pmid: "36648735"
title: "Aumento da senescência celular na lesão ovariana murina induzida por doxorrubicina: efeito dos senolíticos."
authors: "Gao Y, Wu T, Tang X, Wen J, Zhang Y, Zhang J, Wang S"
journal: "GeroScience"
pubdate: "2023 Jun"
doi: "10.1007/s11357-023-00728-2"
source: "PMC Full Text"

Aumento da senescência celular na lesão ovariana murina induzida por doxorrubicina: efeito dos senolíticos.

Autores

Gao Y, Wu T, Tang X, Wen J, Zhang Y, Zhang J, Wang S

Periodico

GeroScience (2023 Jun)

Conteudo

Aumento da senescência celular na lesão ovariana murina induzida por doxorrubicina: efeito dos senolíticos
A lesão ovariana causada pela quimioterapia pode levar à menopausa precoce, infertilidade e até mesmo senilidade prematura em pacientes com câncer do sexo feminino, prejudicando gravemente a qualidade de vida e a saúde geral das sobreviventes do câncer. No entanto, ainda faltam estratégias eficazes de proteção contra essa lesão. A senescência celular pode ser induzida por agentes quimioterápicos em múltiplos órgãos e pode corroer a estrutura e a função dos tecidos normais. Nossa hipótese foi de que a doxorrubicina, um fármaco quimioterápico de primeira linha amplamente utilizado, poderia aumentar a carga de células senescentes no tecido ovariano normal durante o processo terapêutico e que a eliminação de células senescentes com senolíticos melhoraria a lesão ovariana induzida por doxorrubicina. Aqui, demonstramos um acúmulo de senescência celular em ovários tratados com doxorrubicina por meio da detecção dos níveis de expressão de p16 e p21, da atividade da β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) e de fatores do fenótipo secretor associado à senescência (SASP). A intervenção de curto prazo com a combinação senolítica clássica de dasatinibe e quercetina (DQ) ou fisetina reduziu significativamente a carga de células senescentes nos ovários após o tratamento com doxorrubicina. No entanto, nem DQ nem fisetina aliviaram a disfunção ovariana relacionada à doxorrubicina. Experimentos adicionais mostraram que a apoptose e a fibrose ovarianas após a exposição à doxorrubicina não puderam ser melhoradas pelos senolíticos. Em conjunto, nosso estudo mostra que o tratamento senolítico pode eliminar células senescentes acumuladas, mas não pode reverter a perda maciça de folículos e a fibrose estromal ovariana causadas pela doxorrubicina, sugerindo que a senescência celular pode não ser um dos mecanismos-chave na lesão ovariana induzida por doxorrubicina.
Introdução
O rápido desenvolvimento da medicina moderna tornou possível que muitos cânceres sejam detectados e tratados em estágio inicial, prolongando significativamente o tempo de sobrevida dos pacientes com câncer. Por exemplo, as taxas gerais de sobrevida em 5 anos para leucemia linfoblástica aguda e câncer de mama, as malignidades mais comuns em crianças do sexo feminino e mulheres em idade reprodutiva, respectivamente, já ultrapassaram 70% até o momento. Além disso, a idade de início de múltiplos cânceres está diminuindo. Consequentemente, a qualidade de vida pós-tratamento e a função reprodutiva das sobreviventes do câncer do sexo feminino estão recebendo atenção crescente.
Atualmente, a quimioterapia continua sendo a base do tratamento do câncer e a doxorrubicina é um dos medicamentos quimioterápicos de primeira linha mais amplamente prescritos. Conforme recomendado pelas diretrizes da National Comprehensive Cancer Network, a doxorrubicina é frequentemente utilizada em diversos regimes de quimioterapia combinada para leucemia linfoide aguda, linfoma de Hodgkin e câncer de mama invasivo. Os efeitos colaterais sistêmicos da doxorrubicina foram extensivamente estudados, e há evidências consideráveis de que as gônadas femininas são vulneráveis à doxorrubicina. As principais manifestações clínicas da lesão ovariana relacionada à doxorrubicina incluem comprometimento da reserva ovariana, amenorreia, menopausa precoce, subfertilidade e até infertilidade. Os mecanismos de dano revelados por estudos anteriores incluem dano irreversível ao DNA, aumento da apoptose, hiperativação dos folículos primordiais e estresse oxidativo aumentado. Protetores direcionados a esses mecanismos foram desenvolvidos usando modelos de camundongos, mas esses agentes tiveram efeitos limitados e não foram testados quanto à sua capacidade de proteger contra lesão ovariana em humanos. Estratégias gerais de preservação da fertilidade, como criopreservação de embriões e oócitos, oferecem benefícios limitados e apresentam muitas restrições. Portanto, novos medicamentos e mecanismos de dano precisam ser explorados.
A senescência celular é um estado celular em resposta a diferentes estresses, caracterizado por parada irreversível do ciclo celular, dano persistente ao DNA, resistência à apoptose, reprogramação metabólica e fenótipo secretor associado à senescência (SASP). A senescência celular ocorre no processo normal de envelhecimento e também pode ser desencadeada por uma variedade de estímulos estressores, incluindo lesão tecidual aguda e crônica, radiação e quimioterapia. O acúmulo excessivo e anormal de células senescentes nos tecidos pode prejudicar a função tecidual e o potencial regenerativo, além de criar um microambiente pró-inflamatório que contribui para a senescência, disfunção ou transformação maligna das células normais circundantes. Senolíticos foram desenvolvidos para eliminar seletivamente células senescentes e diminuir os impactos prejudiciais da senescência. A combinação de dasatinibe e quercetina (DQ) é o senolítico mais típico. Um grande número de estudos confirmou sua eficácia na eliminação de células senescentes e seu potencial para prolongar a saúde e melhorar doenças relacionadas à idade. Além disso, a fisetina, um agente antioxidante com múltiplas funções farmacológicas, também foi identificada como tendo efeitos senolíticos in vivo e in vitro. Cada vez mais estudos demonstram que medicamentos quimioterápicos como doxorrubicina e cisplatina podem induzir senescência celular em tecidos normais como coração e rim enquanto exercem papéis antitumorais, o que pode estar envolvido na patogênese da disfunção tecidual. Até o momento, permanece incerto se as células senescentes aumentam no ovário após o tratamento com doxorrubicina e se os senolíticos podem aliviar o dano ovariano induzido pela doxorrubicina.
Neste estudo, desenvolvemos um modelo de lesão ovariana por doxorrubicina em camundongos e confirmamos que o tratamento com doxorrubicina aumentou a senescência celular nos ovários murinos. No entanto, nem DQ nem fisetina conseguiram melhorar a reserva ovariana e a fertilidade de camundongos tratados com doxorrubicina, embora ambos tenham reduzido significativamente a senescência ovariana. Experimentos adicionais mostraram que o dano ao DNA, a apoptose e a fibrose estromal causados pela doxorrubicina não puderam ser revertidos pela intervenção com DQ ou fisetina. Nossos resultados sugerem que a senescência celular pode não ser um mecanismo chave da lesão ovariana induzida por doxorrubicina e, portanto, os senolíticos podem não ser uma escolha ideal para a proteção da fertilidade em pacientes com câncer tratadas com regimes contendo doxorrubicina.
Materiais e métodos
Cuidados com os animais e administração de medicamentos
Camundongos fêmeas C57BL/6J de 7 semanas de idade foram adquiridos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. e alimentados livremente por 1 semana para adaptação ambiental antes da administração do medicamento. Todos os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas com livre acesso a comida e água. O ambiente de alimentação foi mantido a uma temperatura de 22 ± 2 °C e uma umidade de 55% ± 15% em um ciclo claro/escuro de 12:12 h.
O primeiro lote de experimentos com animais incluiu 2 grupos (com 16 camundongos fêmeas C57BL/6J de 8 semanas de idade em cada grupo): grupo controle (Con) e grupo doxorrubicina (Dox). A doxorrubicina (D8740, Solarbio, China) foi injetada por via intraperitoneal uma vez na dose de 10 mg/kg. O segundo lote de camundongos foi dividido em seis grupos (com 20 camundongos fêmeas C57BL/6J de 8 semanas de idade em cada grupo): grupo controle veículo (Veículo), grupo doxorrubicina (Dox), grupo doxorrubicina mais DQ (Dox + DQ), grupo doxorrubicina mais fisetina (Dox + F), grupo DQ e grupo Fisetina. DQ (dasatinibe, 5 mg/kg; quercetina, 50 mg/kg) ou fisetina (100 mg/kg) ou solução veículo (polietilenoglicol 400 a 10%, PEG400) foi administrado por gavagem oral em dias alternados por 3 semanas. Uma única injeção intraperitoneal de doxorrubicina (10 mg/kg) ou soro fisiológico foi administrada no dia seguinte à segunda administração dos senolíticos. Os medicamentos senolíticos e o solvente usados neste estudo estão disponíveis comercialmente na MedChemExpress (dasatinibe, HY-10181; quercetina, HY-18085; fisetina, HY-N0182; PEG400, HY-Y0873A).
Amostras de sangue e ovários de camundongos fêmeas foram coletadas com 11 semanas de idade. O peso corporal e o peso dos ovários foram registrados. Seis ovários de cada grupo foram preservados em paraformaldeído a 4% para processamento subsequente. Três ovários de cada grupo foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido para fazer cortes congelados e os outros ovários foram armazenados a −80 °C para extração de proteína ou RNA.
Monitoramento do ciclo estral
Esfregaços vaginais de camundongos foram coletados aproximadamente entre 9 e 11 horas da manhã, todos os dias, por 2 semanas consecutivas. Células vaginais obtidas lavando a vagina com soro fisiológico foram espalhadas em lâminas de vidro limpas e coradas com hematoxilina e eosina (H&E). O estágio do ciclo estral foi determinado pelas características citológicas ao microscópio, conforme descrito anteriormente. Os camundongos foram categorizados como cíclicos regulares se exibissem consistentemente ciclos com duração de 4 a 6 dias. Camundongos com comprimentos médios de ciclo fora desse intervalo e camundongos com ciclos de comprimentos variáveis ou sem ciclos aparentes foram categorizados como cíclicos irregulares.
Medição de hormônios séricos
Amostras de sangue de camundongos fêmeas foram coletadas no diestro. Os níveis séricos de hormônio anti-mülleriano (AMH), hormônio folículo-estimulante (FSH) e estradiol (E2) foram medidos por ensaio de imunoabsorção enzimática de acordo com as instruções do fabricante (CSB-E13156m, CSB-06871m e CSB-E05109m; Cusabio Technology LLC, EUA).
Contagem de folículos
Os ovários fixados em paraformaldeído a 4% foram embebidos em parafina e cortados em fatias de 5 μm, com quatro fatias consecutivas montadas em uma lâmina de vidro. A cada quarta lâmina foi corada com H&E e analisada ao microscópio óptico por 2 pessoas que desconheciam o grupo das secções. Folículos sem oócitos visíveis foram excluídos, enquanto remanescentes da zona pelúcida (ZPR) foram classificados como folículos atrésicos tardios. Os procedimentos detalhados foram realizados conforme descrito anteriormente.
Teste de acasalamento
No segundo lote de experimentos animais, seis camundongos fêmeas de cada grupo foram selecionados aleatoriamente para o teste de acasalamento. Duas camundongos fêmeas e um camundongo macho sexualmente maduro foram mantidos em uma gaiola para acasalamento livre. Após 10 dias, as camundongos fêmeas foram colocadas em gaiolas individuais. Em seguida, o estado de gestação, o resultado do parto, o tamanho da ninhada e as condições dos filhotes foram monitorados e registrados. O teste de acasalamento foi repetido duas vezes. As duas rodadas do teste de acasalamento foram separadas por 50 dias para garantir que todos os camundongos estivessem desmamados antes da segunda rodada.
Coloração de β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal)
A coloração de SA-β-gal de secções de tecido ovariano congelado foi realizada usando um kit comercial de coloração SA-β-gal (C0602, Beyotime Biotechnology, China) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as secções congeladas de tecido ovariano foram reaquecidas à temperatura ambiente, embebidas em PBS e, em seguida, fixadas em solução fixadora por 15 min. Após lavagem com PBS por três vezes, as amostras foram incubadas com solução de trabalho SA-β-gal a 37 °C por 16 h. PBS gelado foi usado para interromper a reação enzimática.
Imuno-histoquímica
Três secções ovarianas representativas de cada grupo foram selecionadas para análise imuno-histoquímica. Após desparafinização e reidratação, as secções foram aquecidas em tampão Tris-Ácido Etilenodiamino Tetraacético (pH 9,0) por 15 min a 95 °C para recuperação antigênica. Em seguida, as secções resfriadas naturalmente foram lavadas três vezes com PBS e incubadas em solução de H2O2 a 3% por 30 min à temperatura ambiente. As secções ovarianas foram bloqueadas em BSA a 3% por 1 h e então incubadas com anticorpo primário (p16 #A0262, ABclonal Technology, China; p21 #A11454, ABclonal Technology, China; γH2AX #AP0687, ABclonal Technology, China) durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, as secções foram incubadas com anticorpo secundário (IgG de coelho anti-cabra conjugado com HRP (H+L), GB23204, Servicebio, China) por 50 min à temperatura ambiente, seguidas por 3 lavagens com PBS. Posteriormente, as secções foram visualizadas com agente cromogênico DAB (AR1022, Boster, China) e contracoradas com hematoxilina. As imagens foram adquiridas usando o software cellSens Dimension (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Alemanha) sob um microscópio óptico e a expressão relativa foi avaliada pelo software Image Pro Plus. Resumidamente, usamos a ferramenta straw no modo HSI para determinar a região de análise e obtivemos a densidade óptica integrada (DOI) e a área de cada imagem. A densidade média foi calculada por DOI/Área para representar o nível de expressão antigênica correspondente. Todas as imagens foram analisadas sob o mesmo ambiente analítico e parâmetros de cor.
Imunofluorescência
Os níveis de expressão do biomarcador típico de fibrose, alfa-actina de músculo liso (α-SMA), nos ovários foram detectados por coloração de imunofluorescência de acordo com o procedimento de rotina. As secções ovarianas foram incubadas com anticorpo primário (α-SMA #ab124964, Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, após incubação com anticorpo secundário (IgG de coelho anti-cabra conjugado com Cy3 (H+L), GB21303, Servicebio, China) por 60 min a 37 °C, os núcleos foram contracorados com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (G1012, Servicebio, China). As imagens foram obtidas por um microscópio de fluorescência (Olympus).
Ensaio de marcação de extremidade nick e dUTP mediada por desoxinucleotidil transferase terminal (TUNEL)
A apoptose celular nos ovários murinos foi analisada usando o Kit de Ensaio de Apoptose TUNEL de Uma Etapa (C1088, Beyotime Biotechnology, China). De acordo com as instruções do fabricante, as secções ovarianas foram primeiro permeabilizadas por Proteinase K à temperatura ambiente por 15 min e depois incubadas com mistura de reação TUNEL a 37 °C por 1 h. Os núcleos foram contracorados com DAPI. Para cada amostra, 3–5 imagens foram obtidas de campos aleatórios.
Coloração com vermelho Sirius
Uma série de secções representativas de tecido ovariano foram rotineiramente desparafinizadas até a água e coradas com corante vermelho Sirius por 15 min. Após desidratação, as secções ovarianas foram seladas com resina neutra e fotografadas para análise quantitativa.
Western blot
A proteína total foi extraída dos ovários conforme procedimento de rotina e separada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio a 10% ou 12%. As proteínas no gel foram subsequentemente transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Após bloqueio com leite desnatado a 5% por 1 h, as membranas foram incubadas com anticorpo primário específico (p16 #A11337, ABclonal Technology, China; p21 #PA9426, Abmart, China; e β-actina #AC026, ABclonal Technology, China) durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, as membranas de PVDF foram lavadas 3 vezes com Tampão Salino Tris mais Tween-20 e incubadas com anticorpo secundário adequado por 1 h a 37 °C. Após outras 3 lavagens, os alvos foram visualizados usando o método de quimioluminescência. A quantificação da expressão proteica foi realizada com o software Image Lab com base na intensidade de luz integrada de cada banda. A expressão de β-actina foi medida para verificar a carga igual.
Reações em cadeia da polimerase quantitativas em tempo real (qRT-PCR)
As sequências dos iniciadores usados para o ensaio de qRT-PCR
Gene Iniciador direto (5′-3′) Iniciador reverso (5′-3′) Cdkn2a GAACTCTTTCGGTCGTACCC CGAATCTGCACCGTAGTTGA Cdkn1a TTGTCGCTGTCTTGCACTCT TCTCTTGCAGAAGACCAATC Il6 TGAACAACGATGATGCACTTG CTGAAGGACTCTGGCTTTGTC Mcp1 CTACCTTTTCCACAACCACCTC ATTAAGGCATCACAGTCCGAGT Tgfβ1 CACCATCCATGACATGAACC TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC Bax CAGGATGCGTCCACCAAGAA GCAAAGTAGAAGAGGGCAACCA Bcl2 TGGAGAGCGTCAACAGGGAGA GCCAGGAGAAATCAAACAGAGGT Caspase 3 AGCAGCTTTGTGTGTGTGATTCTAA AGTTTCGGCTTTCCAGTCAGAC Acta2 CTGACAGAGGCACCACTGAA CATCTCCAGAGTCCAGCACA Col1a1 TTCTCCTGGCAAAGACGGACTCAA GGAAGCTGAATCATAACCGCCA Timp1 TCATGGAAAGCCTCTGTGGAT CGGCCCGTGATGAGAAACT Timp2 GCGTTTTGCAATGCAGACG ATTCCCGGAATCCACCTCC Mmp2 TTTGCTCGGGCCTTAAAAGTAT CCATCAAACGGGTATCCATCTC Actb ATGACCCAAGCCGAGAAGG CGGCCAAGTCTTAGAGTTGTTG
O RNA total dos ovários foi extraído e purificado usando o reagente RNAiso plus (Takara, Nojihigashi, Japão). Amostras contendo 2 g de RNA total foram tratadas com DNase usando gDNA wiper (R223-01, Vazyme, China) e então transcritas reversamente em cDNA usando a transcriptase reversa HiScript (R223-01, Vazyme, China). A PCR em tempo real foi realizada em um sistema de PCR em tempo real CFX96 (Bio-Rad, EUA) em um volume final de 40 μl. O gene Actb foi usado como controle endógeno para calcular a expressão gênica relativa com base no método CT comparativo. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela 1.
Análise estatística
Os dados são apresentados como média ± DP e um p < 0,05 foi considerado significativamente diferente. As comparações estatísticas foram realizadas usando testes t de Student não pareados, teste qui-quadrado ou ANOVA de uma via. As análises estatísticas foram realizadas no SPSS 26.0 e GraphPad Prism 8.0.
Resultados
Acúmulo de células senescentes nos ovários murinos após tratamento com doxorrubicina
A senescência ovariana é aumentada em camundongos tratados com doxorrubicina. a Diagrama esquemático para o delineamento do experimento animal. b–d Peso corporal, peso do ovário e índice ovariano de camundongos após injeção de solução salina ou doxorrubicina (n = 16, teste t de Student não pareado). e Proporção de ciclos estrais regulares ou irregulares após injeção de solução salina ou doxorrubicina (n = 16, teste qui-quadrado). f Níveis séricos de AMH, FSH e E2 no diestro (n = 6, teste t de Student não pareado). g Proporção de folículos em diferentes estágios (PMF: folículos primordiais, GF: folículos em crescimento, ATF: folículos atrésicos). h Imagens representativas da coloração H&E de ovários murinos. Setas amarelas: folículos primordiais, setas vermelhas: folículos primários, setas azuis: folículos secundários, setas pretas: restos de zona pelúcida. ANF: folículos antrais. i Resultados da contagem de folículos com base na coloração H&E de secções ovarianas seriadas (n ≥ 5, teste t de Student não pareado). j Imagens representativas da coloração SA-β-gal e detecção por IHQ de p16 e p21 nos ovários murinos. k Escores de IHQ da expressão relativa de p16 e p21 com base na IOD (n = 3, teste t de Student não pareado). IOD: densidade óptica integrada. l, m Expressão proteica de p16 e p21 em tecidos ovarianos detectada por western blot. n Expressão relativa de mRNA de genes relacionados à senescência celular e SASP (n = 3, teste t de Student não pareado). Os dados são apresentados como média ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001

Tratamos camundongos fêmeas de 8 semanas de idade com dose clinicamente relevante de doxorrubicina a 10 mg/kg uma vez (Fig. 1a). Em comparação ao grupo controle de solução salina, os camundongos tratados com doxorrubicina apresentaram menor peso corporal, peso do ovário e índice ovariano, ou seja, a razão entre o peso do ovário e o peso corporal (Fig. 1b–d). O monitoramento do ciclo estral e o exame dos hormônios séricos foram realizados para refletir a função endócrina ovariana. O grupo Dox (consulte Materiais e métodos para o nome simplificado do grupo) apresentou maior porcentagem de ciclos estrais irregulares (grupo Dox 63,16% vs. grupo Con 15,79%, p<0,01, Fig. 1e). Os níveis séricos de AMH diminuíram significativamente após a administração de doxorrubicina, enquanto E2 e FSH mostraram uma tendência a diminuir e aumentar, respectivamente (Fig. 1f). Além disso, a coloração H&E e a subsequente contagem de folículos ovarianos foram realizadas para apresentar alterações patológicas da reserva ovariana de forma mais direta (Fig. 1h). Em camundongos tratados com doxorrubicina, os folículos primordiais (PMF), folículos primários, folículos secundários e folículos antrais foram bastante reduzidos, enquanto os folículos atrésicos (ATF) apresentaram uma tendência de aumento sem significância estatística (Fig. 1i). Os folículos primários, secundários e antrais foram ainda classificados como folículos em crescimento (GF). A proporção de PMF e GF diminuiu drasticamente, enquanto a proporção de ATF aumentou notavelmente nos ovários tratados com doxorrubicina (Fig. 1g). Portanto, a doxorrubicina em dose clinicamente relevante pode causar disfunção endócrina ovariana e depleção da reserva ovariana em camundongos fêmeas.
Em seguida, para determinar se a senescência celular foi induzida nos ovários após a injeção de doxorrubicina, realizamos a coloração de SA-β-gal e avaliamos a expressão de biomarcadores de senescência celular. A positividade para SA-β-gal, que é regulada positivamente em células senescentes, foi maior nos ovários do grupo Dox em comparação com os ovários controle, especialmente no estroma ovariano (Fig. 1j). A coloração por imuno-histoquímica (IHC) dos inibidores de quinase dependentes de ciclina (CDKIs) p16 e p21, outros dois marcadores típicos de senescência celular, mostrou alterações consistentes com a coloração de SA-β-gal (Fig. 1j, k). A expressão proteica de p16 e p21 em tecidos ovarianos, detectada adicionalmente por western blot, também foi aumentada após o tratamento com doxorrubicina (Fig. 1l, m). Além disso, os níveis de mRNA de Cdkn2a e Cdkn1a, genes que codificam p16 e p21 respectivamente, juntamente com vários genes SASP, incluindo Il6, Mcp1 e Tgfβ1, foram significativamente elevados nos ovários tratados com doxorrubicina (Fig. 1n). Assim, esses resultados sugeriram que o tratamento com doxorrubicina pode de fato induzir o acúmulo de células senescentes nos ovários.
Não alívio da lesão ovariana induzida por doxorrubicina por senolíticos
Senolíticos não podem aliviar a lesão ovariana induzida por doxorrubicina. a Diagrama esquemático breve do desenho do experimento animal. b–d Peso corporal, peso ovariano e índice ovariano dos camundongos em cada grupo (n ≥ 16, ANOVA de uma via). e A proporção de ciclos estrais regulares ou irregulares em cada grupo (n ≥ 18, teste Qui-quadrado). f Os níveis séricos de AMH, FSH e E2 no diestro (n = 6, ANOVA de uma via). g Imagens representativas da coloração H&E de ovários murinos de cada grupo. Setas amarelas: folículos primordiais, setas vermelhas: folículos primários, setas azuis: folículos secundários, setas pretas: remanescentes da zona pelúcida. ANF: folículos antrais, ATF: folículos atrésicos. h Resultados da contagem folicular de acordo com a coloração H&E de secções ovarianas seriadas (n ≥ 5, ANOVA de uma via). i A proporção de folículos em diferentes estágios (PMF: folículos primordiais, GF: folículos em crescimento). j A proporção de camundongos fêmeas prenhes bem-sucedidas no teste de acasalamento (n = 12, teste Qui-quadrado). k Tamanho médio da ninhada de todos os camundongos acasalados (n = 12, ANOVA de uma via). l Tamanho médio da ninhada de camundongos pós-parto (n = 3~11, ANOVA de uma via). m Estado geral dos filhotes em diferentes grupos. Os dados são apresentados como média ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001
Considerando o aumento considerável da senescência celular nos ovários de camundongos tratados com doxorrubicina, levantamos a hipótese de que a intervenção com senolíticos capazes de obliterar células senescentes em camundongos fêmeas melhoraria a lesão ovariana induzida pela doxorrubicina. No presente estudo, o coquetel senolítico mais clássico DQ e o potencial fármaco senolítico fisetina foram selecionados e administrados por via intragástrica antes e após a injeção de doxorrubicina (Fig. 2a). Curiosamente, nos grupos submetidos à doxorrubicina, o tratamento com DQ ou fisetina não atenuou as alterações induzidas pela doxorrubicina no peso corporal, peso/índice dos ovários, ciclos estrais, níveis hormonais séricos e reserva folicular ovariana (Fig. 2b–i). Além disso, testes de acasalamento revelaram que a doxorrubicina prejudicou gravemente a fertilidade de camundongos fêmeas, enquanto a intervenção com DQ ou fisetina não melhorou a taxa de gestação bem-sucedida nem o tamanho médio da ninhada dos camundongos tratados com doxorrubicina (Fig. 2j–m). Vale ressaltar que DQ isoladamente ou fisetina isoladamente não tiveram efeito evidente na maioria dos testes mencionados em comparação com o grupo controle veículo, exceto que DQ isoladamente reduziu significativamente o número e a proporção de PMF em ovários murinos (Fig. 2h, i).

Eliminação de células senescentes por senolíticos em ovários tratados com doxorrubicina

Os senolíticos podem reduzir a senescência ovariana em camundongos tratados com doxorrubicina. a Imagens representativas da coloração de SA-β-gal de secções ovarianas murinas. b, c Imagens representativas da expressão de p16 e p21 em ovários murinos por IHC. d, e Escores de IHC da expressão relativa de p16 e p21 com base na IOD (n = 3, ANOVA unidirecional). f, g Expressão proteica de p16 e p21 em tecidos ovarianos demonstrada por western blot. h Níveis de expressão de mRNA relativo de genes relacionados à senescência celular e SASP nos ovários (n = 3, ANOVA unidirecional). Os dados são apresentados como média ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001

Para descobrir se os dois senolíticos eliminaram as células senescentes acumuladas nos ovários lesionados pela doxorrubicina, detectamos biomarcadores de senescência celular em cada grupo. Em comparação com o grupo Dox, tanto a intervenção com DQ quanto com fisetina reduziram notavelmente a área positiva para coloração de SA-β-gal (Fig. 3a) e diminuíram a expressão aumentada de p16 e p21 para o nível dos ovários controle (Fig. 3b–e). Conforme demonstrado por western blot, DQ e fisetina reduziram os níveis proteicos de p16 e p21 em tecidos ovarianos após a injeção de doxorrubicina (Fig. 3f, g). Além disso, o tratamento com DQ ou fisetina regulou negativamente os níveis de mRNA de Cdkn2a, Cdkn1a, Il6 e Mcp1, mas não de Tgfβ1 (Figs. 3h e 5e). Em conjunto, esses resultados demonstraram que a administração de curto prazo de DQ ou fisetina foi eficaz em neutralizar o aumento da senescência ovariana induzido pela doxorrubicina.

Nenhuma melhora na apoptose e fibrose ovarianas com o tratamento senolítico
Senolíticos não têm efeito protetor contra a apoptose ovariana após tratamento com doxorrubicina. a, c Expressão do marcador de dano ao DNA γH2AX em ovários murinos detectada por IHQ (n = 3, ANOVA de uma via). b Imagens representativas da coloração TUNEL de cortes ovarianos. Pontos fluorescentes verdes indicam células apoptóticas positivas para TUNEL. d–f Expressão relativa de mRNA de genes relacionados à apoptose em ovários (n = 3, ANOVA de uma via). Os dados são apresentados como média ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01

Para elucidar melhor por que DQ e fisetina não conseguiram resgatar a função ovariana em camundongos tratados com doxorrubicina, focamos em outras vias de dano além da senescência celular. A apoptose é o principal e mais estudado processo a jusante do dano ao DNA na lesão ovariana induzida por doxorrubicina. Em seguida, realizamos imuno-histoquímica de γH2AX e coloração TUNEL para detectar dano ao DNA e apoptose nos ovários. Os ovários tratados com doxorrubicina mostraram expressão aumentada de γH2AX, mas nem DQ nem fisetina reverteram essa alteração (Fig. 4a, c). No entanto, os resultados da coloração TUNEL não indicaram alteração óbvia entre os diferentes grupos (Fig. 4b). A expressão de mRNA do gene antiapoptótico Bcl2 nos ovários tratados com doxorrubicina foi significativamente menor e elevada pela fisetina, mas não pela DQ, enquanto a expressão de mRNA dos genes pró-apoptóticos Bax e caspase 3 não diferiu significativamente entre os grupos (Fig. 4d–f). Considerando que houve um intervalo de 2–3 semanas entre a injeção de doxorrubicina e a obtenção dos ovários, esses resultados estão de acordo com pesquisas anteriores que comprovaram que a apoptose no ovário atingiu o pico no dia 1 após o tratamento com doxorrubicina e que a maioria dos folículos apoptóticos degenerou completamente dentro de 2 semanas. Como a apoptose ovariana ocorreu principalmente nas células da granulosa, a degeneração e a perda maciça de folículos apoptóticos podem ter obscurecido nossos resultados da detecção relacionada à apoptose. A diminuição na proporção de FMP e FG e o aumento na proporção de FA nos ovários tratados com doxorrubicina podem ser outra evidência que apoia a ocorrência de apoptose. Aparentemente, nem DQ nem fisetina exerceram efeito protetor evidente contra a apoptose.

Senolíticos não podem prevenir a fibrose ovariana após tratamento com doxorrubicina. a Imagens de imunofluorescência de cortes ovarianos corados com anticorpo α-SMA. Fluorescência vermelha indica células positivas para α-SMA. b Imagens representativas da coloração com Sirius red em ovários murinos. c–d A porcentagem de células positivas para α-SMA e área positiva para Sirius red em cortes ovarianos (n = 3, ANOVA de uma via). e Expressão relativa de mRNA de genes relacionados à fibrose em ovários (n = 3, ANOVA de uma via). Os dados são apresentados como média ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001
Além da apoptose, estudos anteriores sobre a doxorrubicina mostraram que ela pode induzir fibrose parenquimatosa e causar disfunção tecidual em diferentes órgãos. Como marcador de fibroblastos ativados, a α-SMA aumenta com a gravidade da fibrose tecidual em múltiplos órgãos. Realizamos imunofluorescência para α-SMA e coloração com vermelho Sirius para avaliar o nível de fibrose ovariana. A doxorrubicina agravou evidentemente o grau de fibrose no estroma ovariano (Fig. 5a–d). Tanto DQ quanto fisetina não conseguiram atenuar o aumento de α-SMA (Fig. 5a, c), enquanto a fisetina reduziu ligeiramente, mas de forma significativa, a área positiva da coloração com vermelho Sirius após o tratamento com doxorrubicina (Fig. 5b, d). Conforme mostrado na Fig. 5e, a expressão de mRNA de Acta2, Col1a1, Tgfβ1, Timp1, Timp2 e Mmp2 foi significativamente maior nos ovários tratados com doxorrubicina. Esses genes estão envolvidos na remodelação tecidual e na progressão da fibrose. A administração de DQ reverteu ligeiramente o aumento da expressão de Timp2, mas não dos demais. Enquanto isso, a fisetina reduziu os níveis de mRNA de Timp2 e Mmp2 nos ovários lesionados pela doxorrubicina. No geral, esses dois senolíticos não preveniram eficazmente a fibrose ovariana após o tratamento com doxorrubicina, embora alguns indicadores tenham sido parcialmente melhorados.
Discussão
A quimioterapia ainda é um tratamento comum para o câncer atualmente, e os efeitos adversos de curto e longo prazo causados pela quimioterapia sempre foram motivo de preocupação. O dano ovariano associado à quimioterapia não só leva à amenorreia, menopausa precoce e infertilidade em pacientes jovens com câncer, mas também promove o envelhecimento precoce em sobreviventes de câncer e amplifica o risco de doenças relacionadas à idade, como doença de Alzheimer, doença cardiovascular e osteoporose. Estratégias existentes de preservação da fertilidade, como agentes preventivos, criopreservação de embriões e oócitos, criopreservação de tecido ovariano, terapia com células-tronco e ovário artificial, podem beneficiar mulheres com câncer. Mas esses métodos ainda não são amplamente utilizados devido aos seus benefícios limitados, baixa taxa de sucesso, risco de recorrência do câncer ou questões éticas. Assim, a exploração de medicamentos potenciais para proteger os ovários dos danos da quimioterapia tem implicações profundas para a saúde da mulher. Apesar do surgimento sucessivo de novos agentes antitumorais, a doxorrubicina ainda é amplamente utilizada na prática clínica. Estudos anteriores mostraram que a doxorrubicina pode esgotar a reserva folicular ovariana e prejudicar a fertilidade feminina. Os mecanismos de lesão ovariana induzida por doxorrubicina podem envolver dano ao DNA, apoptose, hiperativação de PMF e estresse oxidativo. No entanto, poucos estudos descobriram medicamentos que possam prevenir eficazmente a lesão ovariana induzida por doxorrubicina.
Estudos recentes descobriram que a doxorrubicina pode desencadear a senescência de células tumorais enquanto desempenha papéis antineoplásicos, e também pode induzir senescência celular em órgãos e tecidos normais, como coração, fígado e pele. Como um fator de risco que pode gradualmente corroer a estrutura e função dos tecidos normais, a senescência celular tornou-se um alvo potencial para o tratamento de lesões relacionadas à quimioterapia. No entanto, não se sabe como a senescência celular se altera no tecido ovariano normal exposto à doxorrubicina. Neste estudo, demonstramos pela primeira vez que uma dose clinicamente relevante de doxorrubicina aumentou as células senescentes nos ovários de murinos. Isso foi evidenciado pelo aumento da atividade de SA-β-gal, pela expressão elevada de p16 e p21, e pelo aumento da transcrição de vários genes comuns de SASP, como Il6, Mcp1 e Tgfβ1. A coloração SA-β-gal pode refletir a atividade lisossomal e é, sem dúvida, o biomarcador de senescência mais comum. Os níveis de expressão dos CDKIs p16 e p21, principais impulsionadores da parada do ciclo celular, são altos em células senescentes. SASP é um conjunto de moléculas heterogêneas secretadas por células senescentes, que é inespecífico, mas pode ajudar a identificar a senescência celular. As alterações dos biomarcadores acima em nosso estudo indicam que a doxorrubicina pode induzir senescência celular no tecido ovariano normal.
Nós especulamos que a senescência celular induzida poderia ser uma razão para a lesão ovariana causada por doxorrubicina, e que eliminar as células senescentes acumuladas poderia resgatar a função ovariana até certo ponto. Os senolíticos são uma classe de medicamentos que podem matar seletivamente células senescentes. Há evidências crescentes de que os senolíticos têm grande potencial na medicina antienvelhecimento. O DQ é o senolítico mais clássico, com um efeito de amplo espectro na eliminação de células senescentes. A combinação de DQ foi relatada por melhorar a função física e prolongar a vida útil em camundongos idosos, além de aliviar uma variedade de doenças relacionadas à idade, incluindo déficits cognitivos, perda óssea, degeneração do disco intervertebral e disfunção metabólica mediada pela obesidade. Além disso, o uso intermitente de curto prazo de DQ após lesões agudas, como lesão pulmonar induzida por quimioterapia e úlceras por radiação, reduziu a gravidade das lesões. A fisetina é outro medicamento senolítico que pode prolongar a saúde dos camundongos. Em múltiplos modelos de doenças, como lúpus eritematoso sistêmico e colangite esclerosante primária, a fisetina foi capaz de melhorar os fenótipos da doença ao reduzir o número de células senescentes. A fisetina também protegeu contra danos teciduais causados pela quimioterapia. Ambos os senolíticos estão atualmente em ensaios clínicos e alcançaram resultados preliminares. Em nosso estudo, esses dois senolíticos foram usados para intervir na lesão ovariana induzida por doxorrubicina em camundongos. A administração de DQ ou fisetina reduziu a área positiva da coloração de SA-β-gal e reduziu a expressão de p16 e p21 nos níveis de mRNA e proteína nos ovários tratados com doxorrubicina. O aumento da transcrição dos genes SASP Il6 e Mcp1 nos ovários foi revertido pelo DQ e pela fisetina, sugerindo que os senolíticos podem aliviar o ambiente pró-inflamatório até certo ponto. Em conjunto, tanto o DQ quanto a fisetina reduziram significativamente a senescência ovariana em camundongos tratados com doxorrubicina. No entanto, além de nossa expectativa, a remoção das células senescentes não restaurou a reserva ovariana depletada e a função ovariana diminuída.
Em seguida, investigamos essa discrepância entre a eliminação de células senescentes e a recuperação da função ovariana analisando alguns outros possíveis mecanismos de lesão. O dano ao DNA e a apoptose são as vias moleculares mais estudadas do dano ovariano induzido por doxorrubicina. Nossos resultados mostraram que o dano ao DNA persistiu nos ovários após a exposição à doxorrubicina e não foi atenuado pelo tratamento senolítico. No entanto, não houve diferença óbvia na apoptose ovariana entre os grupos, o que pode ser devido ao nosso cronograma experimental, ou seja, os ovários murinos foram coletados 2 a 3 semanas após a injeção de doxorrubicina, quando a maioria dos folículos ovarianos em apoptose já havia se degenerado completamente. De acordo com a coloração H&E e os resultados da contagem de folículos, a proporção de PMF e GF nos ovários tratados com doxorrubicina diminuiu drasticamente, enquanto a proporção de ATF, especialmente folículos atrésicos em estágio final (ZPRs), aumentou significativamente. Isso poderia ser uma evidência de que a apoptose ocorreu nos ovários e que os senolíticos não conseguiram neutralizar o resultado da apoptose ovariana. Além disso, a fibrose tecidual é outro mecanismo comum na disfunção orgânica e na destruição estrutural causada pela doxorrubicina. Ao detectar vários marcadores representativos de fibrose, descobrimos que a doxorrubicina agravou a fibrose estromal ovariana em grande medida. Nem DQ nem fisetina reverteram a progressão da fibrose em ovários lesados pela doxorrubicina, apesar da melhora parcial em alguns indicadores. Assim, embora os senolíticos tenham eliminado efetivamente as células senescentes, eles não conseguiram prevenir a apoptose ovariana e a fibrose estromal induzidas pelo tratamento com doxorrubicina. O primeiro contribui para a perda maciça da reserva folicular, enquanto o segundo pode perturbar o microambiente ovariano e restringir o crescimento e o desenvolvimento dos folículos restantes. Esta poderia ser a razão pela qual o dano ovariano não foi revertido pelo tratamento senolítico.
Em resumo, é razoável especular que os principais mecanismos da lesão ovariana induzida por doxorrubicina podem ser a apoptose inicial e a consequente perda da reserva folicular, bem como a fibrose estromal persistente. A senescência celular pode ser um fenômeno concomitante no estroma ovariano, em vez de um mecanismo principal de dano ovariano. Portanto, a estratégia de eliminar células senescentes com senolíticos pode não ser uma escolha ideal para proteção contra lesão ovariana induzida por doxorrubicina. A maioria dos estudos sobre senolíticos foi realizada em camundongos muito velhos, onde o acúmulo crônico de células senescentes pode causar mais danos e os senolíticos podem ser mais benéficos. Os sujeitos deste estudo foram camundongos com 2-3 meses de idade, correspondendo a adolescentes do sexo feminino de 15 a 18 anos. O acúmulo de células senescentes nos ovários após o tratamento com doxorrubicina deve ser uma resposta aguda ao estresse, que não teve impactos profundos na reserva ovariana. Esta também pode ser uma razão para os efeitos protetores fracos dos senolíticos. Vale a pena mencionar que nosso estudo anterior demonstrou que o DQ isolado ou combinado com metformina recuperou a função endócrina e reprodutiva ovariana em camundongos expostos à cisplatina. Essa diferença na eficácia do DQ sugere que o papel da senescência celular na lesão ovariana varia com os medicamentos antitumorais, e o potencial terapêutico dos senolíticos no dano ovariano associado à quimioterapia não deve ser completamente negado. Estudos mais abrangentes são necessários para avaliar a extensão da senescência celular nos ovários quando diversos agentes quimioterápicos são usados isoladamente ou em combinação, e para avaliar os potenciais benefícios da aplicação de senolíticos.
Limitações deste estudo devem ser enfatizadas aqui. Primeiro, não especificamos qual tipo de células ovarianas sofreu senescência após exposição à doxorrubicina e se a DQ ou fisetina eliminou todos os tipos de células senescentes nos ovários. A introdução da transcriptômica de células únicas pode ajudar a responder essa pergunta. Segundo, realizamos uma intervenção de curto prazo com apenas dois senolíticos, DQ e fisetina. Embora isso seja suficiente para reduzir a senescência ovariana induzida por doxorrubicina, ainda não está claro se intervenções mais longas ou outros senolíticos e senomórficos serão benéficos para a disfunção ovariana associada à doxorrubicina. Estudos futuros devem examinar os efeitos senolíticos e de proteção ovariana de diferentes drogas sob duração variada de administração. Terceiro, nosso estudo observou que a DQ isoladamente reduziu o número e a proporção de FPM em ovários murinos, mas não teve influência óbvia em outros estágios de folículos. No entanto, nenhum experimento adicional foi realizado para investigar os mecanismos subjacentes e as possíveis consequências dessa alteração. Considerando que o dasatinibe também é um agente antitumoral eficaz, é necessário desenhar experimentos para determinar se o tratamento com DQ em si é prejudicial às gônadas femininas. Por último, não exploramos padrões adicionais de dano além da senescência celular, apoptose e fibrose; portanto, não está claro se a DQ e a fisetina têm outros efeitos nos ovários além de obliterar células senescentes.

Em conclusão, o tratamento com doxorrubicina pode induzir senescência celular em ovários murinos e a administração de curto prazo dos senolíticos DQ ou fisetina pode reduzir células senescentes em excesso. No entanto, tanto DQ quanto fisetina são incapazes de aliviar a depleção de folículos ovarianos e a subfertilidade causadas pela doxorrubicina. Estas descobertas sugerem que a senescência celular pode não desempenhar um papel principal na lesão ovariana induzida por doxorrubicina. Estratégias senolíticas direcionadas a células senescentes podem não ser a opção preferida para proteger a função ovariana em pacientes com câncer do sexo feminino recebendo terapias contendo doxorrubicina, e drogas potenciais mais potentes precisam ser investigadas.

Nota do editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Contribuições dos autores
Yueyue Gao, Jinjin Zhang e Shixuan Wang desenharam o estudo. Yueyue Gao realizou os experimentos e redigiu o manuscrito. Tong Wu e Xianan Tang foram responsáveis pela contagem de folículos e análises de dados. Jingyi Wen e Yan Zhang revisaram o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Financiamento
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Nº 81873824 para Shixuan Wang e Nº 82001498 para Jinjin Zhang). Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, interpretação dos dados ou redação do manuscrito.

Disponibilidade de dados
Os dados gerados neste estudo estão disponíveis com os autores correspondentes mediante solicitação razoável.
Aprovação ética
Todos os protocolos e procedimentos experimentais neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar e Ética em Animais de Laboratório do Hospital Tongji, Faculdade de Medicina Tongji, Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong, na República Popular da China.
Conflito de interesses
Os autores declaram não haver conflitos de interesses.
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