pmid: "22899959"
title: "O estragol em decocções de sementes de erva-doce pode realmente ser considerado um perigo para a saúde humana? Uma atualização sobre a segurança da erva-doce."
authors: "Gori L, Gallo E, Mascherini V, Mugelli A, Vannacci A, Firenzuoli F"
journal: "Evidence-based complementary and alternative medicine : eCAM"
pubdate: "2012"
doi: "10.1155/2012/860542"
source: "PMC Full Text"

O estragol em decocções de sementes de erva-doce pode realmente ser considerado um perigo para a saúde humana? Uma atualização sobre a segurança da erva-doce.

Autores

Gori L, Gallo E, Mascherini V, Mugelli A, Vannacci A, Firenzuoli F

Periodico

Evidence-based complementary and alternative medicine : eCAM (2012)

Conteudo

O Estragol em Decocções de Semente de Funcho Pode Realmente Ser Considerado um Perigo para a Saúde Humana? Uma Atualização sobre a Segurança do Funcho
O fruto maduro (comumente conhecido como sementes) do funcho (Foeniculum vulgare Mill.) e o óleo essencial de funcho são amplamente utilizados como agentes flavorizantes em produtos alimentícios, como licores, pão, queijo, e como ingrediente de cosméticos e produtos farmacêuticos. Além disso, as infusões de funcho são a decocção clássica para bebês em fase de amamentação, a fim de prevenir flatulência e espasmos de cólica. Tradicionalmente, na Europa e em áreas do Mediterrâneo, o funcho é usado como antiespasmódico, diurético, anti-inflamatório, analgésico, secretomotor, secretolítico, galactagogo, colírio e como remédio e integrador antioxidante. Topicamente, o pó de funcho é usado como cataplasma para picadas de cobra. Nas culturas asiáticas, o funcho era ingerido para acelerar a eliminação de venenos. Como uma das nove ervas sagradas dos antigos saxões, o funcho era creditado com o poder de curar. O funcho também era valorizado como uma erva mágica: na Idade Média, era pendurado sobre as portas na Véspera do Solstício de Verão para proteger a casa de espíritos malignos. Recentemente, devido à carcinogenicidade do estragol, o funcho tem sido acusado de ser perigoso para os humanos, especialmente se usado como decocção para bebês. Mas essa alegação não considera que o remédio é preparado como uma matriz de substâncias, e pesquisas recentes confirmam que o estragol puro é inativado por muitas substâncias contidas na decocção.

1. Introdução
   O funcho (Foeniculum vulgare Mill.) pertence à família das Apiáceas, e é uma planta herbácea anual, bienal ou perene, dependendo da variedade, que cresce em solos bons de regiões ensolaradas de clima ameno e é uma espécie de planta aromática bem conhecida. O Foeniculum vulgare possui dois tipos de funcho comercialmente importantes: o funcho amargo, Foeniculum vulgare Mill. subsp. vulgare var. vulgare, e o funcho doce, Foeniculum vulgare subsp. vulgare var. dulce. Várias partes do funcho são comestíveis (bulbos, folhas, talos e frutos). O fruto maduro (comumente conhecido como sementes) e o óleo essencial de funcho são usados como agentes flavorizantes em produtos alimentícios, como licores, pão, queijo, e como ingrediente de cosméticos e produtos farmacêuticos. Além disso, as infusões de funcho são a decocção clássica para bebês em fase de amamentação, a fim de prevenir flatulência e espasmos de cólica. Tradicionalmente, na Europa e em áreas do Mediterrâneo, o funcho é usado como antiespasmódico, diurético, anti-inflamatório, analgésico, secretomotor, secretolítico, galactagogo, colírio e como remédio e integrador antioxidante.
   É, portanto, de extrema importância que a eficácia, a qualidade e, sobretudo, a toxicologia dos remédios e preparações à base de funcho sejam avaliadas, nomeadamente quando o estragol (Figura 1), um de seus constituintes, foi notoriamente declarado uma substância cancerígena.
   A Autoridade Europeia de Segurança Alimentar (EFSA) sugeriu o uso da chamada Margem de Exposição (MOE) para definir prioridades na gestão de riscos em relação a compostos que são tanto genotóxicos quanto carcinogênicos. A MOE é definida como a razão entre o limite inferior de confiança da dose de referência que produz 10% de incidência extra de câncer (BMDL10) e a ingestão diária estimada (EDI) para o estragol, estimada a partir de diferentes fontes alimentares em 0,07 mg/kg de peso corporal/dia. A MOE para o estragol puro equivale a 129–471 e, de acordo com a EFSA, uma MOE inferior a 10.000 pode ser considerada uma prioridade para o risco humano. Defendemos que o estudo do estragol como substância isolada pode ser enganoso e deturpar a atividade dessa substância quando presente na forma de um extrato herbal complexo. Isso questiona a validade de estudos de compostos puros realizados fora do contexto da matriz alimentar normal, que deveria servir como referência para os níveis de teste em estudos de carcinogenicidade humana.
2. Constituintes Químicos do Funcho
   De acordo com a 2ª edição da monografia da Farmacopeia Europeia, o funcho-doce contém não menos que 2,0% v/m de óleo essencial, calculado com referência à droga anidra. O óleo essencial é constituído principalmente por anetol (80%) (uma substância com supostas propriedades anticancerígenas), contém não mais que 10% de estragol e não mais que 7,5% de fenchona. Outros constituintes menores podem estar presentes, incluindo: R-pineno, limoneno, β-pineno, β-mirceno e p-cimeno. Além disso, o funcho-doce contém outros constituintes não voláteis, como flavonoides e cumarinas, que até agora não receberam atenção suficiente quanto às suas propriedades farmacológicas.
   Em um artigo, o rendimento de óleo essencial dos frutos de funcho-amargo foi de 12,5 v/w, enquanto 1,8 v/w de fração volátil (correspondente ao material vegetal) foi obtido por hidrodestilação da infusão da planta, o que equivale a 14,5% do óleo essencial inicial de funcho. Os principais constituintes da fração volátil da infusão de funcho foram (hidrodestilação/SPE): trans-anetol (56,4%/58,4%), fenchona (36,2%/39,5%) e estragol (2,5%/2,2%); que também eram os compostos majoritários do óleo essencial genuíno de funcho-amargo. Nas infusões, a proporção de éteres em relação a cetonas foi significativamente deslocada para uma maior destas últimas, em comparação com o óleo essencial obtido dos frutos.
   Geralmente, os saquinhos de chá pré-embalados comercializados contêm frutos inteiros e/ou triturados ou droga em pó. O uso de frutos inteiros para preparar infusões é incorreto: porque os frutos triturados ou em pó perdem gradualmente seu teor de óleo essencial durante o envelhecimento, como muitos remédios fitoterápicos.
   Muitas pesquisas fitoquímicas foram realizadas até o momento para investigar a composição química do óleo essencial de funcho, com diferentes resultados: dependendo da época de colheita, conservação, região e área de cultivo. Os principais componentes do funcho são derivados fenilpropanoides: trans-anetol e estragol (= metil chavicol), e então alfa-felandreno, limoneno, fenchona e alfa-pineno.
   A composição do óleo essencial depende de fatores internos e externos que afetam a planta, como estruturas genéticas e condições ecológicas; as práticas agrícolas também têm efeitos críticos sobre o rendimento e a composição do óleo em cultivos de óleo essencial, embora o óleo essencial apresente alguns componentes principais que podem variar significativamente de acordo com a época de colheita, conservação, região e área de cultivo.
   Piccaglia e Mariotti indicaram a presença de cinco grupos químicos diferentes nos óleos essenciais isolados de partes aéreas frescas de funcho selvagem coletado em treze áreas italianas: (1) trans-anetol, estragol, alfa-felandreno; (2) trans-anetol, alfa-pineno, limoneno; (3) estragol, alfa-felandreno; (4) estragol, alfa-pineno; (5) alfa-felandreno. Sobre a composição química dos frutos de funcho (= sementes), a fração fenilpropanoide (80–89%) e o estragol (79–88%) dominaram o óleo dos frutos. A quantidade relativa de trans-anetol nesses óleos foi muito menor do que as que caracterizam os óleos de funcho amargo. Alguns estudos anteriores sobre óleos essenciais de frutos de funcho também mencionaram quimiotipos de estragol em quantidades variáveis (uma variabilidade na variedade), onde o estragol sozinho domina o óleo, ou está presente junto com trans-anetol ou fenchona. Esses resultados para a composição química dos óleos essenciais de partes aéreas e frutos de funcho apoiam a visão de Miraldi de que o conhecimento dos óleos essenciais de funcho ainda não é suficiente para distinguir com precisão todas as variedades existentes. Portanto, é muito difícil estabelecer a quantidade efetiva de óleo essencial, estragol e outras substâncias em diferentes preparações industriais e caseiras. Em um artigo recente, foi estudada a composição química de 3 cultivares de funcho cultivados organicamente: Foeniculum vulgare var. azoricum, var. dulce e var. vulgare. A análise por cromatografia gasosa/espectrometria de massas dos óleos essenciais revelou a presença de 18 monoterpenoides principais em todas as três cultivares, mas suas porcentagens em cada óleo foram bastante diferentes. As duas cultivares azoricum e dulce são semelhantes em sua composição química, mas muito diferentes da cultivar vulgare: o trans-anetol representou 61% e 46% no óleo das cultivares azoricum e dulce, respectivamente, enquanto representou apenas 5% na cultivar vulgare. O estragol foi o composto principal no óleo da cultivar vulgare, com uma concentração de 58% em comparação com 12% e 6% nos óleos das cultivares azoricum e dulce, respectivamente. Os óleos essenciais de duas das cultivares de funcho, ou seja, azoricum e dulce, apresentaram atividades antioxidantes dramaticamente maiores do que o óleo essencial da cultivar vulgare. Os três óleos contêm concentrações semelhantes de todos os outros compostos principais, excluindo trans-anetol e estragol, sugerindo que a atividade antioxidante está principalmente relacionada à concentração de trans-anetol. Uma das principais diferenças entre a estrutura química do estragol e do anetol é a dupla ligação da cadeia lateral propenil: no anetol ela é conjugada com o anel aromático, enquanto no estragol ela é não conjugada.
3. Carcinogenicidade do Estragol In Vitro e Suas Vias Metabólicas
   Para a formação de flavonoides, intermediários reativos procedem por sua oxidação enzimática e/ou química a metabólitos do tipo quinona/quinona metídeo, que são intermediários alquilantes reativos. Para alquenilbenzenos, incluindo estragol, metileugenol, elemicina, safrol e miristicina, os metabólitos carcinogênicos finais são seus derivados 1′-sulfooxi, que se degradam em carbocátions alquilantes que se transformam em substâncias reativas, podendo dar origem a adutos de DNA.

Sabe-se que o estragol é metabolizado por várias vias, incluindo O-desmetilação (para formar chavicol), epoxidação da dupla ligação, 1′-hidroxilação e degradação oxidativa da cadeia lateral em ácidos carboxílicos. Zangouras et al. indicam que pelo menos duas vias, nomeadamente O-desmetilação e 1′-hidroxilação, exibem dependência de dose tanto em camundongos quanto em ratos. Assim, a proporção da dose que sofre O-desmetilação diminui de forma dependente da dose, acompanhada por um aumento na proporção da dose que sofre eliminação urinária. Essa mudança presumivelmente decorre da saturação dos sistemas enzimáticos responsáveis pela O-desalquilação. O corolário disso é que, em doses mais altas, um nível de substrato relativamente maior estaria disponível para reações metabólicas alternativas, como a 1′-hidroxilação. No camundongo, a principal via do metabolismo do estragol é a hidroxilação na posição 1′; produzindo derivados com potencial carcinogênico aumentado. Ésteres de ácido sulfúrico desses compostos foram fortemente implicados como os principais metabólitos eletrofílicos e carcinogênicos finais in vivo. Assim, os citossolos do fígado de camundongos contêm atividade de sulfotransferase dependente de 3′-fosfoadenosina 5′-fosfossulfato para 1′-hidroxisafrol e 1′-hidroxideidroestragol.

A conhecida via de bioativação do estragol procede pela hidroxilação metabólica inicial pelas enzimas do citocromo P450, levando à produção do carcinógeno proximal 1′-hidroxiestragol, que, por envolvimento de sulfotransferases, é convertido no 1′-sulfooxiestragol final; uma substância instável que se degrada em um carbocátion reativo que se liga a diferentes nucleófilos endógenos e induz a produção de adutos de DNA, em particular adutos macromoleculares hepáticos; e estes, como demonstrado em roedores quando administrados como composto puro e em altos níveis de dose, induzem hepatomas (Figura 2).
Para estudar a bioativação e a desintoxicação de uma substância tóxica suspeita derivada do estragol, o modelo PBK (cinético baseado na fisiologia) foi estendido para um modelo dinâmico baseado na fisiologia (PBD), pelo qual se prevê a formação de adutos de DNA no fígado de ratos machos. Um modelo PBD foi desenvolvido estendendo o modelo PBK através da vinculação da área sob a curva para a formação de 1′-hidroxiestragol prevista pelo modelo PBK à área sob a curva para 1′-hidroxiestragol em incubações in vitro com hepatócitos de ratos expostos a 1′-hidroxiestragol. O modelo PBD assim obtido foi validado por dados experimentais in vivo sobre a formação de adutos de DNA no fígado de camundongos expostos ao estragol, uma vez que dados de ratos não estavam disponíveis. A literatura relata a formação de 1 aduto em 10.000–15.000 nucleotídeos de DNA após uma única injeção i.p. de cerca de 400 mg estragole/kg bw/dia em camundongos fêmeas CD-1. Nesta dose, o modelo PBD prevê a formação de E-3′-N2-dGuo, o principal aduto de DNA do estragol formado no fígado de rato, em um nível correspondente a 4 adutos em 10.000 nucleotídeos. Assim, os níveis de formação de adutos de DNA nos dois estudos estão dentro da mesma ordem de grandeza. A pequena diferença pode ser explicada pela diferença no desenho experimental dos dois estudos. Em níveis de dose que correspondem às estimativas disponíveis para a ingestão diária de estragol, totalizando 0.01 mg/kg bw e 0.07 mg/kg bw de estragol, o modelo PBD previu quantidades de aduto de DNA E-3′-N2-dGuo formado de, respectivamente, 2 e 12.8 em 108 nucleotídeos.

Estragol, assim como outros análogos do alilbenzeno no fígado, está sujeito à biotransformação que pode gerar intermediários eletrofílicos reativos; os epóxidos alílicos formam-se prontamente in vitro, mas podem ser rapidamente metabolizados em diidrol ou conjugados de glutationa menos tóxicos. Os metabólitos epóxidos do alilbenzeno são altamente reativos e a via metabólica iniciada pela epoxidação tem um potencial equivalente de dano bioquímico àquele representado pela via de 1-hidroxilação. Usando níveis de epóxidos 100 vezes a exposição máxima ao estragol na dieta humana em células de diferentes espécies, as células do fígado humano apresentaram de longe a maior atividade de epóxido hidrolase alílica, sete a 10 vezes maior do que a observada no fígado de rato; provavelmente, o nível de proteção fisiológica contra esses reagentes em humanos é maior do que em outras espécies animais. Derivados diidrodióis foram recuperados em níveis significativos na urina de animais alimentados com estragol, portanto, os metabólitos diidrodióis presumivelmente representam produtos finais da via de epoxidação, e realizados em um teste representaram até 30% da depuração metabólica total do estragol; um resultado importante porque é aproximadamente a mesma contribuição para a depuração metabólica global fornecida pela via de 1′-hidroxilação mais estudada.
Estudos recentes mostraram que a geração de 1′-hidroxiestragol glicuronídeo é uma via principal do metabolismo do estragol em ratos e camundongos, sendo dependente da dose e responsável por até 24% e 33% dos metabólitos urinários do estragol em ratos e camundongos, respectivamente.
O 1′-hidroxiestragol e os glicuronídeos derivados são metabólitos principais formados por hepatócitos humanos in vitro. Em 24 horas, cerca de 12,5% do estragol é convertido em 1′-hidroxiestragol glicuronídeo por células hepáticas humanas. Portanto, a glicuronidação representa outra via significativa de detoxificação do estragol em todas as espécies estudadas e também em humanos, que pode ser ativada, embora de forma diferente, por muitos flavonoides diferentes que fazem parte da matriz do chá de erva-doce. Conforme mostrado no artigo de Iyer, a glicuronidação do 1′-hidroxiestragol em 27 amostras individuais de fígado humano correlacionou-se significativamente (P < 0,05) com a glicuronidação de outros substratos da UGT2B7 (morfina e ibuprofeno). Iyer et al. determinaram que o 1′-hidroxiestragol, que é o precursor do 1′-sulfooxiestragol, o metabólito ativo do estragol considerado carcinogênico, é conjugado principalmente pela UGT2B7, usando isoformas de UGT expressas por cDNA e estudos de correlação com outros substratos da UGT2B7. Também foi constatado que a UGT1A9 e a UGT2B15 conjugam o 1′-hidroxiestragol; isso implica que o consumo crônico concomitante de medicamentos terapêuticos e componentes dietéticos que são substratos da UGT2B7 e/ou UGT1A9 (ambos expressos nos tecidos gastrointestinal e hepático) pode interferir no metabolismo do estragol. Como a carcinogenicidade do 1′-hidroxiestragol depende claramente do equilíbrio entre a formação dos metabólitos ativos (1′-sulfooxiestragol) e epóxidos, e a detoxificação por glicuronidação; diferenças interindividuais acentuadas na taxa de glicuronidação do 1′-hidroxiestragol podem ter implicações toxicogenéticas importantes. A triagem da glicuronidação do 1′-hidroxiestragol em amostras de fígado de 27 indivíduos indicou uma variabilidade intersujeitos significativa, com um coeficiente de variação de 42%.
4. A Questão da Carcinogenicidade do Estragol
O interesse na segurança do estragol como aromatizante alimentar decorre de observações sobre o composto intimamente relacionado, o safrol, que é tanto hepatotóxico quanto hepatocarcinogênico em roedores. Foi demonstrado que o estragol é um hepatocarcinogênico em camundongos CD-1 lactentes e camundongos B6C3F1 lactentes. A administração de 0,23 ou 0,46% (p/p) de estragol na dieta de camundongos CD-1 por 12 meses resultou em hepatomas em 56% e 71% dos camundongos. Sobre esses resultados, é provavelmente importante ressaltar que, no primeiro artigo, a incidência de hepatomas em camundongos CD-1 (grupo verum), que receberam apenas o veículo (trioctanoína), foi de 12%; em um segundo grupo, 24% dos machos e 2% das fêmeas de camundongos CD-1 que receberam trioctanoína apresentavam hepatoma; em outro experimento, 26% dos machos que receberam apenas trioctanoína por injeção i.p. após 12 meses tiveram hepatomas, e até 12% dos camundongos B6C3F1 machos não injetados desenvolveram hepatoma. Acreditamos que esses dados devem estimular a reflexão sobre o real valor desses experimentos na avaliação do estragol e seus derivados, que provavelmente foi superestimada.

Anthony et al., em seu artigo, relatam o metabolismo do [14C] estragol em ratos (por intubação oral) e camundongos (por injeção i.p.), estudando a variação do metabolismo com a dose na faixa de 50 µg a 1000 mg/kg em ambas as espécies. Em camundongos, a eliminação foi essencialmente completa dentro de 24 horas, e em ratos recebendo uma dose alta (500–1000 mg/kg), houve excreção significativa no dia 2. Em ambas as espécies, a principal via de eliminação de doses muito baixas foi a exalação de 14CO2, e a urina foi uma via secundária. Nesses experimentos, à medida que o nível de dose aumentou, a exalação de 14CO2, expressa como porcentagem da dose, diminuiu, enquanto a excreção na urina aumentou. Em ratos e camundongos, a proporção de 14C urinário presente como 1′-hidroxiestragol e álcool 4-metoxicinâmico aumentou significativamente com a dose. A excreção de metabólitos ácidos, indicada pela porcentagem de 14C urinário extraído em éter a pH 1,0, não foi afetada pelo tamanho da dose no camundongo e diminuiu no rato. A eliminação de metabólitos polares não extraíveis diminuiu significativamente com o aumento da dose em ambas as espécies. É de suma importância considerar as implicações desses resultados em relação aos artigos de Miller e Drinkwater, pois a dose que administraram aos animais deve ser contrastada com a ingestão diária humana estimada de apenas 70 µg (aproximadamente 1 µg/kg). (Flavor and Extract Manufacturer's Association, 19?)
De fato, a hepatocarcinogenicidade do estragol em camundongos foi claramente relacionada à sua conversão em 1′-hidroxiestragol, mas fatores que influenciam sua formação também podem causar uma variação relacionada na incidência de tumores e, nesse contexto, a relação não linear entre dose, espécie animal e eliminação do metabólito 1′-hidroxi é importante, particularmente em conexão com o metabolismo humano. Sangster mostrou em 2 indivíduos saudáveis, aos quais foi administrado 1 mg/dia de estragol, que a excreção do glucuronídeo de 1′-hidroxiestragol na urina humana corresponde a apenas 0,3% da dose administrada (0,02 nmol/kg 24 h), um valor muito inferior ao obtido em roedores, mesmo nas doses mais baixas (0,05 mg/kg de peso corporal; excreção de 1′-hidroxiestragol em 24 h em ratos 4,5 nmol/kg; em camundongos 4,5 nmol/kg). Provavelmente, os testes de carcinogenicidade em roedores superestimam o risco da carcinogenicidade do estragol.

Outra diferença importante no metabolismo do estragol entre camundongos e humanos é destacada pelo exame da dependência da dose. Neste caso, o metabólito genotóxico encontrado na urina, 1′-hidroxiestragol, pode ser usado como um indicador das diferenças interespecíficas. Em camundongos, doses crescentes de estragol levam a níveis crescentes do metabólito na urina: doses baixas (0,05–50 mg/kg de peso corporal) levaram a 1,3–5,4% de 1′-hidroxiestragol; doses altas (500–1.000 mg/kg de peso corporal) levaram a 11,4–13,7% de 1′-hidroxiestragol. Em humanos, a quantidade de 1′-hidroxiestragol na urina permaneceu constante em 0,2–0,4% ao longo de uma ampla faixa de dosagem (1–250 mg de estragol ou 0,01–5 mg/kg de peso corporal). Um estudo subsequente sobre o metabolismo do trans-anetol descobriu que ele era eliminado por humanos 6 a 9 vezes mais rapidamente do que por camundongos.

A consideração destas questões (dose, forma de administração e diferenças no metabolismo entre espécies) levanta dúvidas sobre a conclusão de que a semente de erva-doce pode ser “razoavelmente prevista como carcinogênica para humanos”, É claro que o metabolismo humano e animal não pode ser diretamente comparado, mas achamos que os dados não podem ser diretamente comparados, mas achamos que os dados
Em um experimento com ratos machos Sprague-Dawley (180–200 g) utilizando um modelo de CCl4, o uso de extrato puro de óleo essencial de funcho demonstrou um efeito protetor contra a toxicidade induzida por CCl4 em ratos. Qual(is) constituinte(s) do extrato é(são) responsável(is) por esse efeito não foi totalmente investigado.

A atividade anticarcinogênica do óleo essencial de funcho considerado como uma matriz de substância é confirmada por outro artigo recente que usou um extrato metanólico de funcho, que mostrou que as concentrações inibitórias de 50% (média ± desvio padrão) foram de 50 ± 0,03 μg/mL para a linhagem celular de câncer de mama MCF7 e 48 ± 0,22 μg/mL para a linhagem celular de câncer de fígado Hepg-2.

O aumento significativo nos níveis de malondialdeído e a diminuição significativa na atividade da catalase e no teor de glutationa no fígado e no tecido tumoral em camundongos portadores de carcinoma ascítico de Ehrlich melhoraram após a administração do extrato.

Pré-tratamentos in vitro com óleo essencial de funcho inibiram significativamente as frequências de metáfases aberrantes, aberrações cromossômicas, formação de micronúcleos e citotoxicidade em células de medula óssea de camundongos induzidas por ciclofosfamida, e também produziram uma redução significativa de espermatozoides anormais e antagonizaram a redução da superóxido dismutase, glutationa e catalase induzidas por ciclofosfamida e inibiram o aumento das atividades e teor de malondialdeído no fígado.

Em um estudo avaliando a eficácia de um extrato metanólico de sementes de funcho por suas atividades antioxidante, citotóxica e antitumoral e por sua capacidade de servir como um radioprotetor não tóxico em camundongos albinos Swiss, e em diferentes tipos de linhagens celulares humanas in vitro, também foram avaliados os compostos antioxidantes naturais do extrato para uso em aplicação industrial.

O extrato mostrou notável potencial anticancerígeno contra uma linhagem celular de câncer de mama (MCF7) e linhagem celular de câncer de fígado (Hepg-2). Também mostrou forte atividade de sequestro de radicais livres (100%). Nas conclusões, os autores afirmaram que poderia ser usado como uma fonte segura, eficaz e de fácil acesso de antioxidantes naturais para melhorar a estabilidade oxidativa de alimentos gordurosos durante o armazenamento.
No entanto, foi recentemente demonstrada uma carcinogenicidade direta do estragol e encontrados in vitro baixos níveis de adutos de DNA, com uma resposta dose-dependente significativa até 1000 mM, sugerindo a possibilidade de um mecanismo de adição de ação direta. Experimentos também foram conduzidos para avaliar a persistência dos adutos de DNA produzidos pelo estragol em células V79, após um período de recuperação de 25 horas. Os resultados indicaram que os adutos ainda estão presentes após esse período de recuperação, sugerindo que, nesses níveis (1000 mM), a reparação não é eficiente. E foi demonstrado que o estragol não induziu apoptose em todos os ensaios realizados para todas as concentrações testadas, exceto na concentração mais alta de 2000 mM. Para essa dose e um período de 24 horas, o estragol induziu apoptose em extensão limitada, em comparação com o controle positivo. Os ensaios de MTT também não mostraram citotoxicidade significativa (acima de 50% de viabilidade celular) e os autores concluíram que o estragol não induz apoptose em doses fisiologicamente relevantes.
Em resumo, de acordo com os resultados obtidos, parece que a genotoxicidade do estragol in vitro em doses elevadas pode decorrer, em parte, da adição direta ao DNA, o que pode levar a sítios lábeis em álcali no DNA, resultando em caudas no ensaio cometa e SCE, devido a quebras na fita de DNA. No entanto, os autores afirmam que as doses necessárias para induzir uma resposta genotóxica estão muito distantes das doses humanas fisiologicamente relevantes e, portanto, a relevância desses adutos para a indução de tumores em humanos in vivo precisa ser melhor esclarecida.
5. Inibição da Formação de Adutos de DNA Inibição da Carcinogênese
Recentemente, foi demonstrado que a formação de adutos de DNA pelo 1′-hidroxiestragol e cofator para a conversão mediada por SULT poderia ser inibida pelo extrato de manjericão; o mesmo resultado foi então confirmado em células intactas de hepatoma humano. Esse resultado sugere a probabilidade de que a bioativação e a carcinogenicidade possam ser muito menores quando o estragol é administrado em dose baixa e em uma matriz natural.
Em experimentos utilizando derivados de manjericão, o flavonóide nevadensina foi capaz de inibir eficientemente a conversão mediada pela sulfotransferase de 1′-hidroxi alcenilbenzenos nos correspondentes metabólitos 1′-sulfoóxi responsáveis pela formação de adutos de DNA. Experimentos adicionais também indicaram que a inibição mediada pela nevadensina da formação do metabólito carcinogênico final do estragol ocorre sem reduzir a capacidade de desintoxicar o 1′-hidroxiestragol via glicuronidação ou oxidação. Isso indica uma potencial mudança no metabolismo de fase II dos alcenilbenzenos após a co-exposição com nevadensina e/ou outros flavonóides capazes de inibir a sulfotransferase. Assumindo uma absorção de 1% em vez de 100% de nevadensina (similar a uma razão molar nevadensina:estragol de 0,01), o modelo ainda prevê cerca de 17% e 43% de inibição da formação de 1′-sulfoóxiestragol em comparação ao controle em rato e humano, respectivamente, parecendo, portanto, muito mais ativa em humanos. No artigo de Alhusainy et al., foi demonstrado que, em uma razão molar de nevadensina para estragol de 0,06, na qual se espera que os dois compostos estejam presentes no manjericão, o modelo prevê uma inibição quase completa da formação de 1′-sulfoóxiestragol no fígado de rato macho e humano quando se assume 100% de absorção de nevadensina.
No artigo de Rietjens, mesmo com 1% de biodisponibilidade de nevadensina em uma dose de 50 mg/kg pc de estragol, um nível de dose na faixa do BMDL10 para formação de tumores, a administração de uma quantidade equimolar de nevadensina é prevista para resultar em apenas 2,4% de formação de 1′-sulfoóxiestragol em comparação com a quantidade formada na situação não inibida. Nosso grupo isolou e identificou a nevadensina também em diferentes extratos de funcho, por isso acreditamos que a nevadensina provavelmente tenha o mesmo efeito protetor em extratos de funcho também.
Além disso, utilizando 60 frações diferentes de manjericão, além da identificada como nevadensina, cerca da metade foi capaz de inibir a atividade da SULT com diferentes potências, e assim pode-se extrapolar que, todas juntas, podem interromper completamente a atividade da SULT.
Uma dificuldade significativa na avaliação dos dados metabólicos, bioquímicos e toxicológicos do estragol, bem como de outros alcenilbenzenos, é que a exposição humana a essas substâncias resulta da exposição a uma mistura complexa de constituintes de alimentos, especiarias e óleos de especiarias, que pode impactar significativamente o destino bioquímico e o risco toxicológico dos alcenilbenzenos.
Recentemente, Alhusainy et al. demonstraram que, considerando que uma dieta normal pode conter uma variedade de inibidores da SULT, foram realizados experimentos para avaliar o efeito da exposição combinada a flavonoides na atividade da SULT, bem como na oxidação do 1′-hidroxiestragol para 1′-oxoestragol. Para isso, foi definida uma mistura-teste que imita uma mistura dietética realista de flavonoides e incluiu quatro flavonoides considerados abundantes em ervas e especiarias contendo alquenilbenzenos e capazes de inibir a atividade da SULT, a saber: quercetina, kaempferol, apigenina e nevadensina, sendo esta última previamente identificada como um potente inibidor da SULT presente no manjericão. Os compostos não foram citotóxicos para as células HepG2 nas condições utilizadas nestes experimentos e revelaram que uma redução significativa na formação de E-3′-N2-dGuo em comparação com o controle (sem flavonoides) é observada nas células HepG2 humanas após a coadministração de 50 µM do substrato 1′-hidroxiestragol e 23 µM de uma mistura de flavonoides contendo quercetina, kaempferol, miricetina, apigenina e luteolina (cada um em uma concentração correspondente à sua contribuição relativa na dieta). No geral, os dados indicam uma mudança metabólica da sulfonação e oxidação para a glicuronidação, que é uma via de desintoxicação para o 1′-hidroxiestragol. Por fim, vale ressaltar que, mesmo quando a concentração de estragol foi aumentada 1000 vezes, mantendo as concentrações dos flavonoides inibidores da SULT nos valores definidos no artigo, a porcentagem de inibição da formação de 1′-sulfooxiestragol permanece a mesma obtida com a dose 1000 vezes menor de estragol. Esta é uma característica da inibição não competitiva, onde o nível de inibição depende apenas da dose dos inibidores.
Em nossa opinião, o mesmo efeito pode ser deduzido para o decocto de funcho também, porque os flavonoides (nevadensina) são uma substância muito comum em plantas e podem ser facilmente extraídos por decocção de ervas. De fato, os flavonoides induzem enzimas detoxificantes como NAD(P)H: quinona oxidoredutase 1 e glutationa S-transferase, que representam um importante mecanismo de defesa contra tóxicos eletrofílicos e estresse oxidativo. Sua atividade pró-oxidante pode resultar na formação de metabólitos altamente reativos de quinona/quinona metídeo, que preenchem os requisitos para a indução mediada por elementos responsivos a eletrófilos de enzimas detoxificantes. Foi demonstrado que a resposta mediada por elementos responsivos a eletrófilos aos flavonoides é aumentada em células com níveis reduzidos de GSH celular e diminuída em células com níveis aumentados de GSH, corroborando um papel das quinonas/quinonas metídeos dos flavonoides na ativação de elementos responsivos a eletrófilos. Em fórmulas de decocto de funcho para lactentes, o teor de estragol foi encontrado variando de 241 a 2058 mg L−1 em infusões obtidas seguindo o mesmo modo de preparo (em 100 mL de água fervente). Os autores, analisando esses dados e levando em consideração os dados de concentração de estragol e aplicando uma abordagem semelhante à usada pelo Grupo de Trabalho ESCO por uma estimativa inferior de exposição, mostraram que o consumo diário de três xícaras (100 mL) do chá (2,25 g de sementes trituradas) com o maior nível de estragol (2058 μg L−1, produto em saquinho de chá nº 7; quantidade de estragol em uma porção de chá 206 μg) resultou em uma exposição de 10 μg/kg pc/dia; a partir desse nível de exposição, calcularam valores de MOE variando de 870 a 3210, ainda um número preocupante, especialmente se considerado que os decoctos são usados para o tratamento de cólicas infantis. No entanto, em nossa opinião, como os decoctos de sementes de funcho são um remédio muito comum usado por mães italianas e se aceitarmos o fato de que é uma substância hepatocarcinogênica eficaz, a incidência de câncer hepático pediátrico deveria aumentar, enquanto na Itália (e em todo o mundo também) os tumores hepáticos são extremamente raros em crianças. O banco de dados oficial italiano AIRTUM incluiu apenas 20 novos casos de hepatomas em 1998–2002 em crianças (idade 0–14), correspondendo a 1% das neoplasias pediátricas incidentes e a tendência de incidência em 1988–2002 na Itália é de −4%. Acreditamos que esses dados podem confirmar que o uso de decocto de funcho em lactentes não aumenta significativamente o risco de câncer primário de fígado.
6. O Conceito de Carcinogenicidade
Embora as variações internacionais na dieta e no câncer indiquem que a dieta é um importante fator de risco para muitos cânceres, tem sido difícil atribuir um papel claro na causalidade do câncer à exposição a produtos químicos individuais específicos ou a misturas de produtos químicos. Até agora, apenas a ingestão de álcool (câncer de cavidade oral, faringe, esôfago e mama) e alimentos contaminados com aflatoxinas foram claramente documentados como fatores de risco em humanos. Como a evidência de carcinogenicidade em animais de laboratório é geralmente considerada uma indicação de perigo carcinogênico potencial para humanos, grande ênfase é dada à interpretação dos achados de carcinogenicidade animal e à extrapolação desses achados para humanos. O primeiro passo na identificação do perigo de carcinogenicidade é estabelecer se as decocções de funcho são ou não carcinogênicas, portanto, temos que estabelecer se estamos falando de estragol puro ou de uma decocção contendo estragol e outras substâncias (flavonoides).

A decisão sobre a carcinogenicidade é geralmente baseada em um bioensaio padrão de carcinogenicidade de dois anos em roedores, mas acreditamos que evidências importantes devem ser baseadas em dados epidemiológicos que provavelmente fornecem a resposta definitiva para o problema. Em um artigo recente que deve ser considerado uma abordagem preferencial para estabelecer a carcinogenicidade de alimentos com base em dados disponíveis de análises de dose-resposta animal e exposição humana, foi estabelecido por importantes organismos internacionais (OMS, EFSA, ILSI Europa) um consenso sobre o MOE (margem de exposição), mas no mesmo artigo foi afirmado que o MOE pode ser usado apenas para priorização de ações de gerenciamento de risco, embora a conferência tenha declarado a dificuldade de interpretá-lo em termos de risco real à saúde para humanos.

Há uma série de questões que são centrais nesta etapa. Primeiro, é importante decidir se os tumores observados em experimentos com animais são biologicamente relevantes para humanos com base no modo de ação. Portanto, é fundamental entender como a substância tóxica funciona e estabelecer se é genotóxica ou um carcinógeno não genotóxico, o chamado: MOA (modo de ação), e o(s) local(is) de formação do tumor. Segundo, deve-se verificar se os dados toxicocinéticos e toxicodinâmicos existentes são suficientes para chegar a uma conclusão definitiva sobre a provável forma da curva dose-resposta para o efeito carcinogênico. Especialmente para alimentos e derivados de ervas, pode ser particularmente difícil. Terceiro, dados devem ser buscados, além daqueles de estudos tradicionais de genotoxicidade, que contribuam para a compreensão do modo/mecanismo de ação. Em seguida, qualquer possível influência de processos não genotóxicos, por exemplo, hiperplasia, na relação dose-resposta deve ser abordada. Finalmente, é importante identificar dados que sugiram se pode ou não haver uma ou mais subpopulações com sensibilidade/suscetibilidade especial ao efeito carcinogênico (por exemplo, dependente da fase da vida, sexo e polimorfismos genéticos).
Uma vez que tais julgamentos na prática quase sempre dependem de dados animais, as estimativas de potência são calculadas a partir de informações de dose-resposta observadas em experimentos animais, sendo estas substitutas para a situação humana. Estudos experimentais revelaram grandes variações, de até 10⁸–10⁹, nas doses de várias substâncias carcinogênicas necessárias para induzir tumores em experimentos animais.

Embora a identificação de perigos seja uma etapa crucial no processo de caracterização de riscos, é importante reconhecer que seria inadequado avaliar a toxicidade de produtos químicos apenas com base nos resultados da identificação de perigos, baseada meramente na toxicidade intrínseca da molécula. Acontece que dados obtidos em experimentos animais realizados atingindo a DMT (dose máxima tolerada) podem ter pouco significado biológico, pois podem induzir respostas fisiopatológicas que têm pouca relevância para aquelas que podem ser o resultado de doses muito menores. Uma escolha mais qualificada da faixa de doses em estudos animais levaria a um processo de extrapolação melhor e mais significativo de animais para humanos. A chave para uma extrapolação correta de dados animais para humanos é a compreensão do modo de ação dos produtos químicos. Infelizmente, este não é sempre o caso, como é o caso do d-limoneno e do formaldeído. O d-limoneno é reconhecido como um carcinógeno experimental porque causa nefropatia e tumores renais em ratos machos, através da ligação à α 2u-globulina no rim; mas é uma globulina específica de ratos machos e não representa qualquer risco para a saúde humana. O formaldeído foi classificado como um carcinógeno humano conhecido, causando vários cânceres, e particularmente câncer nasofaríngeo e leucemia, mas é inócuo se adicionado ao leite como bacteriostático, porque é rapidamente transformado em espinacina, uma substância inócua.

Tradicionalmente, utiliza-se um fator de incerteza de 100, baseado em um fator de 10 vezes para permitir diferenças entre humanos médios e um fator de 10 vezes para permitir diferenças entre humanos médios e indivíduos sensíveis. Uma decisão de “falso negativo” sobre a carcinogenicidade de uma substância ocorre quando o bioensaio não produz um aumento estatisticamente significativo na incidência de tumores, quando na verdade o produto químico realmente causa um aumento na incidência de tumores na dose testada. Esta é uma limitação estatística resultante do número de animais (geralmente 50) utilizados por grupo espécie-sexo-dose. Usando a estimativa da tendência dose-resposta obtida de outros estudos para cada tipo de tumor/local de tecido especificado em animais e o erro padrão da tendência, é possível estimar a probabilidade aproximada (poder) de detectar uma tendência estatisticamente significativa apenas em função do tamanho da amostra. Mas se muitos mais animais forem usados por grupo de dose, a análise estatística poderia alterar os resultados e uma substância pode ser categorizada como carcinogênica, apenas porque o tamanho da amostra foi alterado.

7. Conclusão
   Em todos os estudos com animais revisados, foi utilizado estragol isolado e purificado. Assim, os achados fornecem um perfil toxicológico apenas dessa molécula, e não o perfil de risco de toda a decocção. Em humanos, o estragol geralmente entra no corpo como componente do chá de erva-doce, ou como um alimento temperado com erva que contém muitas outras substâncias, como nevadensina, epigalocatequina, outros flavonoides e anetol, que têm um papel protetor e, portanto, contrabalançam o possível efeito do estragol puro. Nesse contexto, o estragol ocorre na forma de uma mistura fitoquímica extremamente complexa. Se dados sobre um único constituinte in vivo podem ser usados como base para afirmações sobre uma erva, então dados sobre outros constituintes também devem ser totalmente considerados, pois acreditamos que seja a única maneira de estabelecer definitivamente se uma substância é perigosa ou não; e se é uma substância usada há muitos anos e em subconjuntos específicos de consumidores ou pacientes, dados epidemiológicos, quando disponíveis, podem ajudar a estabelecer, juntamente com o modo real de uso, o risco efetivo para os consumidores.

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