pmid: "41040236"
title: "Proporções Ideais de Combinação Canabinoide-Terpeno Suprimem a Mutagenicidade do Refluxo Gástrico em Células Esofágicas Normais e Metaplásicas."
authors: "Goldman A, Gonzalez G, Karpova SA, Buon L, Shammas MA, Mashimo H, Frank MH, Frank NY"
journal: "bioRxiv : the preprint server for biology"
pubdate: "2025 Sep 25"
doi: "10.1101/2025.09.23.678062"
source: "PMC Full Text"

Proporções Ideais de Combinação Canabinoide-Terpeno Suprimem a Mutagenicidade do Refluxo Gástrico em Células Esofágicas Normais e Metaplásicas.

Autores

Goldman A, Gonzalez G, Karpova SA, Buon L, Shammas MA, Mashimo H, Frank MH, Frank NY

Periodico

bioRxiv : the preprint server for biology (2025 Sep 25)

Conteudo

Proporções Ideais de Combinações Canabinoides-Terpenos Suprimem a Mutagenicidade do Refluxo Gástrico em Células Esofágicas Normais e Metaplásicas

Contexto:
O adenocarcinoma de esôfago (EAC) frequentemente surge da exposição crônica ao refluxo de ácido e bile, com ácidos biliares secundários, como o ácido desoxicólico (DCA), contribuindo para sua patogênese por meio de mecanismos que envolvem espécies reativas de oxigênio (ROS), danos oxidativos ao DNA e resistência à apoptose. O sistema endocanabinoide humano (ECS) regula diversas vias anti-inflamatórias, antioxidantes e analgésicas implicadas na modulação de doenças. Apesar de seu potencial terapêutico, a ativação farmacológica eficaz do ECS continua desafiadora.

Objetivos:
Este estudo teve como objetivo avaliar se combinações específicas de canabinoides-terpenos direcionadas ao ECS poderiam atenuar os efeitos mutagênicos e citotóxicos do estresse induzido por ácidos biliares em modelos celulares esofágicos. Além disso, avaliamos a significância clínica dos receptores proteicos relacionados ao ECS na progressão do EAC.

Desenho:
Modelos experimentais in vitro combinados com análises de amostras clínicas.

Métodos:
Utilizamos modelos in vitro, incluindo linhagens celulares epiteliais esofágicas humanas expostas ao DCA e um modelo de refluxo gastroesofágico (GER) do esôfago de Barrett submetido a baixo pH e a um coquetel de ácidos biliares. Amostras derivadas de pacientes foram analisadas para investigar a associação clínica dos marcadores da via do ECS com a progressão do EAC. Modelos experimentais foram tratados com diferentes proporções de fitocanabinoides e terpenos. Os desfechos incluíram avaliação de danos ao DNA, potencial de membrana mitocondrial e produção de ROS para identificar combinações ideais de compostos. A expressão de receptores proteicos relacionados ao ECS foi avaliada em amostras clínicas para elucidar seu papel no desenvolvimento do EAC.

Resultados:
Uma proporção de 1:5 de canabigerol (CBG) para Fitool (Phy) demonstrou reduzir significativamente os danos ao DNA induzidos pelo DCA, preservar o potencial de membrana mitocondrial e diminuir os níveis de ROS. Essa combinação também aumentou a apoptose em células danificadas e diminuiu a mutagenicidade. A análise de amostras de pacientes revelou que a expressão da proteína receptora CB1 associada ao ECS se correlacionou com a progressão do EAC, sugerindo um papel clínico mais amplo para a modulação do ECS na prevenção do câncer.

Conclusão:
A modulação do ECS por meio de proporções cuidadosamente selecionadas de canabinoides e terpenos pode mitigar os danos esofágicos induzidos por ácidos biliares e pode reduzir a progressão carcinogênica. Esses achados apoiam investigações in vivo adicionais e levantam a possibilidade de expandir as terapias com canabinoides-terpenos para outras condições envolvendo processos patogênicos semelhantes.

Introdução
O adenocarcinoma esofágico (EAC) é uma malignidade altamente agressiva associada à displasia e metaplasia do Esôfago de Barrett (EB) , condições relacionadas à exposição crônica ao refluxo ácido-biliar e à doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) . Os ácidos biliares, como o ácido deoxicólico (DCA), entram no esôfago durante episódios de refluxo e acredita-se que promovam o desenvolvimento do câncer . Pacientes com DRGE e EB apresentam altas concentrações de DCA em seu refluxo. O DCA tem efeitos citotóxicos e pode induzir danos ao DNA através de um processo que envolve a indução de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a disrupção da integridade lisossomal, o que pode causar perturbações iônicas resultando em dano oxidativo induzido por ERO que leva à genotoxicidade e quebras de DNA . As estratégias atuais de prevenção para o desenvolvimento de EAC em pacientes com Esôfago de Barrett, como quimioprevenção com inibidores da bomba de prótons, aspirina e estatinas, bem como vigilância endoscópica, mostram apenas eficácia modesta e inconsistente . Isso destaca a necessidade do desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para neutralizar os efeitos carcinogênicos do refluxo ácido-biliar.
O sistema endocanabinoide (SEC) é uma rede complexa de neurotransmissores à base de lipídios, receptores (principalmente CB1 e CB2) e enzimas que regulam sua síntese e degradação, desempenhando um papel central na manutenção da homeostase em múltiplos sistemas orgânicos, incluindo os sistemas gastrointestinal, imunológico, metabólico e cardiovascular . Fitoquímicos exógenos da Cannabis sativa podem imitar ou modular muitos dos mesmos efeitos fisiológicos produzidos por endocanabinoides endógenos, como a anandamida (AEA), ao interagir com os mesmos receptores canabinoides dentro do SEC . Canabinoides e terpenos, as duas principais classes de fitoquímicos derivados da Cannabis sativa, ambos exibem propriedades anti-inflamatórias e têm sido explorados terapeuticamente para distúrbios crônicos como esclerose múltipla e síndrome do intestino irritável . Canabinoides como o canabigerol (CBG) podem modular os níveis intracelulares de ERO e o antioxidante natural superóxido dismutase . Os terpenos, compostos aromáticos também abundantes na Cannabis sativa, têm como alvo vias de sinalização inflamatória e exibem efeitos anti-inflamatórios moderados, em parte pela modulação dos níveis de TNF-α e IL-1β . Evidências in vitro sugerem que fitocanabinoides e terpenoides inibem a proliferação em múltiplas células cancerígenas. Notavelmente, extratos de planta inteira de cannabis, que combinam canabinoides e terpenos, frequentemente mostram maior eficácia do que compostos isolados, apoiando o conceito de um “efeito comitiva” sinérgico . O efeito comitiva descreve o potencial dos canabinoides, terpenos e outros compostos derivados da cannabis de agir sinergicamente, possivelmente melhorando os efeitos terapêuticos em comparação com canabinoides isolados; no entanto, as combinações de proporções ideais e as doenças ou condições específicas melhor visadas por essas combinações permanecem desconhecidas
Aqui, avaliamos sistematicamente várias proporções de combinações canabinoides-terpenos para elucidar seus efeitos antioxidantes sinérgicos em modelos fisiologicamente relevantes de DRGE. Além disso, exploramos se proporções específicas de canabinoides-terpenos poderiam mitigar a mutagênese induzida por DCA e danos ao DNA através de um efeito entourage. Esses achados preliminares apoiam futuras investigações in vivo e fornecem prova de conceito de que direcionar o ECS com fitoquímicos pode oferecer novas estratégias terapêuticas para a prevenção do EAC.
Material e Métodos
Produtos químicos e reagentes:
Canabinoides foram adquiridos da Cayman Chemical e terpenos foram adquiridos da Sigma Aldrich. O coquetel de ácidos biliares consistiu em uma mistura equimolar de glicocolato, taurocolato, glicodesoxicolato, glicoquenodesoxicolato e desoxicolato a uma concentração final de 300 μM. Este coquetel reflete a mistura de ácidos biliares à qual o esôfago distal é normalmente exposto durante o refluxo gastroesofágico .
Cultura de Células.
Linhagens celulares humanas foram adquiridas dos seguintes fornecedores: HET1a (ATCC, cat# CRL-2692, Virgínia, EUA), Células Epiteliais Esofágicas Humanas (Sciencell, cat# 2720, Califórnia, EUA; CellBiologics, cat# H-6046, Illinois, EUA), CP-A (KR-42421) (ATCC, cat # CRL-4027, Virgínia, EUA). De acordo com as informações do fornecedor, as células foram obtidas sob protocolos aprovados pelo IRB. Células esofágicas normais foram plaqueadas em frascos pré-revestidos com 0,01 mg/mL de fibronectina humana (Corning, cat# 356008, Nova York, EUA) e 0,03 mg/mL de Colágeno I, bovino (ChemCruz, cat# sc-29009, Texas, EUA) e cultivadas em Meio de Crescimento de Células Epiteliais Brônquicas (Lonza, Cat# CC-3170, Basel, Suíça). Células de esôfago de Barrett CP-A foram mantidas em MCDB-153 suplementado com 0,4 μg/ml de hidrocortisona, 20 ng/ml de fator de crescimento epidérmico humano recombinante, 8,4 μg/L de toxina colérica, 20 mg/L de adenina, 140 μg/ml de extrato de pituitária bovina, 1x Suplemento ITS (Sigma; I1884), 4 mM de glutamina e 5% de soro fetal bovino.
Análises de expressão gênica de GPCR:
Estas análises foram realizadas usando dados publicamente disponíveis no NCBI Gene Expression Omnibus sob GSE1420. Nenhum recrutamento ativo de pacientes exigindo aprovação do IRB foi realizado neste estudo. Os dados de expressão gênica dos Arrays Affymetrix Human Genome U133A, compostos pelo epitélio esofágico normal (n=8), esôfago de Barrett (BE) (n=8) e adenocarcinomas esofágicos (EAC) (n=8), foram analisados usando a ferramenta web interativa GEO2R.
Análise de viabilidade celular.
As células foram cultivadas antes da exposição aos artigos de teste indicados. Após o tratamento, as células foram lavadas e ressuspensas em RPMI ou DMEM sem vermelho de fenol e subsequentemente tratadas com o ensaio XTT (ThermoFisher, Waltham, MA, EUA) ou o ensaio MTS (Promega, Madison, WI, EUA) seguindo os protocolos do fabricante.
Imuno-histoquímica.
Para avaliar a expressão de CB1, um tissue array contendo 50 casos/50 núcleos de adenocarcinoma de esôfago, adenocarcinoma de cárdia e tecido normal de esôfago e cárdia foi obtido da Biomax (cat# BC001113, Rockville, MD, EUA). As secções de tecido foram então reidratadas através de uma série de soluções de etanol e colocadas em água destilada. A recuperação antigênica foi realizada em citrato de sódio, pH 6,0 (Sigma, S-4641, St. Louis, MO, EUA) usando uma panela de pressão elétrica. As secções de tecido foram colocadas em uma solução de TritonX-100 a 0,1% (Sigma, T9284) em tampão fosfato-salino (PBS) por 15 minutos e pré-bloqueadas com Reagente de Bloqueio de peróxido de hidrogênio (Abcam, 64218, Cambridge, Reino Unido). A solução de bloqueio consistindo de soro normal de jumento a 10% em PBS (EMD Millipore, S30–100 ML, Billerica, MA, EUA) foi adicionada às lâminas e deixada por 30 minutos à temperatura ambiente. A solução de bloqueio foi substituída pelos anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio usando anti-CB1 de coelho (clone D5N5C, Cell Signaling Technologies, cat# 93815, Massachusetts, EUA) e anti-molécula de adesão de células epiteliais (EPCAM) (Origene, cat# UM500096, Maryland, EUA), que foi usado para marcar o CEE. As secções de tecido foram incubadas em solução de anticorpo primário durante a noite a 4°C e lavadas duas vezes com Tween-20 a 0,1% (Promega, H5151, Madison, WI, EUA) em PBS. As secções foram então incubadas com anticorpo secundário (IgG-594 anti-coelho de jumento e IgG-488 anti-camundongo de jumento) diluído a 1:500 em PBS por 1 hora à TA e lavadas duas vezes em Tween-20 a 0,1% em PBS por 15 minutos cada. 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) foi usado para corar os núcleos. A análise semiquantitativa foi realizada usando uma análise de H-score por dois observadores independentes. A proporção (0–100) e a intensidade da imunomarcação de CB1 (0: sem marcação; 1: marcação fraca; 2: marcação moderada; 3: marcação forte) foram usadas para calcular um H-score.
Potencial de Membrana Mitocondrial.
O Kit de Ensaio MitoProbe JC-1 para Citometria de Fluxo (cat# M34152, ThermoFisher, Massachusetts, EUA) foi usado para medir o potencial de membrana mitocondrial. Dependendo do grupo experimental, as células foram pré-tratadas com a mistura de CBG/Phytol ou DMSO e incubadas por 2 horas a 37°C em uma incubadora de CO2. As células foram então tratadas com DCA com a mistura de CBG/Phytol ou DMSO. Após o tratamento, as células foram carregadas com 2μM de JC-1 e incubadas por 15 minutos a 37°C. Os monômeros de JC-1 citoplasmáticos foram detectados no espectro verde (529 nm) enquanto os agregados J mitocondriais foram detectados no espectro vermelho (590 nm). Os resultados são representativos de 2 e 3 repetições independentes por linhagem celular.
Antes dos tratamentos, as células foram lavadas e incubadas com 2 μM de CM-DCFDA (Life Technologies, Grand Island NY) por 10 minutos, seguidas por uma lavagem em PBS e recuperação em DMEM por 15 min. As células foram então tratadas conforme descrito na legenda da figura. Após o tratamento, as células foram analisadas por leitor de placas fluorescentes ou tripsinizadas em células únicas e processadas por citometria de fluxo (excitação: 488 nm; emissão: 535 nm). A intensidade da fluorescência foi calculada como % de aumento do controle veicular.
Dano ao DNA.
A ativação de ATM e H2AX (um marcador de quebras de DNA) foi medida utilizando o kit Muse Multi-Color DNA Damage (MilliporeSigma, Burlington, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A porcentagem de células ativadas por ATM e células ativadas por H2AX foi determinada como ativação dupla monitorando a expressão tanto de ATM quanto de γ-H2AX, utilizando o Muse Cell Analyzer (MilliporeSigma, Burlington, MA, EUA). A expressão de γ-H2AX foi determinada por citometria de fluxo em um citômetro de fluxo Accuri C6 seguindo o protocolo do fabricante (MilliporeSigma, Burlington, MA, EUA).
Avaliação do impacto na estabilidade do genoma.
As células HET1A foram cultivadas com veículo, 100 μM de DCA, mistura de CBG/Phy, ou uma combinação de DCA e mistura de CBG/Phy por 14 dias. O DNA dessas células e das células parentais (Dia 0) foi extraído usando o kit QIAGEN DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, cat# 69504, Maryland, EUA) e hibridizado a arrays PMDA (Affymetrix). A instabilidade genômica em células cultivadas foi avaliada identificando novos eventos de número de cópias (tanto deleções quanto amplificações), usando o DNA das células do "Dia 0" como ponto de referência.
Resultados
Para explorar se canabinoides e terpenos podem minimizar os efeitos nocivos do DCA, realizamos ensaios de viabilidade celular, despolarização mitocondrial e danos ao DNA utilizando uma linhagem celular epitelial esofágica estabelecida, HET1a, e células epiteliais esofágicas humanas primárias HEsEpiC, conforme resumido na Fig. 1A. Utilizando várias concentrações de DCA previamente encontradas nos aspirados esofágicos de pacientes com DRGE, determinamos que a dose letal 50% (EC50) para DCA em células HET1a é de 295,4 μM com um R2 de 0,9935 (Fig. S1A). Também descobrimos que o DCA pode induzir despolarização da membrana mitocondrial em doses iguais ou superiores a 300 μM (Fig. 1B). Testamos combinações de canabinoides e terpenos com propriedades antioxidantes conhecidas quanto à sua capacidade de neutralizar os danos ao DNA induzidos pelo DCA (Fig. 1C). Em células HEsEpiC tratadas com DCA, observamos um aumento de mais de 5% nas células ATM+ H2AX+ em comparação com controles não tratados (Fig. 1C). A adição do tetraidrocanabinoide (THC) não teve efeito sobre os danos ao DNA induzidos pelo DCA, enquanto a combinação de CBG e o terpenoide Phy resultou em uma redução significativa na porcentagem de células ATM+ H2AX+ (Fig. 1C e Fig. S2). Vale notar que um efeito semelhante foi observado quando as células foram tratadas com CBG em combinação com mirceno ou β-cariofileno (Fig. 1C e Fig. S2). Além disso, investigamos várias concentrações de CBG e Phy quanto à sua capacidade de reduzir as ROS induzidas pelo DCA (Fig. S1A). Descobrimos que a combinação de 1 μM de CBG e 1 μM de Phy foi capaz de diminuir significativamente as ROS em comparação ao controle não tratado (p < 0,0001). Em seguida, testamos várias proporções da combinação de CBG e Phy quanto à sua capacidade de reverter a despolarização da membrana mitocondrial e os danos ao DNA induzidos pelo DCA. Determinamos que a proporção de combinação 1:5 de CBG e Phy pode reverter a despolarização da membrana mitocondrial induzida pelo DCA (Fig. 1D). Além disso, a proporção de combinação 1:5 de CBG/Phy apresentou uma tendência de reduzir a formação de quebras de DNA desencadeadas pelo DCA na linhagem celular HET1a, medida como porcentagem de células ATM+H2AX+ (Fig. 1E).
A mistura de CBG e Phy restringe a proliferação e promove a apoptose de células epiteliais esofágicas danificadas pelo DCA.
Para testar se CBG/Phy pode prevenir a propagação de células epiteliais esofágicas danificadas pelo DCA, primeiro avaliamos seu efeito na proliferação celular após a exposição ao DCA. Células HET1A foram pré-tratadas com CBG/Phy na proporção de 1:5 e expostas ao DCA por 24 horas. Em seguida, as células foram incubadas com meio fresco sem DCA e com CBG/Phy ou veículo controle. Após 48 horas de cultura, o ensaio de viabilidade celular XTT revelou que o tratamento com CBG/Phy isoladamente não teve efeito significativo na proliferação celular em comparação com os controles não tratados. Em contraste, o DCA inibiu significativamente a proliferação de células HET1A em 48 horas, no entanto, um aumento significativo na proliferação celular foi observado subsequentemente em 72 horas de cultura, ou seja, 48 horas após a remoção do DCA (Fig. 2A). Em contraste, culturas de HET1A pré-tratadas com a mistura CBG/Phytol e expostas ao DCA exibiram proliferação reduzida mesmo após a retirada do DCA (Fig. 2A). Esses resultados indicam que, enquanto as células tratadas com DCA têm a capacidade de retomar a proliferação celular após a remoção do DCA e, portanto, propagar células com alterações adquiridas no DNA, o tratamento com a mistura CBG/Phy pode prevenir a expansão dessas populações celulares danificadas. Para testar se o tratamento com CBG/Phy sensibiliza as células danificadas pelo DCA à apoptose, expusemos células HET1A a concentrações de DCA variando de 0 a 500 μM, com CBG/Phy na proporção de 1:5 ou pré-tratamento com veículo controle (Fig. 2B). Descobrimos que CBG/Phy reduziu a EC50 do DCA para 281,3 μM, em comparação com 370,6 μM observada no grupo controle veículo. Em conjunto, esses resultados sugerem que a combinação CBG/Phy previne a proliferação e induz a apoptose de células danificadas pelo DCA, o que pode ser crítico para interromper a carcinogênese esofágica no contexto da exposição ao DCA.
CBG e Phy Atenuam a Instabilidade Genômica Desencadeada pelo DCA
Com base nos efeitos mutagênicos previamente relatados do DCA e em nossos resultados atuais que demonstram o papel da mistura CBG/Phy 1:5 em neutralizar o dano ao DNA induzido pelo DCA, avaliamos o papel de CBG/Phy na reversão da instabilidade genômica causada pelo DCA usando os arrays PMDA de genoma completo (Affymetrix) (Fig. 3A). Descobrimos que o tratamento de células HET1A com DCA resultou na aquisição significativa de novos eventos de número de cópias ao longo de um período de três semanas em comparação com o veículo controle (Fig. 3A). Especificamente, observamos um aumento tanto nas amplificações quanto nas deleções gênicas (Fig. 3B). Quando as células HET1A foram tratadas com a combinação CBG/Phy 1:5 após a exposição ao DCA, observamos uma diminuição significativa nas amplificações e deleções gênicas (Fig. 3B). Notavelmente, nenhuma alteração significativa nos novos eventos de número de cópias foi observada com o tratamento com CBG/Phy isoladamente na ausência de DCA em comparação com as amostras controle veículo (Fig. 3B). Esses dados demonstram que o tratamento com CBG/Phy pode atenuar a instabilidade genômica desencadeada pelo DCA e reduzir a mutagenicidade no contexto da exposição crônica ao DCA.
A combinação CBG/β-cariofileno 1:5 mitiga o ROS induzido por pH baixo e ácido biliar em células do esôfago de Barrett metaplásico
Em seguida, perguntamos se as combinações de canabinoides e terpenos também podem proteger as células esofágicas metaplásicas após exposição aguda a um ambiente de pH baixo (pH 4,5) combinado com um coquetel de ácidos biliares composto por múltiplos ácidos biliares secundários em concentrações que imitam o ambiente cáustico durante o refluxo gastroesofágico (RGE) (Fig. 4A). A linhagem celular de esôfago de Barrett, CP-A, foi pré-tratada com um controle veículo ou canabinoides na presença ou ausência de terpenos por 12 horas, seguida por uma exposição aguda (15 minutos) ao pH baixo e ao coquetel de ácidos biliares (Fig. 4A). As células foram imediatamente analisadas para ROS via detecção fluorescente de CM-DCFDA ou recuperadas por 24 horas e analisadas quanto a danos no DNA via citometria de fluxo de γ-H2AX. Descobrimos que a exposição aguda à combinação de pH baixo/ácido biliar resulta em um aumento significativo de ROS (Fig. 4B). Usando um ensaio de viabilidade celular MTS, determinamos que 1 μM de canabinoide não resultou em aumento da morte celular ou afetou a proliferação (Fig. 4C). Em seguida, usando citometria de fluxo para rastrear várias combinações de terpenos e canabinoides na proporção de 1:5, determinamos que, embora CBG e Phy tenham reduzido a quantidade de ROS causada pelo insulto de pH baixo/ácido biliar, a maior redução de ROS foi identificada na combinação de CBG e β-cariofileno (β-car) (Fig. 4D). De fato, quando testamos essa combinação nas células residuais, colhidas 24 horas após o tratamento, determinamos uma diminuição significativa do dano ao DNA, conforme determinado pela fluorescência de γ-H2AX (Fig. 4E). Por fim, comparamos outras combinações 'padrão ouro' que são conhecidas por reduzir o ataque tóxico do RGE, incluindo catalase e o ácido biliar terciário ácido ursodesoxicólico (UDCA). Notavelmente, os resultados sugeriram que o tratamento com CBG/β-car (1:5) mitigou o insulto oxidativo do RGE melhor do que o UDCA (Fig. 4F).
Associação do CB1 e dos receptores acoplados à proteína G (GPCRs) com a carcinogênese esofágica
Tem se tornado cada vez mais claro que o ECS funciona através de múltiplas vias receptoras além do CB-1 e CB-2. De fato, alguns GPCRs, como GPR35 e GPR63, são considerados com afinidade por endo- e fito-canabinoides. Para avaliar o papel dos GPCRs na carcinogênese associada ao BE, primeiro examinamos a expressão do receptor canabinoide acoplado à proteína G CB-1 estabelecido no esôfago normal e no EAC. Observamos expressão puntiforme de CB1 principalmente na camada basal do epitélio escamoso estratificado esofágico normal (Fig. 5 A&B). No EAC, o CB1 foi coexpresso com o marcador epitelial EPCAM (Fig. 5 C&D) e significativamente regulado positivamente com base na análise semiquantitativa de intensidade pelo H-score (Fig. 5E). Em seguida, investigamos a expressão de GPCRs adicionais no epitélio normal, na metaplasia BE e no adenocarcinoma esofágico (EAC) a partir dos dados publicamente disponíveis GSE1420. Usando a ferramenta interativa GEO2R, com base no log2FC > 0,9 e valores de p ajustados < 0,05, identificamos uma coorte de GPCRs que foram significativamente expressos de forma diferencial no BE e EAC em comparação ao epitélio esofágico normal. Entre eles, GPR35 e GPR5CA foram significativamente regulados positivamente tanto no BE (Fig. 5A) quanto no EAC (Fig. 5B), enquanto GPR63 foi regulado negativamente no BE (Fig. 5A). GPR45 e GPR143 foram regulados negativamente especificamente no EAC (Fig. 5B). Essas observações apontam para o papel potencial da modulação do CB1 e de GPCRs adicionais para a prevenção e tratamento do EAC.
Discussão
Apresentamos um esforço de triagem de medicamentos inédito para o dano induzido pela DRGE que aproveita as propriedades do ECS usando fito-canabinoides e terpenos bioativos. Descobrimos que combinações específicas e proporções dessas combinações são eficazes para diferentes etiologias patológicas no esôfago. Ainda precisa ser estudado como essas combinações e proporções podem ser empregadas de forma clínica para prevenir a conversão de doença maligna e suprimir os efeitos mutagênicos do refluxo de ácido biliar.
Aproveitar as propriedades medicinais de produtos naturais não é um conceito novo. Existem muitos compostos bioativos presentes em plantas medicinais que demonstraram potencial para terapia do câncer. Em particular, compostos bioativos, como [6]-Gingerol, timoquinona, artepilina C e polissacarídeo de Ganoderma atrum, que demonstraram interromper o potencial da membrana mitocondrial, induzir a liberação de citocromo C e ativar a atividade de caspase. Por outro lado, a planta Cannabis sativa tem sido usada como planta 'medicinal' por milhares de anos, mas suas propriedades medicinais foram pouco estudadas, dadas as questões governamentais e legais que a envolvem globalmente. Em contraste com outros produtos naturais e sua atividade individual, descobrimos que canabinoides e terpenos compartilham qualidades sinérgicas que requerem combinações específicas para serem 'terapêuticas', pelo menos no contexto de GER e DRGE. Existem muitas outras combinações que poderiam ser testadas, incluindo combinações de três compostos e quatro compostos, entre outras.

Nossos achados apoiam a hipótese de que CBG e Phy neutralizam o aumento da produção de ROS mediado por DCA e o consequente dano oxidativo ao DNA. Portanto, investigamos o potencial de usar a mistura CBG/Phy como uma terapia quimiopreventiva. No entanto, nossos achados também mostram que a mistura CBG/Phy prepara as células epiteliais esofágicas humanas para sofrer apoptose quando expostas a altas concentrações de DCA. Nossos dados mostraram que, em células esofágicas humanas, o pré-tratamento com a mistura CBG/Phytol e 300 μM de DCA levou a uma interrupção significativa do potencial da membrana mitocondrial e aumento da apoptose celular. Isso pode explicar por que a pré-incubação com CBG/Phytol foi necessária para neutralizar o efeito do DCA e por que ela pôde neutralizar significativamente a instabilidade genômica mediada por DCA. Nossos achados de que CBG e β-car promovem uma resposta terapêutica ideal em células metaplásicas após agressão por baixo pH e ácido biliar sugerem que uma combinação não é universalmente protetora e pode até ser específica da doença.

Mecanismo de ação proposto.
Descobrimos que a mistura de CBG e Phy ou β-car afetou o potencial de recuperação a longo prazo de células epiteliais esofágicas humanas. Mostramos que 100 μM de DCA é suficiente para afetar a proliferação celular, mas não induz apoptose celular mediada por mitocôndrias. Mecanisticamente, foi sugerido que os ácidos biliares não conjugados perturbam as vias celulares e promovem a liberação de ROS das mitocôndrias, perturbando a membrana externa mitocondrial e promovendo o inchaço mitocondrial . O CBG pode ativar o CB1 mitocondrial através do G-alpha-i intramitocondrial e inibir a adenilil ciclase solúvel, o que inibe a proteína quinase A e leva à fosforilação a jusante de proteínas envolvidas no sistema de transporte de elétrons mitocondrial . O Phy, por exemplo, regula a respiração celular inibindo irreversivelmente a SSADH, que está presente na membrana mitocondrial interna . Nossos dados mostram que a manutenção de células com a mistura CBG/terpeno e DCA apresentou proliferação celular reduzida, o que poderia ser resultado de danos a longo prazo nas mitocôndrias. Além disso, a mistura CBG/terpeno pode potencialmente inibir/reverter a instabilidade do DNA induzida por DCA ao promover a instabilidade da membrana mitocondrial e subsequente apoptose mediada por mitocôndrias. Portanto, a mistura CBG/terpeno pode promover uma redução no dano/instabilidade total do DNA ao induzir apoptose e eliminar células com instabilidade significativa do DNA. Um potencial benefício da eliminação de mitocôndrias danificadas mediada por DCA é que isso pode ajudar a neutralizar a instabilidade genômica mediada por DCA. Existe a possibilidade de que outro mecanismo seja responsável pelo efeito na viabilidade celular pela mistura, mas isso exigirá investigação adicional. É importante notar que avaliações adicionais em modelos que representem mais de perto a fisiologia humana, incluindo modelos in vitro multicelulares complexos e modelos in vivo, devem ser avaliados para confirmar o efeito do nosso mecanismo de ação proposto e a eficácia das combinações de CBG e terpenos.

Juntos, os dados sugerem que as misturas de CBG e Phy ou β-car aqui identificadas promovem apoptose celular mediada por mitocôndrias apenas em combinação com DCA. Isso sugere ainda que essas misturas preparam as células para a apoptose e, além disso, interferem em uma recuperação repleta de mutações. Uma combinação de CBG e terpenos pode levar a novas estratégias de prevenção do câncer para superar o aumento significativo do câncer de esôfago, uma doença para a qual não existe tratamento eficaz.
Material Suplementar
Conflito de Interesses: A.G., G.G. e N.Y.F. são inventores de uma patente norte-americana cedida ao Brigham and Women’s Hospital e ao VA Boston Healthcare System, Boston, MA. M.H.F. e N.Y.F. são inventores ou coinventores de patentes norte-americanas e internacionais cedidas ao Brigham and Women’s Hospital, ao Boston Children’s Hospital, ao Massachusetts Eye and Ear Infirmary e ao VA Boston Healthcare System, Boston, MA, licenciadas para a Rheacell GmbH & CoKG (Heidelberg, Alemanha). M.H.F. possui participação societária e atua como consultor científico da Rheacell GmbH & Co. KG.

Declaração de compartilhamento de dados:
Os conjuntos de dados gerados durante e/ou analisados no presente estudo estão disponíveis junto ao autor correspondente mediante solicitação razoável.

Referências
Esôfago de Barrett: prevalência-incidência e etiologia-origens
Esôfago de Barrett: prevalência e incidência de adenocarcinomas
Prevalência do Esôfago de Barrett e do Adenocarcinoma Esofágico com e sem Refluxo Gastroesofágico: Uma Revisão Sistemática e Metanálise
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Esôfago de Barrett: da metaplasia à displasia e câncer
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Um novo papel para o ácido ursodesoxicólico na inibição da apoptose pela modulação da perturbação da membrana mitocondrial
O ácido desoxicólico modula a sinalização de morte celular através de mudanças nas propriedades da membrana mitocondrial
O trocador Na+/H+ controla a apoptose induzida pelo ácido desoxicólico por um desvio iônico ativado por H+ e dependente de Na+ em células esofágicas
Geração de radicais livres mitocondriais, estresse oxidativo e envelhecimento
O metabolismo do oxigênio causa quebras cromossômicas e está associado à apoptose neuronal observada em mutantes de reparo de quebras de fita dupla de DNA
Estamos progredindo na prevenção do câncer esofágico relacionado ao Barrett?
Efeito benéfico do canabinóide vegetal não psicotrópico canabigerol na doença inflamatória intestinal experimental
Fitocanabinóides e endocanabinóides
Os efeitos farmacológicos e clínicos da cannabis medicinal
Modulação canabinóide de distúrbios neuroinflamatórios
Canabinóides, inflamação e fibrose
Evidência de que o canabinóide vegetal canabigerol é um agonista altamente potente do receptor alfa2-adrenérgico e um antagonista moderadamente potente do receptor 5HT1A
Fit, um álcool diterpênico, inibe a resposta inflamatória reduzindo a produção de citocinas e o estresse oxidativo
A heterogeneidade e complexidade dos extratos de Cannabis como agentes antitumorais
O estado atual e perspectivas futuras dos canabinóides na biologia do câncer
Um efeito entourage: ésteres de glicerol de ácidos graxos endógenos inativos aumentam a atividade canabinóide do 2-araquidonoil-glicerol
Identificação de misturas terapêuticas essenciais mínimas a partir de extratos de plantas de cannabis por triagem em modelos celulares e animais de câncer
O Efeito Entourage em Produtos Medicinais de Cannabis: Uma Revisão Abrangente
Propriedades terapêuticas de estratégias de tratamento com múltiplos canabinoides para a doença de Alzheimer
Caracterização de células escamosas esofágicas resistentes a ácidos biliares em pH ácido: implicação para a patogênese do esôfago de Barrett
A progressão da metaplasia de Barrett para adenocarcinoma está associada à supressão dos programas transcricionais de diferenciação epidérmica
Estabelecimento e caracterização de células epiteliais esofágicas humanas imortalizadas pelo antígeno T do SV40
Ácidos biliares tóxicos na doença do refluxo gastroesofágico: influência da acidez gástrica
Ácidos biliares hidrofóbicos, instabilidade genômica, seleção darwiniana e carcinogênese do cólon
Efeitos protetores do ácido glicoursodesoxicólico em células do esôfago de Barrett
Uma Atualização sobre Receptores Acoplados à Proteína G Relacionados a Canabinoides Não-CB1, Não-CB2
GPR55 e GPR35 e sua relação com receptores de canabinoides e lisofosfolipídeos
Identificação de ligantes de receptores lipídicos acoplados à proteína G usando o ensaio PathHunter de beta-arrestina
Estruturas de Receptores para um Caldeirão de Canabinoides
O Papel dos Componentes Bioativos de Ervas na Função Mitocondrial e na Terapia do Câncer
Cannabis Medicinal: História, Farmacologia e Implicações para o Ambiente de Cuidados Agudos
Desafios Analíticos e Farmacológicos na Pesquisa sobre Cannabis
Os desafios da pesquisa sobre cannabis medicinal
O ácido ursodesoxicólico pode inibir a apoptose induzida pelo ácido desoxicólico modulando o potencial transmembrana mitocondrial e a produção de espécies reativas de oxigênio
Uma ligação canabinoide entre mitocôndrias e memória
Fitól, um diterpenoide inibidor da SSADH da Lactuca sativa
Uma combinação de CBG e Phy na proporção de 1:5 pode reverter a despolarização mitocondrial e o dano ao DNA induzidos pelo DCA em células epiteliais esofágicas HET1a e HEsEpiC.
(A) Ilustração esquemática do delineamento experimental.
(B) Análises representativas de citometria de fluxo do potencial de membrana mitocondrial em células HET1A tratadas com DCA, medidas por alterações fluorescentes vermelhas e verdes realizadas com o Kit de Ensaio MitoProbe JC-1. Células com potencial de membrana mitocondrial normal são representadas no canto superior direito (vermelho), e as células com potencial de membrana mitocondrial reduzido são mostradas no canto inferior direito (verde).
(C) O mapa de calor ilustra a porcentagem de células ATM+/H2AX+ em culturas de células HEsEpiC pré-tratadas com diversos canabinoides e terpenos na proporção de 1:5, enquanto expostas a 100 μM de DCA. Os dados foram analisados usando o Muse Multi-color DNA Damage Kit (Cytek, EUA).
(D) O mapa de calor ilustra as alterações no potencial de membrana mitocondrial em células HET1A tratadas com concentrações e proporções variadas de CBG e Phy na presença de 100 μM de DCA.
(E) O gráfico de barras ilustra a porcentagem de células HET1A ATM+/H2AX+ após tratamento com CBG e Fitól na proporção de 1:5 na presença de DCA. Os dados foram analisados usando o Muse Multi-color DNA Damage Kit (Cytek, EUA).
O efeito do CBG e do Phy na proliferação e apoptose de células esofágicas danificadas pelo DCA.
(A) Ensaio de viabilidade celular por XTT de células HET1a submetidas a 100 μM de DCA ou controle veicular por 24 horas na presença ou ausência de CBG e P.
(B) O gráfico representa uma análise de regressão não linear da porcentagem de células apoptóticas na linhagem celular HET1a cultivada com ou sem pré-tratamento com CBG/Phy e exposta a DCA em concentrações variando de 0 a 500 μM.
CBG e Phy na proporção de 1:5 reduzem a instabilidade genômica induzida por DCA em células epiteliais esofágicas normais.
(A) Gráficos de dispersão das amplificações e deleções de todo o genoma em células HET1A cultivadas na presença de controle veicular, 100 μM de DCA, mistura de CBG/Phytol, ou uma combinação de 100 μM de DCA e mistura de CBG/Phytol por 14 dias. O DNA extraído no dia 14 foi comparado usando matrizes PMDA (Affymetrix) ao DNA de células não tratadas coletadas no dia 0.
(B) Gráficos de barras ilustram as análises quantitativas das amplificações de todo o genoma (painel esquerdo) e deleções (painel direito). Os dados foram analisados usando ANOVA de uma via com comparações múltiplas. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; ns, não significativo.
CBG e β-car (1:5) revertem o efeito danoso do refluxo gastroesofágico contendo ácido (GER) em células esofágicas de Barrett metaplásicas.
(A) Esquema do desenho experimental. A linhagem celular de BE CP-A foi tratada com controle veicular ou canabinoides na presença ou ausência de terpenos por 12 horas, seguido por uma exposição aguda de 15 minutos a um coquetel fisiologicamente relevante de baixo pH e ácidos biliares, conforme descrito nos Métodos. As células foram imediatamente analisadas para ROS via detecção fluorescente de CM-DCFDA ou recuperadas por 24 horas e analisadas para danos no DNA usando citometria de fluxo de γ-H2AX.
(B) Gráfico de barras ilustra as análises comparativas de ROS medidas pela fluorescência de CM-DCFDA em células CP-A após exposição aguda ao GER. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo, e os resultados são mostrados como aumento percentual em comparação ao controle veicular. Os dados foram analisados usando teste t não pareado com correção de Welch. * p < 0,05, n=3
(C) Ajuste não linear da análise de viabilidade celular por dose-resposta de células CP-A após exposição a canabinoides por 24 horas, analisada usando o Kit de Ensaio MTS.
(D) Mapa de calor mostra as mudanças nas ROS induzidas pelo GER em células CP-A pré-tratadas com as combinações de canabinoide e terpeno na proporção de 1:5, conforme determinado pela fluorescência de CM-DCFDA. Os dados são expressos como a mudança percentual quando comparados ao GER isoladamente.
(E) Análises representativas de citometria de fluxo de danos no DNA conforme determinado pela fluorescência de γ-H2AX em células CP-A pré-tratadas com CBG e β-car após exposição ao GER.
(F) O gráfico de barras representa as análises comparativas de ROS medidas pela fluorescência de CM-DCFDA em células CP-A expostas a GER e antioxidantes (Catalase), ácido ursodesoxicólico (UDCA) ou a combinação de canabinoide/terpeno de CBG e β-car na proporção de 1:5. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo, e os resultados são mostrados como aumento percentual em comparação ao controle veículo. Os dados foram analisados usando ANOVA de uma via com o teste de comparações múltiplas de Šídák. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; ns, não significativo.
Expressão de CB1 na mucosa esofágica normal humana e no CEE avaliada por microscopia confocal.
(A) Uma análise representativa de imunofluorescência da expressão de CB1 (vermelho) e EPCAM (verde) na mucosa esofágica normal humana (Aumento 63x). O destaque mostra a expressão de CB1 na camada epitelial basal.
(B) Uma análise representativa de imunofluorescência mostrando a coexpressão de CB1 e EPCAM no epitélio ductal da glândula submucosa (d) e ácinos da glândula submucosa (a).
(C&D) Análises representativas de imunofluorescência da coexpressão de CB1 e EPCAM em duas amostras distintas de CEE humano.
(E) O gráfico de barras representa uma análise comparativa de intensidade semiquantitativa do H-score da expressão de CB1 na mucosa esofágica normal humana e no CEE. Os dados foram analisados usando o teste U de Mann-Whitney. ** p < 0,01.
Desregulação da expressão gênica de GPCR no BE clínico e no CEE associado ao BE.
(A) O gráfico de vulcão representa genes diferencialmente expressos no BE clínico (n=8) em comparação ao epitélio esofágico normal (n=8). Os dados foram obtidos do banco de dados GSE sob o código GSE1420. Genes do BE regulados positivamente (azul) e negativamente (vermelho) foram identificados usando a ferramenta GEO2R, com base em log2FC > 0,9 e valores de p ajustados < 0,05.
(B) O gráfico de vulcão representa genes diferencialmente expressos no CEE associado ao BE clínico (n=8) em comparação ao epitélio esofágico normal (n=8). Os dados foram obtidos do banco de dados GSE sob o código GSE1420. Genes do CEE regulados positivamente (azul) e negativamente (vermelho) foram identificados usando a ferramenta GEO2R, com base em log2FC > 0,9 e valores de p ajustados < 0,05.