pmid: "38062873"
title: "Suplementação intermitente com fisetina melhora a função arterial em camundongos idosos ao diminuir a senescência celular."
authors: "Mahoney SA, Venkatasubramanian R, Darrah MA, Ludwig KR, VanDongen NS, Greenberg NT, Longtine AG, Hutton DA, Brunt VE, Campisi J, Melov S, Seals DR, Rossman MJ, Clayton ZS"
journal: "Aging cell"
pubdate: "2024 Mar"
doi: "10.1111/acel.14060"
source: "PMC Full Text"

Suplementação intermitente com fisetina melhora a função arterial em camundongos idosos ao diminuir a senescência celular.

Autores

Mahoney SA, Venkatasubramanian R, Darrah MA, Ludwig KR, VanDongen NS, Greenberg NT, Longtine AG, Hutton DA, Brunt VE, Campisi J, Melov S, Seals DR, Rossman MJ, Clayton ZS

Periodico

Aging cell (2024 Mar)

Conteudo

Suplementação intermitente com fisetina melhora a função arterial em camundongos idosos ao reduzir a senescência celular

Resumo

A senescência celular e o fenótipo secretor associado à senescência (SASP) contribuem para a disfunção arterial relacionada à idade, em parte, ao promover estresse oxidativo e inflamação, que reduzem a biodisponibilidade da molécula vasodilatadora óxido nítrico (NO). No presente estudo, avaliamos a eficácia da fisetina, um composto natural, como senolítico para reduzir a senescência de células vasculares e fatores SASP e melhorar a função arterial em camundongos idosos. Descobrimos que a fisetina diminuiu a senescência celular em cultura de células endoteliais humanas. Em camundongos idosos, a senescência de células vasculares e a inflamação relacionada ao SASP foram menores 1 semana após a dose final da suplementação oral intermitente (1 semana com tratamento—2 semanas sem—1 semana com tratamento) de fisetina. Camundongos idosos suplementados com fisetina apresentaram maior função endotelial. Utilizando camundongos idosos p16-3MR, um modelo transgênico que permite a eliminação genética de células senescentes positivas para p16INK4A, descobrimos que a remoção ex vivo de células senescentes de artérias isoladas de camundongos tratados com veículo, mas não com fisetina, aumentou a dilatação dependente do endotélio, demonstrando que a fisetina melhorou a função endotelial por meio da senólise. A função endotelial aprimorada com fisetina foi mediada pelo aumento da biodisponibilidade de NO e pela redução do estresse oxidativo celular e mitocondrial. A rigidez arterial foi menor em camundongos tratados com fisetina. A senólise genética ex vivo em anéis de aorta de camundongos p16-3MR não reduziu ainda mais a rigidez mecânica da parede em camundongos tratados com fisetina, demonstrando que a menor rigidez arterial após a fisetina foi devida à senólise. A menor rigidez arterial com fisetina foi acompanhada por remodelação favorável da parede arterial. Os achados deste estudo identificam a fisetina como uma terapia promissora para tradução clínica visando a senescência celular excessiva para tratar a disfunção arterial relacionada à idade.

A suplementação oral intermitente com fisetina reduz a senescência de células vasculares para melhorar a função endotelial vascular e reduzir a rigidez aórtica em camundongos idosos.

Abreviaturas

ACh
Acetilcolina
AGEs
Produtos finais de glicação avançada
CuZn
Cobre zinco
DCV
Doenças cardiovasculares
DDE
Dilatação dependente do endotélio
GCV
Ganciclovir
CAEHs
Células endoteliais aórticas humanas
CUVHs
Células endoteliais de veia umbilical humana
L-NAME
Éster metílico de N(gama)-nitro-L-arginina
Mn
Manganês
NADPH
Fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina
NO
Óxido nítrico
VOP
Velocidade da onda de pulso
ERO
Espécies reativas de oxigênio
SA-β-gal
Beta galactosidase associada à senescência
SASP
Fenótipo secretor associado à senescência
NP
Nitroprussiato de sódio
SOD
Superóxido dismutase
TEMPOL
4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxil

INTRODUÇÃO
O avanço da idade é o principal fator de risco para doenças cardiovasculares (DCVs), que continuam sendo a principal causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo (Benjamin et al., ). A disfunção arterial, caracterizada por disfunção endotelial vascular e enrijecimento das grandes artérias elásticas (Jia et al., ), é um antecedente fundamental para o desenvolvimento de DCVs clínicas com o envelhecimento.

Os declínios relacionados à idade na função endotelial, evidenciados pela redução da dilatação dependente do endotélio (DDE), são mediados principalmente pela menor biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) (Brunt et al., ; El Assar et al., ; Lakatta & Levy, ; Seals et al., ). O enrijecimento arterial associado à idade, indicado pelo aumento da velocidade da onda de pulso aórtica (VOP), deve-se em grande parte ao aumento da rigidez mecânica intrínseca da parede aórtica (Laurent et al., ; Vlachopoulos et al., ) e à remodelação da parede arterial, caracterizada por deposição de colágeno (fibrose), degradação de elastina e reticulação dessas proteínas estruturais por produtos finais de glicação avançada (AGEs) (Clayton, Brunt, et al., ; Zieman et al., ). A redução da função endotelial mediada por NO e o enrijecimento arterial são impulsionados pelo excesso de estresse oxidativo relacionado a espécies reativas de oxigênio (ERO), cuja fonte principal são as mitocôndrias disfuncionais (Rossman et al., ), e pela inflamação crônica de baixo grau (Steven et al., ). Assim, identificar terapias que reduzam o estresse oxidativo e a inflamação para melhorar a função arterial com o envelhecimento é um importante objetivo de pesquisa biomédica (Fleenor et al., ; Lesniewski et al., ).

A senescência celular é uma resposta celular ao estresse caracterizada pela parada do ciclo celular essencialmente irreversível (Campisi & d'Adda di Fagagna, ; Kuehnemann et al., ). Níveis homeostáticos de senescência celular auxiliam na cicatrização de feridas e inibem a tumorigênese, em parte por meio da produção do fenótipo secretor associado à senescência (SASP) — uma coleção de citocinas, quimiocinas e mediadores inflamatórios — que ativam respostas imunes (Campisi, ; Campisi & d'Adda di Fagagna, ; Demaria et al., ). Células senescentes acumulam-se em excesso com o envelhecimento, levando a efeitos celulares adversos, em parte por meio do SASP, que contribui para um ambiente pró-inflamatório e pró-oxidativo (Campisi & d'Adda di Fagagna, ; van Deursen, ). A senescência celular é um mecanismo da disfunção arterial relacionada à idade (Clayton et al., ; Roos et al., ) e o aumento da senescência celular em células vasculares de adultos mais velhos está associado à função arterial prejudicada (Rossman et al., ). Assim, reduzir a senescência celular e o SASP na vasculatura pode ser uma abordagem terapêutica promissora para melhorar a função arterial na velhice.
Ensaios clínicos de senolíticos—compostos que eliminam células senescentes—estão em andamento, mas o impacto e a segurança das atuais terapias senolíticas sintéticas em teste não são totalmente compreendidos (Hickson et al., ; Justice et al., ). A fisetina é um flavonoide encontrado em uma variedade de alimentos comumente consumidos, parece ser segura em humanos e tem alto potencial translacional (Bondonno et al., ; Farsad‐Naeimi et al., ; Hejazi et al., ; Khan et al., ; Kim & Je, ; Wang et al., ; Yousefzadeh et al., ). O tratamento intermitente com fisetina—para eliminar o excesso de células senescentes, mas não interferir nas funções homeostáticas da senescência celular (isto é, cicatrização de feridas)—reduz a senescência celular em tecidos selecionados e prolonga a vida sem efeitos adversos em camundongos idosos (Yousefzadeh et al., ). No entanto, estudos anteriores têm resultados fisiológicos limitados e não se sabe se a suplementação intermitente com fisetina reduz a senescência de células vasculares e melhora a função arterial com o envelhecimento.
O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da fisetina na redução da senescência celular e do SASP em células vasculares e artérias e na melhora da função arterial em camundongos idosos. Primeiro, buscamos identificar concentrações de fisetina que reduzam seletivamente a senescência celular em células endoteliais em cultura. Usando uma dose de fisetina baseada em nossos achados em cultura de células, nos propusemos a determinar se o tratamento oral e intermitente com fisetina reduzia a carga de células senescentes vasculares e a inflamação relacionada ao SASP em camundongos idosos. Em seguida, avaliamos se a fisetina poderia melhorar a função endotelial e a rigidez arterial ao diminuir a senescência celular. Por fim, determinamos se a fisetina melhorava a função endotelial ao aumentar a biodisponibilidade de NO e reduzir as ERO totais e mitocondriais, e se as reduções na rigidez arterial eram acompanhadas por remodelação favorável da parede arterial.
MÉTODOS
Experimentos de cultura celular.
HUVECs e HAECs (Lonza, Basel, Suíça) foram cultivadas a 37°C e 5% CO2 até ~80% de confluência em meio Endothelial Cell Growth Media (EGM)‐2 (Lonza) suplementado com 2% adicional de soro fetal bovino (FCS; Sigma‐Aldrich Corp., St. Louis, MO), 100 μg/mL de penicilina e 172 μg/mL de estreptomicina (Gibco, Gaithersburg, MD). Células não senescentes (controle) foram passageadas 3–6 vezes, e células senescentes foram cultivadas até a passagem 15 para induzir senescência replicativa, conforme demonstrado anteriormente (Hayflick & Moorhead, ). Células senescentes foram tratadas com fisetina em EGM‐2 por 48 h, e ensaios celulares foram realizados imediatamente em triplicata após o período de tratamento (Udvardi et al., ). Detalhes experimentais sobre o ensaio de viabilidade celular, coloração SA‐β‐gal, avaliação dos níveis de ERO e expressão gênica são fornecidos no Apêndice S1.
Aprovação ética e estudos em animais
Todos os estudos e procedimentos com camundongos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade do Colorado Boulder (Protocolo nº 2618). Todos os procedimentos seguiram as diretrizes estabelecidas pelo Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (Animals, ).
Camundongos C57BL/6N (tipo selvagem) machos foram obtidos da colônia do Instituto Nacional de Envelhecimento (mantida pela Charles River, Wilmington, MA). Camundongos tipo selvagem foram aclimatados em nossas instalações por 4 semanas antes do início do estudo. Camundongos p16‑3MR machos e fêmeas foram criados e envelhecidos em nossa colônia de camundongos na Universidade do Colorado Boulder. Esses camundongos carregam uma proteína de fusão trimodal (3MR) sob o controle do promotor p16INK4A, que permite a eliminação genética seletiva de células senescentes positivas para p16INK4A em excesso por meio da administração do agente antiviral GCV (Demaria et al., ). Durante todo o estudo, todos os camundongos foram alojados individualmente em nosso biotério com um ciclo claro‐escuro de 12 h:12 h e acesso ad libitum a uma ração roedora irradiada, fixa e aberta (Inotiv/Envigo 7917, armazenada em temperatura ambiente) e água potável.
Para o período de intervenção, camundongos tipo selvagem e p16‑3MR velhos (27 meses) foram designados para receber veículo (10% EtOH, 30% PEG400 e 60% Phosal 50 PG) ou fisetina (100 mg/kg/dia em veículo). Para camundongos tipo selvagem, 18 camundongos receberam veículo e 19 receberam fisetina, e para camundongos p16‑3MR, 27 camundongos receberam veículo e 35 receberam fisetina. O tratamento foi administrado por gavagem oral usando um paradigma de dosagem intermitente envolvendo 1 semana de dosagem ativa diária, 2 semanas sem intervenção e, em seguida, mais 1 semana de dosagem ativa, o que foi demonstrado anteriormente reduzir a carga de células senescentes em tecidos selecionados de camundongos velhos para níveis jovens/basais (Yousefzadeh et al., ). Os camundongos foram sacrificados 1–2 semanas após a dose final. Os grupos de tratamento foram randomizados e pareados para peso corporal basal e PWV aórtica. Durante o período de intervenção, um camundongo tipo selvagem velho e 11 camundongos p16‑3MR morreram devido à perda esperada relacionada à idade, resultando em um tamanho amostral final de: veículo tipo selvagem velho, n = 17; fisetina tipo selvagem velho, n = 19; veículo p16‑3MR velho, n = 22; e fisetina p16‑3MR velho, n = 29.
Rigidez aórtica in vivo e hemodinâmica foram medidas conforme descrito anteriormente (Anexo 1).
VOP aórtica foi avaliada in vivo 1 semana antes (pré) e 1 semana depois (pós) da intervenção, conforme descrito anteriormente (Brunt et al., ; Casso et al., ; Clayton, Brunt, et al., ; Clayton, Hutton, et al., ). Resumidamente, os camundongos foram anestesiados via isoflurano inalatório (1,0%–2,5%) e posicionados em decúbito dorsal sobre uma plataforma aquecida, com as patas fixadas aos eletrodos do eletrocardiograma (ECG). Duas sondas Doppler foram então colocadas no arco aórtico transverso e na aorta abdominal. Três traçados ultrassonográficos repetidos de 2 segundos foram registrados, e o tempo médio de pré-ejeção (ou seja, o tempo entre a onda R do ECG e o pé do sinal Doppler) foi determinado para cada local. A VOP aórtica foi então calculada como: VOP aórtica = (distância física entre as duas sondas)/(∆tempo abdominal menos ∆tempo transverso) e relatada em centímetros por segundo. A pressão arterial foi medida no pré e pós-intervenção durante 3 dias consecutivos usando um método não invasivo de manguito caudal (CODA; Kent Scientific, Torrington, CT), conforme descrevemos anteriormente (Brunt et al., ; Casso et al., ; Clayton, Brunt, et al., ; Clayton, Hutton, et al., ).
Função endotelial
A EDD em resposta a doses crescentes de acetilcolina (Sigma Aldrich, Cat. No. A6625) e a dilatação independente do endotélio em resposta a concentrações crescentes do doador exógeno de NO, SNP (Sigma Aldrich, Cat. No. 13755–38‐9), foram medidas em artérias carótidas isoladas, conforme descrito anteriormente (Brunt et al., ; Casso et al., ; Clayton et al., ; Clayton, Hutton, et al., ). Mais detalhes, incluindo todos os agentes farmacológicos e abordagens utilizados para os experimentos de farmacodissecção, são fornecidos no Apêndice S1.
Análises estatísticas
Descrições detalhadas de todas as análises estatísticas realizadas são fornecidas no Apêndice S1. Os dados são apresentados como média ± EPM no texto, figuras e tabelas, salvo especificação em contrário. A significância estatística foi definida em α = 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o Prism, versão 9 (GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA, EUA).
RESULTADOS
A fisetina reduz a senescência celular em células endoteliais
Inicialmente, realizamos experimentos de cultura celular in vitro em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) para determinar o efeito da fisetina em células endoteliais senescentes e não senescentes (controle). As HUVECs foram induzidas à senescência por exaustão replicativa (um modelo in vitro de estado semelhante ao envelhecimento) (Cristofalo et al., ; Hayflick & Moorhead, ). A viabilidade celular das HUVECs senescentes e controle foi medida em resposta a concentrações crescentes de fisetina para determinar as concentrações que reduziam a viabilidade das células senescentes sem afetar a viabilidade das células controle. Descobrimos que a fisetina apresentou maior potência geral contra HUVECs senescentes em comparação com as células controle (IC50 da fisetina 7,0 ± 0,4 vs. 3,4 ± 0,3 μM em células controle e senescentes, respectivamente; Figura 1a). Além disso, observamos uma redução na viabilidade das HUVECs senescentes com 1 μM de fisetina, enquanto nenhum efeito significativo na viabilidade foi observado nas HUVECs controle nessa concentração (viabilidade a 1 μM de fisetina: células controle, 97 ± 1% vs. células senescentes, 91 ± 1%, p = 0,003; Figura 1a). Com base nessas observações, selecionamos 1 μM como a concentração máxima de fisetina para o restante dos experimentos de cultura celular, pois essa concentração parecia influenciar seletivamente a viabilidade das células senescentes sem afetar as células não senescentes.
A fisetina suprime a senescência celular em células endoteliais. Viabilidade celular em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) em replicação (controle) e senescentes em resposta a doses crescentes de fisetina (linha tracejada representa a IC50). Valores de IC50 de HUVECs controle e senescentes com intervalos de confiança de 95%. Viabilidade de HUVECs controle e senescentes a 1 μM de fisetina (n = 4–8) (a). Sinal de beta-galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal) em HUVECs controle e senescentes em resposta a doses crescentes de fisetina (n = 3) e imagens representativas, à direita (b). Expressão gênica de mRNA dos marcadores de senescência celular Cdkn2a e Cdkn1a em células endoteliais aórticas humanas (HAECs) controle, senescentes ou senescentes tratadas com 1 μM de fisetina (n = 3) (c). Os valores representam média ± EPM. *p < 0,05 senescente versus senescente + tratamento; ^p < 0,05 versus controle.
Para determinar se a diminuição na viabilidade das células senescentes com o tratamento com fisetina estava associada a reduções na senescência celular, avaliamos o sinal de β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) — um marcador estabelecido de senescência celular (Kurz et al., ) — em HUVECs controle e senescentes expostas a concentrações crescentes de fisetina até 1 μM. Descobrimos que as HUVECs senescentes apresentaram sinal de SA-β-gal 13,5 vezes maior em relação às HUVECs controle não senescentes (p = 0,002) e que a fisetina reduziu o sinal de SA-β-gal de forma dependente da concentração até 1 μM (Figura 1b e Figura S1).
Após estabelecer o efeito da fisetina em HUVECs senescentes, nosso objetivo foi ampliar nossa compreensão dos efeitos senolíticos da fisetina em células arteriais usando células endoteliais da aorta humana (HAECs). Dessa forma, em HAECs, medimos a expressão gênica de Cdkn2a e Cdkn1a, que codificam as proteínas inibidoras de quinase dependente de ciclina p16INK4A e p21Cip1/Waf1, respectivamente. Em comparação com as células de controle, esses inibidores de quinase dependente de ciclina são observados em níveis elevados na maioria das células senescentes e são amplamente responsáveis pela parada irreversível do ciclo celular associada à senescência celular (Demaria et al., ; González‐Gualda et al., ). As HAECs senescentes demonstraram expressão 17 vezes maior (p < 0,0001) e 4 vezes maior (p < 0,0001) de Cdkn2a e Cdkn1a, respectivamente, em comparação com HAECs de controle (Figura 1c). Em HAECs senescentes replicativas, 1 μM de fisetina reduziu a expressão de Cdkn2a em 71% (p < 0,0001) de volta aos níveis das células de controle, mas não teve efeito sobre o aumento relativamente modesto da expressão de Cdkn1a, sugerindo que a fisetina pode atuar preferencialmente sobre a cascata do fator de transcrição p16INK4A, em vez da p21Cip1/Waf1, para eliminar células endoteliais senescentes (Figura 1c).
Coletivamente, observamos uma redução na viabilidade de células endoteliais senescentes tratadas com 1 μM de fisetina, mas nenhum efeito na viabilidade das células de controle tratadas com essa concentração. Em células endoteliais senescentes tratadas com fisetina, encontramos diminuições em marcadores selecionados de senescência celular. Assim, nossos experimentos in vitro demonstram que a fisetina pode alvejar seletivamente o excesso de senescência celular em células endoteliais vasculares.
Características dos animais
Em seguida, procuramos estender os efeitos senolíticos da fisetina ao envelhecimento arterial in vivo, avaliando a senescência celular em artérias intactas e a função arterial de camundongos idosos suplementados intermitentemente com fisetina. Para a intervenção, camundongos machos idosos do tipo selvagem receberam veículo (10% EtOH, 30% PEG400 e 60% Phosal 50 PG) ou fisetina (100 mg/kg/dia no veículo). Após estabelecer os efeitos da fisetina em camundongos machos do tipo selvagem, usamos o mesmo regime de intervenção para analisar diferenças sexuais e dissecar o papel da senescência celular em camundongos p16-3MR machos e fêmeas idosos (Demaria et al., ). Como não observamos diferenças sexuais em nenhum dos desfechos nos camundongos p16-3MR, os dados de machos e fêmeas foram combinados nos resultados. A dose de fisetina foi escolhida com base na tradução in vivo da concentração de 1 μM usada em nossos experimentos de cultura celular, uma vez que os níveis plasmáticos máximos de fisetina atingem ~1 μM após a ingestão oral de fisetina na dose de 100 mg/kg/dia em camundongos (Jo et al., ; Touil et al., ). O tratamento foi administrado por gavagem oral usando um paradigma de dosagem intermitente—1 semana com o tratamento; 2 semanas sem; 1 semana com o tratamento, conforme descrito anteriormente (Yousefzadeh et al., ) (Figura 2a). As medições funcionais e bioquímicas foram realizadas 1 semana após a dose final.
Fisetina reduz a senescência celular na vasculatura de camundongos idosos. Desenho do estudo utilizado no modelo animal (a). Expressão gênica do mRNA aórtico de marcadores de senescência celular em camundongos p16‐3MR (3MR) idosos (n=12–15) (b). Abundância proteica aórtica de p16INK4A em camundongos tipo selvagem com bandas virtuais representativas (n=8) (c). Expressão gênica do mRNA aórtico de fatores do fenótipo secretor associado à senescência (n=14–15) (d). As intensidades de cor representam alterações log2. Os valores representam média ± EPM. *p < 0,05 veículo versus fisetina.

Pressão arterial, massa corporal total, massa dos tecidos principais e características da artéria carótida e da aorta no momento da eutanásia nos camundongos tipo selvagem tratados com veículo e fisetina são apresentadas na Tabela 1 (as características dos animais p16‐3MR são apresentadas na Tabela S1). A fisetina não afetou nenhuma dessas características em nenhum dos modelos de camundongos (p > 0,05).

Características dos animais tipo selvagem.
Características Veículo Fisetina n 15 19 Massa corporal, g 29,3 ± 0,5 28,0 ± 0,7 Massa cardíaca, mg 152 ± 4 165 ± 6 Massa do quadríceps, mg 271 ± 11 280 ± 11 Massa adiposa visceral, mg 324 ± 31 292 ± 44 Massa do fígado, g 1,6 ± 0,1 1,4 ± 0,1 Massa do baço, mg 82,4 ± 7,6 82,7 ± 8,5 Artéria carótida Diâmetro de repouso, μm 428 ± 15 412 ± 13 Diâmetro máximo, μm 526 ± 11 519 ± 9 Aorta Diâmetro, μm 416 ± 10 415 ± 8 Espessura médio-intimal, μm 40 ± 2 39 ± 2 Pressão arterial sistólica, mmHg Pré 96 ± 2 94 ± 2 Pós 94 ± 2 89 ± 2 Pressão arterial diastólica, mmHg Pré 73 ± 2 73 ± 2 Pós 75 ± 2 71 ± 2

Nota: Os valores representam média ± EPM.
A fisetina tem como alvo a senescência celular e o SASP na vasculatura de camundongos idosos
Para estabelecer os efeitos senolíticos da fisetina na vasculatura de camundongos idosos, avaliamos marcadores de senescência celular em lisados de aorta de camundongos. Descobrimos que a expressão gênica aórtica dos marcadores de senescência celular Cdkn2a (−85%, p = 0,010), Cdkn1a (−48%, p = 0,006) e Serpine1 (−81%, p = 0,011) foi menor em camundongos p16-3MR idosos suplementados com fisetina em comparação com camundongos p16-3MR tratados com veículo, enquanto não foram observadas diferenças estatísticas na expressão de Lmnb1 (+45%, p = 0,213), um contribuinte da estabilidade da cromatina conhecido por ser reduzido em células senescentes (González‐Gualda et al., ) (Figura 2b). Considerando que observamos uma redução geral nos transcritos de senescência celular vascular em nossa triagem inicial de expressão gênica, validamos essas diferenças medindo a abundância da proteína vascular p16INK4A. Descobrimos que camundongos do tipo selvagem idosos suplementados com fisetina apresentaram 36% menos abundância da proteína p16INK4A na aorta (p = 0,007; Figura 2c e Figura S2a) em comparação com camundongos idosos tratados com veículo. A suplementação com fisetina também reduziu a expressão aórtica de vários fatores SASP, incluindo citocinas pró-inflamatórias (Tnfα; P = 0,107), quimiocinas (Ccl2, Cxcl2; p = 0,032 e p = 0,126, respectivamente), fatores de crescimento (Vegf; P = 0,172) e proteinases (Mmp3, Plat; p = 0,045 e p = 0,037, respectivamente) (Figura 2d). Esses resultados sugerem que a suplementação intermitente de fisetina pode diminuir a senescência celular e modular os fatores SASP na vasculatura de camundongos idosos.
A fisetina melhora a função endotelial em camundongos idosos ao suprimir a senescência celular, aumentar a biodisponibilidade de NO e abolir o estresse oxidativo e sua supressão associada da EDD
EDD
Para determinar se a fisetina melhora a função endotelial na idade avançada, avaliamos a EDD ex vivo em artérias carótidas removidas de camundongos idosos do tipo selvagem tratados com veículo e suplementados com fisetina em resposta a doses crescentes de acetilcolina (ACh). A EDD foi 20% maior em camundongos idosos suplementados com fisetina em relação aos camundongos idosos tratados com veículo (pico de EDD: veículo, 81 ± 3% vs. fisetina, 97 ± 1%, p < 0,001; Figura 3a,b), sugerindo que a suplementação intermitente de fisetina melhora a função endotelial vascular na velhice.
A fisetina melhora a função endotelial em camundongos idosos ao suprimir a senescência celular e aumentar a biodisponibilidade de óxido nítrico (NO). Dilatação dependente do endotélio (EDD) em artérias carótidas isoladas em resposta à acetilcolina (ACh; 1 × 10−9 a 1 × 10−4 M; n = 12–18) (a,b). EDD em resposta à ACh na presença ou ausência de eliminação genética ex vivo da senescência celular via ganciclovir (GCV; 5 μm; 180 min de pré-incubação; n = 9–11) (c). EDD mediada por NO em resposta à ACh na presença ou ausência do inibidor da NO-sintase, L-NAME (0,1 mM; 30 min de pré-incubação; n = 15) (d,e). Dilatação independente do endotélio a doses crescentes do doador de NO, nitroprussiato de sódio (SNP; 1 × 10−10 a 1 × 10−4 M; n = 9) (f). Os valores representam média ± EPM. *p < 0,05 veículo idoso versus fisetina idosa; ^p < 0,05 versus ACh sozinha.
Supressão da EDD mediada por senescência celular

Após as medições iniciais da EDD, nosso objetivo foi obter evidências causais de que reduções na senescência celular com fisetina medeiam melhorias na função endotelial usando técnicas de "farmacodissecção". Para isso, utilizamos o modelo de camundongo transgênico p16-3MR, que permite a eliminação genética de células senescentes positivas para p16INK4A com GCV in vivo e ex vivo (Demaria et al., ). O uso combinado de modelos genéticos de senólise com agentes senolíticos é considerado o padrão de referência para avaliar o impacto causal da senescência celular na função fisiológica (Clayton et al., ; Demaria et al., ). Assim, para eliminar seletivamente as células senescentes, incubamos artérias carótidas isoladas de camundongos p16-3MR velhos tratados com veículo e suplementados com fisetina com 5 μM de GCV e avaliamos a EDD antes e após o período de incubação. Antes do GCV, observamos que camundongos tratados com veículo apresentavam EDD inicial mais baixa, e a eliminação de células senescentes com incubação com GCV aumentou a EDD, indicando que um acúmulo de senescência celular prejudicou a função endotelial nessas artérias (EDD de pico: ACh sozinha, 76 ± 4% vs. com GCV, 90 ± 3%, p = 0,005). Por outro lado, camundongos que receberam suplementação com fisetina apresentaram EDD inicial elevada, e a incubação com GCV não melhorou ainda mais a EDD nessas artérias (EDD de pico: ACh sozinha, 93 ± 1% vs. com GCV, 92 ± 3%, p = 0,71; Figura 3c e Figura S3a). Essas descobertas sugerem que reduções na senescência celular nas artérias sustentam melhorias na EDD com suplementação intermitente de fisetina.
A produção e a subsequente biodisponibilidade da potente molécula vasodilatadora NO são diminuídas em células endoteliais senescentes e com o envelhecimento (Hayashi et al., ). Assim, avaliamos a seguir os efeitos da fisetina na função endotelial mediada por NO. Para isso, avaliamos a EDD antes e após a inibição da produção de NO com o inibidor da NO‐sintase L‐NAME. A incubação com L‐NAME aboliu as diferenças entre grupos na EDD (EDD de pico: veículo, 37 ± 5% vs. fisetina, 44 ± 5%, p = 0,350; Figura 3d e Figura S3b), sugerindo que as melhorias na função endotelial com a fisetina se deveram a uma maior biodisponibilidade de NO. Consistente com essa ideia, a dilatação mediada por NO de pico (ACh sozinho [−] ACh com L‐NAME) foi 40% maior em camundongos fisetina‐suplementados versus veículo‐suplementados (veículo, 43 ± 4% vs. fisetina, 60 ± 5%, p < 0,001; Figura 3e). Em seguida, para determinar se as melhorias na vasodilatação foram resultado de uma maior sensibilidade do músculo liso ao NO, medimos a dilatação independente do endotélio como a resposta vasodilatadora ao nitroprussiato de sódio (SNP). Não encontramos diferenças entre os grupos (resposta de pico ao SNP, veículo, 98 ± 1% vs. fisetina, 97 ± 1%, p = 0,856), indicando que a fisetina melhora a vasodilatação em camundongos idosos de maneira específica do endotélio (Figura 3f). Coletivamente, esses dados indicam que a suplementação intermitente com fisetina melhora a função endotelial em camundongos idosos como resultado de uma maior biodisponibilidade de NO e não por meio do aumento da sensibilidade do músculo liso vascular ao NO.
Estresse oxidativo de célula inteira
As reduções relacionadas à idade no NO são mediadas, em parte, por uma produção excessiva de ROS, que reagem com o NO reduzindo sua biodisponibilidade (Hsieh et al., ). O excesso de senescência celular está associado a um aumento na produção de ROS (Pole et al., ). Dessa forma, determinamos a seguir se os efeitos favoráveis da fisetina na função endotelial de camundongos idosos estavam associados à redução do estresse oxidativo celular total. Para isso, primeiro avaliamos os níveis de ROS em secções do anel aórtico. Camundongos idosos suplementados com fisetina apresentaram níveis de ROS aórticos 1,7 vezes menores em relação aos camundongos idosos suplementados com veículo (veículo, 8173 ± 1243 vs. fisetina, 4703 ± 455 unidades arbitrárias [UA], p = 0,028; Figura 4a). Para investigar os mecanismos responsáveis pelos níveis mais baixos de ROS com a suplementação de fisetina, medimos a abundância proteica da enzima pró-oxidante NADPH oxidase, uma fonte chave de produção de ROS nas células endoteliais (Chen et al., ), e da superóxido dismutase citosólica antioxidante CuZn (SOD), um importante eliminador de ROS (Fukai & Ushio-Fukai, ), em lisados aórticos. Camundongos suplementados com fisetina apresentaram abundância de NADPH oxidase 30% menor (veículo, 0,086 ± 0,008 vs. fisetina, 0,060 ± 0,006 unidades de quimioluminescência [UQ], p = 0,027; Figura 4b e Figura S2b), mas não foram observadas diferenças na abundância de CuZnSOD entre os grupos (veículo, 0,919 ± 0,131 vs. fisetina, 1,116 ± 0,276 UQ, p = 0,525; Figura 4c e Figura S2c). Isso sugere que a fisetina pode facilitar a redução do estresse oxidativo tônico em camundongos idosos ao reduzir fontes chave de ROS que, uma vez diminuídas, ficaram em equilíbrio com o status antioxidante celular. Para determinar se essa redução nos níveis de ROS celular total desempenhou um papel direto na melhora da função endotelial dos camundongos suplementados com fisetina, avaliamos a DDE em artérias carótidas isoladas com e sem a presença do eliminador de ROS TEMPOL. Descobrimos que a pré-incubação com TEMPOL aumentou a DDE em camundongos idosos tratados com veículo (pico de DDE: ACh sozinha, 84 ± 4% vs. com TEMPOL, 93 ± 2%, p = 0,011) para níveis observados em camundongos idosos suplementados com fisetina apenas com ACh. Por outro lado, a adição de TEMPOL não teve efeito sobre a DDE em camundongos idosos suplementados com fisetina (pico de DDE: ACh sozinha, 99 ± 1% vs. com TEMPOL, 98 ± 1%, p = 0,487; Figura 4d e Figura S3c). Em conjunto, essas observações indicam que a fisetina melhorou a DDE em camundongos idosos ao atenuar a supressão relacionada às ROS tônicas da DDE.
A fisetina melhora a função endotelial ao atenuar o estresse oxidativo celular total e mitocondrial. Níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) na aorta de célula inteira (n = 6–8) (a). Abundância proteica aórtica da NADPH oxidase (n = 8) (b) e da superóxido dismutase CuZn (SOD; n = 11–12) (c) com bandas de blot virtual representativas, à direita. Dilatação dependente do endotélio (DDE) em artérias carótidas isoladas em resposta à acetilcolina (ACh) na presença ou ausência do mimético da SOD, TEMPOL (1 mM, 60 min de pré-incubação; n = 7–8) (d). Níveis de ERO mitocondriais na aorta (n = 6–10) (e). Abundância proteica aórtica da p66SHC fosforilada (p-p66SHC; n = 11–12) (f) e da MnSOD (n = 11–12) (g) com bandas de blot virtual representativas, à direita. DDE em artérias carótidas em resposta à ACh na presença ou ausência do antioxidante específico mitocondrial, MitoQ (1 μM; 60 min de pré-incubação; n = 5–7) (h). Os valores representam média ± EPM. *p < 0,05 veículo velho versus fisetina velha; ^p < 0,05 versus ACh isolada.
As mitocôndrias são uma fonte primária de ROS em excesso com o envelhecimento e os níveis de ROS derivados das mitocôndrias são mais altos em células senescentes (Passos et al., ). Assim, nosso objetivo foi determinar se a suplementação com fisetina reduziu os ROS derivados das mitocôndrias na vasculatura de camundongos idosos. Camundongos idosos suplementados com fisetina apresentaram níveis de ROS mitocondriais aórticos 2,6 vezes menores em comparação com camundongos idosos suplementados com veículo (veículo, 6603 ± 1956 vs. fisetina, 2527 ± 440 UA, p = 0,011; Figura 4e). Para determinar os mecanismos que contribuem para os níveis mais baixos de ROS mitocondriais com a suplementação de fisetina, medimos a abundância proteica da forma ativada do marcador pró-oxidante mitocondrial e regulador mestre da produção de ROS mitocondrial, p66SHC fosforilada (p-p66SHC) (Pole et al., ), e a principal enzima antioxidante mitocondrial, MnSOD (Fukai & Ushio-Fukai, ), em lisados aórticos. Camundongos idosos suplementados com fisetina apresentaram aproximadamente 40% menor abundância arterial de p-p66SHC (veículo, 0,049 ± 0,008 vs. fisetina, 0,030 ± 0,003 UC, p = 0,034; Figura 4f e Figura S2d), enquanto nenhuma diferença foi observada na abundância total de p66SHC (veículo, 0,050 ± 0,001 vs. fisetina, 0,050 ± 0,001 UC, p = 0,961; Figura S2e e Figura S4). A abundância de MnSOD foi aproximadamente 100% maior em camundongos idosos suplementados com fisetina em comparação com camundongos idosos suplementados com veículo (veículo, 0,202 ± 0,018 vs. fisetina, 0,410 ± 0,101 UC, p = 0,046; Figura 4g e Figura S2f). Esses dados sugerem que a fisetina pode reduzir o estresse oxidativo mediado pelas mitocôndrias ao suprimir uma enzima pró-oxidante mitocondrial e aumentar as defesas antioxidantes mitocondriais. Para determinar se os ROS mitocondriais mais baixos tiveram um papel funcional na EDD aumentada observada em camundongos idosos suplementados com fisetina, avaliamos a EDD em artérias carótidas isoladas com e sem incubação prévia com o sequestrador de ROS mitocondrial MitoQ. Descobrimos que a pré-incubação com MitoQ aumentou a EDD em camundongos idosos tratados com veículo (EDD de pico: ACh sozinha, 86 ± 5% vs. com MitoQ, 99 ± 1%, p = 0,025) para níveis observados em camundongos suplementados com fisetina apenas com ACh, indicando que camundongos idosos tratados com veículo experimentaram inibição tônica da EDD pelo excesso de ROS mitocondriais arteriais. Importante, não observamos um aumento adicional na EDD com MitoQ no grupo suplementado com fisetina, indicando que a fisetina melhorou a função endotelial em camundongos idosos ao atenuar a supressão da EDD relacionada aos ROS mitocondriais (EDD de pico: ACh sozinha, 97 ± 1% vs. com MitoQ, 97 ± 1%, p = 0,487; Figura 4h e Figura S3d). Coletivamente, esses dados sugerem que a fisetina melhorou a EDD em camundongos idosos ao atenuar a supressão da EDD relacionada aos ROS mitocondriais.
A fisetina reduz a rigidez aórtica em camundongos idosos: Efeitos na rigidez mecânica intrínseca da parede e nos componentes da parede arterial
PWV aórtico
Para determinar se a suplementação intermitente com fisetina reduz a rigidez aórtica em camundongos idosos, avaliamos serialmente a VOP aórtica, uma medida análoga estabelecida ao padrão de referência VOP carotídeo-femoral em humanos, no início e após o tratamento em camundongos suplementados com veículo e com fisetina. A VOP aórtica foi equivalente no início do estudo nos dois grupos (p = 0,586). A suplementação com fisetina reduziu a VOP aórtica em ~20% (pré, 425 ± 7 cm/s vs. pós, 335 ± 6 cm/s, p < 0,001), enquanto nenhuma alteração significativa foi observada ao longo do tempo no grupo suplementado com veículo (pré, 425 ± 7 cm/s vs. pós, 433 ± 5 cm/s, p = 0,403; Figura 5a). Esses efeitos ocorreram sem alterações óbvias nas pressões arteriais sistólica ou diastólica (manguito de cauda) (Tabela 1 e Tabela S1), o que está de acordo com estudos anteriores sugerindo que a rigidez aórtica relacionada à idade pode ser reduzida independentemente de alterações na pressão arterial (Clayton, Brunt, et al., ; Gioscia-Ryan et al., ).
A fisetina reduz a rigidez arterial em camundongos idosos ao melhorar a rigidez mecânica intrínseca da parede aórtica. A velocidade de onda de pulso (VOP) aórtica foi medida pré e pós-intervenção (n = 9–10) (a). Curva tensão-deformação representativa para determinação da rigidez mecânica intrínseca da parede ex vivo, avaliada pelo módulo elástico em anéis aórticos (calculado como a inclinação dos quatro pontos finais na curva tensão-deformação) (n = 7) (b). O módulo elástico foi avaliado após supressão genética (GCV) (n = 8–10) (c) e farmacológica (ABT-263) (n = 9–10) (d) ex vivo da senescência celular em aortas obtidas de camundongos idosos p16-3MR (3MR) e tipo selvagem, respectivamente. Os valores representam média ± EPM. *p < 0,05 veículo idoso vs. fisetina idosa; ^p < 0,05 vs. apenas meio.
Rigidez mecânica intrínseca da parede (módulo elástico)
Após estabelecer reduções na VOP aórtica com a suplementação intermitente de fisetina in vivo, procuramos determinar se modificações estruturais na parede arterial poderiam ter contribuído para esse efeito. Para isso, medimos o módulo elástico de anéis aórticos isolados de camundongos idosos suplementados com veículo e com fisetina. O módulo elástico, definido como a associação entre a mudança na tensão na parede arterial em resposta a um aumento na deformação (alongamento), é um mecanismo chave subjacente aos aumentos na VOP com o envelhecimento (Fleenor et al., ). Como esta medida é realizada ex vivo, não pode ser influenciada por fatores humorais ou pressão arterial, permitindo-nos avaliar diretamente a influência da suplementação intermitente com fisetina na rigidez mecânica da parede arterial. A Figura 5b mostra uma curva tensão-deformação representativa do módulo elástico aórtico de camundongos idosos suplementados com veículo e com fisetina. O módulo elástico aórtico foi ~20% menor em camundongos idosos suplementados com fisetina versus veículo (veículo, 3342 ± 246 kPa vs. fisetina, 2736 ± 170 kPa, p = 0,012; Figura 5b), indicando que a fisetina reduziu a rigidez mecânica intrínseca da parede da aorta.
Rigidez mecânica intrínseca da parede mediada por senescência celular
Para determinar se a fisetina reduziu a rigidez da parede aórtica ao alvejar a senescência celular, utilizamos uma abordagem de "farmacodissecção", conforme realizado anteriormente por nosso laboratório (Clayton, Brunt, et al., ; LaRocca et al., ). Aqui, o módulo elástico foi medido em anéis de aorta isolados de camundongos p16-3MR velhos suplementados com veículo e fisetina após 48 h de incubação em meio de cultura padrão (controle) com ou sem 5 μM de GCV. Em anéis de aorta de camundongos velhos tratados com veículo, os anéis aórticos incubados com GCV apresentaram um módulo elástico menor em comparação aos anéis de aorta incubados em meio controle, indicando que a carga de senescência celular contribui para a rigidez intrínseca da parede da aorta (meio apenas, 4653 ± 482 kPa vs. GCV, 3036 ± 231 kPa, p = 0,009; Figura 5c). Após incubação em meio controle, os camundongos suplementados com fisetina apresentaram menor módulo elástico inicial em comparação aos camundongos velhos tratados com veículo (veículo, 4653 ± 482 kPa vs. fisetina, 3537 ± 289 kPa, p = 0,054), e não houve redução adicional após a eliminação genética de células senescentes com GCV, sugerindo que a fisetina eliminou efetivamente o excesso de células senescentes vasculares para reduzir a rigidez aórtica (fisetina, meio apenas, 3537 ± 289 kPa vs. GCV, 3346 ± 278 kPa, p = 0,640; Figura 5c). Em conjunto, esses dados sugerem que a senescência celular influencia a rigidez arterial em camundongos velhos e que a fisetina pode modular o enrijecimento das grandes artérias elásticas ao reduzir os aumentos mediados pela senescência celular na rigidez mecânica intrínseca da parede.

Em seguida, utilizamos uma abordagem complementar para estabelecer ainda mais a senólise como um mecanismo primário das reduções na rigidez arterial com a fisetina em camundongos velhos. Avaliamos o módulo elástico em anéis de aorta isolados de camundongos selvagens velhos suplementados com veículo e fisetina após incubação ex vivo com o senolítico sintético bem estabelecido ABT-263 (Cang et al., ; Chang et al., ). Assim como na eliminação genética de células senescentes, descobrimos que a eliminação de células senescentes com ABT-263 reduziu o módulo elástico em anéis de aorta isolados de camundongos tratados com veículo (veículo, meio apenas, 4860 ± 344 kPa vs. ABT-263, 3210 ± 210 kPa, p = 0,002; Figura 5d). A exposição ao ABT-263 não reduziu ainda mais o módulo elástico em anéis de aorta obtidos de camundongos suplementados com fisetina (fisetina, meio apenas, 2977 ± 216 kPa vs. ABT-263, 3323 ± 199 kPa, p = 0,329; Figura 5d). Coletivamente, esses resultados implicam a senescência celular como um mecanismo subjacente do enrijecimento das grandes artérias elásticas em camundongos idosos e sugerem que a fisetina diminui a rigidez mecânica intrínseca da parede aórtica ao reduzir a senescência celular.
Remodelação da parede arterial induzida por fisetina
Para obter insights sobre os mecanismos downstream pelos quais a fisetina reduz a rigidez arterial, medimos a abundância aórtica de AGEs e proteínas estruturais por imunoblotting. A abundância de AGEs, que aumenta o enrijecimento aórtico ao formar ligações cruzadas em proteínas estruturais (Zieman et al., ), foi 36% menor nas aortas de camundongos suplementados com fisetina em comparação com veículo (veículo, 0,022 ± 0,004 vs. fisetina, 0,014 ± 0,001 UC, p = 0,030; Figura 6a e Figura S2g). Também observamos uma redução na isoforma arterial principal de colágeno (colágeno-1), uma proteína que confere rigidez à parede aórtica (veículo, 1,379 ± 0,271 vs. fisetina, 0,772 ± 0,123 UC, p = 0,070; Figura 6b e Figura S2h). Por outro lado, a abundância de α-elastina na proteína total da aorta, a principal proteína estrutural que confere elasticidade à parede arterial, não foi afetada pelo tratamento com fisetina (veículo, 0,012 ± 0,001 vs. fisetina, 0,013 ± 0,001 UC, p = 0,379; Figura 6c e Figura S2i). Para entender a localização dessas mudanças estruturais na parede arterial, realizamos imuno-histoquímica em seções da aorta. As reduções na abundância de AGEs e colágeno-1 pareceram ser específicas da região adventicial da parede aórtica, que é o principal componente de suporte de carga das artérias sob condições fisiológicas (Figura 6d,e). Em conjunto, esses dados sugerem que a suplementação intermitente com fisetina pode reduzir a rigidez aórtica em parte por modular favoravelmente os componentes da parede arterial.
A fisetina reduz a rigidez mecânica intrínseca da parede aórtica ao remodelar favoravelmente os componentes da parede arterial. Abundância proteica aórtica de produtos finais de glicação avançada (AGEs) (n = 9) (a), colágeno-1 (n = 9) (b) e α-elastina (n = 9) (c) com bandas virtuais representativas. Coloração imuno-histoquímica representativa de AGEs aórticos (d) e colágeno-1 (e). As setas indicam acúmulo de proteína na camada médio-adventicial. Os valores representam média ± EPM. *p < 0,05 veículo idoso versus fisetina idosa.
DISCUSSÃO
Nossos achados demonstram que a fisetina reduz a senescência celular vascular e melhora a função arterial em camundongos idosos. Usando modelos de cultura celular, primeiro identificamos uma concentração de fisetina que reduziu a senescência celular em células endoteliais de passagem tardia sem afetar células não senescentes. Em camundongos idosos, descobrimos em seguida que a suplementação oral intermitente de fisetina reduziu os marcadores de senescência celular e fatores SASP na vasculatura. A suplementação com fisetina também melhorou duas manifestações-chave da disfunção arterial relacionada à idade, a disfunção endotelial vascular e a rigidez arterial, pelo menos em parte, pela diminuição da senescência celular. Além disso, descobrimos que a fisetina melhorou a função endotelial vascular aumentando a biodisponibilidade de NO e reduzindo a bioatividade de ROS celular total e mitocondrial, e que as reduções na rigidez arterial foram acompanhadas por remodelação favorável da parede arterial. Esses achados identificam a suplementação oral intermitente de fisetina como uma estratégia terapêutica promissora para tradução clínica visando melhorar a função arterial com o envelhecimento.
Fisetina e senescência celular vascular.
A senescência celular e o SASP aumentam com o avanço da idade na vasculatura (Abdellatif et al., ; El Assar et al., ; Mahoney et al., ; Yousefzadeh et al., ). A fisetina demonstrou reduzir a senescência celular em fibroblastos e células endoteliais levadas à senescência por radiação ionizante em cultura (Zhu et al., ) ou fibroblastos primários de camundongos progeroides (Yousefzadeh et al., ). In vivo, a suplementação com fisetina reduziu marcadores de senescência celular em vários tecidos de camundongos idosos (Yousefzadeh et al., ) e outras espécies de mamíferos (Huard et al., ). Aqui, estendemos essas observações e mostramos que a fisetina na concentração de 1 μM reduziu a viabilidade de HUVECs levadas à senescência por exaustão replicativa, com efeitos mínimos em células não senescentes. Essa concentração é menor do que concentrações anteriores que demonstraram reduzir a viabilidade de células senescentes em cultura (Zhu et al., ), uma observação provavelmente relacionada a diferenças na indução da senescência celular. Mostramos ainda que 1 μM de fisetina reduziu múltiplos marcadores de senescência celular em células venosas e arteriais in vitro, estabelecendo os efeitos senolíticos dessa concentração.
Em seguida, traduzimos nossos achados para um contexto in vivo usando uma dose oral de 100 mg/kg/dia, considerando que estudos farmacocinéticos demonstram que os níveis plasmáticos de pico atingem ~1 μM após a ingestão oral de fisetina nessa dose (Touil et al., ). Selecionamos um paradigma de dosagem intermitente estabelecido para suplementação oral, a fim de remover células senescentes em excesso, mas não inibir cronicamente a ativação da senescência celular e interferir em seus papéis fisiológicos principais, e para distinguir entre os efeitos senolíticos da fisetina e quaisquer efeitos off‐target/agudos do composto na função arterial (Yousefzadeh et al., ). Consistente com nossos achados em cultura de células endoteliais, a suplementação oral intermitente de fisetina in vivo reduziu a senescência celular vascular e os marcadores SASP em camundongos idosos.
Fisetina e função endotelial vascular
A disfunção endotelial vascular é uma manifestação chave da disfunção arterial relacionada à idade e um importante antecedente para DCVs evidentes, incluindo aterosclerose e acidente vascular cerebral oclusivo (Benjamin et al., ). No presente estudo, mostramos que a suplementação intermitente com o senolítico emergente fisetina melhorou a função endotelial em camundongos idosos do tipo selvagem. Para demonstrar um papel contribuinte das reduções na senescência celular na mediação das melhorias na função endotelial com a fisetina, também realizamos experimentos de suplementação com fisetina no modelo de camundongo transgênico p16-3MR, para mostrar que as melhorias na função endotelial com a fisetina foram mediadas, em parte, pela supressão da senescência celular vascular.
A disfunção endotelial associada à idade é amplamente mediada pela redução da biodisponibilidade de NO, que é impulsionada principalmente pelo excesso de ROS, cuja fonte chave são as mitocôndrias desreguladas (AlGhatrif et al., ; Ben‐Shlomo et al., ; Cahill & Redmond, ; Lakatta & Levy, ; Sutton‐Tyrrell et al., ). A senescência celular vascular está associada à diminuição da biodisponibilidade de NO e ao aumento do estresse oxidativo relacionado a ROS em toda a célula e mitocondrial (Hayashi et al., ). Além disso, a disfunção mitocondrial, incluindo o aumento da produção de ROS, é uma característica chave das células senescentes (Wiley et al., ). Mostramos que as melhorias induzidas pela fisetina na função endotelial se deveram a melhorias na biodisponibilidade de NO e a uma redução na supressão da função endotelial relacionada a ROS em toda a célula e mitocondrial. As reduções de ROS em toda a célula e mitocondrial pareceram estar associadas a uma combinação de redução nas moléculas de sinalização pró-oxidantes (por exemplo, NADPH oxidase e p66SHC fosforilada) e aumento nas defesas enzimáticas antioxidantes (por exemplo, MnSOD). Coletivamente, esses achados demonstram que a suplementação oral intermitente de fisetina pode visar o excesso de senescência celular para melhorar a biodisponibilidade de NO e reduzir o estresse oxidativo, melhorando, em última análise, a função endotelial vascular na idade avançada.
Fisetina e rigidez das grandes artérias elásticas
Aumentos na rigidez de grandes artérias elásticas (ou seja, aumento da VOP aórtica e da rigidez mecânica intrínseca da parede) com o envelhecimento é um importante preditor independente de DCV clínica associada à idade (Vasan et al., ), intolerância à glicose (Zheng et al., ), disfunção renal (Ford et al., ), comprometimento cognitivo (Thorin‐Trescases et al., ) e retinopatia diabética (An et al., ). A suplementação com fisetina reduziu a rigidez arterial (VOP aórtica) em camundongos selvagens idosos ao reduzir a rigidez mecânica intrínseca da parede aórtica. Usando o modelo de camundongo p16-3MR, mostramos que as reduções no excesso de senescência celular com a fisetina contribuíram para a diminuição da rigidez mecânica intrínseca da parede aórtica, reduzindo a rigidez arterial em camundongos idosos.

A remodelação patológica da parede arterial com o envelhecimento inclui: (1) maior deposição de colágeno-1, a principal proteína de suporte de carga na parede aórtica; (2) fragmentação e degradação da elastina, a principal proteína estrutural que confere elasticidade às artérias; e (3) aumento da formação e expressão de AGEs, que juntos promovem ainda mais a rigidez arterial (Clayton, Brunt, et al., ; Zieman et al., ). A suplementação com fisetina tendeu a reduzir os níveis de colágeno-1 e AGEs nas regiões adventícias da parede arterial de camundongos idosos. A combinação de níveis mais baixos de colágeno-1 e AGEs após a suplementação com fisetina, apesar de não haver alterações na elastina, poderia conferir reduções na rigidez aórtica. Juntos, esses achados fornecem evidências de que a suplementação oral intermitente com fisetina leva a uma remodelação favorável da parede arterial, que está associada a menor rigidez aórtica, e sugere que a fisetina pode ser uma estratégia terapêutica viável para ser traduzida para adultos mais velhos para reduzir a rigidez arterial.
LIMITAÇÕES DO ESTUDO
É possível que alguns de nossos efeitos observados tenham sido independentes das ações senolíticas da fisetina, uma vez que a fisetina modula uma variedade de vias de sinalização celular e possui propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias (Farsad‐Naeimi et al., ; Khan et al., ). No entanto, observamos reduções em múltiplos marcadores de senescência celular e do SASP com a fisetina, nossas medições em camundongos foram realizadas 1 semana após a dose final de fisetina (ou seja, muito tempo após o composto ser eliminado da circulação (Jo et al., )), e, como a senescência celular e o SASP promovem inflamação arterial e estresse oxidativo (Clayton et al., ; Hayashi et al., ), a senólise induzida por fisetina é provavelmente um mecanismo upstream e contribuinte pelo qual a fisetina exerce efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios (Yousefzadeh et al., ). Também utilizamos a eliminação genética de células senescentes em excesso para demonstrar que reduções na senescência celular vascular contribuem para melhorias na função arterial com o tratamento com fisetina em camundongos idosos. Reconhecemos que existem limitações no modelo de camundongo p16-3MR, como a eliminação de células p16INK4A positivas não senescentes e a capacidade limitada de atingir células senescentes que não expressam p16INK4A (Demaria et al., ). No entanto, as células endoteliais senescentes expressam altamente p16INK4A e, como tal, o modelo de camundongo p16-3MR é um modelo altamente relevante para estudar o papel da senescência celular no envelhecimento arterial (Clayton et al., ).

CONCLUSÕES
No geral, nossos achados fornecem a primeira evidência de que a suplementação oral intermitente de fisetina reverte a disfunção endotelial vascular e a rigidez das grandes artérias elásticas por meio da supressão do excesso de senescência celular, inflamação e estresse oxidativo. Embora a fisetina seja encontrada em uma variedade de frutas e vegetais, dietas ricas em fisetina não são viáveis devido às variações no conteúdo dos alimentos. No entanto, a fisetina está disponível comercialmente como suplemento dietético e é relatada como segura para consumo humano (Bondonno et al., ; Farsad‐Naeimi et al., ; Hejazi et al., ; Kim & Je, ; Wang et al., ). Dessa forma, nossos achados pré-clínicos fornecem a evidência de prova de conceito necessária de eficácia, apoiando a necessidade de futuros estudos clínicos que avaliem o potencial da fisetina para tratar a disfunção arterial em adultos mais velhos e potencialmente reduzir o risco de DCV com o envelhecimento.

CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES.
SAM, JC, SM, DRS, MJR e ZSC desenharam o estudo. SAM, RV, MAD, KRL, NSV, NTG, AGL, DAH, VEB e ZSC realizaram os experimentos. SAM, KRL e ZSC analisaram os dados. SAM, DRS, MJR e ZSC interpretaram os dados e redigiram o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram a versão final do manuscrito. [Correção adicionada em 13 de janeiro de 2024, após a primeira publicação online: As contribuições dos autores foram modificadas nesta versão.]

INFORMAÇÕES SOBRE FINANCIAMENTO
Este trabalho foi apoiado pelas Bolsas do National Institute of Health F31 HL165885 (para SAM), K01 DK115524 (para MJR), K99 HL159241 (para ZSC), F32 HL151022 (para ZSC), R01AG055822 (para DRS e ZSC) e R01 AG055822 (para JC, SM e DRS) e um prêmio da American Heart Association AHA 23CDA1056582 (para MJR).
DECLARAÇÃO DE CONFLITO DE INTERESSES
Nenhum conflito de interesses, financeiro ou de outra natureza, é declarado pelos autores.
Informações de apoio
DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS
Os dados que apoiam os resultados deste estudo estão disponíveis com os autores correspondentes mediante solicitação razoável.
REFERÊNCIAS
Marcas do envelhecimento cardiovascular
Trajetórias longitudinais da rigidez arterial e o papel da pressão arterial: O estudo longitudinal de Baltimore sobre envelhecimento
Aumento da rigidez arterial como preditor para início e progressão da retinopatia diabética no diabetes mellitus tipo 2
Atualização de 2018 das estatísticas de doenças cardíacas e acidente vascular cerebral: Um relatório da American Heart Association
A velocidade da onda de pulso aórtica melhora a predição de eventos cardiovasculares: Uma metanálise de participantes individuais de dados observacionais prospectivos de 17.635 indivíduos
A ingestão de flavonoides está associada a menor mortalidade na coorte dinamarquesa de dieta, câncer e saúde
A supressão do microbioma intestinal melhora a disfunção arterial relacionada à idade e o estresse oxidativo em camundongos
Endotélio vascular — guardião da saúde dos vasos
Envelhecimento, senescência celular e câncer
Senescência celular: Quando coisas ruins acontecem a células boas
ABT-199 (venetoclax) e inibidores de BCL-2 em desenvolvimento clínico
Iniciação de 3,3-dimetil-1-butanol na meia-idade previne a disfunção endotelial e atenua o enrijecimento aórtico in vivo com o envelhecimento em camundongos
A eliminação de células senescentes por ABT263 rejuvenesce células-tronco hematopoéticas envelhecidas em camundongos
Regulação da transdução de sinal de ROS pela localização da NADPH oxidase 4
Inflamação mediada pelo fator de necrose tumoral alfa e remodelação da matriz extracelular subjacente ao enrijecimento aórtico induzido pelo agente quimioterápico comum doxorrubicina
O estresse oxidativo induzido por doxorrubicina e a disfunção endotelial em artérias condutoras são prevenidos pelo tratamento com antioxidante específico mitocondrial
A apigenina restaura a função endotelial melhorando o estresse oxidativo, reverte o enrijecimento aórtico e mitiga a inflamação vascular com o envelhecimento
A senescência celular contribui para o enrijecimento da artéria elástica grande e disfunção endotelial com o envelhecimento: Melhora com tratamento senolítico
Senescência replicativa: uma revisão crítica
Um papel essencial para células senescentes na cicatrização ideal de feridas através da secreção de PDGF-AA
A senescência celular promove efeitos adversos da quimioterapia e recidiva do câncer
Mecanismos envolvidos na disfunção vascular induzida pelo envelhecimento
Efeito da suplementação de fisetina em fatores inflamatórios e enzimas metaloproteinases da matriz em pacientes com câncer colorretal
Terapia de redução de superóxido com TEMPOL reverte a disfunção arterial com o envelhecimento em camundongos
A curcumina melhora a disfunção arterial e o estresse oxidativo com o envelhecimento
A rigidez aórtica está independentemente associada à taxa de declínio da função renal na doença renal crônica estágios 3 e 4
Superóxido dismutases: Papel na sinalização redox, função vascular e doenças
A terapia antioxidante direcionada à mitocôndria com MitoQ melhora o enrijecimento aórtico em camundongos velhos
Um guia para avaliar a senescência celular in vitro e in vivo
Óxido nítrico e senescência celular endotelial
O cultivo seriado de linhagens celulares diploides humanas
Ingestão dietética habitual de flavonoides e mortalidade por todas as causas e específica: Estudo de coorte de Golestan
Senolíticos diminuem as células senescentes em humanos: Relatório preliminar de um ensaio clínico de Dasatinibe mais quercetina em indivíduos com doença renal diabética
Mecanotransdução endotelial induzida por cisalhamento: A interação entre espécies reativas de oxigênio (ERO) e óxido nítrico (NO) e as implicações fisiopatológicas
Efeitos do tratamento com Fisetina na senescência celular de vários tecidos e órgãos de ovelhas velhas
Senescência de células endoteliais na disfunção vascular relacionada ao envelhecimento
Identificação da conversão absoluta em geraldol a partir da fisetina e farmacocinética em camundongo
Senolíticos na fibrose pulmonar idiopática: Resultados de um estudo piloto, aberto, primeiro em humanos
Fisetina: um antioxidante dietético para promoção da saúde
Ingestão de flavonoides e mortalidade por doença cardiovascular e todas as causas: Uma meta-análise de estudos de coorte prospectivos
Inibidores de protease antirretrovirais induzem características de senescência celular que são reversíveis após a remoção do fármaco
A beta-galactosidase associada à senescência reflete um aumento na massa lisossomal durante o envelhecimento replicativo de células endoteliais humanas
Envelhecimento arterial e cardíaco: Principais acionistas nas empresas de doenças cardiovasculares: Parte I: Artérias envelhecidas: uma "configuração" para doença vascular
Controle de qualidade mitocondrial e enrijecimento arterial associado à idade
A rigidez aórtica é um preditor independente de acidente vascular cerebral fatal na hipertensão essencial
O tratamento com salicilato melhora a disfunção endotelial vascular associada à idade: Papel potencial do fator nuclear kappaB e da fosforilação da forkhead box O
Identificação e análise funcional de células senescentes no sistema cardiovascular usando abordagens ômicas
A disfunção mitocondrial é responsável pela heterogeneidade estocástica na senescência dependente de telômeros
Estresse oxidativo, senescência celular e envelhecimento
O tratamento crônico com senolíticos alivia a disfunção vasomotora estabelecida em camundongos idosos ou ateroscleróticos
Visando a aptidão mitocondrial como estratégia para um envelhecimento vascular saudável
Senescência de células endoteliais com o envelhecimento em humanos saudáveis: Prevenção pelo exercício habitual e relação com a função endotelial vascular
Envelhecimento e função endotelial vascular em humanos
Inflamação vascular e estresse oxidativo: Principais desencadeadores de doenças cardiovasculares
Velocidade elevada da onda de pulso aórtica, um marcador de rigidez arterial, prediz eventos cardiovasculares em idosos com boa funcionalidade
Impacto da pressão de pulso nos eventos cerebrovasculares que levam ao declínio cognitivo relacionado à idade
Disposição e metabolismo da fisetina em camundongos: Identificação do geraldol como um metabólito ativo
Onze regras de ouro da RT‐PCR quantitativa
O papel das células senescentes no envelhecimento
Rigidez arterial e risco de longo prazo de desfechos de saúde: O estudo Framingham heart
Predição de eventos cardiovasculares e mortalidade por todas as causas com rigidez arterial: uma revisão sistemática e meta-análise
A fisetina prolonga a janela terapêutica do acidente vascular cerebral isquêmico usando ativador de plasminogênio tecidual: um ensaio clínico randomizado duplo-cego controlado por placebo
Disfunção mitocondrial induz senescência com um fenótipo secretor distinto
Especificidade tecidual do acúmulo de células senescentes durante o envelhecimento fisiológico e acelerado de camundongos
A fisetina é um senoterapêutico que prolonga a saúde e a vida útil
Associação entre rigidez arterial e insuficiência cardíaca de novo: O estudo Kailuan
Novos agentes que visam células senescentes: A flavona, fisetina, e o BCL‐X
Mecanismos, fisiopatologia e terapia da rigidez arterial