pmid: "32121131"
title: "Efeitos do canabidiol no metabolismo de fosfolipídeos em queratinócitos de pacientes com psoríase vulgar"
authors: "Jarocka-Karpowicz I, Biernacki M, Wroński A, Gęgotek A, Skrzydlewska E"
journal: "Biomolecules"
pubdate: "2020 Feb 28"
doi: "10.3390/biom10030367"
source: "PMC Full Text"

Efeitos do canabidiol no metabolismo de fosfolipídeos em queratinócitos de pacientes com psoríase vulgar

Autores

Jarocka-Karpowicz I, Biernacki M, Wroński A, Gęgotek A, Skrzydlewska E

Periodico

Biomolecules (2020 Feb 28)

Conteudo

Efeitos do Canabidiol no Metabolismo de Fosfolipídios em Queratinócitos de Pacientes com Psoríase Vulgar

A psoríase é uma doença inflamatória crônica da pele caracterizada pela diferenciação desregulada dos queratinócitos, mas o estresse oxidativo também desempenha um papel importante na patogênese dessa doença. Aqui, examinamos o efeito do canabidiol (CBD), um fitocanabinoide com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, no equilíbrio redox e no metabolismo de fosfolipídios em queratinócitos irradiados com UVA/UVB isolados da pele de pacientes psoriáticos ou voluntários saudáveis. O CBD se acumula principalmente nos queratinócitos da membrana, especialmente em pacientes com psoríase. Este fitocanabinoide reduz o desequilíbrio redox observado nos queratinócitos irradiados por UV de indivíduos saudáveis. Ele faz isso diminuindo a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), aumentando a eficiência do sistema dependente de Trx e aumentando os níveis de vitaminas A e E. Consequentemente, também foi observada uma redução nos produtos de peroxidação lipídica, como 8-isoprostanos e 4-hidroxinonenal. Além disso, o CBD modifica o equilíbrio redox e a peroxidação lipídica nos queratinócitos de pacientes psoriáticos após irradiação UV. Curiosamente, essas mudanças ocorrem em grande parte na direção oposta ao caso dos queratinócitos de indivíduos saudáveis. O CBD também regula as alterações metabólicas modulando o sistema endocanabinoide, que é perturbado pelo desenvolvimento da psoríase e pela irradiação UV. Observamos uma diminuição no nível de anandamida nos queratinócitos irradiados por UV de controles saudáveis após o tratamento com CBD, enquanto nos queratinócitos de pacientes tratados com CBD, o nível de anandamida aumentou. No entanto, o nível de palmitoiletanolamida (PEA) diminuiu em ambos os grupos tratados com CBD. Demonstramos ainda que o CBD aumenta a expressão do receptor CB1, principalmente nos queratinócitos dos pacientes, e aumenta a expressão do receptor CB2 em ambos os grupos psoriático e controle. No entanto, o CBD diminui a expressão do receptor CB2 em queratinócitos irradiados por UV de pacientes. A atividade de transportadores transmembrana (resistência a múltiplas drogas (MDR) e proteína de resistência ao câncer de mama (BCRP)) induzida por UV e psoríase é normalizada após o tratamento com CBD. Concluímos que o CBD reduz parcialmente o estresse oxidativo nos queratinócitos de indivíduos saudáveis, enquanto mostra uma tendência a aumentar o estado oxidativo e inflamatório nos queratinócitos de pacientes com psoríase, especialmente após irradiação UV.

1. Introdução
   Psoríase é uma doença inflamatória crônica da pele. Sua patogênese envolve hiperceratose da epiderme, caracterizada por infiltrados inflamatórios cutâneos, hipertrofia epidérmica e proliferação, diferenciação e descamação desreguladas dos queratinócitos. Acredita-se que a patogênese da psoríase seja resultado de uma imunidade comprometida, possuindo um componente genético ligado a genes imunes e suas vias codificadas. Nos últimos anos, a desregulação desses genes, incluindo TNF-α e IL-23, demonstrou participar do desenvolvimento da psoríase.

O sistema endocanabinoide — composto por endocanabinoides, as enzimas responsáveis por sua degradação e os receptores canabinoides CB1 e CB2 — é amplamente expresso em células epidérmicas e desempenha um papel vital na resposta imune. O endocanabinoide mais conhecido é a anandamida (AEA), que reduz os níveis de várias quimiocinas (incluindo TNF-α e IL-23) em linhagens celulares de queratinócitos (HaCaT e NHEK), bem como de IL-17 em co-culturas de linfócitos (Th1 e Th17) e queratinócitos. Importante, esses efeitos foram prevenidos por um antagonista do receptor CB1. Os receptores canabinoides demonstraram modular a expressão de citocinas pró-inflamatórias; a ativação dos receptores CB1 aumenta o nível de citocinas pró-inflamatórias, enquanto a ativação dos receptores CB2 promove sua redução e a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Assim, os endocanabinoides podem modificar simultaneamente a inflamação e o estresse oxidativo. Além disso, o estresse oxidativo resultante da superprodução de ERO e da capacidade antioxidante reduzida modifica as vias de sinalização celular, incluindo a sinalização pró-inflamatória que contribui para o desenvolvimento da psoríase. No entanto, a AEA também reduz a diferenciação de queratinócitos ao modificar a ativação dos receptores CB1, o que por sua vez aumenta a atividade da enzima degradadora de AEA — a hidrolase de amida de ácido graxo (FAAH) — e, assim, reduz o nível de AEA. Outro endocanabinoide — a palmitoiletanolamida (PEA) — demonstrou ser um fator anti-inflamatório que pode aumentar o nível de AEA. No entanto, a PEA também atua como ativadora dos canais de cátions de potencial receptor transitório (TRPVs) e dos receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (PPARs).
A modulação farmacológica do sistema endocanabinoide é uma abordagem moderna para regular a inflamação, o equilíbrio redox e as funções epidérmicas. Sabe-se que os canabinoides exógenos—por meio de alterações na expressão dos receptores canabinoides—podem regular a inflamação através de vários mecanismos, incluindo a redução de citocinas pró-inflamatórias e EROs. Os canabinoides exógenos também influenciam a proliferação e diferenciação de queratinócitos. Também foi demonstrado que o receptor ativado por proliferadores de peroxissomo γ (PPARγ), que é ativado por canabinoides, é expresso nos queratinócitos de pacientes com psoríase. A administração tópica de agonistas de PPARγ reduz a hiperplasia epidérmica em experimentos em camundongos e humanos. Portanto, acredita-se que o efeito de crescimento e diferenciação dos canabinoides sobre os queratinócitos humanos inclua mecanismos dependentes de receptores canabinoides, bem como TRPV1 e PPAR, através de sua capacidade de reduzir a inflamação e o estresse oxidativo.

Um dos principais fitocanabinoides encontrados na Cannabis sativa L. é o canabidiol (CBD), que não apresenta psicoatividade, mas possui um amplo espectro de atividade biológica, incluindo efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e neuroprotetores. O CBD pode regular o estado redox celular tanto direta quanto indiretamente. A ação direta leva a uma diminuição da capacidade oxidativa das células, o que está associado à prevenção da geração de EROs. Além disso, o CBD causa um aumento no nível de mRNA, bem como no nível/atividade de proteínas antioxidantes, incluindo as isoenzimas superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GSH-Px) em vários distúrbios metabólicos. O CBD também pode afetar indiretamente o equilíbrio redox ao alterar a ativação dos receptores canabinoides; o CBD pode ativar/antagonizar/inibir receptores metabotrópicos de forma dependente da concentração. Consequentemente, o CBD previne o estresse oxidativo e as modificações oxidativas dos componentes celulares (DNA, lipídios e proteínas), uma característica que pode levar ao desenvolvimento de várias doenças.

Apesar das evidências de que o estresse oxidativo está associado à psoríase, muitos dos procedimentos utilizados para tratar a psoríase aumentam o estresse oxidativo. Por exemplo, no tratamento com psoraleno e UVA, há produção em massa de oxigênio singlete na pele. Sabe-se que a radiação solar que intensifica o estresse oxidativo melhora as condições clínicas de pacientes com psoríase. Acredita-se também que a fototerapia com UVB, frequentemente usada no tratamento da psoríase, causa exacerbação local do desequilíbrio oxidativo, mas pode ter um efeito anti-inflamatório benéfico na pele. Isso pode ser devido à ativação de vias antiproliferativas e pró-apoptóticas tanto em populações celulares residentes quanto infiltrativas.
Portanto, há importância clínica na compreensão da resposta dos queratinócitos epidérmicos ao CBD, que poderia representar uma nova terapia para a psoríase. Isso se aplica principalmente ao potencial aumento do estresse oxidativo e, consequentemente, aos distúrbios metabólicos dos fosfolipídios de membrana. Tais distúrbios podem ser acompanhados por alterações na ativação de receptores de membrana que controlam o metabolismo lipídico, proliferação, diferenciação e apoptose das células epidérmicas, incluindo queratinócitos. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do CBD no sistema redox e no metabolismo de fosfolipídios induzido pela radiação UV em queratinócitos cultivados isolados da pele de pacientes com psoríase em comparação com controles saudáveis.

2. Materiais e Métodos

Amostras de tecido cutâneo foram coletadas de 30 pacientes não tratados com diagnóstico de psoríase vulgar e 15 voluntários saudáveis. A população do estudo incluiu 11 homens e 19 mulheres com faixa etária de 27 a 54 anos (idade média de 40 anos) e 6 homens saudáveis e 9 mulheres saudáveis com faixa etária de 28 a 52 anos (idade média de 39 anos) formando o grupo controle. Os pacientes elegíveis foram diagnosticados com psoríase em placas, com pelo menos 10% da superfície corporal total afetada por no mínimo seis meses. A gravidade da psoríase foi avaliada usando o Índice de Área e Gravidade da Psoríase (PASI) (variação de 10 a 25; mediana de 17). Nenhum dos pacientes ou indivíduos saudáveis recebeu medicações tópicas, orais ou injetáveis nas 4 semanas anteriores ao estudo. Pacientes com histórico indicando a presença de outros distúrbios foram excluídos do estudo. Nenhum dos participantes do estudo era fumante ou consumidor excessivo de álcool. O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque, e o protocolo foi aprovado pelo Comitê Local de Bioética da Universidade Médica de Bialystok (Polônia), nº R-I-002/289/2017. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes.

Fragmentos de pele imediatamente após a biópsia foram enviados para exame histopatológico (coloração com hematoxilina-eosina). O restante da amostra foi lavado em PBS com 50 U/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina e foi incubado durante a noite em dispase (1 mg/mL) a 4 °C para separar a epiderme da derme. Após a incubação, a epiderme foi digerida por 20 min a 37 °C usando tripsina/EDTA. Os queratinócitos separados foram lavados e ressuspensos em meio de cultura celular.

2.1. Cultura de Células e Tratamento
Os queratinócitos obtidos foram cultivados em um Kit de Crescimento de Queratinócitos (Gibco, Grand Island, NY, EUA) contendo Meio Livre de Soro para Queratinócitos suplementado com 10% de soro fetal bovino, 5 µg/L de fator de crescimento epidérmico EGF 1–53, 50 U/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina. As células foram cultivadas em condições padrão (atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37 °C) até a 4ª passagem. Quando os queratinócitos atingiram 80% de confluência, foram lavados com PBS (37 °C) e expostos à radiação UV em PBS (4 °C) para evitar estresse térmico e oxidação dos componentes do meio. A viabilidade celular de 70% medida pelo ensaio de MTT foi um indicador para a seleção das doses. As células foram irradiadas no gelo a uma distância de 15 cm de um conjunto de 6 lâmpadas (Bio-Link Crosslinker BLX 365/312; Vilber Lourmat, Alemanha) de 6 W cada, correspondendo a 4,2 mW/cm2 e 4,08 mW/cm2, para UVA (365 nm) e UVB (312 nm), respectivamente. As doses totais de radiação foram as seguintes: UVA-30 J/cm2 e UVB-60 mJ/cm2.
O efeito do CBD sobre os queratinócitos foi examinado da seguinte forma: todos os grupos celulares (células controle, queratinócitos após irradiação UVA e células após irradiação UVB) foram cultivados por 24 h em um meio suplementado com 4 µM de CBD (dissolvido em etanol com uma concentração final de 0,1%). Essa concentração de CBD não alterou a morfologia ou proliferação dos queratinócitos, nem afetou a viabilidade celular medida pelo ensaio de MTT (dados não mostrados). As células controle foram cultivadas em paralelo sem tratamento. Após a incubação, todas as células foram lavadas com PBS, coletadas por raspagem em PBS frio e centrifugadas. As células foram então ressuspensas em PBS e sonicadas. O ensaio de Bradford foi utilizado para a medição do conteúdo total de proteínas.
2.2. Métodos
2.2.1. Análise da Oxidação
A atividade da NADPH oxidase (NOX-EC 1.6.3.1) foi medida pelo método luminescente com lucigenina como luminóforo. A quantidade de enzima necessária para liberar 1 nmol de O2- por minuto foi descrita como uma unidade de atividade de NOX, e é apresentada em unidades relativas de luminescência (RLU) por miligrama de proteína.
A atividade da xantina oxidase (XO-EC1.17.3.2) foi medida de acordo com o método publicado por Prajda e Weber. As alterações na absorbância a 290 nm foram medidas para a detecção da formação de ácido úrico a partir do substrato xantina. Uma unidade de XO foi definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 μM de ácido úrico por minuto. A atividade específica da enzima é descrita em microunidades por miligrama de proteína.
A geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) foi detectada usando a interação seletiva das sondas de spin, CMH (1-hidroxi-3-metóxi-carbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina, 200 µM), com ROS. Os complexos resultantes foram medidos por um espectrômetro de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) e-scan (Noxygen GmbH/Bruker Biospin GmbH, Alemanha). A geração de ROS é expressa em micromoles por minuto por miligrama de proteína.
2.2.2. Análise de Antioxidantes
Atividade da glutationa peroxidase (GSH-Px-EC.1.11.1.6) foi medida espectrofotometricamente utilizando o método descrito por Paglia e Valentine. A oxidação de 1 µmol de NADPH min⁻¹ a 25 °C e pH 7,4 foi definida como uma unidade de atividade de GSH-Px e normalizada por concentração de proteína em cada amostra. A glutationa (GSH) foi quantificada por eletroforese capilar (CE) com detecção UV a 200 nm. A concentração de GSH foi determinada a partir da curva de calibração na faixa: 1–120 nmol/L (r² = 0,9985) e o nível de GSH é expresso como nanomoles por miligrama de proteína.
A atividade da tiorredoxina redutase (TrxR-EC.1.8.1.9) foi avaliada com base na redução mediada por NADPH do ácido 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) a ácido 5-tio-2-nitrobenzoico (TNB) amarelo. As medições foram feitas utilizando reagentes do kit comercialmente disponível (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA; CN CS0170). Uma unidade de TrxR foi definida como a quantidade da enzima que causou um aumento na A412 de 1,0 por minuto por mL a 25 °C e pH 7,0. A atividade específica da enzima é expressa em unidades normalizadas por miligrama de proteína.
O nível de tiorredoxina (Trx) foi quantificado utilizando o método ELISA. Padrões e lisados celulares foram carregados em poços de placa de ELISA (Nunc Immuno Maxisorp, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) e incubados durante a noite a 4 °C com um anticorpo primário anti-tiorredoxina (Abcam, Cambridge, MA, EUA). Após lavagem, as placas foram incubadas à temperatura ambiente (TA) por 30 min com uma solução de bloqueio de peroxidase (3% H₂O₂, 3% leite em pó desnatado em PBS). Em seguida, como anticorpo secundário, anticorpo secundário de cabra anti-coelho (Dako, Carpinteria, CA, EUA) foi adicionado por 1 h à TA. Depois, por 40 min, solução de substrato cromogênico (0,1 mg mL⁻¹ TMB, 0,012% H₂O₂) foi adicionada a cada poço. A reação foi interrompida por ácido sulfúrico. A absorção foi lida a 450 nm com o filtro de referência ajustado a 620 nm. O nível de tiorredoxina é expresso em microgramas por miligrama de proteína.
A atividade da catalase (CAT-EC.1.11.1.9) foi avaliada espectrofotometricamente (a 240 nm) medindo a taxa de decomposição do peróxido de hidrogênio, utilizando um método previamente publicado. A quantidade da enzima que catalisa a decomposição de 1 µmol de peróxido de hidrogênio em água e oxigênio dentro de 1 min foi descrita como uma unidade de atividade de CAT. A atividade específica da enzima é expressa em unidades por miligrama de proteína.
Os níveis de vitamina A e E foram detectados utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). As vitaminas foram extraídas dos lisados celulares usando hexano, que foi seco e diluído em etanol. Um total de 50 µL da mistura foi injetado na coluna RP-18. A taxa de fluxo foi de 1 mL/min de metanol e água (95:5). Detecção UV a 294 nm foi aplicada. A concentração das vitaminas foi determinada usando uma faixa da curva de calibração: 0,125–1 mg/L para vitamina A (r² = 0,9998) e 5–25 mg/L para vitamina E (r² = 0,9999). Os níveis das vitaminas são expressos como microgramas por miligrama de proteína.
2.2.3. Análise dos Produtos de Peroxidação Lipídica
A peroxidação lipídica foi estimada medindo o nível de 8-isoprostanos e 4-hidroxinonenal (4-HNE). O nível total de 8-isoprostanos (8-isoPGF2α) foi determinado, após extração em fase sólida, com base no método de Coolen et al., utilizando cromatografia líquida de ultraeficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem (LCMS 8060, Shimadzu, Kioto, Japão). Uma coluna Zorbax Eclipse Plus C18 (2.1 mm × 100 mm, 1.8-micron) foi empregada. A separação por gradiente foi realizada, começando com um solvente composto por 60% H2O (pH 3.85) e 40% acetonitrila (ACN) por 4 min. Em 1 min, um gradiente foi executado até 100% ACN, que permaneceu até 8 min. De 8 a 9 min, um gradiente foi usado para retornar à composição original do eluente e o sistema foi equilibrado até 15 min. Devido à presença de um grupo carboxílico, a ionização por electrospray (ESI) operando em modo de íons negativos com monitoramento de reações múltiplas (MRM) forneceu a melhor sensibilidade. Para a análise MRM, as transições de massa m/z 353.2 → 193.1 para 8-isoPGF2α e 357.2 → 197.1 para 8-isoPGF2α-d4 foram selecionadas. O nível de 8-isoPGF2α é expresso em picogramas por miligrama de proteína.
Os níveis de 4-HNE foram medidos como derivados O-PFB-oxima-TMS usando modificações menores do método de Tsikas et al. A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GCMS) foi utilizada no modo de monitoramento de íons selecionados (SIM). A cada amostra, foram adicionados 50 pmol de 4-HNE-d3 como padrão interno. O aldeído foi derivatizado pela adição de cloridrato de O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzil) hidroxilamina (PFBHA·HCl) (5 mg/mL em tampão PIPES) e N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida em 1% trimetilclorosilano (BSTFA:TMCS; 99:1) para formar éteres TMS. O aldeído derivatizado foi analisado usando um GC-7000 MS/MS quadrupolo 7890A (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA) equipado com uma coluna capilar HP-5ms (0.25 mm d.i., 30 m de comprimento). A temperatura da coluna, inicialmente ajustada a 50 °C por 1 min, foi aumentada da seguinte forma: 10 °C/min até 200 °C, 3 °C/min até 220 °C, 20 °C/min até 310 °C, e mantida a 310 °C por 5 min. A temperatura do injetor foi mantida a 250 °C, a linha de transferência a 280 °C, e a temperatura da fonte foi ajustada a 230 °C. Os aldeídos derivatizados foram detectados usando o modo de monitoramento de íon único (SIM). O íon usado para identificação do 4-HNE foi o seguinte: m/z 242 para 4-HNE-PFB-TMS, e m/z 245,0 para o derivado do padrão interno (4-HNE-d3-PFB-TMS). O nível de 4-HNE é expresso em nanomoles por miligrama de proteína.
2.2.4. Medição dos Níveis de Adutos 4-HNE-proteína
O nível de adutos 4-HNE-proteína foi medido usando o método ELISA descrito acima (medição do nível de tiorredoxina), utilizando um anticorpo anti-4-HNE-His (anticorpo monoclonal murino genuíno anti-4-HNE-His, clone 4-HNE 1g4) e anticorpo de cabra anti-camundongo (Dako, Carpinteria, CA, EUA). Os resultados são apresentados como porcentagem da expressão determinada em células controle.
2.2.5. Análise dos Níveis de Canabinoides
O nível dos endocanabinoides: araquidonoiletanolamina (anandamida, AEA), 2-araquidonoilglicerol (2-AG) e palmitoiletanolamida (PEA) foi medido usando cromatografia líquida de ultra-performance acoplada à espectrometria de massas em tandem (LCMS 8060, Shimadzu, Kyoto, Japão). Uma coluna Poroshell 120 EC-C18 (3,0 mm × 150 mm, 2,7 mícrons) foi empregada. As condições cromatográficas iniciais foram 70% de ACN em água contendo 0,1% (v/v) de ácido fórmico como agente ionizante. Após desenvolvimento isocrático por 1 min, um gradiente foi aplicado até 80% de ACN do min 1 ao 5, seguido por um segundo gradiente até 88% de ACN do min 5 ao 15; então, 100% de ACN foi alcançado após 0,5 min. Essas condições foram mantidas constantes até o final da etapa cromatográfica, que termina no min 25. Os endocanabinoides foram extraídos usando extração em fase sólida (SPE) e analisados no modo de íons positivos (MRM). AEA-d8, 2-AG-d8 e OEA-d4 foram usados como padrões internos para quantificação. A transição do precursor para o íon produto foi a seguinte: m/z 348,3 → 62,15 para AEA, m/z 379,3 → 287,25 para 2-AG e 300,3 → 62,00 para PEA. Os níveis de endocanabinoides são expressos em fmoles normalizados por miligrama de proteína.
O nível de CBD no citosol e na membrana celular foi determinado usando LCMS de ultra-performance (LCMS 8060, Shimadzu, Kyoto, Japão). Os lisados celulares obtidos por sonificação foram centrifugados (15.000 × g por 10 min, 4 °C) e o sobrenadante contendo a fração citosólica foi separado da fração de membranas. O CBD das amostras foi extraído usando SPE, separado na coluna Poroshell 120 EC-C18 (3,0 mm × 150 mm, 2,7 mícrons) conforme descrito acima, e analisado no modo de íons positivos (MRM). CBD-d9 foi usado como padrão interno para quantificação. A transição do precursor para o íon produto foi a seguinte: 315,1 → 193,00 para CBD. O nível de CBD foi expresso em microgramas por miligrama de proteína.
2.2.6. Medindo a Atividade das Enzimas Degradadoras de Endocanabinoides
A atividade das enzimas envolvidas no metabolismo de fosfolipídios—hidrolase de amida de ácido graxo (FAAH-EC-3.5.1.99) e lipase de monoacilglicerol (MAGL-EC 3.1.1.23)—foi examinada da seguinte forma: a atividade da FAAH foi avaliada por medição espectrofotométrica do nível de m-nitroanilina (m-NA) liberada do decanol de m-nitroanilina (a 410 nm), enquanto a da MAGL foi avaliada por medição espectrofotométrica (a 412 nm) da formação de ácido 5’-tio-2-nitrobenzoico durante uma reação de 1 min. A atividade enzimática é expressa em nanomoles de m-NA por minuto por miligrama de proteína.
2.2.7. Medindo a Expressão de Proteínas
Uma análise de Western Blot da proteína celular foi realizada de acordo com Eissa e Seada. Lisados celulares totais ou frações de membrana (de 6 indivíduos selecionados aleatoriamente entre saudáveis e psoriáticos) foram misturados com um tampão Laemmle contendo 5% de 2-mercaptoetanol, aquecidos a 95 °C por 10 min e separados por SDS-PAGE 10% Tris-Glicina. As proteínas separadas foram transferidas dos géis para uma membrana de nitrocelulose, que foi bloqueada por 1 h com 5% de leite desnatado. Anticorpos monoclonais primários (hospedeiro: coelho) contra CB1/2, TRPV1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), bem como anticorpos secundários anti-coelho marcados com fosfatase alcalina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foram usados a uma concentração de 1:1000. As bandas de proteínas foram visualizadas usando um sistema de substrato líquido BCIP/NBT disponível comercialmente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e quantificadas usando o Sistema Versa Doc e o software Quantity One (Bio-Rad Laboratories Inc., CA, EUA). O nível de proteínas é expresso como a porcentagem do valor determinado a partir das células controle.
2.2.8. Atividade do Transportador de Membrana
A atividade dos transportadores ABC foi determinada usando um ensaio de Resistência a Múltiplas Drogas (MDR) de acordo com os protocolos do fabricante (kits de ensaio de resistência a múltiplas drogas eFluxx-ID, Enzo LifeSciences, Reino Unido). Todas as amostras foram misturadas com inibidores específicos para transportadores (inibidor de MDR1—Verapamil, inibidor de MRP—MK-571, inibidor de BCRP—Novobiocina em DMSO) e sem inibidores como controle (contendo PBS e DMSO). As amostras foram então incubadas por 5 min a 37 °C no escuro em placas de 96 poços. Em seguida, um reagente de detecção verde EFLUXX-ID® foi adicionado aos poços. A luminescência foi medida na excitação λ = 485 nm e emissão λ = 535 nm no Leitor Multilabel En Spire 2300 (Perkin Elmer). A atividade das enzimas é expressa como uma porcentagem do valor determinado a partir das células controle.
2.3. Análise Estatística
Os resultados obtidos no presente estudo foram expressos como média ± desvio padrão (DP) para n = 30 (pacientes psoriáticos) e n = 15 (voluntários saudáveis). Os dados foram analisados usando análises estatísticas padrão, incluindo análise de variância unidirecional (ANOVA) com o teste de Tukey para comparações múltiplas, a fim de determinar diferenças significativas entre os diferentes grupos. Valores de p menores que 0,05 foram considerados significativos.
3. Resultados
3.1. Efeito do CBD no Desequilíbrio Redox em Queratinócitos Irradiados com UV de Pacientes Psoriáticos
Para avaliar o efeito da psoríase no equilíbrio redox da epiderme, a geração de EROs e a atividade/nível de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos foram determinados em queratinócitos de pacientes com psoríase vulgar. Os queratinócitos de pacientes com psoríase foram caracterizados por uma maior atividade das enzimas responsáveis pela geração celular do ânion superóxido (NOX, XO). Consequentemente, esses queratinócitos também apresentaram aumento na geração de EROs em comparação com células de controles saudáveis (Figura 1). Além disso, a exposição dos queratinócitos à radiação UVA/UVB aumentou a atividade de NOX e XO e os níveis de EROs em ambos os grupos, especialmente nas células de pacientes com psoríase, onde os níveis foram ainda mais elevados. O tratamento com CBD demonstrou prevenir parcialmente os distúrbios no equilíbrio redox dos queratinócitos observados em pacientes com psoríase, bem como após radiação UV (Figura 1). No entanto, no caso dos queratinócitos de pacientes com psoríase, o CBD apenas preveniu o aumento dos níveis de EROs sob a influência da radiação UV. Vale ressaltar que o CBD reduziu claramente o nível de EROs nos queratinócitos de indivíduos saudáveis, tanto não irradiados quanto irradiados.
O desenvolvimento da psoríase e a exposição à radiação UV são fatores que modificam o nível/atividade de antioxidantes e seus receptores nos queratinócitos. O nível de GSH e a atividade de GSH-Px nos queratinócitos de pacientes com psoríase foram significativamente reduzidos, e a irradiação UV intensificou essas alterações (Figura 2). No entanto, o nível de Trx não se alterou entre pacientes e controles, e a atividade de Trx-R foi maior nos queratinócitos de pacientes com psoríase. A irradiação UV aumentou os níveis de Trx nos queratinócitos de células saudáveis e de pacientes, enquanto a atividade de TrxR só foi aumentada nos queratinócitos de pacientes. A atividade da catalase, outra enzima responsável pela proteção dos fosfolipídios, foi aumentada nos queratinócitos de pacientes em comparação com os controles (Figura 3). No entanto, a direção das alterações na atividade da catalase após a irradiação UV foi semelhante à atividade da GSH-Px, enquanto as alterações nos níveis de antioxidantes lipofílicos, como as vitaminas E e A, seguiram uma tendência semelhante ao principal antioxidante hidrofílico—GSH (Figura 2). O tratamento com CBD tendeu a aumentar os níveis de GSH e Trx nos queratinócitos de indivíduos saudáveis e irradiados por UV, enquanto diminuiu os níveis desses compostos nos queratinócitos de pacientes. No caso da GSH-Px, nos queratinócitos de indivíduos saudáveis, o CBD tendeu a diminuir a atividade, enquanto nos queratinócitos de pacientes e amostras irradiadas por UVA, o CBD aumentou a atividade dessa enzima. No entanto, a atividade de TrxR foi aumentada nos queratinócitos de indivíduos saudáveis após o tratamento com CBD, mas foi diminuída nos queratinócitos de pacientes e amostras irradiadas por UVB. A atividade da CAT apresentou alterações na direção semelhantes à GSH-Px (Figura 3). O CBD preveniu parcialmente a redução de ambas as vitaminas nos queratinócitos de indivíduos saudáveis expostos a UV, enquanto tendeu a reduzir o nível de ambas as vitaminas nos queratinócitos de pacientes com psoríase. O CBD reduziu o desequilíbrio redox observado nos queratinócitos irradiados por UV de indivíduos saudáveis. Isso ocorreu por meio da redução da geração de ROS, do aumento das capacidades do sistema dependente de Trx e do aumento dos níveis de vitaminas A e E. Os resultados obtidos indicam que o CBD reduz o desequilíbrio redox observado nos queratinócitos irradiados por UV de indivíduos saudáveis.
3.2. Efeito do CBD no Metabolismo de Fosfolipídios nos Queratinócitos Irradiados por UV de Pacientes Psoriáticos
3.2.1. Peroxidação Lipídica
A mudança no equilíbrio redox em direção a condições oxidativas, como consequência da psoríase ou da irradiação UV, alterou o metabolismo de fosfolipídios dependente de ROS e enzimático. Os queratinócitos de pacientes com psoríase foram caracterizados por um nível significativamente mais alto de produtos de peroxidação lipídica dependente de ROS, incluindo, aproximadamente, um aumento de duas vezes no 4-HNE (um produto aldeído da fragmentação de fosfolipídios) e um aumento de 30% nos 8-isoprostanos (o produto da ciclização de fosfolipídios) (Figura 4). Consequentemente, um nível aumentado de adutos de 4-HNE-proteína foi observado. A irradiação UVA aumentou o nível de 4-HNE e seus adutos proteicos em maior grau nos queratinócitos de pessoas saudáveis (5 vezes) em comparação com pacientes psoriáticos (3,5 vezes); a irradiação UVB aumentou o nível de 4-HNE em aproximadamente 2,5 vezes em queratinócitos saudáveis e 1,5 vezes em pacientes psoriáticos. O tratamento com CBD reduziu o nível de 8-isoprostanos, bem como de 4-HNE e adutos de 4-HNE-proteína em queratinócitos irradiados por UV e teve um efeito mais forte nas células de pacientes em comparação com as células de pessoas saudáveis.
3.2.2. Metabolismo Enzimático de Fosfolipídios
A consequência do estresse oxidativo, que é observado tanto na manifestação da psoríase quanto após a irradiação UV, é um metabolismo enzimático de fosfolipídios intensificado. Alguns dos produtos desse metabolismo modificado são os endocanabinoides. Os níveis de dois endocanabinoides básicos—AEA e 2-AG—foram reduzidos nos queratinócitos de pacientes com psoríase, enquanto o nível do endocanabinoide atípico PEA foi aumentado (Figura 5). A radiação UV, especialmente UVB, também diminuiu AEA e 2-AG, e aumentou significativamente os níveis de PEA; essas alterações foram significativamente maiores nos queratinócitos de pacientes psoriáticos em comparação com indivíduos saudáveis. O CBD neutralizou tanto a redução de AEA nos queratinócitos de indivíduos saudáveis, quanto o aumento no nível de PEA nos queratinócitos psoriáticos (tanto com quanto sem irradiação UV).
Mudanças nos níveis de endocanabinoides foram acompanhadas por mudanças tanto na atividade das enzimas responsáveis por sua degradação quanto na expressão de receptores de membrana, que são ligantes. Foi observado um aumento na atividade de FAAH e MAGL em queratinócitos de pacientes, enquanto a exposição das células à radiação UV aumentou a atividade dessas enzimas, particularmente em queratinócitos de pacientes. Em contraste, o tratamento com CBD diminuiu principalmente a atividade de MAGL, especialmente em queratinócitos irradiados de pacientes com psoríase. A presença de psoríase, bem como a irradiação de queratinócitos com radiação UVA/B, foi acompanhada por um aumento na expressão dos receptores testados (CB1/2 e TRPV1). O tratamento com CBD aumentou a expressão do receptor CB1 em queratinócitos de pacientes, bem como em queratinócitos irradiados por UV de ambos os grupos (células saudáveis e de pacientes). O CBD aumentou a expressão dos receptores CB2 em queratinócitos saudáveis e de pacientes, enquanto reduziu significativamente a expressão de CB2 em queratinócitos irradiados por UV de pacientes. O CBD também aumentou a expressão do receptor TRPV1, mas apenas no grupo saudável e em pacientes com psoríase sem exposição à UV. Os resultados do sistema endocanabinoide destacam o efeito antioxidante do CBD em queratinócitos de indivíduos saudáveis.
3.2.3. A Atividade dos Transportadores de Membrana em Queratinócitos
A transferência de substâncias exógenas e endógenas através das membranas celulares depende em grande parte da atividade dos transportadores de membrana ABC, como a proteína de resistência a múltiplos medicamentos 1 (MDR1/ABCB1), proteína de resistência a múltiplos medicamentos (MRP/ABCC) e proteína de resistência ao câncer de mama (BCRP/ABCG2). Foi observado um aumento na atividade de MDR1 e BCRP em queratinócitos de pacientes psoriáticos e em células de ambos os grupos após irradiação UVA/B (Figura 6). Em contraste, o tratamento das células com CBD inibiu a atividade de todos os transportadores avaliados, com a atividade de BCRP nos queratinócitos de pacientes com psoríase e irradiados com UVA/B apresentando a resposta mais robusta.
3.2.4. A Penetração de Queratinócitos pelo CBD
Alterações no metabolismo dos fosfolipídios de membrana e na atividade dos transportadores de membrana causadas pelos efeitos da psoríase e da radiação UV são acompanhadas por alterações na forma como o CBD penetra nos queratinócitos (Figura 7). O tratamento de queratinócitos de indivíduos saudáveis com CBD resultou em sua absorção na membrana e no citosol em níveis semelhantes. No entanto, no caso de queratinócitos de pacientes com psoríase, as membranas celulares acumularam até 3 vezes mais CBD do que o citosol. A radiação UV também alterou o nível de CBD no citosol e na membrana. No caso de queratinócitos de indivíduos saudáveis, a radiação UVA aumentou os níveis de CBD no citosol em quase 3 vezes, e em aproximadamente 5 vezes nas membranas, enquanto a radiação UVB aumentou o CBD em apenas aproximadamente 2 vezes nas membranas dos queratinócitos. No entanto, no caso de queratinócitos de pacientes com psoríase, as membranas celulares acumularam mais de 2 vezes mais CBD do que o citosol. Em contraste, a radiação UVA aumentou a absorção de CBD no citosol em cerca de 2 vezes e nas membranas em cerca de 2,5 vezes. A radiação UVB tendeu a diminuir o nível de CBD no citosol e produzir um aumento de cerca de 3 vezes no nível de CBD na membrana. Como consequência, tanto a psoríase quanto a radiação UV aumentaram o acúmulo de CBD na membrana dos queratinócitos.
4. Discussão
4.1. Condições Redox em Queratinócitos de Pacientes com Psoríase Tratados com CBD
As células da pele são frequentemente expostas a espécies reativas de oxigênio (ROS), que surgem como resultado de fatores ambientais, mas também em resposta a alterações no metabolismo celular decorrentes do desenvolvimento de doenças de pele, incluindo a psoríase. Embora os antioxidantes endógenos neutralizem os efeitos da superprodução de ROS, a presença excessivamente alta e/ou duradoura de ROS nas células, como em condições de doença, leva ao estresse oxidativo. Recentemente, mostramos um deslocamento no equilíbrio redox em direção a condições oxidativas com a formação de estresse oxidativo no plasma, linfócitos e granulócitos de pacientes com psoríase, levando à intensificação de modificações oxidativas de lipídios, proteínas e outros compostos endógenos. Diferentes populações de leucócitos ativados que infiltram as lesões cutâneas também levam a um aumento no nível de oxidantes locais e causam uma resposta pró-inflamatória, bem como modificações oxidativas de proteínas e lipídios nas células da pele, especialmente nos queratinócitos. Apesar das evidências de que o estresse oxidativo ocorre sistêmica e localmente na psoríase, muitos tratamentos atuais, para acelerar a remoção de células epidérmicas danificadas, aumentam ainda mais o estresse oxidativo, levando à sua morte. Isso é particularmente importante para a pele exposta à radiação UV, que leva à produção em massa de oxigênio singleto.
Pesquisas em andamento confirmaram a existência de um desequilíbrio redox em queratinócitos de pacientes com psoríase, resultante tanto do aumento da produção de ROS quanto da desregulação dos sistemas antioxidantes dependentes de GSH e Trx. Além disso, uma resposta pró-oxidante mais forte à radiação UV foi observada em queratinócitos de pacientes com psoríase em comparação com controles saudáveis. Tanto a GSH quanto a Trx podem existir em formas reduzidas ou oxidadas, participando assim da manutenção do estado redox adequado das células ao reduzir as pontes dissulfeto de peptídeos e proteínas. No entanto, os resultados aqui obtidos indicam que o sistema dependente de GSH em queratinócitos psoriásicos não é totalmente eficaz, uma vez que o nível de GSH é reduzido como resultado do desenvolvimento da doença e é ainda mais diminuído após a irradiação UV. Isso pode resultar de um aumento no nível de transportadores de membrana, especialmente MRP1, mas também pode ser consequência da formação de conjugados de GSH com 4-HNE, cujo nível está aumentado nos queratinócitos de pacientes com psoríase. A GSH — junto com a glutationa peroxidase — participa da proteção dos fosfolipídios de membrana. Portanto, o nível reduzido desse tripeptídeo como co-substrato da peroxidase impede a redução dos peróxidos lipídicos. É importante notar, no entanto, que a eficiência reduzida do sistema dependente de GSH é acompanhada por um sistema dependente de Trx mais eficiente. A manutenção desses dois sistemas confirma o princípio da cooperação mútua na regulação da homeostase redox em queratinócitos no desenvolvimento da psoríase. Além disso, no citosol, o sistema dependente de Trx desempenha um papel antioxidante dominante, sugerindo que ele fornece condições redutoras para as proteínas dos queratinócitos tanto no desenvolvimento da psoríase quanto durante a terapia UV. No entanto, como o desenvolvimento da psoríase promove tanto uma diminuição na atividade da glutationa peroxidase e da catalase quanto no nível de vitamina E diretamente envolvida na proteção dos fosfolipídios de membrana, a intensificação do processo de peroxidação lipídica parece evidente nessas condições.

O estresse oxidativo moderado pode ser benéfico no combate a patologias específicas. No entanto, para eliminar as consequências metabólicas do estresse oxidativo excessivo durante a psoríase e a fototerapia — especialmente em relação às células inalteradas —, compostos que modificam as condições redox são ativamente buscados. Neste estudo, o efeito terapêutico do CBD, um composto natural com propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes, foi avaliado.
Para que o CBD seja terapeuticamente tópico, ele deve penetrar efetivamente nas células da pele. Nossos resultados confirmam que, ao entrar nos queratinócitos, o CBD – especialmente após exposição à radiação UVA – acumula-se principalmente nas membranas dos queratinócitos, particularmente em queratinócitos de pacientes com psoríase. Isso provavelmente é resultado da natureza lipofílica do CBD e da modificação da estrutura da biomembrana sob condições oxidativas. O transporte do CBD através das membranas pode ser facilitado pela ação de transportadores de membrana (transportadores ABC) que transportam compostos endógenos e exógenos. Este estudo indica que, embora o desenvolvimento da psoríase promova a ativação do transportador BCBP, a radiação UV, especialmente a UVB, também ativa os transportadores MDR e MRP. Dados da literatura confirmam que o estresse oxidativo que observamos na psoríase e após irradiação UV aumenta a atividade dos transportadores transmembrana (MRP, MDR e BCRP) nos queratinócitos. No entanto, o tratamento com CBD reduz significativamente a atividade dos transportadores BCRP e MDR. Estudos em células cerebrais de camundongos mostraram que animais com knockout de MDR e BCRP não apresentaram transporte perturbado de CBD, mas o CBD inibiu tanto os transportadores MDR quanto BCRP. Em contraste, o CBD pode induzir a expressão de MRP em hepatócitos de camundongos C57BL/6J através da ativação do fator de transcrição sensível a redox Nrf2, uma noção consistente com nossas observações anteriores. No entanto, independentemente do transporte através das membranas celulares via transportadores de membrana, o CBD também pode ser transportado através dos canais de ânions dependentes de voltagem (VDAC). Com base nos resultados deste estudo, é difícil determinar de forma inequívoca quais mecanismos de membrana facilitam a penetração dos queratinócitos pelo CBD. Sem dúvida, o CBD pode penetrar nas células epidérmicas. Sua atividade metabólica nessas células é de grande importância porque pertence ao grupo dos canabinoides envolvidos na modelagem do nível de estresse oxidativo.
Os achados deste trabalho mostram que o CBD, ao reduzir a atividade das enzimas geradoras de ROS, diminui os níveis de ROS, especialmente em queratinócitos de células tanto de indivíduos saudáveis quanto de pacientes tratados com radiação UV. No entanto, nos queratinócitos de pacientes com psoríase, o nível de ROS, mesmo após o tratamento com CBD, ainda está elevado, especialmente quando essas células foram expostas à radiação UVB. Essa observação é importante porque a pele é exposta diariamente à luz solar contendo radiação UV, e também porque a fototerapia — que visa remover células modificadas pela doença — é utilizada no tratamento da psoríase. Relatos anteriores confirmam a capacidade do CBD de inibir a produção de ROS em células progenitoras de oligodendrócitos, reduzindo a atividade das enzimas responsáveis por sua geração. Além disso, sabe-se que o CBD, como outros antioxidantes, também pode interromper reações em cadeia de radicais livres, capturando-os ou transformando-os em formas menos ativas. O CBD também reduz a geração de ROS ao quelar íons de metais de transição envolvidos na reação de Fenton para formar radicais hidroxila extremamente reativos.
Além de reduzir diretamente o nível de oxidantes, o CBD também modifica o equilíbrio redox ao aumentar o nível/atividade de antioxidantes. Os resultados deste estudo sugerem que o CBD aumenta a eficiência do sistema dependente de GSH nos queratinócitos de pessoas saudáveis, enquanto reduz a eficácia desse sistema nos queratinócitos de pacientes com psoríase e após irradiação UV. Isso pode ser explicado pela alta afinidade do CBD pela cisteína da GSH e pela selenocisteína da GSH-Px, especialmente no caso dos níveis mais elevados de CBD nas células de psoríase. Também foi sugerido que o metabólito reativo do CBD — canabidiol hidroxiquinona — reage covalentemente com a cisteína para formar adutos, por exemplo, com glutationa e citocromo P450 3A11, inibindo assim sua atividade biológica. O CBD, por outro lado, apoia a ação de enzimas antioxidantes como a glutationa peroxidase, prevenindo a redução dos íons de estanho necessários para a atividade biológica dessa enzima, cujo nível geralmente é reduzido em condições patológicas. O CBD aumenta o nível/atividade de Trx e TrxR nos queratinócitos de pessoas saudáveis. Foi demonstrado anteriormente que o CBD — ao aumentar a atividade transcricional do Nrf2 — leva a um aumento no nível de tiorredoxina e tiorredoxina redutase, o que indica que o sistema da tiorredoxina é necessário para a sobrevivência dos queratinócitos. Além disso, o CBD tem um efeito estabilizador sobre a atividade da catalase, bem como sobre o nível de vitaminas lipofílicas, prevenindo sua oxidação. O CBD possui capacidades antioxidantes muito maiores (30%–50%) do que o α-tocoferol ou a vitamina C.
Os resultados deste estudo destacam uma resposta distinta dos queratinócitos de pacientes com psoríase em relação às células de indivíduos saudáveis, especialmente no contexto da irradiação celular por UV. A capacidade do CBD de prevenir parcialmente o desequilíbrio redox, particularmente nas células de indivíduos saudáveis, indica uma potencial ação protetora do CBD sobre os componentes das células suscetíveis a condições oxidativas, incluindo fosfolipídios e proteínas.
4.2. Metabolismo de Fosfolipídios em Queratinócitos Tratados com CBD
As células epidérmicas, incluindo os queratinócitos, são ricas em fosfolipídios, que não apenas contribuem para a formação e manutenção da barreira epidérmica, mas também desempenham um papel fundamental na manutenção das funções metabólicas das células. O nível de fosfolipídios, bem como os produtos de seu metabolismo dependente de EROs e de enzimas, como produtos da peroxidação lipídica e endocanabinoides, é regulado pelas condições redox, mas esses derivados fosfolipídicos também estão envolvidos na regulação do equilíbrio redox celular.
Condições oxidativas, observadas em queratinócitos de pacientes com psoríase, promovem modificações oxidativas de fosfolipídios, conforme demonstrado pelo aumento dos níveis dos produtos de peroxidação lipídica 8-isoprostanos e 4-HNE. O 4-HNE é um aldeído eletrofílico altamente reativo que reage prontamente com grupos nucleofílicos. Portanto, o 4-HNE pode reagir com lipídios, ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas, particularmente aqueles que contêm resíduos de cisteína, histidina e lisina. Como resultado, o 4-HNE pode modificar a estrutura da maioria das proteínas e peptídeos antioxidantes envolvidos na proteção de biomembranas, incluindo componentes dos sistemas dependentes de GSH e Trx, bem como da catalase. Além disso, o nível de adutos 4-HNE-proteína está aumentado nos queratinócitos de pacientes psoriáticos. A formação de adutos 4-HNE-proteína em queratinócitos psoriáticos já foi demonstrada em estudos proteômicos, especialmente no contexto de proteínas envolvidas na resposta antioxidante. A intensificação do processo de peroxidação lipídica também foi observada nas células sanguíneas e no plasma de pacientes com psoríase vulgar, o que confirma que esta doença, independentemente de modificações metabólicas locais nas células da pele, também é caracterizada por alterações no metabolismo sistêmico. A irradiação UV de queratinócitos também aumenta a peroxidação lipídica, elevando o nível de adutos 4-HNE-proteína, promovendo alterações metabólicas adicionais. A formação de adutos 4-HNE-proteína permite que o 4-HNE participe da regulação em múltiplas etapas das vias metabólicas (incluindo vias de sinalização associadas à ativação de quinases), bem como de fatores de transcrição responsáveis pela homeostase redox (como Ref-1, Nrf2, p53, NFκB e Hsf1). A formação de adutos 4-HNE-proteína também afeta a geração de fatores pró-inflamatórios e proteínas antiapoptóticas. Além disso, a radiação UV impacta as células epidérmicas, que respondem por meio de uma cascata de marcadores inflamatórios, como citocinas (IL-6, IL-8, TNFα) e 8-isoprostanos, que podem ser usados como indicadores de danos fotooxidativos às células e à matriz extracelular.
O CBD—ao reduzir o nível de ROS—diminui a probabilidade de modificações oxidativas dos fosfolipídios. Isso confirma a diminuição observada no nível de 4-HNE e de adutos de 4-HNE-proteína, especialmente no caso de queratinócitos de pacientes com psoríase, bem como uma redução no nível de 8-isoprostano, especialmente nos queratinócitos de pessoas saudáveis. Relatos anteriores também confirmam a eficácia do CBD na prevenção da peroxidação lipídica. Observou-se que o CBD reduz os níveis de MDA e 4-HNE em células hipocampais de camundongos (HT22) privadas de oxigênio e glicose sob condições de reperfusão, bem como em homogenatos de fígado de camundongos C57BL/6J. O CBD também reduziu os níveis de MDA e 4-HNE em camundongos com cardiomiopatia diabética e nos fígados de camundongos no modelo de intoxicação alcoólica aguda. O CBD mostrou evidências de redução do nível de isoprostanos no córtex de camundongos transgênicos que modelam a doença de Alzheimer. Uma vez que o efeito dos produtos reativos da peroxidação lipídica (particularmente o 4-HNE) sobre o metabolismo celular é dependente da concentração, o CBD—ao reduzir a gravidade da peroxidação lipídica—pode promover mecanismos de proteção nos queratinócitos. Nessa situação, o 4-HNE, ao induzir a síntese ou atividade proteica, pode modificar a transdução de sinal (por exemplo, através da estimulação de cinases) e, portanto, pode exercer efeitos fisiologicamente benéficos que promovem a sobrevivência e proliferação celular.
Independentemente da peroxidação lipídica, o metabolismo de fosfolipídios dependente de enzimas leva à formação de outro grupo de derivados de fosfolipídios — os endocanabinoides, que estão envolvidos tanto na fisiologia quanto na patologia das células da pele, incluindo psoríase e resposta à irradiação UV. Isso é consistente com os resultados deste estudo. O nível de endocanabinoides depende principalmente da atividade das enzimas envolvidas em seu metabolismo, como FAAH e MAGL. Os níveis de FAAH e MAGL tendem a aumentar na psoríase e após a irradiação UV de queratinócitos, conforme demonstrado por nossos achados. Os níveis de endocanabinoides também podem ser alterados pela diminuição da atividade dos transportadores ABC (proteína de resistência a múltiplos fármacos 1 — MDR1 — e proteína de resistência ao câncer de mama — BCRP), o que é sugerido pelos resultados deste estudo. Dados da literatura anterior também indicam que o transportador de anandamida (AMT) é responsável pela captação de AEA nas células, incluindo queratinócitos. Em queratinócitos de pacientes com psoríase e irradiados por UV, os níveis de AEA e 2-AG são reduzidos e os níveis de PEA são aumentados. No entanto, o CBD tende a reduzir os níveis de AEA em queratinócitos controle e a aumentar os níveis de AEA em queratinócitos irradiados por UV de pacientes. Um relato anterior mostrou que o CBD modula a função do sistema endocanabinoide ao aumentar os níveis de anandamida em queratinócitos humanos (HaCaT). Outros dados, no entanto, indicam que o CBD inibe a captação celular e o catabolismo da AEA, competindo com a AEA pela ligação às proteínas de ligação a ácidos graxos (FABPs) responsáveis pelo transporte de compostos hidrofóbicos no citosol, mas não por inibir a FAAH humana, como sugerido anteriormente. Nossos resultados confirmam a ausência de efeito do CBD na atividade de FAAH/MAGL em queratinócitos de pessoas saudáveis e pacientes com psoríase, mas mostram uma diminuição em sua atividade após a irradiação UV. Além disso, o tratamento com CBD em queratinócitos irradiados por UV reduz significativamente os níveis de PEA, especialmente em pacientes com psoríase.
Os efeitos metabólicos dos endocanabinoides estão principalmente associados à ativação de receptores de membrana, incluindo CB1/2, TRPVs, PPARs, para os quais o CBD também é um ligante. Assim, o CBD pode afetar o metabolismo celular modulando a atividade agonista dos endocanabinoides ou competindo diretamente com eles na ativação/antagonismo/inibição dos receptores canabinoides de maneira dependente da concentração. No entanto, dada a falta de efeito do CBD sobre o nível dos principais endocanabinoides em pacientes com psoríase, e sua modificação na expressão de receptores, a interação direta do CBD com os receptores é a mais provável. A ativação do receptor CB1 (para o qual o CBD é um agonista fraco) em queratinócitos de pacientes com psoríase, bem como após irradiação UV, pode aumentar a produção de ROS e a resposta de síntese do TNFα pró-inflamatório. Além disso, o CBD—ao ativar o CB1 em outras células epidérmicas (melanócitos)—aumenta a melanogênese e a atividade da tirosinase. Um aumento mais forte na expressão do receptor CB2 foi observado em ambos os grupos de queratinócitos (de indivíduos saudáveis e pacientes) tratados com CBD, enquanto os níveis de AEA e 2-AG foram reduzidos. Isso confirma que o CBD é um agonista real do receptor CB2. Sua ação poderia levar a uma diminuição no nível de ROS e TNFα e, assim, contribuir para a redução do estresse oxidativo e da inflamação. Portanto, a resposta geral dos receptores canabinoides indica que o CBD possui atividade antioxidante mais forte em comparação à pró-oxidativa. No entanto, quando células irradiadas por UV são tratadas com CBD, o efeito total da ativação dos receptores CB1/2 indica que condições pró-oxidativas são promovidas nos queratinócitos dos pacientes. Outro alvo molecular do CBD é o receptor vaniloide (TRPV1), cujo ligante primário é a PEA, que apresenta níveis significativamente aumentados nos queratinócitos de pacientes e em células após irradiação UV. Assim, o CBD também pode modificar indiretamente a ativação dos receptores CB1 e CB2 através da AEA e do TRPV1. Dados da literatura publicada indicam que a PEA pode reduzir a expressão e os níveis de citocinas inflamatórias em doenças de pele por meio desse mecanismo. Dessa forma, a PEA, em níveis mais elevados, pode se comportar como um agente protetor endógeno contra a inflamação induzida por UV. Esse efeito pode contribuir para o conhecido efeito terapêutico da radiação UV em doenças inflamatórias crônicas da pele. Portanto, a avaliação do efeito protetor do CBD sobre os queratinócitos de pessoas saudáveis, e do efeito destrutivo que poderia levar à apoptose dos queratinócitos de pacientes com psoríase, requer mais pesquisas, incluindo a avaliação simultânea da inflamação.
O estresse oxidativo observado nos queratinócitos de pacientes com psoríase é um elemento crítico da resposta imunológica à patologia, sendo ainda mais intensificado pela radiação UV. Modificações metabólicas, especialmente de fosfolipídios/proteínas de membrana, podem levar à apoptose excessiva ou à modulação da sinalização celular dependente de derivados de fosfolipídios, que são parcialmente responsáveis pela modulação do estresse oxidativo. Portanto, o tratamento com CBD, que leva ao acúmulo de CBD principalmente nas membranas dos queratinócitos, particularmente nas células psoriásicas irradiadas com UV, reduz as modificações oxidativas dos fosfolipídios e suas consequências. Ao mesmo tempo, o CBD, ao aumentar o nível de PEA, pode contribuir para a redução da inflamação. As alterações observadas podem indicar o mecanismo celular de ação do CBD na psoríase e no caso da radiação UV da pele do paciente.
Contribuições dos Autores
Conceitualização, E.S.; Análise formal, M.B. e A.G.; Aquisição de financiamento, E.S.; Metodologia, I.J.-K., M.B., A.W. e A.G.; Administração do projeto, E.S.; Supervisão, A.W. e E.S.; Validação, I.J.-K., M.B. e A.G.; Visualização, I.J.-K. e A.G.; Redação – rascunho original, I.J.-K. e E.S.; Redação – revisão e edição, A.W. e E.S. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento
Este estudo foi financiado pelo National Science Centre Polônia (NCN) sob o número de concessão 2016/23/B/NZ7/02350.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Referências
Patogênese da psoríase e desenvolvimento do tratamento
Papel emergente da rede de células imunológicas em doenças autoimunes da pele: uma atualização sobre pênfigo, vitiligo e psoríase
Patogênese da psoríase e desenvolvimento de novas terapias imunológicas direcionadas
O sistema endocanabinoide da pele. Uma abordagem potencial para o tratamento de doenças de pele
Envolvimento da N-acil etanolamida e eicosanoides na dermatite irritante
Os endocanabinoides estimulam a melanogênese humana através do receptor canabinoide tipo 1
A anandamida suprime as respostas de células T pró-inflamatórias in vitro através da inibição de mTOR mediada pelo receptor canabinoide tipo 1 em queratinócitos humanos
Os receptores canabinoides CB1 e CB2 regulam diferencialmente a produção de espécies reativas de oxigênio por macrófagos
Modulação da homeostase redox celular pelo sistema endocanabinoide
Estresse oxidativo na psoríase e uso potencial terapêutico de antioxidantes
O Sistema Endocanabinoide em Queratinócitos Humanos: evidências de que a anandamida inibe a diferenciação epidérmica através da inibição dependente do receptor cb1 da proteína quinase c, proteína ativadora-1 e transglutaminase
O mediador anti-inflamatório palmitoiletanolamida aumenta os níveis de 2-araquidonoil-glicerol e potencializa suas ações nos canais de cátions TRPV1
O receptor nuclear peroxissomo proliferador-ativado alfa medeia as ações anti-inflamatórias da palmitoiletanolamida
Sinalização Canabinoide na Pele: Potencial Terapêutico do Sistema "C (ut) anabinoide"
Troglitazona melhora a psoríase e normaliza modelos de doença proliferativa da pele: Ligantes para o receptor ativado por proliferador de peroxissomo-γ inibem a proliferação de queratinócitos
Papel protetor da palmitoiletanolamida na dermatite alérgica de contato
Modulação do estresse oxidativo e da peroxidação lipídica por endocanabinoides e seus análogos lipídicos
Canabidiol como uma estratégia promissora para tratar e prevenir distúrbios do movimento?
O canabidiol atenua a nefrotoxicidade induzida por cisplatina ao diminuir o estresse oxidativo/nitrosativo, inflamação e morte celular
Canabidiol, neuroproteção e transtornos neuropsiquiátricos
O canabidiol atenua a disfunção cardíaca, estresse oxidativo, fibrose e vias de sinalização inflamatória e de morte celular na cardiomiopatia diabética
O canabidiol protege contra a cardiomiopatia induzida por doxorrubicina ao modular a função e a biogênese mitocondrial
O canabidiol e o Δ(9)-tetraidrocanabivarina são moduladores negativos do sistema endocanabinoide? Uma revisão sistemática
Canabidiol para distúrbios neurodegenerativos: Novas aplicações clínicas importantes para este fitocanabinoide?
Fototerapia da psoríase, uma doença inflamatória crônica da pele
Erupção polimorfa à luz iatrogênica induzida por UVB de banda estreita: Um caso e sugestões para superar esta complicação rara
Mecanismos moleculares da apoptose induzida por UV e seus efeitos nas células residentes da pele: A implicação na fototerapia baseada em UV
Ensaios de citotoxicidade in vitro: Comparação dos ensaios de LDH, vermelho neutro, MTT e proteína em linhagens de células de hepatoma após exposição ao cloreto de cádmio
O canabidiol induz vias antioxidantes em queratinócitos ao alvejar o BACH1
O canabidiol regula a expressão de proteínas de queratinócitos envolvidas no processo inflamatório por meio da regulação transcricional
Um método rápido e sensível para a quantificação de quantidades de microgramas de proteína utilizando o princípio da ligação proteína-corante
A angiotensina II estimula a atividade da NADH e NADPH oxidase em células musculares lisas vasculares cultivadas
Desequilíbrio ligado à transformação maligna: Atividade diminuída da xantina oxidase em hepatomas
Interações do peroxinitrito, tetra-hidrobiopterina, ácido ascórbico e tióis: Implicações para o desacoplamento da óxido nítrico sintase endotelial
Estudos sobre a caracterização quantitativa e qualitativa da glutationa peroxidase eritrocitária
Eletroforese capilar da glutationa para monitorar o estresse oxidativo e a resposta a tratamentos antioxidantes em um modelo animal
Tiorredoxina e tiorredoxina redutase
Níveis diminuídos de tiorredoxina e aumentados de tiorredoxina redutase no cérebro da doença de Alzheimer
Catalase in vitro
Efeito de altas doses de vitamina E na dieta sobre as concentrações de vitamina E em várias regiões do cérebro, plasma, fígado e tecido adiposo de ratos
Cinética de biomarcadores: Validade biológica e técnica dos isoprostanos no plasma
Medição simultânea de malondialdeído e 4-hidroxi-2-nonenal por GC-MS/MS em plasma humano: Efeitos da administração de L-arginina a longo prazo
Medição de adutos de proteína-HNE em plasma e soro humano por ELISA - Comparação de dois anticorpos primários
Estudo da preparação de amostras para determinação de endocanabinoides e compostos análogos em soro humano por LC-MS/MS em modo MRM
A hidrolase de amida de ácido graxo determina a morte celular induzida por anandamida no fígado
Avaliação de um ensaio espectrofotométrico para atividade da monoacilglicerol lipase
Quantificação da proteína bcl-2 em tecido de câncer de bexiga por imunoensaio enzimático: Comparação com Western blot e imuno-histoquímica
Os transportadores de fármacos ABCB1 e ABCG2 são diferencialmente expressos em carcinomas pulmonares de células não pequenas (CPCNP) e a expressão é modificada pelo tratamento com cisplatina via sinalização Wnt alterada
Alterações fisiopatológicas da sinalização redox e do sistema endocanabinoide em granulócitos e plasma de pacientes psoriáticos
Efeito do desequilíbrio redox nas modificações proteicas em linfócitos de pacientes psoriáticos
O perfil proteômico de queratinócitos e linfócitos em pacientes psoriáticos
Papel do estresse oxidativo em vários estágios da psoríase
Envolvimento do estresse oxidativo na psoríase: Uma revisão sistemática
Sinalização redox mediada pelos sistemas tiorredoxina e glutationa no sistema nervoso central
Transportadores de glutationa da membrana plasmática e seus papéis na fisiologia e fisiopatologia celular
Papel do efluxo de glutationa reduzida na apoptose de queratinócitos humanos imortalizados induzida por UVA
Antioxidantes e HNE na homeostase redox
A relação entre a atividade da tiorredoxina redutase tecidual e o Índice de Gravidade e Área de Psoríase
Estresse Oxidativo: Danos e Benefícios para a Saúde Humana
O canabidiol exerce efeitos sebostáticos e anti-inflamatórios em sebócitos humanos
Sistemas de liberação de canabinoides para tratamento de dor e inflamação
Expressão de múltiplas enzimas do citocromo p450 e proteínas transportadoras associadas à resistência a múltiplos fármacos em queratinócitos da pele humana
Avaliação in vitro do efeito de fármacos antiepilépticos na expressão e função de transportadores ABC e suas interações com ABCC2
Os transportadores ABC P-gp e Bcrp não limitam a captação cerebral do novo fármaco antipsicótico e anticonvulsivante canabidiol em camundongos
Caracterização cinética de pré-estado estacionário da atividade de AP endonuclease da AP endonuclease 1 humana
Mitocôndrias como alvos emergentes para terapias contra leucemia linfoblástica aguda de células T
Avanços na fototerapia para psoríase e dermatite atópica
O canabidiol protege células progenitoras de oligodendrócitos da apoptose induzida por inflamação ao atenuar o estresse do retículo endoplasmático
Compreendendo os Aspectos Moleculares do Tetraidrocanabinol e do Canabidiol como Antioxidantes
Comparação de canabidiol, antioxidantes e diuréticos na reversão da neurotoxicidade induzida por etanol em binge
A apoptose de esplenócitos induzida por canabidiol hidroxiquinona é mediada predominantemente pela depleção de tiol
Efeito cardioprotetor do canabidiol em ratos expostos à toxicidade da doxorrubicina
TrxR1 como um potente regulador do sistema de resposta Nrf2-Keap1
Uma Atualização sobre Segurança e Efeitos Colaterais do Canabidiol: Uma Revisão de Dados Clínicos e Estudos Relevantes em Animais
Papel dos lipídios na formação e manutenção da barreira de permeabilidade cutânea
Visando o equilíbrio redox em condições inflamatórias da pele
As Diferenças no Perfil do Proteoma de Fibroblastos da Pele Tratados com Canabidiol após Irradiação UVA ou UVB em Culturas Celulares 2D e 3D
A relevância das alterações fisiopatológicas na sinalização redox do 4-hidroxinonenal para terapias farmacológicas de principais doenças associadas ao estresse
Perfil Cinético de Marcadores Inflamatórios na Pele Humana In vivo Após Exposição ao Ultravioleta B Indica Liberação Sincrônica de Citocinas e Prostanoides
O canabidiol atenua danos induzidos por OGD/R ao aumentar a bioenergética mitocondrial e modular o metabolismo da glicose via via das pentoses-fosfato em neurônios hipocampais
O canabidiol protege o fígado da esteatose induzida por consumo excessivo de álcool por mecanismos que incluem inibição do estresse oxidativo e aumento da autofagia
O tratamento de longo prazo com canabidiol previne o desenvolvimento de déficits de memória de reconhecimento social em camundongos transgênicos para a doença de Alzheimer
Mediadores lipídicos bioativos na inflamação e imunidade da pele
Traduzindo a Biologia dos Endocanabinoides para a Prática Clínica: Canabidiol para a Prevenção de AVC
2-Pentadecil-2-Oxazolina, a Oxazolina da Ervilha, Modula a Inflamação Aguda Induzida por Carragenina
Identificação de transportadores intracelulares para o endocanabinoide anandamida
As proteínas de ligação a ácidos graxos (FABPs) são transportadores intracelulares para o Δ9-tetra-hidrocanabinol (THC) e canabidiol (CBD)
Alvos moleculares para o canabidiol e seus análogos sintéticos: Efeito sobre os receptores vaniloides VR1 e sobre a captação celular e hidrólise enzimática da anandamida
O sistema endocanabinoide e sua modulação por fitocanabinoides
O canabidiol desvia o agonismo tendencioso nos receptores canabinoides CB1 e CB2 com menor efeito em complexos heterorreceptores CB1-CB2
O canabidiol exibe potência inesperadamente alta como antagonista de agonistas dos receptores CB1 e CB2 in vitro
O canabidiol regula positivamente a melanogênese através da via dependente de CB1 ao ativar p38 MAPK e p42/44 MAPK
Efeito do canabidiol (CBD) (4 µM) na atividade da NADPH oxidase e xantina oxidase (XO), bem como na geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) em queratinócitos expostos à radiação UVA (30 J/cm2) e UVB (60 mJ/cm2). Os queratinócitos foram obtidos de indivíduos saudáveis (I) (n = 15) e pacientes com psoríase vulgar (II) (n = 30). Os valores médios ± DP são apresentados com diferenças estatisticamente significativas: a-vs. grupo controle/psoríase; b-vs. grupo sem CBD; x-psoríase vs. grupos controle; p < 0,05.
Efeito do CBD (4 µM) no nível de glutationa reduzida (GSH) (A-I e A-II) e na atividade da glutationa peroxidase (GSH-Px), bem como no nível de tiorredoxina (Trx) e na atividade da tiorredoxina redutase (Trx-R) em queratinócitos expostos à radiação UVA (30 J/cm²) e UVB (60 mJ/cm²). Os queratinócitos foram obtidos de indivíduos saudáveis (I) (n=15) e de pacientes com psoríase vulgar (II) (n=30). Os valores médios ± DP são apresentados com diferenças estatisticamente significativas: a-vs. grupo controle/psoríase; b-vs. grupo sem CBD; x-psoríase vs. grupos controle; p < 0,05.

Efeito do CBD (4 µM) na atividade da catalase, bem como nos níveis de vitamina A e vitamina E em queratinócitos expostos à radiação UVA (30 J/cm²) e UVB (60 mJ/cm²). Os queratinócitos foram obtidos de indivíduos saudáveis (I) (n=15) e de pacientes com psoríase vulgar (II) (n=30). Os valores médios ± DP são apresentados com diferenças estatisticamente significativas: a-vs. grupo controle/psoríase; b-vs. grupo sem CBD; x-psoríase vs. grupos controle; p < 0,05.

O efeito do CBD (4 µM) nos produtos da peroxidação lipídica, como 8-isoprostanos e 4-HNE, bem como nos níveis de adutos de 4-HNE-proteína em queratinócitos expostos à radiação UVA (30 J/cm²) e UVB (60 mJ/cm²). Os queratinócitos foram obtidos de indivíduos saudáveis (I) (n=15) e de pacientes com psoríase vulgar (II) (n=30). Os valores médios ± DP são apresentados com diferenças estatisticamente significativas: a-vs. grupo controle/psoríase; b-vs. grupo sem CBD; x-psoríase vs. grupo controle; p < 0,05.

Efeito do CBD (4 µM) nos componentes do sistema endocanabinoide: endocanabinoides (anandamida (AEA), 2AG e palmitoiletanolamida (PEA)), enzimas degradadoras de endocanabinoides (hidrolase de amida de ácido graxo (FAAH) e lipase monoacilglicerol (MAGL)), e receptores ativados por mediadores lipídicos (CB1, CB2, TRPV1) em queratinócitos expostos à radiação UVA (30 J/cm²) e UVB (60 mJ/cm²). Os queratinócitos foram obtidos de indivíduos saudáveis (n=15 para endocanabinoides e enzimas degradadoras; n=6 para CB1/2 e TRPV1) (I) e de pacientes com psoríase vulgar (n=30 para endocanabinoides e enzimas degradadoras; n=6 para CB1/2 e TRPV1) (II). Os valores médios ± DP são apresentados com diferenças estatisticamente significativas: a-vs. grupo controle/psoríase; b-vs. grupo sem CBD; x-psoríase vs. grupo controle; p < 0,05.

Efeito do CBD (4 µM) nos transportadores de proteína de resistência a múltiplos medicamentos 1 (MDR1), proteína de resistência a múltiplos medicamentos (MRP) e proteína de resistência ao câncer de mama (BCRP) em queratinócitos expostos à radiação UVA (30 J/cm²) e UVB (60 mJ/cm²). Os queratinócitos foram obtidos de indivíduos saudáveis (n=15) (I) e de pacientes com psoríase vulgar (n=30) (II). Os valores médios ± DP são apresentados com diferenças estatisticamente significativas: a-vs. grupo controle/psoríase; b-vs. grupo sem CBD; x-psoríase vs. grupo controle; p < 0,05.
Efeito do CBD (4 µM) sobre o nível deste fitocanabinoide no citosol e nas membranas de queratinócitos expostos à radiação UVA (30 J/cm²) e UVB (60 mJ/cm²). Os queratinócitos foram obtidos de indivíduos saudáveis (n = 15) (I) e de pacientes com psoríase vulgar (n = 30) (II). Os valores médios ± DP são apresentados com diferenças estatisticamente significativas: a-vs. grupo controle/psoríase; x-psoríase vs. grupo controle; p < 0,05.