pmid: "37049865"
title: "Atividade Antibacteriana e Mecanismo Antibacteriano do Óleo Essencial de Erva-Cidreira."
authors: "Gao X, Liu J, Li B, Xie J"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2023 Mar 30"
doi: "10.3390/molecules28073102"
source: "PMC Full Text"

Atividade Antibacteriana e Mecanismo Antibacteriano do Óleo Essencial de Erva-Cidreira.

Autores

Gao X, Liu J, Li B, Xie J

Periodico

Molecules (Basel, Switzerland) (2023 Mar 30)

Conteudo

Atividade Antibacteriana e Mecanismo Antibacteriano do Óleo Essencial de Verbena-Limão

O efeito destrutivo e o modo de ação do óleo essencial de verbena-limão sobre as células foram investigados, tomando a Pseudosciaena D4 isolada como objeto de pesquisa. A absorbância extracelular da Pseudosciaena D4 aumentou em OD260 e OD280 após ser tratada com óleo essencial de verbena-limão, o que destruiu a integridade das células de Pseudosciaena D4, mostrando um efeito significativo na prevenção da formação de biofilme e na destruição do biofilme formado. Com o aumento da concentração de óleo essencial de verbena-limão, o polissacarídeo extracelular apresentou uma diminuição significativa no conteúdo e um aumento significativo na taxa de inibição, indicando que a secreção de polissacarídeo extracelular pelas células de Pseudosciaena D4 poderia ser inibida pelo óleo essencial de verbena-limão durante o processo de formação do biofilme. Introssecção e encolhimento celular apareceram após o tratamento com óleo essencial, e uma cavidade transparente foi formada pelo conteúdo celular extravasado. O óleo essencial de verbena-limão destruiu a parede celular, resultando em uma permeabilidade aumentada da membrana celular e vazamento do conteúdo, causando assim a morte celular.

1. Introdução

Os peixes marinhos são uma escolha alimentar popular devido à sua rica nutrição, incluindo proteínas e ácidos graxos poli-insaturados, além de selênio, iodo, vitamina D e outros nutrientes benéficos à saúde. A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda comer 1 a 2 refeições de peixe por semana para fornecer 200 a 500 mg de ômega-3-PUFA. No entanto, a qualidade do peixe fresco é propensa a declinar após ser capturado. A composição nutricional da maioria dos peixes é degradada por enzimas digestivas, lipases e microrganismos de superfície. Além disso, as mudanças na composição do peixe durante a decomposição levam não apenas à oxidação lipídica e degradação de proteínas, mas também à perda de outras moléculas valiosas.

No processo de refrigeração de produtos aquícolas, a Pseudomonas, uma bactéria Gram-negativa com necessidades nutricionais simples, é considerada um organismo específico de deterioração comum (SSO), que pode ser isolada de produtos aquícolas, produtos pecuários e laticínios. A Pseudomonas pode resistir a condições ambientais adversas através de mecanismos de defesa. A "resposta ao estresse" aparece em casos de nutrientes esgotados ou temperatura drasticamente variável, a fim de melhorar sua capacidade de se adaptar a ambientes adversos, dependendo dos produtos da expressão gênica coordenada. As Pseudomonas são capazes até mesmo de causar ceratite em alguns casos. Para neutralizar o efeito deteriorante da Pseudomonas, muitos pesquisadores têm gradualmente desenvolvido novas embalagens ativas verdes e filmes ativos biodegradáveis naturais que inibem bactérias específicas de deterioração, como Pseudomonas, no armazenamento e transporte de alimentos de frutas e vegetais, a fim de reduzir perdas econômicas e na distribuição de alimentos.
Os óleos essenciais são uma importante fonte de subprodutos da indústria de processamento agroalimentar (cascas, sementes e polpas) e são purificados das glândulas do córtex externo de frutas e vegetais, apresentando forte atividade biológica. Por exemplo, os óleos essenciais cítricos possuem fortes propriedades antioxidantes e atividade antibacteriana, sendo amplamente utilizados em produtos como bebidas, sorvetes, bolos, purificadores de ar, produtos domésticos e perfumes. O óleo essencial de verbena-limão é um tipo de óleo essencial vegetal extraído da verbena-limão. Seu principal componente é o citral, que possui fortes capacidades antioxidantes e antibacterianas. A planta e seu óleo essencial têm sido amplamente utilizados em diferentes medicinas tradicionais; por exemplo, o óleo essencial de verbena-limão pode inibir o efeito putrefativo de Listeria monocytogenes em carne bovina e pode melhorar a estabilidade do óleo de girassol, o que tem sido associado à presença de flavonoides e ácidos fenólicos. No entanto, o efeito do óleo essencial de verbena-limão sobre Pseudomonas não foi relatado. Portanto, a cepa Pseudomonas D4 previamente isolada foi tomada como objeto de pesquisa para investigar o efeito destrutivo e o modo de ação do óleo essencial de verbena-limão em suas células, de modo a fornecer uma base para o uso do óleo essencial de verbena-limão como conservante natural nos processos de armazenamento refrigerado e preservação de produtos aquáticos.
2. Materiais e Métodos
2.1. Cepa Bacteriana Pseudosciaena D4
Cepa isolada Pseudosciaena D4 (a similaridade entre D4 e a cepa Pseudomonas sp. U3-n-1 foi de 99,80% após identificação por 16S): As bactérias foram armazenadas em 9 mL de meio líquido (caldo MHB) (inóculo de 1%) e incubadas em agitador rotatório por 16 h para criar a suspensão bacteriana para uso. De acordo com o agrupamento experimental, bactérias suficientes foram expandidas e cultivadas para detecção experimental subsequente.
2.2. Materiais e Reagentes
Foram utilizados um kit FilmTracer™ LIVE/DEAD® Biofilm Viability (Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA), tubo Eppendorf, ponteira azul, ponteira amarela (Axygen, Union City, CA, EUA), kit de Heparinase Humana (HPA), reagente de Folin, ácido gálico, Azul Brilhante de Coomassie R250, o-Nitrofenil β-D-galactopiranosídeo (Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China), hemácias de ovelha (Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Xi'an, China), violeta genciana, kit de Ensaio de Atividade Metabólica de Biofilme (XTT) (Sigma, Munique, Alemanha) e óleo essencial de verbena-limão: geranial (31,79%), neral (23,75%), geraniol (22,01%) e D-limoneno (10,36%) (Beijing Sulaibao Technology Co., Ltd., Pequim, China).
2.3. Instrumentos e Equipamentos
Um leitor de microplacas (MK3 Thermo Fisher, EUA), incubadora de temperatura constante (DNP9082 Shanghai Jinghong Instrument Equipment Co., Ltd., Xangai, China), centrífuga (MIKRO220R Hettich, Vestfália, Alemanha), microvibrador (MM-1 Fábrica de Instrumentos Médicos de Jintan, Jintan, China), microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) (LSM880 Zeiss, Oberkochen, Alemanha) e microscópio eletrônico de transmissão biológico (Tecnai G2 SpiritBiotwin, FEI Company, Hillsboro, OR, EUA) foram utilizados.
2.4. Método Experimental
2.4.1. Determinação da CIM e da CBM
O teste de suscetibilidade antifúngica por microdiluição em caldo foi utilizado para detectar o efeito antimicrobiano do óleo essencial de verbena-limão sobre Pseudomonas. A cultura em agitação foi realizada na suspensão bacteriana testada (105 unidades formadoras de colônias (UFC) mL−1) e óleo essencial de verbena-limão (solvente para óleo essencial é caldo MHB) em caldo nutriente por 16 h. As concentrações de óleo essencial utilizadas foram 0,15%, 0,3%, 0,6%, 0,9% e 1,2%. A CIM é definida como a menor concentração de um fármaco que inibe o crescimento de bactérias patogênicas no meio. Além disso, a suspensão bacteriana do grupo teste sem crescimento bacteriano visível foi cultivada em ágar nutriente. A CBM foi definida como a concentração mínima de óleo essencial de verbena-limão sem crescimento de colônias.
2.4.2. Determinação da Curva de Crescimento
Um total de 1 mL de cultura overnight foi retirado e inoculado em 35 mL de meio Caldo Triptona de Soja (TSB) fresco, e a cultura estacionária foi realizada sob diferentes condições. O meio TSB estéril foi tomado como controle branco, e 100 μL foram retirados a cada 24 h para determinar a DO600.
2.4.3. Detecção da Estrutura da Biomembrana Bacteriana por Microscópio Confocal de Varredura a Laser (CLSM)
Após 72 h de formação da biomembrana, a lamínula de vidro foi suavemente lavada com PBS três vezes e fixada em paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 °C por 4 h, lavada com PBS três vezes, e então corada com o marcador de membrana bacteriano vivo/morto TM live/dead™ Biofilm Activity Kit (Film Tracer™, molecular probe*, Thermo Fisher) no escuro por 30 min. A lamínula de vidro foi lavada três vezes com PBS para remover o excesso de corantes. Finalmente, a biomembrana foi observada e fotografada com lente de imersão a óleo 63×/1,40 do CLSM sob excitação de 488 nm.
2.4.4. Determinação do Conteúdo de Polissacarídeos Extracelulares
Culturas bacterianas overnight foram inoculadas em caldo LB (1 × 105 UFC/mL) com diferentes concentrações de óleos essenciais (0 CIM, 0,5 CIM, 1 CIM, 2 CIM, 4 CIM) e cultivadas a 37 °C por 9 h. Após centrifugação a 10.000 rpm por 1 min, 1 mL do sobrenadante coletado e 1 mL de PBS (contendo 10 mg/mL de pó de azurol de pele HPA) foram cultivados a 37 °C por 2 h. Após adicionar 2 mL de ácido tricloroacético a 10% (v/v) para interromper a reação, o conteúdo de EPS e a taxa de inibição foram quantificados registrando a densidade óptica a 600 nm.
2.4.5. Teste de Permeabilidade da Membrana Celular
Usando O-nitrofenil p-galactopiranosídeo (ONPG, Sigma, St. Louis, MO, EUA) como substrato, a atividade de β-gal em Pseudomonas D4 foi medida para determinar a permeabilidade intimal. A cultura ativa da cepa Pseudomonas D4 cultivada foi lavada duas vezes com PBS, e então a cultura foi diluída no mesmo tampão para obter valores de absorbância em OD600 entre 0,5 e 0,7. Uma solução bacteriana não tratada foi usada como controle (ou seja, grupo 0 MIC). A OD600 nm foi de aproximadamente 0,2. As amostras foram cultivadas a 28 °C por 8 h, e então 10 mL de suspensão celular foram retirados de cada amostra e centrifugados a 4 °C e 8000× g por 15 min. A atividade de β-gal foi determinada pela adição de 4 mL de substrato ONPG 0,05 mol/L dissolvido em tampão fosfato 0,1 M a cada tubo contendo 0,2 mL de sobrenadante celular e 0,8 mL de tampão Z (Na2HPO4 0,06 M, NaH2PO4·H2O 0,04 M, KCl 0,01 M e MgSO4·7H2O 0,001 M). A solução foi deixada reagir a 37 °C por 30 min, e então a reação foi interrompida pela adição de 0,5 mL de Na2CO3 1 M. Finalmente, o valor da absorbância foi medido a 420 nm em um leitor de microplacas (Gen 52.06, Synergy HT, Biotech, VT, EUA). onde A é o sistema de reação (mL), 5 mL; B é o tempo de reação (min), 40 min; C é o volume da amostra usada na análise (mL), 10 mL; e 0,0045 (mL/n mol) é o coeficiente de extinção.
2.4.6. Teste de Hemólise
Pseudomonas D4 foi cultivada em infusão cérebro-coração (BHI) suplementada com 0, 0,5 MIC, 1 MIC, 2 MIC ou 4 MIC de óleos essenciais a 28 °C sob agitação (130 g) por 18 h. Após a incubação, a cultura foi centrifugada (4000× g, 4 °C, 10 min) e então adicionada à mistura contendo 900 μL de tampão hemolisina e 100 μL de glóbulos vermelhos de ovelha recém-lavados. O sobrenadante do óleo essencial foi usado como controle negativo (0% de hemólise), enquanto o controle positivo (100% de hemólise) foi preparado pela adição de 250 μL de Triton X-100 a 1% (v/v) ao tampão hemolisina e aos glóbulos vermelhos de ovelha. As amostras foram cultivadas a 37 °C por 30 min, e então centrifugadas a 4000× g a 4 °C por 10 min. Um leitor de microplacas foi usado para coletar a leitura de OD450 do sobrenadante obtido. A porcentagem de hemólise foi determinada comparando a amostra com o controle positivo.
2.4.7. Formação de Biomembrana e Experimento de Atividade Metabólica (Experimento XTT)
Setenta e duas horas após a formação da biomembrana, a lamínula foi lavada com PBS três vezes para remover as células suspensas, fixada com metanol em temperatura ambiente por 30 min e então seca em temperatura ambiente. Em seguida, a amostra foi corada com 200 μL de solução de violeta cristal a 0,1% por 30 min. A lamínula foi lavada com PBS três vezes e seca ao ar ou seca a 65 °C. Finalmente, 200 μL de etanol a 95% foram adicionados para liberar o violeta cristal, e a absorbância foi medida por um leitor de microplacas a 595 nm.
Setenta e duas horas após a formação da biomembrana, 2000 μL de meio fresco foram adicionados a cada poço (as concentrações finais foram 0, 0,5, 1, 2 e 4 CIM) e incubados a 28 °C por 8, 16 e 24 h. O reagente de marcação XTT e o reagente de acoplamento eletrônico de um kit XTT foram derretidos em banho-maria a 37 °C, e então os dois reagentes foram misturados na proporção de 50:1 com o reagente XTT. Em seguida, 100 μL de PBS e 50 μL de XTT foram adicionados a cada poço e incubados por 24 h a 28 °C ao abrigo da luz. Finalmente, a absorbância foi detectada a 450 nm.
2.4.8. Teste de Integridade da Biomembrana
Pseudomonas D4 foi inoculada durante a noite e subcultivada com uma diluição de 1:200 (volume final 2000 μL) a 28 °C em uma placa de cultura celular de 24 poços revestida com lâminas de escalada. O espécime foi cultivado continuamente por 24 h, e então o sobrenadante foi removido e substituído por meio de cultura LB fresco por três vezes consecutivas. Em seguida, 72 h após a formação da biomembrana, 2000 μL de meio fresco foram adicionados a cada poço (as concentrações finais foram 0, 0,5, 1, 2 e 4 CIM), e incubados a 28 °C por 8, 16 e 24 h. Óleo essencial de lúcia-lima em diferentes concentrações foi adicionado à solução bacteriana.
Com base no método utilizado por Chen et al., a concentração de Pseudomonas D4 foi ajustada para 1 × 10⁵ UFC/mL e centrifugada a 4000× g por 4 min. Após enxágue duas vezes com água destilada, as partículas foram suspensas com tampão PBS estéril, e então a suspensão foi incubada por 24 h. Em seguida, 100 μL de suspensão bacteriana foram removidos da placa de 96 poços em diferentes tempos e detectados por espectrofotometria a 260 nm. Além disso, espécimes com a mesma concentração sem bactérias e soluções contendo apenas bactérias sem espécimes foram usados como controles. Os espécimes tratados com cefixima foram usados como controles positivos. A quantidade de DNA liberada pelas bactérias foi detectada. Em seguida, 100 μL de Azul Brilhante de Coomassie R250 foram adicionados à placa de 96 poços e cultivados no escuro por 3 min. A proteína liberada foi detectada por espectrofotometria de absorção a 280 nm.
2.4.9. Experimento de Observação da Estrutura Bacteriana por Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Diferentes concentrações (0, 0,5 CIM, 1 CIM, 2 CIM ou 4 CIM) de óleo essencial de lúcia-lima foram adicionadas à suspensão inicial, e as células bacterianas foram obtidas por centrifugação após agitação da cultura a 30 °C por 6 h. Os espécimes foram fixados com glutaraldeído a 2,5%, enxaguados com tampão fosfato 0,01 mol L⁻¹ e fixados em tetróxido de ósmio a 1% por 2 h, e então enxaguados novamente. Posteriormente, os espécimes foram desidratados continuamente com etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100%) e tratados com acetona pura por 20 min. Os espécimes foram embebidos em resina epóxi (Spurr) para polimerização, e então cortados em fatias finas com um ultramicrótomo e duplamente corados com acetato de uranila e citrato de chumbo. Finalmente, imagens de MET foram obtidas por microscopia eletrônica de transmissão.
2.5. Análise Estatística
Comparações múltiplas foram realizadas por análise de variância de uma via (ANOVA) utilizando SPSS 22.0, e os resultados foram expressos como média ± desvio padrão.
3. Resultado Experimental
3.1. CIM e CBM
Após o cultivo da solução bacteriana ter sido tratado com óleo essencial de lúcia-lima em diferentes concentrações, a absorbância a OD600 do cultivo foi medida. A partir da clarificação e absorbância da solução bacteriana, não houve diferença significativa entre a solução bacteriana adicionada com 0,3% de óleo essencial e o grupo controle. Não houve crescimento bacteriano na placa cultivada e revestida com a solução bacteriana adicionada com 0,6%, 0,9% e 1,2% de óleo essencial. Portanto, determinou-se que a CIM e a CBM do óleo essencial de lúcia-lima na cepa Pseudomonas D4 isolada de Pseudosciaena foram de 0,3% e 0,6%, respectivamente.
3.2. Curva de Crescimento
Para analisar a atividade antibacteriana do óleo essencial de lúcia-lima, foram traçadas as curvas de crescimento de Pseudomonas D4 sob a ação de diferentes concentrações de óleo essencial de lúcia-lima. Como mostrado na Figura 1A, a taxa de crescimento de Pseudomonas foi relativamente mais rápida no grupo controle sem o tratamento com óleo essencial de lúcia-lima; em seguida, entrou em um período de crescimento logarítmico após 10 h e um período estável após 40 h. O crescimento de Pseudomonas tratada com óleo essencial de lúcia-lima a 2 × CIM foi completamente inibido.
3.3. Integridade da Membrana Celular
A integridade da membrana celular pode ser avaliada pela detecção do vazamento de ácidos nucleicos e proteínas no ambiente externo. Ácidos nucleicos e proteínas são substâncias fundamentais em toda a membrana celular bacteriana e no citoplasma, e fluem para fora quando a membrana bacteriana é rompida. Para elucidar o efeito antibacteriano do óleo essencial de lúcia-lima sobre a Pseudomonas D4, foram investigados seus efeitos na permeabilidade e na integridade da membrana celular da Pseudomonas D4. Após a destruição da membrana celular causada pelo óleo essencial de lúcia-lima, pequenos íons moleculares fluíram primeiro, seguidos por ácidos nucleicos, proteínas e outras substâncias macromoleculares. Esse fenômeno pode ser verificado medindo a alteração na integridade celular, que é caracterizada pelo vazamento de ácido nucleico e proteína através da membrana bacteriana a 260 nm e 280 nm, respectivamente. De acordo com a absorbância (OD 260 nm) do filtrado de cultura de células de Pseudomonas D4 expostas a diferentes concentrações de óleo essencial de lúcia-lima, o valor de absorbância aumentou com a extensão do tempo de cultura (Figura 1B). Enquanto isso, o valor de absorbância a 260 nm aumentou significativamente com o aumento da concentração de óleo essencial de lúcia-lima (p < 0,05). Após o tratamento com óleo essencial de lúcia-lima em diferentes concentrações (0 × CIM, 1/2 × CIM, 1 × CIM, 2 × CIM e 4 × CIM), os valores de absorbância da Pseudomonas D4 a 260 nm foram 0,02, 0,23, 0,55, 0,78 e 0,89, respectivamente (Figura 2A). Como principal sinal de destruição da membrana e lise celular, a liberação de proteína a 260 nm também requer monitoramento. A concentração de proteína após o tratamento com óleo essencial de lúcia-lima em diferentes concentrações é mostrada na Figura 1C. Semelhante aos resultados da liberação de ácido nucleico, o conteúdo de proteína também aumentou com a extensão do tempo de cultura. O valor de absorbância a 280 nm aumentou significativamente com o aumento da concentração de óleo essencial de lúcia-lima (p < 0,05). Os resultados do vazamento citoplasmático mostraram que o óleo essencial de lúcia-lima poderia induzir a ruptura da membrana celular bacteriana. Portanto, o efeito bactericida do óleo essencial de lúcia-lima pode ser inferido pela destruição da integridade celular das células de Pseudomonas D4.
3.4. Determinação da Biomassa da Biomembrana e Teste de Atividade Metabólica da Biomembrana (Teste de Redução do XTT)
A atividade antibiofilme do óleo essencial de lúcia-lima pode ser verificada medindo as alterações na biomassa do biofilme usando coloração com cristal violeta. Conforme mostrado na Figura 2A, o conteúdo da Pseudomonas D4 apresentou uma tendência de queda com o prolongamento do tempo de cultura. A concentração do óleo essencial aumentou e o conteúdo da Pseudomonas D4 diminuiu, indicando que a utilização do óleo essencial de lúcia-lima não apenas destruiu o biofilme, mas também inibiu sua produção. Quanto maior a utilização do óleo essencial, melhor o efeito inibitório. Os resultados obtidos pelo experimento de redução do XTT foram consistentes com os obtidos usando a coloração com cristal violeta.

Houve uma diferença significativa entre o grupo experimental tratado com óleo essencial e o grupo controle (p < 0,05). Em comparação com o grupo controle, o óleo essencial de lúcia-lima em diferentes concentrações reduziu significativamente a atividade do metabolismo celular no biofilme. Esses resultados mostraram o papel evidente do óleo essencial de lúcia-lima na prevenção da formação do biofilme e na destruição do biofilme. As teorias relatadas sobre a destruição do biofilme incluem as seguintes. (i) Teoria da limitação de penetração. Os polímeros extracelulares produzidos pelos próprios microrganismos envolvem as células do biofilme, formando uma barreira natural para impedir a penetração de agentes antibacterianos. Enquanto isso, a penetração de agentes antibacterianos pode ser prevenida através da alta densidade de microrganismos, pequenos espaços entre as bactérias e um grande volume de proteoglicanos hidrofóbicos no biofilme. (ii) Teoria da restrição nutricional. A maioria das bactérias é insensível aos agentes antimicrobianos devido ao suprimento limitado de nutrientes no biofilme. (iii) Outras teorias incluem a degradação ou modificação de agentes antibacterianos e as enzimas produzidas contra agentes antibacterianos. Conforme mostrado na Figura 2B, a detecção por XTT foi usada como um indicador ligado às células vivas. Após 8 h de tratamento, a atividade metabólica do grupo experimental com óleo essencial de lúcia-lima diminuiu significativamente, mas diminuiu ligeiramente após 16 h e 24 h de tratamento.

3.5. Determinação de EPS
O acúmulo de EPS espessa o biofilme e aumenta a resistência das bactérias a antibióticos e outros fatores indesejáveis. Portanto, a diminuição na produção de EPS poderia beneficiar a inibição da Pseudomonas D4. O efeito do óleo essencial de lúcia-lima na intervenção e na taxa de inibição do EPS de células bacterianas durante a formação da biomembrana foi medido. Conforme mostrado na Figura 2C,D, com o aumento da concentração do óleo essencial de lúcia-lima, o conteúdo de EPS na biomembrana da Pseudomonas D4 diminuiu significativamente (p < 0,05), enquanto a taxa de inibição aumentou significativamente (p < 0,05), indicando que a secreção de EPS pelas células de Pseudomonas poderia ser inibida pelo óleo essencial de lúcia-lima durante a formação da biomembrana. A proteção da matriz polimérica externa à biomembrana dificulta sua eliminação uma vez formada em patógenos de origem alimentar em um ambiente de processamento de alimentos ou nos alimentos. O conteúdo de polímero extracelular determina a integridade da estrutura da biomembrana e protege as células bacterianas da invasão de agentes antibacterianos. O EPS é o principal componente da matriz extracelular polimérica na biomembrana, cuja produção pode ser inibida pelo óleo essencial de lúcia-lima durante a formação da Pseudomonas D4, conforme observado neste estudo. A redução no conteúdo de EPS levou à estrutura frouxa da biomembrana, facilitando a inativação das células bacterianas na biomembrana por agentes antibacterianos, o que é favorável à inibição da produção de EPS por agentes antibacterianos na indústria alimentícia. A produção diminuída de EPS impacta a formação de biofilmes, pois o EPS tem um papel vital no estágio inicial da formação do biofilme.
3.6. Teste de Permeabilidade da Membrana Celular
A β-Galactosidase (β-Gal) pode ser usada como uma enzima marcadora osmótica celular para avaliar o dano de permeabilidade das membranas celulares causado pelo óleo essencial de lúcia-lima. Na suspensão de óleo essencial de lúcia-lima e Pseudomonas D4 em diferentes concentrações, a atividade da β-Gal aumentou com o aumento da concentração e do tempo, e foi cerca de 1,29, 1,35, 1,40 e 1,50 vezes maior do que a do CK a 0,5 MIC, 1 MIC, 2 MIC e 4 MIC por 8 h, respectivamente (Figura 2E). A atividade da β-Gal aumentou rapidamente na primeira hora após a adição do óleo essencial de lúcia-lima em diferentes concentrações, e depois aumentou gradualmente com a extensão do tempo de incubação. O óleo essencial de lúcia-lima poderia destruir a membrana celular da Pseudomonas D4 e aumentar sua permeabilidade, resultando no vazamento de componentes intracelulares.
3.7. Teste de Hemólise
Após a incubação do óleo essencial de lúcia-lima em diferentes concentrações em hemácias de ovelha, a taxa de hemólise diminuiu com o aumento da concentração do óleo essencial de lúcia-lima (Figura 3A,B). A hemólise promove a liberação de hemoglobina por meio da instabilidade da membrana celular, levando à disfunção de órgãos importantes como rins, fígado e coração. Moléculas lipofílicas presentes no óleo essencial podem interagir com a membrana eritrocitária para aumentar sua fluidez. No entanto, essa interação destrói a membrana celular, levando ao influxo desordenado de íons e água e, eventualmente, à lise dos eritrócitos. Um teste de hemólise pode determinar como os componentes do óleo essencial interagem com entidades biológicas humanas (hemácias) em nível celular; portanto, pode ser utilizado como um dos indicadores de citotoxicidade. Apesar da forte capacidade antibacteriana, alguns óleos essenciais levam a uma alta taxa de hemólise em baixas concentrações, dificultando seu uso como agente antibacteriano. Por exemplo, Rodrigues et al. identificaram o potencial de aplicação do óleo essencial no controle de Leishmania amazonensis. No entanto, sua taxa de hemólise pode chegar a 50% sob uma concentração de 50 μL/mL. Portanto, o óleo essencial de lúcia-lima não pode causar hemólise, apesar de seu forte efeito antibacteriano.
3.8. Detecção da Estrutura Bacteriana por Microscópio Confocal de Varredura a Laser (CLSM)
Meio TSB contendo Pseudomonas D4 (106 UFC/mL) foi adicionado a uma lamínula de vidro estéril para formar uma biomembrana. As células da biomembrana aderidas à lamínula, tratadas com óleo essencial de lúcia-lima em diferentes concentrações, foram marcadas com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (10 μg/mL) e mantidas ao abrigo da luz por 10 min. Amostras não tratadas foram utilizadas como controle. A biomembrana corada foi observada por CLSM em comprimento de onda de excitação de 364 nm e comprimento de onda de emissão de 454 nm.
A Figura 4 mostra o grupo controle não tratado (CK) e células de Pseudomonas D4 expostas a 1/2 × CIM, 1 × CIM, 2 × CIM e 4 × CIM de óleo essencial de lúcia-lima. Na análise de CLSM, a redução na região de fluorescência indicou o número reduzido de bactérias na biomembrana. Conforme mostrado na Figura 4 CK, a maioria das células no grupo controle de Pseudomonas D4 estava viva (verde), e todas as células eram células únicas sem agregados visíveis. Em contraste, a maioria das células tratadas apareceu como agregados verdes (células vivas) (Figura 2C–Figura 4 1/2 × CIM, 1 × CIM), o que pode ser atribuído ao envelhecimento das células, uma vez que as células foram tratadas com o óleo essencial antibacteriano de lúcia-lima no período estável inicial, durante o qual as células apresentaram a maior resistência a condições adversas. Inicialmente, a biomembrana tinha uma estrutura tridimensional densa e completa, que foi destruída em graus variados após ser tratada com óleo essencial de lúcia-lima em diferentes concentrações. Com o aumento da concentração de óleo essencial de lúcia-lima, a estrutura tridimensional da biomembrana colapsou completamente, e apenas um pequeno número de células bacterianas aderiu ao vidro (Figura 4 1/2 × CIM, 1 × CIM).

Uma razão para isso pode ser que o óleo essencial de lúcia-lima é hidrofóbico, o que pode aumentar a hidrofobicidade das células, tornando-a favorável à adesão entre as células. Yaron et al. descobriram que os componentes hidrofóbicos do óleo essencial podem destruir a membrana citoplasmática, levando ao vazamento de proteínas, induzindo assim a agregação celular, o que pode ser devido à perda de transportadores transmembrana como SecA2. O óleo essencial de lúcia-lima pode interagir com a membrana citoplasmática, resultando em danos à sua estrutura e às proteínas de membrana (como SecA2). Os resultados de CLSM mostraram um efeito favorável de eliminação do óleo essencial de lúcia-lima na biomembrana de Pseudomonas D4.

3.9. Observação da Estrutura Bacteriana por MET
Conforme mostrado na Figura 5A, a imagem de TEM mostrou que as características morfológicas externas de Pseudomonas D4 mudaram após o tratamento com óleo essencial de erva-cidreira em diferentes concentrações (0 × MIC, 1/2 × MIC, 1 × MIC e 2 × MIC). As células de Pseudomonas D4 não tratadas mantiveram sua morfologia original (Figura 5A CK). As células de Pseudomonas D4 tratadas com óleo essencial de erva-cidreira sofreram lise, resultando na liberação de seu conteúdo celular para o ambiente circundante, tornando-se, portanto, vazias. Comparado com CK, fragmentos de células apareceram ao redor das células danificadas no grupo de tratamento, revelando citoplasma eletrônico-translúcido. A parede celular e a membrana do CK estavam intactas, e a camada de peptidoglicano e a membrana plasmática estavam bem preservadas. Células rompidas foram observadas nas células de Pseudomonas D4 tratadas com óleo essencial, com paredes celulares e membranas celulares destruídas, e membranas celulares e paredes celulares localmente isoladas. Além disso, a degradação celular foi acompanhada pelo extravasamento de citoplasma das células danificadas. He et al. descobriram que Staphylococcus aureus tinha uma superfície regular e lisa no grupo controle. Staphylococcus aureus foi seriamente danificado após o tratamento com óleo essencial de rizomas de Atractylodes lancea, revelando uma forma irregular, e algumas células até sofreram lise.

3.10. Teste Anti Quorum Sensing (QS)

O sistema QS de bacilos de coloração púrpura foi utilizado para determinação. Sabe-se que a produção de violetina (um pigmento púrpura) é controlada por QS em C. violaceum CECT 494 selvagem violeta, de modo a corresponder à síntese do autoindutor de N-acil-t-homoserina lactonas (AHLs), como C6-acil homoserina lactonas e C4-acil homoserina lactonas. Para mutantes de C. violaceum CV026 e VIR07 violeta, a violetina deve ser produzida pela adição de um autoindutor exógeno (AHLs de cadeia curta e AHLs de cadeia longa, respectivamente). O método de difusão em poço foi utilizado para detectar a atividade anti-QS do óleo essencial de erva-cidreira. Neste teste (Figura 5B), um halo claro foi formado pela inibição do crescimento bacteriano, enquanto um halo turvo contendo células bacterianas acromáticas foi formado como resultado positivo da inibição de QS.
Tomando a Pseudomonas D4 como objeto de pesquisa, o efeito de destruição e o modo de ação do óleo essencial de lúcia-lima (Aloysia citriodora) sobre suas células foram estudados. Após a Pseudomonas D4 ser tratada com óleo essencial de lúcia-lima, os valores de absorbância de OD260 e OD280 aumentaram, o que destruiu a integridade celular da Pseudomonas D4. O óleo essencial de lúcia-lima reduziu significativamente a atividade do metabolismo celular no biofilme e desempenhou um papel evidente na prevenção da formação e destruição do biofilme. O conteúdo de polissacarídeo extracelular diminuiu significativamente com o aumento da concentração do óleo essencial de lúcia-lima, e a taxa de inibição aumentou significativamente com o aumento da concentração do óleo essencial, indicando que o óleo essencial de lúcia-lima pode inibir a secreção de polissacarídeo extracelular da Pseudomonas D4 durante a formação do biofilme. As células tratadas com óleo essencial de lúcia-lima apresentaram depressões e dobras, e o conteúdo celular fluiu para formar uma cavidade transparente. O óleo essencial de lúcia-lima destruiu a parede celular, aumentou a permeabilidade da membrana celular e o conteúdo celular fluiu, o que levou à morte celular.
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Contribuições dos Autores
Conceitualização, B.L. e J.X.; metodologia, X.G.; software, J.L.; validação, X.G., J.L. e B.L.; análise formal, X.G.; investigação, X.G.; recursos, X.G.; curadoria de dados, X.G.; preparação do rascunho original, B.L.; redação – revisão e edição, B.L.; visualização, J.X.; supervisão, J.L.; administração do projeto, B.L.; aquisição de financiamento, J.X. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Conselho de Revisão Institucional
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Efeitos do óleo de verbena combinado com goma de linhaça na estrutura e características bioquímicas da proteína miofibrilar em pregado
Valor Nutricional do Peixe: Lipídios, Proteínas, Vitaminas e Minerais
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Deterioração de Carne e Peixe
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Desrupção da membrana celular e do biofilme de Pseudomonas D4 pelo óleo essencial de lúcia-lima. (A) Determinação da biomassa do biofilme (método do violeta cristal) de Pseudomonas D4 em diferentes tempos e diferentes concentrações de óleo essencial de lúcia-lima a 595 nm. (B) Ensaio de atividade metabólica do biofilme (ensaio de redução do XTT) de Pseudomonas D4 em diferentes tempos e diferentes concentrações de óleo essencial de lúcia-lima a 450 nm. (C) Absorbância de Pseudomonas D4 tratada com diferentes concentrações de óleo essencial de lúcia-lima (0 × CIM, 1/2 × CIM, 1 × CIM, 2 × CIM e 4 × CIM) a 600 nm. (D) Taxa de inibição de exopolissacarídeos de Pseudomonas D4 tratada com diferentes concentrações de óleo essencial de lúcia-lima (0 × CIM, 1/2 × CIM, 1 × CIM, 2 × CIM e 4 × CIM). (E) Teste de permeabilidade da endomembrana de Pseudomonas D4 tratada com diferentes concentrações de óleo essencial de lúcia-lima (0 × CIM, 1/2 × CIM, 1 × CIM, 2 × CIM e 4 × CIM).
O óleo essencial de verbena-limão inibe o efeito hemolítico de Pseudomonas D4 em hemácias de ovelha. (A) Ensaio de hemólise de Pseudomonas D4 tratada com diferentes concentrações de óleo essencial de verbena-limão (0 × MIC, 1/2 × MIC, 1 × MIC, 2 × MIC e 4 × MIC). (B) Ensaio de hemólise de Pseudomonas D4 tratada com diferentes concentrações de óleo essencial de verbena-limão (0 × MIC, 1/2 × MIC, 1 × MIC, 2 × MIC e 4 × MIC).
Efeito inibitório do óleo essencial de verbena-limão no biofilme de Pseudomonas D4. Foto de CLSM de Pseudomonas D4 tratada com diferentes concentrações de óleo essencial de verbena-limão (0 × MIC, 1/2 × MIC, 1 × MIC, 2 × MIC e 4 × MIC).
Efeito do óleo essencial de verbena-limão em Pseudomonas D4 sob microscopia eletrônica de transmissão. (A) Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de Pseudomonas D4 tratada com diferentes concentrações de óleo essencial de verbena-limão (0 × MIC, 1/2 × MIC, 1 × MIC e 2 × MIC). (B) Ensaio anti-QS de Pseudomonas D4 tratada com diferentes concentrações de óleo essencial de verbena-limão (0 × MIC, 1/2 × MIC, 1 × MIC e 2 × MIC).