pmid: "37257051"
title: "Integração de docking molecular, dinâmica molecular e farmacologia de rede para explorar a farmacologia multi-alvo do feno-grego contra o diabetes."
authors: "Luo W, Deng J, He J, Yin L, You R, Zhang L, Shen J, Han Z, Xie F, He J, Guan Y"
journal: "Journal of cellular and molecular medicine"
pubdate: "2023 Jul"
doi: "10.1111/jcmm.17787"
source: "PMC Full Text"

Integração de docking molecular, dinâmica molecular e farmacologia de rede para explorar a farmacologia multi-alvo do feno-grego contra o diabetes.

Autores

Luo W, Deng J, He J, Yin L, You R, Zhang L, Shen J, Han Z, Xie F, He J, Guan Y

Periodico

Journal of cellular and molecular medicine (2023 Jul)

Conteudo

Integração de docking molecular, dinâmica molecular e farmacologia em rede para explorar a farmacologia multi-alvo do feno-grego contra a diabetes
Resumo
O feno-grego é uma erva antiga que tem sido usada por séculos para tratar a diabetes. No entanto, como os compostos químicos derivados do feno-grego atuam no tratamento da diabetes permanece incerto. Aqui, integramos docking molecular e farmacologia em rede para elucidar os constituintes ativos e os potenciais mecanismos do feno-grego contra a diabetes. Primeiramente, 19 compostos ativos do feno-grego e 71 alvos principais relacionados à diabetes foram identificados por meio de análise de farmacologia em rede. Em seguida, os resultados de docking molecular e simulações sugerem que diosgenina, luteolina e quercetina atuam contra a diabetes por meio da regulação dos genes ESR1, CAV1, VEGFA, TP53, CAT, AKT1, IL6 e IL1. Esses compostos e genes podem ser fatores-chave do feno-grego no tratamento da diabetes. Os resultados celulares demonstram que o feno-grego tem boa segurança biológica e pode melhorar efetivamente o consumo de glicose das células IR-HepG2. A análise de enriquecimento de vias revelou que o efeito antidiabético do feno-grego é regulado pelas vias de sinalização AGE-RAGE e NF-κB. Está principalmente associado ao estresse antioxidante, à resposta anti-inflamatória e à proteção das células β. Nosso estudo identificou os constituintes ativos e as potenciais vias de sinalização envolvidas no efeito antidiabético do feno-grego. Essas descobertas fornecem uma base teórica para a compreensão do mecanismo do efeito antidiabético do feno-grego. Finalmente, este estudo pode ajudar no desenvolvimento de suplementos alimentares ou medicamentos antidiabéticos baseados no feno-grego.
INTRODUÇÃO
A diabetes é o terceiro maior risco à saúde depois das doenças cardiovasculares e do câncer, de acordo com a Federação Internacional de Diabetes. Estatísticas da Organização Mundial da Saúde indicam que 415 milhões de pessoas tinham diabetes em 2015, e a prevalência da diabetes deve aumentar para 693 milhões até 2045. Dependendo da patogênese, a diabetes pode ser amplamente dividida em diabetes mellitus tipo 1 (DM1), DM2, diabetes gestacional e outros tipos específicos; destes, o DM2 responde por mais de 90% dos casos. O DM2 é uma doença crônica na qual o ciclo de feedback negativo entre a atividade da insulina e a secreção de insulina se torna desregulado, resultando em metabolismo anormal da glicose. Além disso, os efeitos acumulados de longo prazo do metabolismo anormal da glicose levam a lesões cardiovasculares, doença renal, pé diabético e outras complicações, que podem ter impactos graves no bem-estar mental e físico dos pacientes com DM2. A medicação ao longo da vida é geralmente necessária para pessoas com diabetes controlar sua glicose no sangue e, portanto, seus custos de saúde são três vezes maiores do que os de pessoas sem diabetes. Em 2015, 67,3 bilhões de dólares foram gastos mundialmente para tratar a diabetes, representando 12% dos gastos globais com saúde. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver formas eficazes de prevenir e tratar a diabetes.
Feno-grego (Trigonella foenum‐graecum L.) é uma planta da família Luminaceae, nativa da Índia e do Norte da África. É cultivada em muitas partes do mundo, incluindo China, Austrália, Norte da África, Europa e Argentina. O feno-grego tem sido usado tanto como alimento quanto como medicamento no Irã, na Índia e na China por cerca de seis milênios. Estudos farmacológicos revelaram que o feno-grego contém alcaloides, flavonoides, polissacarídeos, saponinas esteroidais e óleos voláteis, além de outros constituintes ativos com efeitos hipolipemiantes e hipoglicemiantes. O feno-grego é amplamente utilizado como um suplemento dietético natural para o tratamento do diabetes, para o qual se mostrou seguro e eficaz. Muitos estudos demonstraram que os alcaloides derivados do feno-grego não apenas apresentam forte inibição da β-glicosidase, supressão do câncer, atividades antioxidantes e anti-inflamatórias, mas também exercem efeitos como proteção cardiovascular, redução do colesterol e inibição da adipogênese. Além disso, os flavonoides, polissacarídeos e saponinas derivados do feno-grego demonstraram desempenhar um papel no controle dos níveis de glicose no sangue, bem como no tratamento do diabetes e suas complicações, tanto em pacientes quanto em modelos animais. No entanto, o mecanismo exato permanece incerto.
Detalhes sobre as reações entre constituintes ativos específicos do feno-grego e células, genes e proteínas no corpo ainda são limitados. Portanto, é necessária uma análise de associação das propriedades físico-químicas do feno-grego juntamente com os potenciais alvos e seus possíveis mecanismos. Recentemente, a farmacologia de redes surgiu como um novo subcampo empolgante do desenvolvimento de fármacos, pois combina a análise de big data biomédico com a medicina de sistemas. Ao introduzir big data biomédico, as relações de rede entre os compostos ativos em medicamentos tradicionais e suas proteínas alvo podem ser construídas, revelando assim o mecanismo de ação terapêutica sinérgica em medicamentos tradicionais. Assim, a farmacologia de redes ajudou a transicionar o campo da descoberta de fármacos do quadro convencional de 'um alvo, um fármaco' para uma abordagem de 'alvo de rede, tratamento com múltiplos compostos'.
O feno-grego tem sido usado há muito tempo como uma erva medicinal tradicional chinesa para o tratamento do diabetes. Recentemente, Oh et al. investigaram o efeito anti-diabético da casca de alho com base em docking molecular e farmacologia de redes e relataram os constituintes bioativos e as vias de sinalização contra o diabetes, demonstrando a utilidade dessas técnicas na identificação dos constituintes bioativos de fórmulas fitoterápicas tradicionais, dos potenciais alvos de ação e dos mecanismos de interação entre eles.
No presente estudo, utilizamos docking molecular, simulação de dinâmica molecular (DM) e farmacologia de redes para investigar os constituintes ativos do feno-grego e identificar suas potenciais proteínas alvo, com o objetivo de elucidar os mecanismos subjacentes de suas atividades anti-diabéticas. O fluxo de trabalho do estudo é mostrado na Figura 1.
Fluxo de trabalho do estudo compreendendo uma etapa de farmacologia de rede e uma etapa de validação e predição, com o objetivo de elucidar os mecanismos subjacentes aos efeitos antidiabéticos do feno-grego.
MATERIAIS E MÉTODOS
Triagem de compostos ativos e alvos relacionados
Uma lista de compostos do feno-grego foi obtida do banco de dados Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP) (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php/). A triagem dos constituintes ativos foi realizada seguindo o princípio de que a drug-likeness (DL) é ≥0,18 e a biodisponibilidade oral é ≥30%. Compostos que não foram identificados pela triagem, mas que foram relatados como reguladores metabólicos, também foram incluídos na análise de rede. Em seguida, o banco de dados TCMSP foi consultado com o objetivo de prever ainda mais os alvos dos constituintes ativos. Para gerar uma coleção mais abrangente, a entrada do sistema de entrada linear simplificado de entrada molecular (SMILES) para cada constituinte ativo foi recuperada do banco de dados PubChem. Em seguida, os bancos de dados BindingDB (http://bindingdb.org/bind/index.jsp), DrugBank (https://go.drugbank.com/), STITCH (http://stitch.embl.de/) e SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) foram pesquisados em busca de alvos relacionados dos compostos ativos com base em suas fórmulas SMILES.
Predição de alvos da diabetes
Foram realizadas buscas nos bancos de dados GeneCards (https: //www.genecards. org/) e OMIM (https: // www.omim.org/), utilizando as palavras-chave ‘diabetes’ e ‘hiperlipidemia’, respectivamente, com o objetivo de obter os alvos relacionados das doenças em Homo sapiens. Dos alvos obtidos do GeneCards, aqueles com pontuação de relevância > 40 foram selecionados como alvos potenciais. Quanto aos conjuntos de dados do OMIM, todos os alvos relacionados à diabetes foram incluídos. Em seguida, uma ferramenta online de desenho de diagrama de Venn, Venny ver. 2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/), foi usada para visualizar os alvos sobrepostos entre os compostos selecionados e os genes alvo da diabetes.
Construção da rede
Rede Droga‐Composto‐Alvo‐Doença
Os alvos sobrepostos e os compostos ativos foram importados para o Cytoscape ver. 3.7.1 para construir a rede Droga‐Composto‐Alvo‐Doença e a função ‘Network Analyzer’ foi utilizada para analisar as propriedades topológicas da rede.
Rede de Interação Proteína‐Proteína (PPI)
As interações proteína‐proteína foram analisadas usando o String ver. 11.0 (https://string‐db.org/). Para investigar melhor o mecanismo de ação do feno-grego no tratamento do DM2, os alvos de interseção foram importados para o String. A pontuação combinada mínima foi definida como 0,400 e as relações de interação proteína para Homo sapiens foram obtidas. Alvos sem interação foram removidos e os dados foram salvos como arquivos SIF. Em seguida, a rede PPI foi construída importando node1, node2 e a pontuação combinada para o Cytoscape. Finalmente, os alvos principais foram selecionados por análise de cluster usando o plug‐in MCODE no Cytoscape.
Análises de enriquecimento de vias GO e KEGG
A análise de enriquecimento da Ontologia Genética (GO) foi realizada executando o pacote 'clusterProfiler' no R ver. (R Foundation for Statistical Computing). Os módulos Processo Biológico (BP), Componente Celular (CC) e Função Molecular (MF) foram selecionados e anotações biológicas significativas (p < 0.05) foram escolhidas para análise. Ao mesmo tempo, a análise de enriquecimento da via KEGG foi realizada para investigar as principais vias de sinalização envolvidas nos efeitos antidiabéticos do feno-grego. Finalmente, os resultados enriquecidos foram analisados usando o pacote 'ggplot2' no R.

Rede Composto‐Gene‐Via
Para esclarecer a relação entre compostos ativos, genes alvo e vias, as 20 vias significativas principais foram intersectadas com a rede Composto‐Gene‐Doença para construir a rede Composto‐Gene‐Via. Os resultados foram visualizados no Cytoscape.

Docking molecular e perfil ADMET
O docking molecular pode ajudar a validar alvos principais na farmacologia de redes. Primeiro, pesquisamos os compostos importantes no banco de dados PubChem, e a estrutura de 'MOL2' foi exportada. Em seguida, as estruturas 3D das proteínas principais foram obtidas do Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/). Então, o progresso da desidratação, hidrogenação e edição de cargas foi monitorado usando o software AutoDock 4.2.6, e as proteínas alvo modificadas e compostos importantes foram exportados como arquivos PDBQT. Depois, o progresso do docking foi monitorado separadamente usando o software AutoDock Vina 1.2.0. Finalmente, os resultados do docking foram importados para o software PyMol para análise e visualização. Aqui, empregamos a Metformina, um medicamento comumente usado para diabetes mellitus, como droga de referência.

O servidor online SwissADME foi usado para realizar aprendizado de máquina para prever as propriedades semelhantes a fármacos. Os seis compostos importantes foram inseridos no site SwissADME e as propriedades ADMET foram selecionadas para análise. A toxicidade dos seis compostos importantes foi prevista usando a ferramenta online gratuita ProTox‐II, e os resultados, incluindo LD50 previsto, ensaio de mutação reversa (teste de Ames) e citotoxicidade, foram registrados.

Simulações de dinâmica molecular
GROMACS (2021.3) com campo de força CHARMm36 foram empregados para simulações de DM. De acordo com os resultados de docking, os três principais complexos proteína-ligante em cada grupo foram selecionados para simulações de DM. Complexos proteína-inibidor do banco de dados PDB foram utilizados como sistemas de referência. Parâmetros de simulação foram adotados conforme descrito. Um total de 10 ns de simulação de DM foi conduzido. Os dados de cada picossegundo foram salvos. Xmgrace foi utilizado para analisar RMSD e RMSF de cada complexo. GMX‐MM/PBSA (Versão 1.6.0) foi utilizado para calcular as energias livres de ligação.

Validação in vitro
Células HepG2 foram utilizadas para estabelecer o modelo de resistência à insulina. Conforme o método descrito por Chen et al. Resumidamente, células HepG2 foram plaqueadas em placas de 96 poços com uma densidade de 1 × 105 células/poço e cultivadas na incubadora de células por 24 h. Em seguida, as células foram privadas de soro por 24 h com meio livre de soro. O meio livre de soro foi então substituído por DMEM com alta glicose (50 μM) com insulina humana recombinante (5 × 10−7 M) por 48 h para estabelecer o modelo de IR.
100 μL de células HepG2 (1 × 106 células/mL) foram adicionados em placas de 96 poços. Após 24 h de pré-adesão, o meio original foi substituído por solução de feno-grego em diferentes concentrações (12,5; 25; 50; 100; 200; 400; 800 e 1600 μg/mL). As células foram cultivadas por mais 24 h e 48 h. Em seguida, o teste CCK-8 foi realizado para avaliar a viabilidade celular.
Conforme mencionado acima, o modelo IR-HepG2 foi induzido por DMEM com alta glicose e insulina humana recombinante. Em seguida, as células IR-HepG2 foram cultivadas com diferentes concentrações de feno-grego por 24 h. Posteriormente, ensaios de captação de glicose foram realizados usando um kit de ensaio de glicose (método da glicose oxidase) para estimar os efeitos antidiabéticos do feno-grego.
RESULTADOS
Constituintes ativos no feno-grego
Pesquisando no banco de dados TCMSP, 14 compostos putativos derivados do feno-grego, com valor limiar OB ≥30% e DL ≥0,18, foram identificados por triagem. Enquanto isso, uma busca na literatura foi conduzida e cinco constituintes ativos foram identificados. As características básicas de todos os 19 constituintes ativos são apresentadas na Tabela 1. Esses 19 constituintes ativos são principalmente terpenoides, flavonoides e ácidos orgânicos.
Características dos 19 constituintes ativos derivados do feno-grego.
MOL‐ID PubChem ID Nome molecular Mw OB (%) DL AlogP Tipo MOL1 64,971 Mairin 456.78 55.38 0.78 6.52 Terpenoide MOL2 222,284 β‐sitosterol 414.79 36.91 0.75 8.08 Terpenoide MOL3 5,281,779 Irolone 298.26 46.87 0.36 2.1 Flavonoide MOL4 5,280,378 Formononetin 268.28 69.67 0.21 2.58 Flavonoide MOL5 5,280,448 Calycosin 284.28 47.75 0.24 2.32 Flavonoide MOL6 5,280,863 Kaempferol 286.25 41.88 0.24 1.77 Flavonoide MOL7 99,474 Diosgenin 414.69 80.88 0.81 4.63 Terpenoide MOL8 162,995,045 Gallic acid‐3‐O‐(6’‐O‐galloyl)‐glucoside 484.4 30.25 0.67 −0.03 Glicosídeo MOL9 5,280,445 Luteolin 286.25 36.16 0.25 2.07 Flavonoide MOL10 5,281,471 Hiyodori lactone A 420.5 58.33 0.52 1.81 Flavonoide MOL11 99,516 Tigogenone 414.69 37.35 0.81 4.56 Terpenoide MOL12 162,350 Isovitexin 432.41 31.29 0.72 −0.06 Flavonoide MOL13 12,304,433 Neotigogenin 416.71 80.98 0.81 4.88 Terpenoide MOL14 5,280,343 Quercetin 302.25 46.43 0.28 1.5 Flavonoide MOL15 442,664 Vicenin‐2 594.57 3.42 0.78 −2.45 Flavonoide MOL16 442,664 Vitexin‐7‐glucoside_qt 432.41 16.49 0.71 −0.06 Flavonoide MOL17 114,776 Isoorientin 448.41 23.30 0.76 −0.32 Flavonoide MOL18 5,280,441 Vitexin 432.41 3.05 0.71 −0.06 Flavonoide MOL19 2,773,624 4‐Hydroxyisoleucine 147.17 / / −2.50 Aminoácido
Abreviações: AlogP, coeficiente de partição atômica; DL, semelhança a fármacos; OB, biodisponibilidade oral; Mw, peso molecular.
Interseção dos alvos de feno-grego e diabetes
Após explorar o TCMSP, SwissTargetPrediction, DrugBank e outras bases de dados. Foram obtidos 277 alvos relacionados ao diabetes sem valores duplicados. Enquanto isso, um total de 462 alvos de diabetes foram identificados nos bancos de dados GeneCards e OMIM, usando regras de triagem de alvos relacionados ao diabetes. Conforme mostrado na Figura 2A, um total de 71 alvos sobrepostos foi obtido determinando a interseção dos 277 alvos relacionados a compostos e os 462 alvos relacionados ao diabetes usando o Venny.
Resultados da análise de farmacologia de rede. (A) Diagrama de Venn dos alvos do feno‑grego e diabetes. (B) Rede de interação Fármaco‑Composto‑Alvo‑Doença. Diamantes verdes são compostos ativos, o hexágono rosa é a doença, círculos roxos são os genes alvo comuns dos compostos e da doença e as linhas representam interações entre compostos e alvos. (C) Rede PPI dos genes alvo comuns. Diamantes representam proteínas, as cores (de azul a verde a amarelo) indicam o grau de ligação entre as proteínas e as linhas representam interações proteína‑proteína. (D) Rede Composto‑Gene‑Via. Retângulos azuis representam genes centrais, círculos roxos representam compostos ativos e diamantes verdes indicam vias associadas aos alvos principais.
Construção e análise da rede Fármaco–Composto–Alvo–Doença
Para construir a rede Fármaco–Composto–Alvo–Doença (Figura 2B), 71 alvos comuns do feno‑grego no tratamento do diabetes foram inseridos no Cytoscape. Como mostrado na Figura 2B, a rede compreendeu 98 nós (19 nós de compostos ativos, 71 nós de alvos, 1 nó de feno‑grego e 1 nó de diabetes) e 252 arestas, cada uma representando a relação entre o feno‑grego e os compostos ativos, os compostos ativos e os alvos, e o alvo e a doença (ou seja, diabetes). Na rede, o valor do grau representa o número de arestas conectadas ao nó. Os nós de compostos são triados de acordo com o princípio da topologia da rede. Esses compostos desempenham um papel fundamental em toda a rede e podem ser os compostos chave em medicamentos para o tratamento do diabetes. O valor mediano do grau dos compostos nesta rede foi quatro, e os compostos importantes foram MOL7, MOL4, MOL2, MOL6, MOL9 e MOL14, com 10, 10, 10, 22, 27 e 60 alvos (Tabela 2), respectivamente. A distribuição do grau e a distribuição da centralidade dos nós de compostos importantes na rede indicam importância no tratamento do diabetes.
Parâmetros de topologia dos compostos importantes na rede.
MOL ID Nome químico Grau Centralidade de intermediação MOL7 Diosgenina 10 0.01457813 MOL4 Formononetina 10 0.00951153 MOL2 β‐Sitosterol 10 0.01139956 MOL6 Kaempferol 22 0.03922565 MOL9 Luteolina 27 0.05734171 MOL14 Quercetina 60 0.30288612
Rede PPI de alvos terapêuticos do feno‑grego contra diabetes
Um total de 71 alvos comuns foram inseridos no banco de dados String, e a rede PPI foi exportada como um arquivo TSV para o Cytoscape, onde a rede PPI foi visualizada e analisada. Conforme mostrado na Figura 2C, a rede PPI compreendia 71 nós e 2252 arestas, com os nós indicando alvos potenciais e as arestas representando a relação entre os dois alvos conectados. Além disso, o tamanho e a cor eram proporcionais ao valor de grau dos nós, com azul indicando valores maiores e amarelo indicando valores menores. Descobrimos que o valor mediano de grau era 33. Com base em um estudo anterior, definimos as condições de triagem como grau >40 e centralidade de intermediação >0,024. Os oito principais genes alvo obtidos, classificados em ordem decrescente de grau do nó, foram IL6 (61), AKT1 (59), VEGFA (59), TP53 (58), IL1B (56), ESR1 (49), CAT (47) e CAV1 (41). As características desses genes chave são apresentadas na Tabela 3.
Características dos genes chave.
Nome do alvo Símbolo do gene Grau Centralidade de intermediação ESR1 Receptor de estrogênio 1 49 0.02681766 CAV1 Caveolina 1 41 0.06836266 VEGFA Fator de crescimento endotelial vascular A 59 0.0283019 TP53 Proteína tumoral P53 58 0.02667203 CAT Catalase 47 0.03529778 AKT1 AKT Serina/treonina quinase 1 59 0.02828517 IL6 Interleucina 6 61 0.04171243 IL1B Interleucina 1 beta 56 0.02426754
Análise de enriquecimento de vias GO e KEGG
A análise de enriquecimento funcional GO foi realizada usando o Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery. Um total de 1713 termos GO (p < 0.01) foram enriquecidos, incluindo 1553 para BP, 61 para CC e 99 para MF. Os 10 principais termos GO classificados por valor p para BP, CC e MF foram plotados em um gráfico, totalizando 30. Na Figura 3, a ordenada indica o número de genes dos termos GO enriquecidos. Os termos GO mais bem classificados foram resposta a peptídeo, regulação positiva da migração celular, resposta a níveis de oxigênio, resposta celular ao estresse químico, regulação negativa da proliferação da população celular, regulação da adesão celular, desenvolvimento glandular, regulação positiva da fosforilação de proteínas, regulação da via de sinalização apoptótica e processo do sistema circulatório.
Visualização do enriquecimento de termos GO.
Um total de 168 vias KEGG foram enriquecidas ao inserir 71 genes centrais no pacote ‘clusterProfiler’ no R. As 20 principais vias classificadas de acordo com o valor p são apresentadas na Tabela 4, e as 20 principais vias são visualizadas na Figura 4. O tamanho do círculo indica o número de genes correlacionados na via, e a cor indica o valor p, com verde indicando valores menores e vermelho indicando valores maiores. A rede inclui principalmente vias de câncer, a via de sinalização AGE-RAGE, a via de sinalização FoxO, a via de sinalização HIF-1, a via de sinalização NF-κB e lipídios e aterosclerose, o que sugere que o feno-grego pode exercer seus efeitos antidiabéticos através dessas vias.
Principais 20 vias KEGG classificadas por valor p.
Pathway Gene ratio (%) Count Log10(P) Log10(q) hsa05200:Vias no câncer 47.89 34 −40.07 −37.53 hsa04933:Via de sinalização AGE‐RAGE em complicações diabéticas 26.76 19 −31.03 −28.79 hsa05417:Lipídios e aterosclerose 28.17 20 −26.13 −24.07 hsa04066:Via de sinalização HIF‐1 21.13 15 −22.18 −20.42 hsa05205:Proteoglicanos no câncer 23.94 17 −21.28 −19.58 hsa05215:Câncer de próstata 19.72 14 −21.01 −19.43 hsa05152:Tuberculose 19.72 14 −17.12 −15.86 hsa05144:Malária 14.08 10 −16.6 −15.4 hsa04218:Senescência celular 18.31 13 −16.3 −15.17 hsa04068:Via de sinalização FoxO 16.9 12 −15.56 −14.5 hsa04064:Via de sinalização NF‐kappa B 12.68 9 −11.52 −10.74 hsa05202:Desregulação transcricional no câncer 12.68 9 −9.11 −8.47 hsa04211:Via de regulação da longevidade 9.86 7 −8.76 −8.16 hsa04672:Rede imune intestinal para produção de IgA 8.45 6 −8.76 −8.16 hsa04217:Necroptose 9.86 7 −7.01 −6.47 hsa04726:Sinapse serotoninérgica 7.04 5 −5.11 −4.64 hsa04611:Ativação plaquetária 7.04 5 −4.95 −4.5 hsa05014:Esclerose lateral amiotrófica 9.86 7 −4.62 −4.19 hsa04520:Junção aderente 5.63 4 −4.62 −4.19 hsa04610:Cascatas do complemento e coagulação 5.63 4 −4.31 −3.9
Visualização do enriquecimento de vias KEGG.
Análise da rede Composto‐Gene‐Via
A rede Composto‐Gene‐Via foi construída usando o Cytoscape. Como mostrado na Figura 2D, o tamanho do nó representa o valor do grau. A rede compreende 110 nós e 390 arestas. AKT1, PTGS2, MAPK1, TP53 e IL‐6 interagiram com a maioria das vias potenciais, incluindo vias do câncer, a via de sinalização AGE‐RAGE, a via de sinalização FoxO, a via de sinalização HIF‐1, a via de sinalização NF‐κB e lipídios e aterosclerose, o que sugere que esses genes possam desempenhar um papel fundamental nos efeitos antidiabéticos do feno-grego. A Figura 5 mostra a ação do alvo central na via de sinalização AGE‐RAGE em complicações diabéticas.
Ação do alvo central na via de sinalização AGE‐RAGE em complicações diabéticas. Os retângulos vermelhos representam os alvos-chave.
Verificação de docking molecular e perfilagem ADMET
Os seis importantes constituintes ativos—β‐sitosterol, diosgenina, formononetina, kaempferol, luteolina e quercetina—foram selecionados para verificação de docking molecular com os principais alvos AKT1, CAV1, DPP4, IL6, INSR, MAPK8, MMP9, PPARG e SLC2A4, que são considerados alvos potenciais no tratamento do diabetes. A energia de ligação (escore Vina) calculada pelo AutoDock Vina foi usada para estimar a atividade de ligação entre as moléculas de docking, sendo que um escore Vina menor indica atividade de ligação mais forte, bem como maior afinidade e estrutura mais estável entre ligante e receptor. Em comparação com o fármaco de referência, esses compostos importantes mostraram maior afinidade pelos alvos principais (<−5,0 kcal/mol, Tabela 5), o que demonstrou bom docking e alta afinidade. Os três melhores escores Vina para cada composto importante e seus alvos selecionados são visualizados na Figura 6, o que indica que o ponto de docking e a estrutura dos ligantes de pequenas moléculas e dos receptores proteicos foram estáveis.
Resultados de docking de moléculas alvo para constituintes ativos centrais candidatos.
Nome do composto Afinidade (kcal/mol) AKT1 CAV1 DPP4 IL6 INSR MAPK8 MMP9 PPARG SLC2A4 Média β‐Sitosterol −7,3 −5,0 −6,4 −5,0 −6,7 −5,2 −5,2 −7,7 −6,6 −6,1 Diosgenina −9,7 −7,8 −9,0 −7,0 −9,5 −10,4 −8,4 −8,9 −8,4 −8,8 Formononetina −8,1 −6,7 −8,2 −6,3 −7,5 −6,5 −7,6 −6,8 −8,3 −7,3 Kaempferol −7,8 −6,3 −7,8 −6,6 −7,7 −8,4 −8,0 −6,9 −8,9 −7,6 Luteolina −8,0 −6,0 −8,7 −7,7 −7,9 −7,7 −8,1 −7,2 −8,6 −7,8 Quercetina −8,2 −5,9 −7,8 −6,9 −7,4 −8,5 −8,1 −7,1 −8,6 −7,6 Média −7,6 −5,8 −7,5 −6,2 −7,2 −7,2 −7,1 −7,0 −7,6 Metformina −5,1 −3,7 −5,0 −4,8 −5,1 −4,7 −5,3 −5,0 −4,7 −4,8
Resultados de docking molecular dos compostos importantes e das proteínas correspondentes dos alvos gênicos.
A análise ADMET é uma ferramenta importante na descoberta de medicamentos. O banco de dados SwissADME foi utilizado para a análise ADMET, e os resultados revelaram que os compostos importantes possuem excelentes propriedades farmacocinéticas. Como podemos ver na Tabela 6, todos os seis candidatos a medicamentos selecionados não apresentaram efeitos colaterais em termos de suas propriedades farmacocinéticas nos vários modelos de predição, incluindo substratos de glicoproteína P, penetração na barreira hematoencefálica, absorção gastrointestinal e absorção oral humana. Além disso, todos os constituintes ativos importantes mostraram boa biocompatibilidade nos vários modelos de predição de toxicidade, e nenhum deles apresentou comportamento tóxico como mutação reversa, hepatotoxicidade e citotoxicidade. Formononetina, luteolina e quercetina mostram 'ativo' nas predições de carcinógenos e mutagenicidade. De acordo com o gráfico radar de toxicidade, não há forte confiança de resultados positivos de toxicidade. Várias pesquisas comprovaram que formononetina, luteolina e quercetina apresentam alta biocompatibilidade.
Perfil ADMET dos compostos.
Compostos β‐Sitosterol Diosgenina Formononetina Kaempferol Luteolina Quercetina Absorção GI Alta Alta Alta Alta Alta Alta Permeante na BHE Não Sim Sim Não Não Não Substrato da P‐gp Não Não Não Não Não Não Absorção oral humana Alta Alta Alta Média Média Média Inibidor de CYP1A2 Não Não Sim Sim Sim Sim Inibidor de CYP2C19 Não Não Não Não Não Não Inibidor de CYP2D6 Não Não Sim Sim Sim Sim Inibidor de CYP2C9 Não Não Não Não Não Não DL50 prevista 890 mg/kg 8000 mg/kg 2500 mg/kg 3919 mg/kg 3919 mg/kg 159 mg/kg Toxicidade Teste de Ames (mutação reversa) Não Tóxico Não Tóxico Não Tóxico Não Tóxico Não Tóxico Não Tóxico Hepatotoxicidade Inativo Inativo Inativo Inativo Inativo Inativo Carcinógenos Inativo Inativo Ativo(0,50) Inativo Ativo(0,69) Ativo(0,69) Mutagenicidade Inativo Inativo Inativo Inativo Ativo(0,52) Ativo(0,52) Citotoxicidade Inativo Inativo Inativo Inativo Inativo Inativo
Abreviaturas: BHE, barreira hematoencefálica; GI, gastrointestinal; Abs. oral, absorção oral.
Simulações moleculares e cálculos de energia livre de ligação
De acordo com os resultados de docking molecular, os três principais complexos proteína‐ligante em cada grupo, classificados por afinidade de docking, foram selecionados para simulações de DM. A estabilidade do sistema foi testada calculando o desvio quadrático médio (RMSD) em 10 ns da trajetória da simulação. A flutuação quadrática média (RMSF) foi usada para analisar a flutuação e a flexibilidade de cada complexo durante a simulação. Conforme mostrado na Figura 7, os desempenhos de cada complexo receptor‐ligante foram independentes. No entanto, em cada grupo, podemos encontrar mais de um complexo proteína‐ligante que foi mais estável que o sistema de referência. Esses complexos mantêm consistentemente uma faixa de flutuação mais leve durante as simulações (RMSD <0,1 nm). Entre eles, AKT1‐quercetina, CAV1‐diosgenina, DPP4‐diosgenina, IL6‐luteolina, INSR‐diosgenina, MAPK8‐diosgenina, MMP9‐diosgenina, PPARG‐diosgenina e SLC2A4‐luteolina foram marcados como complexos representativos. Os resultados de RMSF indicam que os complexos representativos apresentam picos e vales quase idênticos aos do sistema de referência. Isso significa que o sítio de ação desses compostos no receptor alvo é semelhante ao do inibidor de referência. Eles podem ter um mecanismo farmacodinâmico semelhante ao das referências.
Gráfico de RMSD e RMSF dos complexos receptor‐ligante selecionados durante as simulações de dinâmica molecular. (Ref): sistema de referência.
Enquanto isso, as energias de ligação desses complexos foram calculadas usando o método GMX‐MM/PBSA. Da Tabela 7, AKT1‐quercetina, CAV1‐diosgenina, DPP4‐diosgenina, IL6‐luteolina, INSR‐diosgenina, MAPK8‐diosgenina, MMP9‐diosgenina, PPARG‐diosgenina e SCL2A4‐luteolina exibem menor energia livre de ligação em comparação aos membros do mesmo grupo. Esse fenômeno indica que esses compostos têm uma forte afinidade de ligação ao receptor alvo. Além disso, a contribuição dessa afinidade de ligação deriva principalmente das forças de van der Waals e interações eletrostáticas. Portanto, com base nos resultados coletados, diosgenina, quercetina e luteolina foram ainda selecionados como os componentes principais do feno-grego no anti‐diabetes. Esses componentes principais podem se ligar a alvos-chave para formar complexos estáveis, que por sua vez exercem efeitos antidiabéticos.
A energia livre de ligação do sistema complexo receptor‐ligante pelo método GMX‐MM/PBSA.
Componentes de energia (Kcal/mol) Alvo Compostos △Evdw △Eelec △Ggas △Gsolv △Gbind AKT1 Diosgenina −17,13 −1,6 −18,73 12,84 −5,90 Quercetina −21,65 −55,74 −77,39 69,85 −7,54 Formononetina −29,70 −15,10 −44,80 35,38 −9,43 G4Q501 (Ref) −74,08 −30,65 −104,74 72,42 −32,32 CAV1 Diosgenina −18,84 −0,77 −19,61 3,78 −15,83 Formononetina −20,98 −21,93 −42,91 29,22 −13,69 Kaempferol −23,08 −13,39 −36,47 25,61 −10,68 Ácido gálico (Ref) −4,6 −35,76 −40,39 36,87 −3,52 DPP4 Diosgenina −22,39 −4,23 −26,62 13,87 −12,75 Luteolina −22,37 −41,20 −63,57 48,42 −15,15 Formononetina −29,58 −12,41 −41,99 29,98 −12,01 D3C801 (Ref) −11,13 −5,98 −17,11 12,14 −4,97 IL6 Luteolina −28,09 −63,02 −91,11 70,83 −20,28 Diosgenina −15,82 −0,82 −16,64 10,54 −6,10 Quercetina −21,93 −16,47 −38,40 32,91 5,49 TLA300 (Ref) −0,34 −0,46 −0,80 0,75 −0,05 INSR Diosgenina −30,51 −9,38 −39,89 32,01 −7,89 Luteolina −26,59 −28,42 −55,01 52,75 −2,26 Kaempferol −32,17 −15,76 −47,93 48,85 0,92 351B2001 (Ref) −6,26 −3,62 −9,88 5,44 −4,44 MAPK8 Diosgenina −29,50 −8,24 −37,74 15,06 −22,68 Quercetina −28,18 −22,50 −50,68 40,32 −10,45 Kaempferol −31,10 −23,73 −54,83 47,00 −7,83 CFK1 (Ref) −30,66 −24,61 −55,27 30,39 −24,89 MMP9 Diosgenina −35,70 −19,53 −55,23 33,65 −21,58 Luteolina −30,70 −18,97 −49,67 42,49 −7,19 Quercetina −32,78 −35,69 −68,47 59,17 −9,30 B9Z306 (Ref) −0,29 −0,53 −0,81 0,66 −0,15 PPARG Diosgenina −15,13 −1,60 −16,73 12,34 −4,40 β‐sitosterol −24,42 −0,08 −24,50 6,63 −17,87 Luteolina −21,66 −19,28 −40,94 33,49 −7,45 9WQ501 (Ref) −28,16 −10,92 −32,11 19,18 −12,93 SCL2A4 Kaempferol −32,56 −8,52 −41,08 36,97 −4,11 Luteolina −32,13 −12,42 −44,55 37,83 −6,72 Quercetina −28,84 −8,57 −37,42 30,11 −7,30 5RH601 (Ref) −45,60 −20,93 −66,53 57,47 −9,06
Abreviaturas: ∆EvdW, energia de van der Waals; ∆Eelec, energia eletrostática; ∆Ggas, energia livre em fase gasosa; ∆Gsolv, energia livre de solvatação; ∆Gbind, energia livre de ligação total; (Ref), sistema de referência.
Efeito do feno-grego no consumo de glicose em células HepG2 IR
A Figura 8A ilustrou que a viabilidade das células HepG2 diminuiu com o aumento da concentração de feno-grego. Comparando com as células normais, uma citotoxicidade significativa apareceu em concentrações superiores a 400 μg/mL de feno-grego. Isso sugere que a dosagem segura de tratamento de feno-grego para células HepG2 foi inferior a 400 μg/mL. Conforme mostrado na Figura 8B, em comparação com o modelo de RI, o consumo de glicose aumentou significativamente em todos os grupos tratados com feno-grego. Assim, o feno-grego pode contribuir para melhorar a captação de glicose em células IR-HepG2.

Efeitos do feno-grego na viabilidade celular e na captação de glicose em células IR-HepG2. (A) Viabilidade celular de células HepG2 cultivadas em diferentes concentrações de feno-grego de 0 a 1600 μg/mL por 24 h e 48 h. (B) Consumo de glicose de células HepG2 IR incubadas com ou sem feno-grego por 24 h (****p < 0,001 vs. o grupo modelo, ***p < 0,01 vs. o grupo modelo, *p < 0,05 vs. o grupo modelo).

DISCUSSÃO

Pesquisas anteriores investigaram os efeitos antidiabéticos do feno-grego. Além disso, extratos derivados do feno-grego têm sido utilizados para o tratamento do diabetes, com bons resultados. Os efeitos terapêuticos do feno-grego manifestam-se principalmente como melhorias na sensibilidade e resistência à insulina, bem como na redução da glicemia de jejum e dos níveis de HbA1c. Essas atividades farmacodinâmicas podem estar relacionadas aos flavonoides, alcaloides, óleos voláteis e ácidos graxos insaturados derivados do feno-grego. No entanto, quais composições são mais eficazes, os potenciais genes-alvo e os mecanismos de ação não são totalmente compreendidos, o que limita a aplicação do feno-grego.

Nos últimos anos, a tecnologia de docking molecular e a farmacologia de redes têm sido utilizadas para rastrear constituintes ativos e potenciais alvos de ação, avaliar o grau de associação composto-alvo e explicar os mecanismos farmacológicos de ação em medicamentos tradicionais chineses. Essas ferramentas são úteis para acelerar o esclarecimento dos mecanismos farmacológicos em medicamentos fitoterápicos tradicionais chineses e o desenvolvimento de novos fármacos. Os achados deste estudo podem servir como um ponto de referência para a triagem preliminar de compostos ativos antidiabéticos no feno-grego, bem como fornecer um novo conceito terapêutico para explorar ainda mais os mecanismos de ação antidiabéticos do feno-grego.
Este estudo investigou sistematicamente o mecanismo farmacológico do feno-grego no tratamento do diabetes. Primeiramente, os constituintes ativos foram obtidos das bases de dados TCMSP, CNKI e PubMed. Em seguida, as informações físicas e químicas desses compostos foram analisadas, e 19 compostos—mairina, β‐sitosterol, irolona, formononetina, calicosina, kaempferol, diosgenina, galato de ácido gálico‐3‐O‐(6’‐O‐galoil)‐glicosídeo, luteolina, lactona A de hiyodori, tigogenona, isovitexina, neotigogenina, quercetina, vicenina‐2, vitexina‐7‐glicosídeo_qt, isoorientina, vitexina e 4‐hidroxiisleucina—foram determinados como constituintes ativos, o que é consistente com os resultados de um estudo recente. Dentre esses constituintes ativos, foi demonstrado que a 4‐hidroxiisleucina, a quercetina e a diosgenina possuem atividade antidiabética e podem exercer efeitos antidiabéticos adicionais ao afetar genes-chave como AKT1, DPP4, INSR, MAPK8, MMP9, PPARG e SLC2A4. Além disso, os resultados da análise farmacológica em rede revelaram que esses compostos exercem efeitos antidiabéticos ao modular o papel de proteínas-alvo em várias vias metabólicas. Simultaneamente, a rede Composto–Gene–Via sugeriu que seis importantes constituintes ativos—β‐sitosterol, diosgenina, formononetina, kaempferol, luteolina e quercetina—estão incluídos nos constituintes ativos candidatos responsáveis pelos efeitos antidiabéticos do feno-grego. Ademais, a análise ADMET dos constituintes ativos exibiu propriedades como absorção intestinal, biodisponibilidade oral, substrato da glicoproteína P e penetração na barreira hematoencefálica. Mais importante, com base na análise preditiva do modelo de citotoxicidade, os seis importantes constituintes ativos apresentaram uma DL50 elevada (>150 mg/kg) e nenhuma citotoxicidade. Além disso, a docagem molecular e a simulação de dinâmica molecular selecionaram ainda que a diosgenina, a quercetina e a luteolina mostram capacidade de ligação mais forte com os alvos correspondentes. Esses resultados sugerem que a conexão entre os principais constituintes ativos selecionados e os genes-alvo centrais relacionados ao diabetes é estável, indicando que os compostos ativos principais do feno-grego podem se ligar aos genes-chave envolvidos no diabetes mellitus e induzir atividade antidiabética. Além disso, os resultados da cultura celular demonstraram que o feno-grego não só possui boa segurança biológica in vitro, mas também pode melhorar efetivamente o consumo de glicose das células HepG2 com resistência à insulina. Portanto, nossos resultados sugerem ainda que esses constituintes ativos principais podem ser fármacos candidatos para o tratamento do diabetes e suas complicações.
De acordo com a análise de enriquecimento funcional GO, as atividades GO antidiabéticas do feno-grego afetam principalmente BP, incluindo resposta a peptídeos, resposta a níveis de oxigênio, resposta celular ao estresse químico, regulação positiva da fosforilação de proteínas, regulação da via de sinalização apoptótica e regulação do sistema circulatório. Com base nos resultados da análise de enriquecimento da via KEGG, além da via AGE-RAGE, que está intimamente relacionada ao diabetes, outras vias de sinalização relacionadas foram enriquecidas em termos de complicações do diabetes, incluindo a via de sinalização do câncer, a via de sinalização FoxO, a via de sinalização HIF-1, a via de sinalização NF-κB e lipídios e aterosclerose. Um número crescente de estudos tem mostrado que a via de sinalização AGE-RAGE desempenha um papel fundamental na geração de complicações vasculares relacionadas ao diabetes, incluindo aterosclerose e doença renal.
Em termos de aumento dos níveis de glicose e outros açúcares redutores, a sinalização AGE‐RAGE é fortemente amplificada, induzindo assim a liberação de NAD(P)H oxidase e aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio. Essa condição pode causar estresse oxidativo grave, bem como disfunção endotelial vascular e dos nervos periféricos, o que, por sua vez, pode levar a complicações diabéticas graves, incluindo pé diabético, nefropatia diabética e lesão miocárdica diabética. Além disso, numerosos relatos sugerem que existe uma sinergia amplificada entre a via de sinalização AGE‐RAGE e a via de sinalização TNF‐α. O aumento dos níveis de TNF‐α prejudica a sinalização da insulina por meio da fosforilação da serina, o que induz resistência à insulina e leva ao desenvolvimento de DM2. Durante o desenvolvimento do diabetes, o fator nuclear está intimamente associado à inflamação e à ativação do estresse oxidativo e desempenha um papel fundamental na expressão de citocinas como TNF‐α, IL‐6 e IL‐1B, bem como de moléculas de adesão como ICAM1. Zheng et al. relataram que a taxa de transferência nuclear da proteína de células endoteliais NF‐κBp65 foi reduzida sob condições de alta glicose pelo pré‐tratamento com inibidores de NF‐κB. Subsequentemente, o dano endotelial vascular foi reduzido. A Associação Americana de Diabetes e a Sociedade Americana de Câncer sugeriram que o DM2 e o câncer compartilham muitos fatores patogênicos sobrepostos. De fato, quando pacientes são tratados para alguns dos tipos mais graves de câncer, eles têm três vezes mais chances do que outros pacientes de desenvolver diabetes. Por último, mas não menos importante, o diabetes é uma doença inflamatória crônica. No presente estudo, a tecnologia de docking molecular e a farmacologia de redes foram utilizadas para revelar o mecanismo pelo qual o feno-grego exerce seus efeitos antidiabéticos. Os principais genes-alvo selecionados, processos biológicos e vias de sinalização estão intimamente relacionados à inflamação. Portanto, levantamos a hipótese de que o efeito antidiabético do feno-grego foi exercido por meio da inibição das vias de sinalização inflamatória e da regulação dos efeitos dos fatores inflamatórios nos tecidos pancreáticos e na gordura. No entanto, essa hipótese requer verificação experimental subsequente.
CONCLUSÃO
Utilizamos docking molecular, simulação de dinâmica molecular e farmacologia de redes para realizar um estudo preliminar dos constituintes ativos e mecanismos de ação do feno-grego no tratamento do diabetes. Um total de 19 constituintes ativos foram selecionados, dos quais três—diosgenina, luteolina e quercetina—foram triados como constituintes ativos principais. Além disso, um total de 71 genes-alvo comuns foram triados, dos quais ESR1, CAV1, VEGFA, TP53, CAT, AKT1, IL6 e IL1 foram previstos como genes-alvo principais. Além disso, a análise de enriquecimento da via KEGG mostrou que o feno-grego exerceu efeitos antidiabéticos ao inibir a via de sinalização inflamatória, reduzindo a expressão de fatores inflamatórios e protegendo o endotélio vascular, nervos periféricos e células das ilhotas contra citocinas inflamatórias. As vias de sinalização incluem a via de sinalização AGE-RAGE, a via de sinalização FoxO, a via de sinalização HIF-1, a via de sinalização NF-κB e lipídios e aterosclerose. No geral, este estudo fornece insights profundos sobre a atividade biológica, potenciais alvos de interação e modo de ação do feno-grego contra o diabetes. Também fornece uma base teórica para explorar o papel e os mecanismos relacionados do feno-grego no tratamento do diabetes. Além disso, esses constituintes selecionados são biocompatíveis e antidiabéticos. Assim, eles poderiam ser potenciais agentes terapêuticos para o diabetes mellitus. Nossos resultados podem ajudar no desenvolvimento de suplementos dietéticos ou medicamentos antidiabéticos baseados no feno-grego. Futuramente, conduziremos estudos animais e clínicos para validar os alvos de triagem com base nesta análise preditiva, com o objetivo de fornecer evidências científicas adicionais para a aplicação clínica do feno-grego no tratamento do diabetes.

CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES
Wenfeng Luo: Conceituação (principal); curadoria de dados (igual); administração do projeto (igual); recursos (igual); escrita – rascunho original (igual). Jie Deng: Curadoria de dados (igual); análise formal (igual); aquisição de financiamento (igual); software (igual). Jiecheng He: Curadoria de dados (igual); metodologia (igual); software (igual); visualização (igual). Liang Yin: Curadoria de dados (igual); investigação (igual); visualização (igual). Rong You: Conceituação (igual); metodologia (igual); supervisão (igual); escrita – revisão e edição (igual). Lingkun Zhang: Investigação (igual); software (igual); validação (igual). Jian Shen: Recursos (igual); software (igual); validação (igual). Zeping Han: Conceituação (igual); investigação (igual); software (igual). Fangmei Xie: Curadoria de dados (igual); recursos (igual). Jin‐Hua He: Aquisição de financiamento (igual); visualização (igual); escrita – revisão e edição (igual). Yanqing Guan: Conceituação (igual); aquisição de financiamento (igual); administração do projeto (igual); escrita – revisão e edição (igual).

INFORMAÇÕES DE FINANCIAMENTO
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Panyu (2019‐Z04‐07, 2019‐Z04‐35, 2019‐Z04‐84, 2020‐Z04‐054), pelo Projeto de Ciência e Tecnologia da Comissão de Saúde de Guangzhou (No. 20211A011114), pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (No. 202002020023), pelo Projeto Geral de Talentos Inovadores Juvenis Universitários da Província de Guangdong (No. 2022KQNCX281).
DECLARAÇÃO DE CONFLITO DE INTERESSES
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS
Dados disponíveis mediante solicitação aos autores.
REFERÊNCIAS
IDF Diabetes Atlas: Estimativas globais da prevalência de diabetes para 2017 e projeções para 2045
IDF Diabetes Atlas: Estimativas de prevalência de diabetes globais, regionais e por país para 2021 e projeções para 2045
Prevalência atual de diabetes tipo 1 e tipo 2 em adultos e crianças no Reino Unido
Diabetes e complicações: vias de sinalização celular, compreensão atual e terapias direcionadas
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