ª e 12ª semanas, respectivamente. No presente estudo, sementes EC obtidas de vagens de cardamomo foram utilizadas nas dietas experimentais.
Ao final do estudo, os camundongos foram privados de alimento por seis horas antes da eutanásia; esta foi realizada administrando-se aos camundongos uma dose letal de sevoflurano. O volume total de sangue foi coletado da veia cava posterior usando uma seringa de 1 mL com heparina, e o plasma foi obtido por centrifugação por 10 min a 1500× g a 4 °C. O tecido adiposo subcutâneo (TAS), tecido adiposo visceral (TAV), tecido adiposo marrom (TAM), fígado e músculo esquelético (sóleo e gastrocnêmio) foram rapidamente removidos e divididos em pequenas amostras. Algumas amostras foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a −80 °C, e o restante foi fixado em paraformaldeído a 4% (p/v) gelado em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para análises histológicas, conforme descrito abaixo. Os encéfalos foram dissecados e congelados a −70 °C até o processamento, e as glândulas adrenais foram dissecadas e pesadas.
4.6. Medição da Composição Corporal e do Gasto Energético
A composição corporal (massa magra e massa gorda) foi avaliada em cada camundongo usando ressonância magnética (EchoMRI; Echo Medical Systems, Houston, TX, EUA). O gasto energético foi medido por calorimetria indireta em um Sistema de Monitoramento Animal Oxymax Lab (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, EUA). Os animais foram alojados individualmente em gaiolas de Plexiglas com um sistema de fluxo aberto conectado ao CLAMS por 24 h. Antes do teste, os animais foram aclimatados por 24 h, em jejum por 12 h no período claro e alimentados durante o período escuro. Durante todo o teste, o consumo de O2 (VO2, ml/kg/h) e a produção de CO2 (VCO2, mL/kg/h) foram medidos sequencialmente durante 90 s. O consumo total de O2 foi calculado e relatado como VO2. A taxa de troca respiratória (RER) foi calculada como a razão média entre o CO2 produzido e o O2 inalado (VCO2/VO2).
4.7. Análise Histológica do Fígado e do Tecido Adiposo
Amostras de fígado e tecido adiposo foram fixadas em paraformaldeído a 4% tamponado com PBS, desidratadas, embebidas em parafina e cortadas em fatias de 4 µm. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (H&E) e observados usando um microscópio Leica DM750 (Leica, Wetzlar, Alemanha) com lente de 20×. A análise da área dos adipócitos de pelo menos 100 adipócitos por corte foi realizada com o software Adiposoft para ImageJ (ImageJ 1.52K, National Institutes of Health, Bethesda, ML, EUA). Duas imagens diferentes por tecido foram analisadas após a calibração do software usando a barra de escala com comprimento de 100 µm.
4.8. Determinação de Corticosterona e Triiodotironina (T3) no Plasma
As concentrações de corticosterona e triiodotironina (T3) no plasma foram determinadas por ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando kits comerciais para camundongos da DRG International, Inc. (Springfield Township, NJ, EUA) e Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA), conforme descrito. Cada amostra foi medida em duplicata.
4.9. Determinação da Atividade Mitocondrial e do Conteúdo Lipídico no Músculo Esquelético e no Fígado
Para analisar a atividade mitocondrial e o conteúdo lipídico no fígado e no músculo esquelético, tecidos congelados foram embebidos em composto de temperatura de corte ideal (OCT), seccionados com um criostato (8 μm) e montados em lâminas com carga positiva (Kling-On SFH1103, BIOCARE Medical, Concord, CA, EUA). A atividade da succinato desidrogenase (SDH) muscular foi determinada conforme descrito em. Resumidamente, cortes congelados foram incubados em solução de coloração para SDH (0,55 mM de nitroblue tetrazólio e 0,05 mM de succinato de sódio) e incubados a 37 °C por 60 min. Em seguida, as lâminas foram lavadas com água deionizada e desidratadas sequencialmente (2 min/lavagem) em acetona a 30%, 60% e 90%, que foi removida com imersão sequencial em acetona a 60% e 30% e água deionizada (2 min/imersão). Fotografias digitais foram tiradas de cada corte com ampliação de 20× conforme descrito acima, e a atividade mitocondrial (coloração azul) foi quantificada com o software ImageJ. Para visualizar lipídios neutros, cortes de tecido congelado foram corados com 0,5% de Oil Red O (ORO) em propilenoglicol (Sigma-Aldrich, Burlington MA, EUA) conforme descrito em. Para a análise quantitativa da coloração ORO, a densidade integrada foi determinada a partir da área e o valor médio de cinza foi obtido a partir das medições realizadas em cada imagem.
4.10. Imunotransferência
Os tecidos foram homogeneizados a 4 °C em tampão RIPA gelado contendo PBS, 1% IGEPAL, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% dodecil sulfato de sódio, 1 mM fluoreto de sódio, 2 mM ortovanadato de sódio e 1 comprimido/10 mL de mistura de inibidores de protease (Complete Mini, Roche Diagnostics, South San Francisco, CA, EUA) em um TissueLyser (Qiagen, Germantown, MD, EUA). As amostras foram incubadas em gelo por 30 min, centrifugadas a 14.500× g por 30 min a 4 °C, e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo e armazenado a −80 °C até o uso. A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Lowry. Amostras de proteínas (40 µg) foram separadas em um gel de SDS-poliacrilamida a 10% e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Hybond-P, Amersham, GE Healthcare, Chicago, IL, EUA) usando um sistema de eletrotransferência úmida (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As membranas foram bloqueadas por 1 h com leite seco desnatado a 5% e incubadas com anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio durante a noite. Os anticorpos primários foram adicionados da seguinte forma: UCP-1 (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab155117, diluição 1:2000 BAT), HSL (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab45422, diluição 1:2000 SAT), fosfo-HSL (Cell Signaling, Danvers, MA, EUA, 4139, diluição 1:1000, SAT), AMPKa 1/2 (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab131512, diluição 1:2000 músculo esquelético), PGC1-alfa (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab191838, diluição 1:1000 músculo esquelético) e GADPH (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab8245, 1:50.000 BAT e músculo esquelético). As membranas foram lavadas três vezes com TBS-T por 10 min e, em seguida, incubadas com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano-silvestre—anti-coelho de cabra 1:10.000, 1:45.000, 1:10.000, 1:7500 e 1:10.000 (Santa Cruz, CA, EUA, SC-2357), respectivamente. A visualização foi realizada utilizando um reagente de detecção quimioluminescente (Millipore, MA, EUA). Imagens digitais das membranas foram obtidas com um densitômetro ChemiDoc MP e analisadas usando o software Image Lab 6.1 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Os resultados são relatados como razão proteína de interesse/proteína constitutiva ou razão proteína fosforilada/proteína total. Um valor de 1 foi atribuído arbitrariamente ao grupo controle, que foi usado como referência para as outras condições.
4.11. Expressão Gênica de Peptídeos Hipotalâmicos
A análise da expressão dos mRNAs do núcleo arqueado hipotalâmico (ARC: NPY e POMC) e do núcleo paraventricular (PVN) (TRH) foi realizada por PCR em tempo real. Os PVN (−0,58 a −1,22 mm do bregma) e ARC (−1,22 a −2,46 mm do bregma) foram dissecados por punção a partir de tecidos congelados usando um amostrador de 1 mm de diâmetro e tratados para extração de RNA total pelo método do tiocianato de guanidina, conforme descrito. Resumidamente, o reagente de tiocianato de guanidínio foi adicionado às amostras, seguido de homogeneização usando um sonicador. Álcool isoamílico de fenol-clorofórmio (3/10 do volume do reagente de tiocianato de guanidínio) foi adicionado às amostras, incubado por 15 min e centrifugado a 12.300× g por 20 min a 4 °C. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e misturada com isopropanol (1:1 do volume da fase aquosa). Após incubação overnight a −20 °C, o RNA foi precipitado por centrifugação a 23.400× g por 30 min a 4 °C, seguido por duas lavagens com etanol 75% gelado. O pellet foi seco a vácuo e dissolvido em água tratada com DEPC. A concentração de RNA foi medida usando um biofotômetro (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). Uma quantidade de 1,5 mg de RNA foi retrotranscrita com um kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Thermo Fisher Scientific, Pleasanton, CA, EUA) para obter cDNA. O conteúdo de mRNA de NPY, POMC e pro-TRH foi então quantificado usando reagentes e equipamentos da Applied Biosystems (Carlsbad, CA, EUA), incluindo TaqMan Universal PCR Master Mix, um sistema StepOne de PCR em tempo real e primers e sonda TaqMan (Npy, Mm03038253_m1; Pomc, Mm00435874_m1; Trh, Mm01182425_g1). Cada amplicon foi normalizado usando 18S (Mm03928990_g1) como gene de referência, e cada amostra foi analisada em duplicata. O programa de amplificação foi de 40 ciclos de 95 °C por 15 s, depois 60 °C por 1 min. As alterações no conteúdo de diferentes mRNAs do ARC e PVN foram avaliadas usando o ciclo limiar com o método ΔCt; o valor de ΔCt foi obtido a partir da diferença entre o número de ciclos de cada gene problema e o do 18S para atingir o limiar (ΔCt = Ct dos genes desconhecidos − Ct 18S). O grupo controle foi usado como referência, cujo valor de fluorescência em unidades arbitrárias foi considerado como 1, e a porcentagem de alteração para cada gene examinado foi obtida pela equação: ΔΔCt = 2 − (ΔCt = Ct Controle − Ct grupo experimental).

4.12. Análises Estatísticas

Os dados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.). O teste de normalidade de Shapiro–Wilk foi utilizado para verificar a distribuição dos dados. Todos os dados foram analisados por análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Tukey usando o GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) e o software SigmaPlot 12.3 (Systat Software Inc., Erkrath, Alemanha). As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p< 0,05.

5. Conclusões
   O presente estudo indica que a ingestão de sementes de cardamomo influencia os circuitos neurais que regulam a ingestão alimentar e o metabolismo energético periférico. A análise por LC-MS e GC-MS revela 11 compostos fenólicos e 16 terpenoides nas sementes de cardamomo. O cardamomo dietético aumenta a lipólise no tecido adiposo e o metabolismo oxidativo mitocondrial no fígado e no músculo esquelético, levando a um maior gasto energético e menor massa de gordura corporal. Os efeitos da ingestão de sementes de cardamomo podem ser decorrentes de ações centrais e periféricas paralelas no hipotálamo e nos órgãos metabólicos, ou de um efeito principalmente central que modula os eixos HPT e HHA, levando a um ambiente hormonal ajustado que regula finamente as atividades metabólicas nos órgãos periféricos. Esses resultados pré-clínicos abrem caminho para novas pesquisas que visam aprofundar nossa compreensão dos efeitos endócrinos e metabólicos do cardamomo e reforçam o uso da semente de cardamomo na prática clínica como coadjuvante no tratamento de doenças metabólicas.
   Aviso/Nota do Editor: As declarações, opiniões e dados contidos em todas as publicações são de responsabilidade exclusiva do(s) autor(es) e colaborador(es) individual(is) e não da MDPI e/ou do(s) editor(es). A MDPI e/ou o(s) editor(es) se isentam de responsabilidade por qualquer dano a pessoas ou propriedades resultante de quaisquer ideias, métodos, instruções ou produtos referidos no conteúdo.
   Contribuições dos Autores
   Conceitualização, C.D.-P. e L.C.-Z.; metodologia, I.T.-V., Y.Y.C.-C., L.G.N., C.G.-L., P.S.-C. e C.J.B.; análise formal, Y.Y.C.-C., C.G.-L., I.T.-V., P.S.-C. e C.J.B.; recursos, L.C.-Z. e I.T.-V.; redação — preparação do rascunho original, C.D.-P., L.C.-Z., I.T.-V., Y.Y.C.-C., C.G.-L., P.S.-C. e C.J.B.; administração do projeto, C.D.-P. e L.C.-Z.; aquisição de financiamento, L.C.-Z.; redação — revisão e edição, C.D.-P., L.C.-Z., I.T.-V., Y.Y.C.-C., L.G.N., C.G.-L., P.S.-C., P.d.G. e C.J.B. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
   Declaração do Comitê de Revisão Institucional
   O protocolo do estudo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (código do protocolo CICUAL NAN-1992-20/21-1 e data de aprovação: 28 de maio de 2020).
   Declaração de Consentimento Informado
   Não aplicável.
   Declaração de Disponibilidade de Dados
   Não aplicável.
   Conflitos de Interesse
   Os autores declaram não haver conflito de interesses.
   Referências
   Benefícios Potenciais do Cardamomo para a Saúde
   Efeito de Alguns Níveis de Cardamomo, Cravo e Anis na Hepatotoxicidade em Ratos Causada por CCL4
   Os Efeitos do Extrato de Semente de Uva no Controle Glicêmico, Lipoproteínas Séricas, Inflamação e Peso Corporal: Uma Revisão Sistemática e Meta-Análise de Ensaios Clínicos Randomizados
   A Suplementação com Pó de Cardamomo Previne a Obesidade, Melhora a Intolerância à Glicose, a Inflamação e o Estresse Oxidativo no Fígado de Ratos Obesos Induzidos por Dieta Rica em Carboidratos e Gorduras
   Nanolipossomas do Extrato de Dióxido de Carbono Supercrítico de Sementes de Cardamomo Pequeno Tratam Diabetes Tipo 2 e Hipercolesterolemia
   Comparação da Eficácia do Cardamomo (Elettaria Cardamomum) com a Pioglitazona na Esteatose Hepática, Dislipidemia e Hiperglicemia Induzidas por Dexametasona em Ratos Albino
   Extrato de Elettaria Cardamomum Rico em Terpenoides Previne Alterações Semelhantes ao Alzheimer Induzidas em Ratos Diabéticos por meio da Inibição da Atividade da GSK3β, Estresse Oxidativo e Citocinas Pró-inflamatórias
   Atividades Moduladoras Intestinais, Redutoras da Pressão Arterial, Diuréticas e Sedativas do Cardamomo
   Efeitos Cardiovasculares Induzidos por α-Terpineol em Ratos Hipertensos
   Influência Anti-Hipercolesterolêmica da Especiaria Cardamomo (Elettaria cardamomum) em Ratos Experimentais
   Polifenóis: Métodos de Extração, Ação Antioxidante, Biodisponibilidade e Efeitos Anticarcinogênicos
   Estresse Oxidativo na Patologia Humana e no Envelhecimento: Mecanismos Moleculares e Perspectivas
   Efeitos Cardiovasculares dos Monoterpenos: Uma Revisão
   Efeito Neuroprotetor do Óleo de Cardamomo contra a Neurotoxicidade Induzida por Alumínio em Ratos
   Controle Hipotalâmico do Gasto Energético e da Termogênese
   Estimativa de Ácidos Fenólicos em Canela, Cravo, Cardamomo, Noz-Moscada e Macis por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
   Composição química do óleo volátil do pericarpo (casca) do cardamomo-grande (Amomum subulatum Roxb.)
   Mecanismo Molecular da Lipotoxicidade como um Aspecto Interessante no Desenvolvimento de Estados Patológicos — Visão Atual do Conhecimento
   Componentes das Dietas AIN-93 como Melhorias em Relação à Dieta AIN-76A
   Um Novo Calorímetro Indireto é Preciso e Confiável para Medir o Gasto Energético Basal, o Efeito Térmico dos Alimentos e a Oxidação de Substratos em Indivíduos Obesos e Saudáveis
   Flexibilidade Metabólica e seu Impacto nos Resultados de Saúde
   Lipólise: Mecanismos Celulares para a Mobilização de Lipídios a partir dos Depósitos de Gordura
   O Ácido Carnósico Preveniu os Distúrbios Metabólicos Induzidos pela Olanzapina por meio da Ativação da AMPK
   O Açafrão (Crocus sativus L.) Aumenta a Captação de Glicose e a Sensibilidade à Insulina em Células Musculares por meio de Mecanismos de Múltiplas Vias
   A Genisteína Estimula a Sensibilidade à Insulina através da Remodelação da Microbiota Intestinal e da Ativação da AMPK no Músculo Esquelético em Indivíduos Obesos
   Ação Hipotensora de Diterpenos de Ocorrência Natural: Uma Promessa Terapêutica para o Tratamento da Hipertensão
   Flexibilidade Metabólica como uma Adaptação aos Recursos e Requisitos Energéticos na Saúde e na Doença
   A perda de peso moderada é suficiente para afetar a homeostase dos hormônios tireoidianos e inibir sua conversão periférica
   Desiodase Tipo 3 na Hipóxia: Esfriar ou Matar?
   Indução do mRNA da UCP2 pelos Hormônios Tireoidianos no Coração de Ratos
   Expressão da Proteína Desacopladora-3 e Atividade Mitocondrial na Transição do Estado Hipotireoideo para o Hipertireoideo no Músculo Esquelético de Ratos
   A Proteína Desacopladora-3 é um Determinante Molecular para a Regulação da Taxa Metabólica de Repouso pelo Hormônio Tireoidiano
   O TRH Diminui a Ingestão de Alimentos e Aumenta a Ingestão de Água e a Temperatura Corporal em Ratos
   Supressão da Atividade Alimentar e de Ingestão de Líquidos em Ratos Após Injeção Intraventricular do Hormônio Liberador de Tireotrofina (TRH)
   O Hormônio α-Melanócito-Estimulante Está Contido em Terminais Nervosos que Inervam Neurônios Sintetizadores do Hormônio Liberador de Tireotropina no Núcleo Paraventricular Hipotalâmico e Previne a Supressão Induzida por Jejum do Gene E do Pró-Hormônio Liberador de Tireotropina
   O Efeito do Extrato de Elettaria Cardamomum no Comportamento do Tipo Ansiedade em um Modelo de Ratos com Transtorno de Estresse Pós-Traumático
   Glicocorticoides Aumentam a Expressão Gênica do Neuropeptídeo Y e do Peptídeo Relacionado ao Agouti via Sinalização da Proteína Quinase Ativada por Monofosfato de Adenosina no Núcleo Arqueado de Ratos
   Reversão por Quercetina do Efeito do Tipo Ansiedade e Depressão Induzido pelo Fator Liberador de Corticotrofina em Camundongos
   Quercetina: Investigação Adicional de Suas Propriedades Antinociceptivas e Mecanismos de Ação
   Inervação GABAérgica e Catecolaminérgica de Células β-Endorfina do Hipotálamo Mediobasal que Projetam para a Área Pré-Óptica Medial
   Desconstrução de um Circuito Neural para a Fome
   Mapeamento de Todo o Cérebro das Entradas Diretas e Projeções Axonais dos Neurônios POMC e AgRP
   Localização Celular da Imunorreatividade da Subunidade α do Receptor GABAA no Hipotálamo de Ratos: Relação com Neurônios Contendo Peptídeos Orexigênicos ou Anorexigênicos
   Regulação Transcricional Coordenada pela Interação do Hormônio Tireoidiano e Glicocorticoide em Células Neuronais Derivadas do Hipocampo de Camundongos Adultos
   Regulação da Expressão Gênica pelo Hormônio Tireoidiano em Células Cerebrocorticais Primárias: Papel dos Subtipos de Receptores de Hormônio Tireoidiano e Interações com Ácido Retinoico e Glicocorticoides
   Regulação Gênica Sinérgica pelo Hormônio Tireoidiano e Glicocorticoide no Hipocampo
   Estresse e Regulação do Receptor de Glicocorticoide na Expressão Gênica Mitocondrial
   Receptores de Glicocorticoide e Hormônio Tireoidiano em Mitocôndrias de Animais
   Efeito Supressor da Quercetina na Resposta do Eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal Induzida por Estresse Agudo em Ratos Wistar
   A Ingestão de Leite de Cabra Previne a Obesidade, a Esteatose Hepática e a Resistência à Insulina em Camundongos Alimentados com Dieta Rica em Gordura ao Reduzir Marcadores Inflamatórios e Aumentar o Gasto Energético e o Conteúdo Mitocondrial no Músculo Esquelético
   Concentrado de Aguamiel de Agave salmiana e Suas Saponinas Extraídas Atenuaram a Obesidade e a Esteatose Hepática e Aumentaram a Akkermansia muciniphila em Camundongos C57BL6
   Tradução de Dose de Estudos em Animais para Humanos Revisitada
   A Suplementação com DHA em Ratas Obesas durante a Gravidez e Lactação Modifica a Composição do Leite e o Comportamento de Ansiedade da Prole
   O Método de Lowry para Quantificação de Proteínas
   Método de Etapa Única de Isolamento de RNA por Extração com Tiocianato de Guanidínio Ácido-Fenol-Clorofórmio
   Perfis fenólicos e terpenoides de sementes de cardamomo: (A) Cromatogramas LC de um extrato metanólico de semente de cardamomo e atribuição de picos em azul dos compostos fenólicos identificados apresentados na Tabela 1; (B) Perfis GC-MS de compostos voláteis de sementes de cardamomo obtidos por destilação a vapor e atribuição de picos em vermelho dos compostos voláteis identificados apresentados na Tabela 2.
   Ganho de peso corporal, ingestão alimentar e composição corporal de camundongos alimentados com dieta controle ou dieta contendo 3%, 6% ou 12% de Elettaria cardamomum (EC). (A) peso corporal em gramas de 0 a 14 semanas (ANOVA de medidas repetidas unifatorial); (B) peso corporal final em gramas na semana 14; (C) ingestão alimentar média diária; (D) ingestão energética média diária em calorias; (E) porcentagem de massa gorda; e (F) massa magra de camundongos alimentados com dieta controle ou dieta contendo 3%, 6% ou 12% de cardamomo. Os dados são apresentados como média ± E.P.M., n = 8 camundongos por grupo. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05. Valores médios com letras minúsculas diferentes indicam diferenças estatísticas entre si.

Morfologia dos tecidos adiposos, análises histológicas e conteúdo proteico de UCP-1 e HSL em camundongos alimentados com dieta controle ou dieta contendo 3%, 6% ou 12% de Elettaria cardamomum (EC). (A) coloração com hematoxilina e eosina dos tecidos adiposos subcutâneo (TAS), visceral (TAV) e marrom (TAM); (B) tamanho médio dos adipócitos no TAS; (C) distribuição de frequência dos adipócitos no TAS; (D) tamanho médio dos adipócitos no TAV; (E) distribuição de frequência dos adipócitos no TAV; (F) distribuição de frequência das gotículas lipídicas no TAM; (G) distribuição de frequência das gotículas lipídicas no TAM; (H) imagens de WB do conteúdo de HSL total, HSL fosforilada e GAPDH no TAS, e UCP-1 e GAPDH no TAM; (I) razão da abundância proteica de HSL-fosforilada/HSL total; e (J) razão da abundância proteica de UCP1/GAPDH de camundongos alimentados com dieta controle ou dieta contendo 3%, 6% ou 12% de EC. Os dados são expressos como média ± E.P.M., n = 8 camundongos por grupo. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05. Valores médios com letras minúsculas diferentes indicam diferenças estatísticas entre si. Fotografias digitais foram tiradas de cada corte em 20×.

Atividade mitocondrial do músculo esquelético, conteúdo lipídico e densidade proteica de PGC1α e AMPK em camundongos alimentados com dieta controle ou dieta contendo 3%, 6% ou 12% de Elettaria cardamomum (EC). (A) fotomicrografias representativas da coloração para succinato desidrogenase (SDH) e oil red O (ORO) no músculo esquelético; (B) análise densitométrica da coloração para SDH; (C) análise densitométrica da coloração para ORO; (D) imagem representativa do imunoblot de PGC-1α e AMPK; (E) análise densitométrica da razão de abundância proteica AMPK/GAPDH; e (F) análise densitométrica da razão de abundância proteica PGC1α/GAPDH de camundongos alimentados com dieta controle ou dietas contendo 3%, 6% ou 12% de EC. Os resultados são apresentados como média ± E.P.M., n = 8 camundongos por grupo. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05. Valores médios com letras minúsculas diferentes indicam diferenças estatísticas entre si. Fotografias digitais foram tiradas de cada corte em 20×.
Morfologia hepática e atividade da SDH hepática de camundongos alimentados com dieta controle ou dieta contendo 3%, 6% ou 12% de Elettaria cardamomum (EC). (A) Fotomicrografias representativas foram obtidas de cada corte em 40× da coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e succinato desidrogenase (SDH) no fígado; (B) área média das gotículas lipídicas; e (C) densitometria da SDH como (%) de cortes hepáticos de camundongos alimentados com dieta controle ou dieta contendo 3%, 6% ou 12% de EC. Os resultados são apresentados como média ± E.P.M., n = 8 camundongos por grupo. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05. Valores médios com letras minúsculas diferentes indicam diferenças estatísticas entre si. Foram obtidas fotografias digitais de cada corte em 40×.
Gasto energético e oxidação de substratos de camundongos alimentados com dieta controle ou dieta contendo 3%, 6% ou 12% de Elettaria cardamomum (EC). (A) Consumo de oxigênio (VO2) durante os períodos de jejum e alimentação determinado por calorimetria indireta; zonas claras e sombreadas indicam períodos de jejum e alimentação, respectivamente. Consumo médio de oxigênio durante (B) jejum e (C) alimentação. (D) Quociente respiratório (RER) e RER médio durante os períodos de (E) jejum e (F) alimentação de camundongos alimentados com dieta controle ou dieta contendo 3%, 6% ou 12% de EC. Os dados são apresentados como média ± E.P.M., n = 8 camundongos por grupo. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05. Valores médios com letras minúsculas diferentes indicam diferenças estatísticas entre si.
Expressão gênica de peptídeos hipotalâmicos e concentração circulante de triiodotironina (T3) e corticosterona de camundongos alimentados com dieta controle ou dieta contendo 3%, 6% ou 12% de Elettaria cardamomum (EC). (A) Conteúdo de mRNA do NPY no ARC e (B) conteúdo de mRNA da POMC no ARC, (C) expressão de mRNA do TRH no PVN, (D) níveis circulantes de T3, (E) peso das glândulas adrenais e (F) conteúdo circulante de corticosterona em camundongos alimentados com dieta controle ou dieta contendo diferentes concentrações de EC (3%, 6% ou 12%) por 14 semanas. Os resultados são apresentados como média ± E.P.M., n = 4–8 camundongos por grupo. Valores médios com letras minúsculas diferentes indicam diferenças estatísticas entre si. A ANOVA de uma via mostrou um efeito significativo da dieta: (B) F(3,15) = 5,218, p < 0,05, (C) F(3,26) = 4,398, p < 0,05 e (E) F(3,22) = 6,335, p < 0,01.
Cenário 1: Efeitos centrais e periféricos paralelos da ingestão de cardamomo regulando o metabolismo energético. Os diferentes compostos presentes nas sementes de cardamomo exerceram efeitos centrais e periféricos modulando o balanço energético em camundongos. Os efeitos centrais incluem a modulação da expressão de NPY e POMC, os peptídeos hipotalâmicos que controlam a ingestão alimentar e o gasto energético, provavelmente pela ativação do receptor GABAA. A atividade dos neurônios TRH e CRH no núcleo paraventricular (PVN) também é modulada por receptores GABAA. Esses neurônios regulam os níveis circulantes de triiodotironina (T3) e corticosterona. As atividades metabólicas do T3 nos tecidos periféricos incluem a ativação da termogênese mediada pela proteína desacopladora 1 (UCP-1) no tecido adiposo marrom. As sementes de cardamomo também exerceram efeitos periféricos no tecido adiposo, músculo esquelético e fígado, em parte pelo aumento da proteína quinase ativada por AMP (AMPK). A sinalização da AMPK no tecido adiposo aumentou a lipólise pela ativação da lipase sensível a hormônios (HSL). No músculo esquelético e no fígado, a AMPK aumenta a capacidade oxidativa ao aumentar a biogênese e a atividade mitocondrial. Por outro lado, a sinalização crônica de corticosterona prejudica a biogênese e a função mitocondrial. Assim, a redução na corticosterona circulante pelo consumo de cardamomo favorece o metabolismo oxidativo nos tecidos metabólicos, reduzindo a gordura corporal ao aumentar a lipólise e o gasto energético total por meio do aumento da atividade mitocondrial no músculo esquelético e no fígado. Seta para cima = regulação positiva, seta para baixo = regulação negativa.
Cenário 2: Modulação dos eixos tireoidiano e adrenal pela ingestão de cardamomo, gerando um “ambiente hormonal ajustado” com efeitos periféricos regulando o metabolismo energético. O consumo de sementes de cardamomo modula a expressão de NPY e POMC, os peptídeos hipotalâmicos que controlam a ingestão alimentar e o gasto energético, provavelmente pela ativação do receptor GABAA no núcleo arqueado (ARC). Além disso, a ativação do receptor GABAA no núcleo paraventricular (PVN) influencia os neurônios de TRH e CRH, que regulam a síntese e secreção de triiodotironina (T3) e corticosterona. As atividades metabólicas do T3 nos tecidos periféricos incluem a estimulação da lipólise no tecido adiposo através da ativação da lipase sensível a hormônios (HSL), a ativação da termogênese mediada pela proteína de desacoplamento 1 (UCP-1) no tecido adiposo marrom e a estimulação da capacidade oxidativa no fígado e no músculo esquelético, aumentando a biogênese e atividade mitocondrial, em parte pelo aumento da proteína quinase ativada por AMP (AMPK). Por outro lado, a corticosterona regula negativamente algumas vias metabólicas que são ativadas pelo T3. Assim, a modulação da atividade do PVN mediada pela ingestão de cardamomo poderia reduzir a secreção de T3, mas também a síntese de corticosterona, aumentando algumas das ações metabólicas mediadas pela tireoide nos tecidos periféricos. A regulação dos eixos hipotálamo-hipófise-tireoide (HPT) e hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) pela ingestão de cardamomo gera um “ambiente hormonal ajustado”, reduzindo a gordura corporal pelo aumento da lipólise e aumentando o consumo de oxigênio e o gasto energético através da atividade mitocondrial aumentada no músculo esquelético e no fígado. Seta para cima = regulação positiva, seta para baixo = regulação negativa.
Identificação de compostos fenólicos de um extrato metanólico de sementes de cardamomo por análise de CLAE-EM (picos da Figura 1A).
Nº do Pico RT M-H Fragmentos de EM * Nome do Composto e Fórmula Molecular EC Sementes (mg/100 g) 1 10,70–10,78 153 109 ácido protocatecuico; ácido 3,4-di-hidroxibenzoico; (HO)2C6H3CO2H 29,69 2 14,00–14,33 153 109, 103 ácido gentísico; ácido 2,5-di-hidroxibenzoico; C7H6O4 1,98 3 18,20–18,21 179 161, 135 ácido cafeico; ácido 3,4-di-hidroxibenzenoacrílico; (HO)2C6H3CH=CHCO2H 26,23 4 18,25–18,35 197 191, 173 ácido siríngico; ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzoico; HOC6H2(OCH3)2CO2H 36,43 5 19,16–19,22 193 179 ácido ferúlico; ácido 4-hidroxi-3-metoxicinâmico; C10H10O4 6,68 6 19,78–18,02 167 135, 121 ácido vanílico; ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico; HOC6H3(OCH3)CO2H 4,28 7 20,8–21,19 353 190, 179 ácido 5-O-cafeoilquínico 14,6 8 22,6–22,8 163 143, 135, 121 ácido p-cumárico; ácido trans-4-hidroxicinâmico; HOC6H4CH=CHCO2H 0,44 9 23,08–24,8 397 191, 173 ácido sinapoíquínico 1,46 10 25,31–27,31 367 173, 161 ácido feruloíquínico; ácido 3-O-feruloíquínico; C17H20O9 0,054 11 31,3–31,34 609 447, 301 rutina; rutosídeo; C27H30O16 2,69

• Nota: Números em negrito indicam os picos base nos espectros de EMn. EC, Elettaria cardamomum.
  Identificação dos compostos presentes nas sementes de cardamomo por análise de GC-MS (picos da Figura 1B).
  Nº do Pico Nome do Composto e Fórmula Molecular Massa Tempo de Retenção Sementes de EC (% Área) 1 terpineolcis-α-terpineol; C10H18O 154 27,17 7,99 2 beta-terpineol; cis-β-terpineol; C10H18O 154 27,57 1,43 3 linalol; 3,7-dimetilocta-1,6-dien-3-ol; C10H18O 154 33,66 0,84 4 terpinen-4-ol; (1R)-4-metil-1-propan-2-ilciclohex-3-en-1-ol; C10H18O 154 34,94 0,23 5 α-terpineol; alfa-terpineol; C10H18O 154 36,22 0,92 6 geraniol; lemanol; C10H18O 154 37,57 1,05 7 trans-nerolidol; (6E)-3,7,11-trimetildodeca-1,6,10-trien-3-ol; C15H16O 222 38,15 0,47 8 α-acorenol; acorenol; C15H26O 222 39,39 0,52 9 cubebol; (1R,4S,5R,6R,7S,10R)-4,10-dimetil-7-propan-2-il-triciclo[4.4.0.01,5]decan-4-ol; C15H26O 222 39,78 0,26 10 isospatulenol; 1aR,7S,7aS,7bR)-1,1,4,7-tetrametil-2,3,5,6,7a,7b-hexahidro-1aH-ciclopropa[h]azulen-7-ol; C15H24O 220 41,64 0,26 11 globulol; (1aR,4R,4aR,7R,7aS,7bS)-1,1,4,7-tetrametil-2,3,4a,5,6,7,7a,7b-octahidro-1aH-ciclopropa[e]azulen-4-ol; C15H26O 222 42,24 0,75 12 trans-farnesol; (2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trien-1-ol; C15H26O 222 43,91 0,62 13 ambrial; 2-(5,5,8a-trimetil-2-metilideno-3,4,4a,6,7,8-hexahidro-1H-naftalen-1-il)acetaldeído; C16H26O 234 50,49 5,3 14 eicosano; icosano; C20H42 282 51,21 0,22 15 costunolídeo; (3aS,6E,10E,11aR)-6,10-dimetil-3-metilideno-3a,4,5,8,9,11a-hexahidrociclodeca[b]furan-2-ona; C15H20O2 232 54,43 68,11 16 coronarina; 4-[2-[(1S,4aS,8aS)-5,5,8a-trimetil-2-metilideno-3,4,4a,6,7,8-hexahidro-1H-naftalen-1-il]etil]-2-metoxi-2H-furan-5-ona; C21H23O3 300 54,85 1,12 17 β-mono palmitina 330 50,59 0,23 18 β-mono estearina 358 56,65 0,39 19 erucilamida; (Z)-docos-13-enamida; C22H43NO 337 62,71 0,41 20 β-sitosterol; 17-(5-Etil-6-metil-heptan-2-il)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodeca-hidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ol; C29H50O 414 64,17 0,84
  EC, Elettaria cardamomum.
  Composição das dietas experimentais.
  Semente de Elettaria cardamomum % Controle 3% 6% 12% Proteínas 20,30 20,40 20,60 20,90 Carboidratos 63,70 63,50 63,20 62,70 Gordura 16,0 16,10 16,20 16,40 Ingredientes (g/kg): Caseína a 200 196,10 192,20 184,40 Sacarose 100 100 100 100 Maltodextrina 132 132 132 132 Amido de milho 397,50 377,58 357,66 317,82 Óleo de soja 70 67,42 64,84 59,68 Cellulose 50 46,40 42,80 35,60 Mistura de vitaminas b 10 10 10 10 Mistura de minerais c 35 35 35 35 L-Cisteína d 3 3 3 3 Colina d 2,50 2,5 2,5 2,5 Sementes de EC 30 60 120 Total 1000 1000 1000 1000

a Teste “livre de vitaminas”, Envigo, Teklad diets, Madison, WI, EUA. b AIN-93, Envigo. c AIN-93G, Envigo. d Sigma-Aldrich, Burlington, MA, EUA. EC, Elettaria cardamomum.