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pmid: "39658621"
title: "IL-23R é um biomarcador circulante e tecidual de envelhecimento ligado à senescência."
authors: "Carver CM, Rodriguez SL, Atkinson EJ, Dosch AJ, Asmussen NC, Gomez PT, Leitschuh EA, Espindola-Netto JM, Jeganathan KB, Whaley MG, Kamenecka TM, Baker DJ, Haak AJ, LeBrasseur NK, Schafer MJ"
journal: "Nature aging"
pubdate: "2025 Feb"
doi: "10.1038/s43587-024-00752-7"
source: "PMC Full Text"

IL-23R é um biomarcador circulante e tecidual de envelhecimento ligado à senescência.

Autores

Carver CM, Rodriguez SL, Atkinson EJ, Dosch AJ, Asmussen NC, Gomez PT, Leitschuh EA, Espindola-Netto JM, Jeganathan KB, Whaley MG, Kamenecka TM, Baker DJ, Haak AJ, LeBrasseur NK, Schafer MJ

Periodico

Nature aging (2025 Feb)

Conteudo

IL-23R é um biomarcador circulante e tecidual de envelhecimento associado à senescência

A senescência celular é um mecanismo de envelhecimento caracterizado pela parada do ciclo celular e um fenótipo secretor associado à senescência (SASP). Estudos pré-clínicos demonstram que medicamentos senolíticos, que têm como alvo vias de sobrevivência em células senescentes, podem neutralizar condições associadas à idade que abrangem vários órgãos. A eficácia comparativa de diferentes medicamentos senolíticos na modificação de biomarcadores de envelhecimento e senescência in vivo não foi demonstrada. Aqui, estabelecemos proteínas plasmáticas e transcritos teciduais relacionados ao envelhecimento e à senescência que mudaram em camundongos idosos versus jovens, machos e fêmeas. Investigamos a responsividade ao tratamento agudo com venetoclax, navitoclax, fisetina ou luteolina em comparação com a eliminação transgênica de células senescentes em camundongos p16-InkAttac envelhecidos. Descobrimos que as alterações dependentes da idade nas proteínas plasmáticas, incluindo IL-23R, CCL5 e CA13, foram revertidas pelos senoterapêuticos, o que correspondeu a diferenças de expressão nos tecidos, particularmente no rim. No plasma de humanos ao longo da vida, o IL-23R aumentou com a idade. Nossos resultados revelam fatores circulantes como mediadores candidatos da transdução de sinal interorgânica associada à senescência e biomarcadores de impacto translacional da carga sistêmica de células senescentes.

Usando plasma de camundongos e humanos, Carver et al. identificam fatores que são alterados com a idade e testam quais são revertidos por um painel de intervenções genéticas e farmacológicas senolíticas em camundongos envelhecidos. Eles identificam o IL-23R como um biomarcador circulante associado à senescência e aumentado com a idade.

Principal

A senescência celular é um mecanismo associado à idade que contribui para a patogênese em diversos sistemas orgânicos, incluindo disfunção imunológica, doenças cardiovasculares e metabólicas, fibrose pulmonar, osteoporose, doença renal, dano hepático, sarcopenia e declínio cognitivo. Fatores no sangue envelhecido podem impulsionar a ativação senescente e inflamatória em numerosos tecidos. As origens teciduais e celulares específicas dos fatores circulantes progerônicos não são bem caracterizadas. Proteínas circulantes que se originam de células senescentes podem refletir a carga sistêmica de células senescentes, podem ser exploradas como biomarcadores diagnósticos ou prognósticos translacionais e são possíveis mediadores da comunicação interorgânica progerônica.
Propriedades características das células senescentes incluem a regulação positiva de proteínas reguladoras do ciclo celular, incluindo p16ink4a (codificada por Cdkn2a), produção e secreção de um SASP e ativação de vias antiapoptóticas de células senescentes (SCAPs). O SASP é específico para o tipo celular e contexto e pode conferir alterações adversas aos ambientes teciduais locais e órgãos sistêmicos. O uso do modelo transgênico p16-InkAttac, que permite a eliminação sistêmica de células p16-positivas por meio de um gene suicida controlado temporalmente, demonstrou que a deleção de células senescentes alivia características de patologia relacionada à idade em vários órgãos, incluindo rim, tecido adiposo, músculo esquelético, olho, coração e cérebro. Uma comparação recente entre o direcionamento transgênico específico de tipo celular versus o de corpo inteiro de células p16-positivas demonstrou maiores benefícios na composição óssea envelhecida após a eliminação sistêmica, o que apoia a noção de que a influência adversa das células senescentes e do SASP resulta de sinalização local e distante.

Compostos senolíticos visam e desativam seletivamente as SCAPs para permitir a apoptose de células senescentes. Duas classes de senolíticos direcionados a SCAPs incluem inibidores da família BCL e flavonoides de produtos naturais. Venetoclax (ABT-199; VEN) e navitoclax (ABT-263; NAV) são miméticos de BH3/inibidores da família BCL com seletividade e especificidade diferenciais para BCL2, BCL-XL e/ou BCL-W. Fisetina (FIS) e luteolina (LUT) são flavonoides estruturalmente semelhantes que reduzem marcadores de senescência em camundongos envelhecidos, conferem propriedades anti-inflamatórias e atenuam patologias relacionadas à idade. Apesar dos testes senolíticos consideráveis em andamento em modelos pré-clínicos e humanos, a compreensão dos efeitos comparativos de drogas senolíticas e da eficiência de direcionamento de células senescentes entre tecidos é limitada.
O objetivo central deste estudo foi identificar biomarcadores plasmáticos e teciduais relacionados à idade e à senescência que sejam responsivos à intervenção senoterapêutica. Avaliamos perfis sistêmicos de senescência, SASP e biomarcadores inflamatórios durante o envelhecimento e sua alteração por compostos senolíticos clinicamente relevantes em comparação com o direcionamento transgênico de células senescentes p16-InkAttac em camundongos. Descobrimos que a abundância de IL-23R, CCL5 e outras proteínas que apresentam aumentos dependentes da idade na circulação foi reduzida por agentes senoterapêuticos. A CA13 diminuiu no plasma envelhecido, e os senolíticos restauraram esse fator para níveis juvenis. Em tecidos secretores, a expressão gênica de Il23r e Ccl5 coincidiu com a expressão de marcadores de senescência e a abundância de proteínas plasmáticas envelhecidas in vivo, e esses fatores foram significativamente regulados positivamente e secretados por células senescentes in vitro. Nossos resultados sugerem que células senescentes em rim, fígado e baço envelhecidos são fontes viáveis desses biomarcadores de envelhecimento na circulação sanguínea. Entre os medicamentos testados, o VEN suprimiu as alterações relacionadas à idade no maior número de biomarcadores circulantes e teciduais em camundongos envelhecidos. No plasma humano, descobrimos que a abundância de IL-23R aumentou com a idade tanto em mulheres quanto em homens. No geral, este estudo identifica candidatos a biomarcadores de envelhecimento progerônicos e rejuvenescedores como indicadores da carga sistêmica de senescência e possíveis mediadores da sinalização interorgânica regulada pela senescência que podem ser controlados pela intervenção senolítica in vivo.

Resultados
Proteínas plasmáticas circulantes alteram sua abundância com o envelhecimento
Proteínas plasmáticas conservadas e distintas são alteradas pela idade em camundongos fêmeas e machos.
a,b, Estimativas beta correspondentes à comparação da abundância de proteínas do controle velho (OLD CON) versus controle jovem (YNG CON) determinada por Olink PEAs em amostras de plasma de fêmeas (a) e machos (b). Diferenças estatisticamente significativas entre OLD CON e YNG CON são destacadas em laranja (P < 0,05, teste de soma de postos de Kruskal-Wallis bilateral), com valores negativos indicando uma diminuição nos níveis de proteínas no envelhecimento e valores positivos indicando um aumento na abundância de proteínas em amostras envelhecidas. Os pontos de dados resumem a estimativa beta média e as barras resumem o ± erro padrão. Tamanhos amostrais: YNG CON fêmea, n = 6; YNG CON macho, n = 5; OLD CON fêmea, n = 6; OLD CON macho, n = 8.
Dados de origem
Primeiramente, buscamos identificar biomarcadores circulantes que foram alterados pelo envelhecimento entre camundongos jovens (3–4 meses) e velhos (16–20 meses) usando ensaios de extensão de proximidade Olink (PEAs). O painel de proteínas incluiu fatores SASP, inflamatórios, metabólicos, de desenvolvimento, de suporte celular e de sinalização (Fig. 1). A utilidade desta abordagem foi investigar tanto fatores relacionados à senescência quanto fatores generalizados da saúde sistêmica no envelhecimento. Em relação às fêmeas jovens, quatro proteínas estavam mais elevadas (CCL5, CCN1, IL-23R, GCG) e três proteínas estavam mais baixas (CA13, CNTN4, MIA) no plasma de fêmeas velhas (Fig. 1a). Em relação aos machos jovens, 4 proteínas estavam mais elevadas (CCL3, CCN1, IL-17A, IL-23R) e 12 proteínas estavam mais baixas (CCN4, CDH6, CNTN4, CLMP, CPE, FSTL3, LPL, MIA, NOTCH3, TGFBR3, TNFRSF12A, VSIG2) no plasma de machos velhos (Fig. 1b). Em ambos os sexos, IL-23R e CCN1 estavam mais elevados e CNTN4 e MIA estavam mais baixos no plasma envelhecido. Em seguida, buscamos medir a expressão transcricional desses e de outros biomarcadores de envelhecimento em tecidos.
Genes de senescência e do plasma envelhecido aumentam em tecidos envelhecidos
Genes associados à senescência e à idade são expressos em tecidos de camundongos fêmeas e machos velhos p16-InkAttac.
a–f, Valores de expressão gênica por RT-PCR de tecidos de fêmeas jovens, fêmeas velhas, machos jovens e machos velhos para rim (a), fígado (b), baço (c), córtex cerebral (d), adiposo perigonadal (e) e pulmão (f). Os valores são normalizados em relação à expressão de camundongos controle jovens de cada sexo por tecido; barras pretas indicam valores medianos para cada grupo. g–n, São mostrados modelos de regressão logística ordinal comparando a expressão gênica de rim, fígado, baço, córtex, adiposo e pulmão jovens e velhos para p16ink4a (g), Cdkn2a (h), Bcl2a1a (i), Il23r (j), Ccl3 (k), Ccl5 (l), Il1b (m) e Il6 (n). Os símbolos denotam a estimativa beta média da predição ordinal ± erro padrão. *P < 0,05 significância entre camundongos velhos e jovens do mesmo sexo pela regressão logística ordinal bilateral. Tamanhos amostrais: fêmeas jovens, n = 6; machos jovens, n = 5; fêmeas velhas, n = 6; machos velhos, n = 8.
Dados fonte
Nossa hipótese foi de que proteínas que aumentam no plasma envelhecido podem ser originárias de células senescentes. Portanto, medimos a expressão do transcrito de genes que codificam fatores plasmáticos aumentados com a idade, juntamente com marcadores canônicos de senescência, em tecidos de camundongos p16-InkAttac velhos versus jovens. Para apoiar a interpretação dinâmica entre os tecidos, apresentamos os dados de expressão gênica por PCR em tempo real (RT-PCR) em ciclo limiar (CT) de amostras individuais (Fig. de Dados Estendidos 1), expressão relativa (Fig. 2a–f), regressão ordinal (Fig. 2g–n) e mapa de calor de expressão relativa normalizada (Fig. Suplementar 2). Em comparação com camundongos jovens, detectamos maior expressão de p16ink4a no rim (Fig. 2a), fígado (Fig. 2b), baço (Fig. 2c) e córtex cerebral (Fig. 2d) de camundongos velhos de ambos os sexos. p16ink4a foi maior no tecido adiposo perigonadal de camundongos machos velhos (Fig. 2e). A expressão do locus Cdkn2a mais amplo, que detecta tanto p19arf quanto p16ink4a, acompanhou de perto a expressão de p16ink4a por órgão (Fig. 2a–h). Ao examinar os valores relativos de CT, observamos que o baço envelhecido apresentou a maior abundância de transcrito de p16 entre os tecidos jovens e velhos (Fig. de Dados Estendidos 1). No entanto, modelos de predição ordinal demonstram a maior mudança associada à idade na expressão relativa de p16ink4a e Cdkn2a no rim, seguido pelo fígado e depois pelo baço (Fig. 2g,h). A expressão de p21 foi maior no rim envelhecido em ambos os sexos e no tecido adiposo feminino, mas menor no córtex envelhecido (Fig. 2a,d,e). O gene SCAP Bcl2 aumentou no baço de camundongos machos e fêmeas velhos (Fig. 2c). Além disso, Bcl2a1a, um efetor a jusante e mediador estimulado por citocinas da via de sobrevivência celular BCL2, foi maior no rim envelhecido em ambos os sexos, no fígado em fêmeas e no baço em machos (Fig. 2i). Observamos maior expressão de Il23r no rim, fígado e tecido adiposo de fêmeas velhas, e no fígado, tecido adiposo e pulmão de machos velhos (Fig. 2a,b,e,f,j). A expressão das quimiocinas SASP Ccl3 (Fig. 2k) e Ccl5 (Fig. 2l), Il1b (Fig. 2m) e Il6 (Fig. 2n) aumentou sistemicamente em vários tecidos envelhecidos, incluindo rim, fígado, baço, córtex e tecido adiposo, com Ccl5 aumentando de forma mais consistente em relação às outras quimiocinas analisadas.
Em seguida, aplicamos correlações de Spearman para determinar se os níveis de proteínas plasmáticas estavam associados à abundância de transcritos específicos de tecido em camundongos jovens e idosos (Figura de Dados Estendidos 2). Descobrimos várias proteínas plasmáticas alteradas pela idade que se correlacionaram positivamente com seus transcritos correspondentes. Em fêmeas, a expressão de Il23r em vários tecidos se correlacionou positivamente com a abundância da proteína no plasma (rim r = 0,78, P = 0,004; fígado r = 0,87, P < 0,001; tecido adiposo r = 0,70, P = 0,014; pulmão r = 0,74, P = 0,008). O Ccl5 hepático em machos se correlacionou positivamente com a proteína plasmática CCL5 (r = 0,56, P = 0,047). Também avaliamos associações entre proteínas plasmáticas alteradas pela idade e a expressão de marcadores canônicos de senescência. A proteína plasmática IL-23R correlacionou-se com a abundância de transcritos de Cdkn2a e p16ink4a em diversos tecidos (Figura de Dados Estendidos 2), com a maior associação positiva observada entre IL-23R plasmática e a expressão renal de Cdkn2a em camundongos fêmeas (r = 0,83, P = 0,002; Figura de Dados Estendidos 2a). O rim foi caracterizado por assinaturas consistentes de genes de senescência elevados com a idade que se correlacionaram com proteínas circulantes (Fig. 2); a expressão gênica de p16ink4a, Cdkn2a, Bcl2a1a, Ccl2, Ccl3, Ccl5, Il1b, Il6 e Il23r e/ou Tnf associou-se positivamente com IL-23R, CCL2, CCL3, CCL5 e/ou IL-17A plasmáticos e negativamente com MIA (Figura de Dados Estendidos 2). Descobrimos que a proteína plasmática IL-23R e/ou CCL5 também aumentou concomitantemente com a expressão de fatores p16, SASP e SCAP no rim, fígado, baço e tecido adiposo (Figura de Dados Estendidos 2).

Como Cdkn2a/p16 e Il23r (biomarcadores de envelhecimento estabelecido e emergente, respectivamente) ambos aumentaram no rim envelhecido, realizamos hibridização in situ fluorescente para localizar e validar sua expressão no rim envelhecido (Figura de Dados Estendidos 3). A expressão de p16ink4a foi abundante nos néfrons e no interstício. Além disso, Il23r estava altamente concentrado em células encontradas na cavidade do seio renal e no tecido perivascular, nas quais p16ink4a estava colocalizado. Além disso, observamos que Il23r e p16ink4a colocalizaram com células Cd3e+ em nódulos imunológicos por todo o rim envelhecido, presentes nos glomérulos e difusos no tecido mesenquimal, enquanto o rim jovem não apresentava Il23r (Figura de Dados Estendidos 3b–j).

Células senescentes expressam Il23r e Ccl5
Para determinar definitivamente se a IL-23R ou CCL5 podem ser originárias de células senescentes, implementamos um modelo de cultura celular estabelecido de senescência induzida por irradiação (IR) em fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) (Extended Data Fig. 4). Confirmamos que os MEFs expostos à IR estavam senescentes por meio de coloração por β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) e avaliações da morfologia nuclear, perfil de expressão gênica por RT-PCR e análise de imunoensaio multiplexado do SASP em meio condicionado. A IR induziu uma maior porcentagem (Extended Data Fig. 4b) e número total (Extended Data Fig. 4c) de células SA-β-gal+ em comparação com os controles simulados (sham). As células das culturas com IR caracterizaram-se por maior área nuclear (Extended Data Fig. 4d). Para o perfil de expressão gênica, examinamos genes estabelecidos de senescência e SASP, bem como genes que codificam proteínas que exibiram alterações associadas à idade no plasma (Extended Data Fig. 4e). Em relação ao sham, a expressão de p16ink4a, Cdkn2a, p21, Gdf15, Il6 e Mmp3 aumentou nos MEFs com IR. Coincidindo com essa assinatura de senescência, a expressão de Il23r foi 2,4 ± 0,3 vezes maior, e a expressão de Ccl5 foi 6,3 ± 0,5 vezes maior nos MEFs com IR, em comparação com as culturas sham. Mia também aumentou nos MEFs com IR, mas Ccn1 foi menor que o sham. A seguir, medimos a abundância de proteínas SASP canônicas e biomarcadores emergentes secretados por células senescentes por IR e células controle em meios condicionados, utilizando imunoensaios multiplexados Luminex e Olink (Extended Data Fig. 4f,g). Nos dois ensaios, as proteínas CCL2, CCL3, CCL5, CCL11, CCL20, CXCL1, CXCL9, GDF15, IL-23R, MMP2, MMP12, OPN, TNFSF12 e TNFRSF1A aumentaram significativamente no meio condicionado dos MEFs com IR. Coletivamente, a expressão de Ccl5/CCL5 e Il23r/IL-23R é induzida em e secretada por células senescentes, o que sugere que os níveis elevados de CCL5 e IL-23R na circulação sanguínea envelhecida podem se originar de células senescentes.
Senoterapêuticos suprimem proteínas plasmáticas associadas à idade
Alterações relacionadas à idade nas proteínas plasmáticas são revertidas por intervenções senoterapêuticas de curto prazo.
a, Grupos de tratamento (acima) e cronograma de tratamento senoterapêutico (abaixo) de camundongos jovens e idosos que receberam veículo ou AP20187 (AP) por injeção i.p. e veículo ou um de quatro fármacos senolíticos (VEN, NAV, FIS ou LUT) por gavagem oral. A partir da semana 1, os camundongos foram tratados uma vez ao dia por 5 dias, seguidos de 2 semanas sem tratamento, depois 5 dias de tratamento adicional, seguidos de 1 semana sem tratamento antes da necropsia. b–k, Os níveis de proteínas plasmáticas são demonstrados para todos os biomarcadores que diferiram por idade e pelo menos uma intervenção senolítica reverteu significativamente a alteração relacionada à idade em pelo menos um sexo. Este critério foi atendido para IL-23R (b,c), CCL5 (d,e), GCG (f,g), IL-17A (h,i) e CA13 (j,k). Rosa, grupos femininos; azul, grupos masculinos. Os valores das proteínas foram medidos por Olink PEAs e são reportados como NPX. As barras resumem valores medianos. Tamanhos das amostras: YNG CON fêmea, n = 6; OLD CON fêmea, n = 6; OLD AP fêmea, n = 5; OLD VEN fêmea, n = 5; OLD NAV fêmea, n = 7; OLD FIS fêmea, n = 7; OLD LUT fêmea, n = 7; YNG CON macho, n = 5; OLD CON macho, n = 8; OLD AP macho, n = 8; OLD VEN macho, n = 6; OLD NAV macho, n = 7; OLD FIS macho, n = 7; OLD LUT macho, n = 7. YNG CON versus OLD CON refletem as estatísticas fornecidas na Fig. 1 com valores exatos de P fornecidos. Testes de Kruskal–Wallis com correção de comparação múltipla foram usados para comparação dos grupos de tratamento idosos com OLD CON. Reportamos *P < 0,05. Veja Métodos para descrição adicional da abordagem estatística de duas etapas. a, Criado com BioRender.com.
Dados de origem
Em seguida, testamos se as proteínas plasmáticas putativas associadas à idade são moduladas por drogas que visam células senescentes in vivo. Em camundongos p16-InkAttac idosos, realizamos uma comparação direta entre intervenções transgênicas mediadas por AP20187 (AP) e intervenções senolíticas por meio de uma estratégia de administração intermitente de curto prazo (Fig. 3a). Todos os quatro compostos (VEN, NAV, FIS e LUT) demonstraram capacidade seletiva de induzir apoptose através da atividade da caspase-3 clivada em fibroblastos pulmonares senescentes induzidos por etoposídeo in vitro (Extended Data Fig. 5). Hipotetizamos que os agentes senoterapêuticos reverteriam a direção das alterações relacionadas à idade das proteínas plasmáticas in vivo. Portanto, analisamos as respostas aos medicamentos para proteínas que demonstraram uma alteração dependente da idade usando testes estatísticos não paramétricos de duas caudas com correção para comparações múltiplas (Fig. 3b–k). Em camundongos fêmeas idosos, VEN e LUT reduziram a abundância plasmática de IL-23R (Fig. 3b). Em camundongos machos idosos, VEN reduziu a abundância plasmática de IL-23R (Fig. 3c). NAV reduziu a abundância plasmática de CCL5 em fêmeas idosas e AP apresentou uma tendência de redução de CCL5 (Fig. 3d). LUT reduziu a abundância plasmática de GCG em fêmeas idosas (Fig. 3f). Em machos idosos, VEN, NAV e FIS reduziram a abundância plasmática de IL-17A (Fig. 3i). CA13 estava mais baixo no plasma de fêmeas idosas em comparação com o plasma jovem e aumentou em camundongos idosos após o tratamento com VEN, NAV, FIS ou LUT (Fig. 3j). Assim, os compostos senoterapêuticos revertem a abundância de proteínas circulantes associadas à idade para níveis mais juvenis, incluindo a modulação de fatores que são tanto aumentados quanto diminuídos com o envelhecimento. Entre esses dados, IL-23R estava elevado em camundongos idosos de ambos os sexos e mostrou modulação significativa pelo senoterapêutico VEN. Também testamos se algum medicamento ‘exacerbou’ a alteração dependente da idade nos níveis de proteínas plasmáticas. No plasma masculino, FIS aumentou ainda mais a alteração dependente da idade em CDH6, FSTL3, MIA e CCN4 (Source data).
Drogas que visam senescência concentram-se em órgãos secretores
Com base em nossa observação de que os senolíticos reverteram as alterações associadas à idade na abundância de biomarcadores plasmáticos, realizamos análise farmacocinética no plasma e tecidos usando espectrometria de massa em 20 min, 2 h, 6 h e 3 dias após 4 dias consecutivos de tratamento com AP ou VEN (Tabela Suplementar 1). O AP apresentou baixo volume de distribuição com concentração plasmática relativamente alta em comparação com os tecidos. As concentrações de estado estacionário de AP alcançadas no plasma, rim e fígado diminuíram gradualmente com uma meia-vida aproximada de 3–4 h, mas níveis detectáveis permaneceram em 72 h (plasma, 2,1–6,6 µM; rim, 0,2–0,8 µM; fígado, 0,8–2,2 µM). Em camundongos tratados com VEN, as concentrações máximas no plasma (2,9–6,0 µM), rim (2,8–4,1 µM) e fígado (18,8–29,5 µM) foram detectadas 2 h após a dose final, e a maior parte do fármaco foi eliminada em 72 h. Observamos que essas medidas foram derivadas de camundongos de 18 meses de idade que foram tratados com fármaco por apenas 4 dias; espera-se que camundongos mais velhos ou doentes tratados a longo prazo apresentem cinética farmacológica distinta. No entanto, esses resultados demonstram que AP e VEN, fármacos que visam células senescentes, concentram-se e persistem no rim e fígado, que abrigam uma carga substancial de marcadores de células senescentes (Fig. 2) e, portanto, são prováveis de induzir efeitos alvo nesses tecidos.

Il23r e Ccl5 aumentam com a idade e são reduzidos pelos senoterapêuticos

A expressão de p16 em camundongos velhos p16-InkAttac é reduzida em um subconjunto de tecidos envelhecidos em resposta ao direcionamento transgênico ou farmacológico de curto prazo de células senescentes.

a–l, RT-PCR foi usado para avaliar a expressão gênica de Cdk2na (a,b,e,f,i,j) e p16ink4a (c,d,g,h,k,l) entre camundongos controle velhos (OLD CON) versus camundongos tratados com fármacos senolíticos, no rim (a–d), baço (e–h) e córtex (i–l). Os valores são expressão relativa ao YNG CON por grupo. Rosa, grupos femininos; azul, grupos masculinos. Cdkn2a detecta ambas as variantes de transcrição 1 (p19arf) e 2 (p16ink4a) (a,b,e,f,i,j) e p16ink4a detecta apenas a variante de transcrição 2 (c,d,g,h,k,l). YNG CON versus OLD CON refletem as estatísticas fornecidas na Fig. 2 com valores exatos de P fornecidos. Testes de Kruskal–Wallis com correção de comparação múltipla foram usados para comparação de grupos de tratamento velhos com OLD CON. Relatamos *P < 0,05 bicaudal. As barras resumem os valores medianos dos grupos. Tamanhos das amostras: YNG CON feminino, n = 6; OLD CON feminino, n = 6; OLD AP feminino, n = 5; OLD VEN feminino, n = 5; OLD NAV feminino, n = 7; OLD FIS feminino, n = 7; OLD LUT feminino, n = 7; YNG CON masculino, n = 5; OLD CON masculino, n = 8; OLD AP masculino, n = 8; OLD VEN masculino, n = 6; OLD NAV masculino, n = 7; OLD FIS masculino, n = 7; OLD LUT masculino, n = 7.

Dados de origem
Em seguida, examinamos se compostos senoterapêuticos reduziam a abundância de transcritos que codificam proteínas plasmáticas alteradas pela idade e por senolíticos em consonância com transcritos que codificam fatores canônicos de senescência. Hipotetizamos que tratamentos senolíticos reduziriam os níveis de transcritos aumentados com a idade, em relação a camundongos idosos tratados com veículo, e realizamos comparações não paramétricas bicaudais direcionadas por hipóteses com correções para comparações múltiplas para fêmeas e machos por tecido (Fig. 4). O direcionamento anterior de células positivas para p16 pelo p16-InkAttac através de tratamento de longo prazo com AP indicou eliminação de maneira variável e específica do tecido, com efeitos substanciais no rim. Consistente com esses achados, descobrimos que o tratamento com AP reduziu a expressão de Cdkn2a no rim feminino envelhecido (Fig. 4a). VEN e LUT também reduziram a expressão de Cdkn2a no rim feminino (Fig. 4a) e FIS reduziu Cdkn2a no rim masculino (Fig. 4b). No baço feminino, os senolíticos não alteraram significativamente Cdkn2a (Fig. 4e), mas VEN reduziu p16ink4a (Fig. 4g). FIS e LUT reduziram Cdkn2a no córtex de camundongos machos (Fig. 4j) e FIS reduziu p16ink4a (Fig. 4l). Não observamos reversão mediada por senolíticos da expressão de p16 aumentada com a idade no fígado, pulmão ou tecido adiposo perigonadal (Dados Estendidos Fig. 6). A tendência de aumentos dependentes da idade na expressão de p21 no baço foi reduzida por NAV (Dados Estendidos Fig. 7). A menor expressão de p21 associada à idade no córtex masculino foi revertida para níveis juvenis por VEN (Dados Estendidos Fig. 7). Modulação senoterapêutica adicional específica do tecido da expressão gênica pode ser encontrada nos Dados Fonte. Para discernir melhor as mudanças dependentes de senolíticos em fatores relacionados à idade, realizamos análise de componentes principais nas variáveis combinadas de expressão gênica renal e proteínas plasmáticas de camundongos jovens, idosos e idosos tratados. Observamos qualitativamente que camundongos idosos tratados com AP ou drogas senoterapêuticas tenderam a se agrupar entre camundongos idosos ou jovens tratados com veículo (Fig. Suplementar 3 e Tabela Suplementar 2). A expressão do gene Ccl5 diminui em um subconjunto de tecidos envelhecidos em resposta ao direcionamento transgênico ou farmacológico de curto prazo de células senescentes.
a–l, Comparação da expressão do gene Ccl5 medida por RT-PCR entre intervenção com fármacos senolíticos e OLD CON no rim (a,b), fígado (c,d), baço (e,f), pulmão (g,h), tecido adiposo perigonadal (i,j) e córtex (k,l). Rosa, grupos femininos; azul, grupos masculinos. YNG CON versus OLD CON refletem as estatísticas fornecidas na Fig. 2 com valores exatos de P fornecidos. Testes de Kruskal–Wallis com correção para comparações múltiplas foram usados para comparação dos grupos de tratamento idoso com OLD CON. Relatamos *P < 0,05 bicaudal. As barras resumem os valores medianos dos grupos. Tamanhos das amostras: YNG CON feminino, n = 6; OLD CON feminino, n = 6; OLD AP feminino, n = 5; OLD VEN feminino, n = 5; OLD NAV feminino, n = 7; OLD FIS feminino, n = 7; OLD LUT feminino, n = 7; YNG CON masculino, n = 5; OLD CON masculino, n = 8; OLD AP masculino, n = 8; OLD VEN masculino, n = 6; OLD NAV masculino, n = 7; OLD FIS masculino, n = 7; OLD LUT masculino, n = 7.

Em seguida, determinamos se a expressão de Ccl5 nos tecidos diminuía em resposta a cada intervenção (Fig. 5). Ccl5 exibiu expressão diferencial generalizada entre órgãos envelhecidos e foi expresso mais abundantemente no baço envelhecido (Fig. de Dados Estendidos 1). O tratamento com VEN diminuiu a abundância do transcrito de Ccl5 no rim feminino (Fig. 5a) e no baço (Fig. 5e). O tratamento com FIS também diminuiu a expressão de Ccl5 no baço feminino (Fig. 5e).

A expressão do gene Il23r é alterada em um subconjunto de tecidos envelhecidos em resposta ao direcionamento de células senescentes por meio de transgênese de curto prazo ou farmacológico.

a–l, Comparação da expressão do gene Il23r medida por RT-PCR entre intervenção com fármacos senolíticos e OLD CON no rim (a,b), fígado (c,d), baço (e,f), pulmão (g,h), tecido adiposo perigonadal (i,j) e córtex (k,l). Rosa, grupos femininos; azul, grupos masculinos. YNG CON versus OLD CON refletem as estatísticas fornecidas na Fig. 2 com valores exatos de P fornecidos. Testes de Kruskal–Wallis com correção para comparações múltiplas foram usados para comparação dos grupos de tratamento idoso com OLD CON. Relatamos *P < 0,05 bicaudal. As barras resumem os valores medianos dos grupos. Tamanhos das amostras: YNG CON feminino, n = 6; OLD CON feminino, n = 6; OLD AP feminino, n = 5; OLD VEN feminino, n = 5; OLD NAV feminino, n = 7; OLD FIS feminino, n = 7; OLD LUT feminino, n = 7; YNG CON masculino, n = 5; OLD CON masculino, n = 8; OLD AP masculino, n = 8; OLD VEN masculino, n = 6; OLD NAV masculino, n = 7; OLD FIS masculino, n = 7; OLD LUT masculino, n = 7.
Testamos em seguida se os senoterapêuticos atenuaram as alterações transcricionais de Il23r associadas à idade (Fig. 6). No rim feminino envelhecido, o tratamento com AP reduziu a expressão de Il23r (Fig. 6a). O VEN reverteu os aumentos dependentes da idade em Il23r no rim feminino (Fig. 6a) e no baço (Fig. 6e). FIS e LUT também reduziram a expressão de Il23r no rim feminino envelhecido em comparação com os controles (Fig. 6a). Nos machos, o FIS reverteu a tendência de aumento dependente da idade em Il23r no rim (Fig. 6b). Antitético aos tecidos periféricos, o LUT aumentou Il23r no córtex feminino envelhecido, para o nível mais alto de expressão cortical em camundongos jovens (Fig. 6k). O VEN exibiu eficácia consistente na mitigação da expressão gênica relacionada à senescência no paradigma de tratamento agudo, com fenocópia parcial da eliminação de células senescentes mediada por AP no rim. Em conjunto, as alterações mediadas pela idade e pelos senoterapêuticos na proteína plasmática e na expressão gênica sugerem que IL-23R e CCL5 são importantes biomarcadores de envelhecimento e senescência.
A proteína IL-23R aumenta no plasma humano envelhecido
A proteína IL-23R no plasma aumenta com a idade em humanos.
a–c, Medição de IL-23R em plasma EDTA humano em participantes do Biobanco da Clínica Mayo com idades entre 20 e 82 anos, combinados (a), femininos (rosa) (b) e masculinos (azul) (c). A linha de melhor ajuste e o intervalo de confiança de 95% (linhas tracejadas) foram determinados por regressão linear. Participantes femininos (F = 4,545, g.l. = 38, P = 0,0395). Participantes masculinos (F = 4,837, g.l. = 37, P = 0,0342). Teste bicaudal dos valores de correlação de Pearson (r) e valores de P são fornecidos para cada gráfico.
Dados de origem
Nossos achados sugerem que IL-23R é uma proteína plasmática aumentada com a idade e sensível à intervenção senoterapêutica. Para começar a avaliar a relevância translacional dessa descoberta, medimos IL-23R usando ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) em plasma humano de uma amostra transversal de 79 participantes do Biobanco da Clínica Mayo. IL-23R aumentou com a idade na amostra combinada (r = 0,337, P = 0,002) e separadamente em participantes femininos (r = 0,327, P = 0,039) e masculinos (r = 0,340, P = 0,034) (Fig. 7). Em seguida, examinamos a abundância da proteína IL-23R em amostras jovens e envelhecidas de camundongos e humanos. Em amostras de camundongos, realizamos ensaios Olink que incluíram padrões de plasma com pico da proteína IL-23R. Descobrimos que a concentração plasmática média de IL-23R para camundongos fêmeas de 22 a 24 meses de idade foi de 78 ± 5 pg ml−1 (n = 17), enquanto amostras de plasma jovem (n = 7) estavam abaixo do limite inferior de detecção da curva padrão (Tabela Suplementar 3). Usando ELISAs com padrões da proteína IL-23R, determinamos que a média de IL-23R no plasma humano foi de 37 ± 3 ng ml−1 para fêmeas idosas de 66 a 82 anos e 46 ± 4 ng ml−1 para machos de 67 a 82 anos. Portanto, IL-23R aumenta com a idade tanto em camundongos quanto em humanos.
Nosso estudo foi desenvolvido sob a hipótese de que algumas proteínas associadas ao envelhecimento na circulação se originam ou são influenciadas por células senescentes. Hipotetizamos ainda que a eliminação de células senescentes reduziria as proteínas plasmáticas aumentadas com a idade (putativas pró-gerônicas) e aumentaria as proteínas plasmáticas reduzidas com a idade (putativas rejuvenescedoras), restaurando, em última análise, o ambiente circulatório para um estado mais jovem. Essas hipóteses estão ligadas à lógica de que os benefícios derivados da deleção sistêmica de células senescentes podem resultar tanto de efeitos localizados nos tecidos quanto circulatórios. Fornecemos evidências para ambas as modalidades em resposta ao direcionamento de células senescentes. Nosso estudo revela proteínas plasmáticas associadas à idade e genes expressos em tecidos que são responsivos à intervenção senoterapêutica de curto prazo. Demonstramos biomarcadores circulantes que refletem a carga sistêmica de células senescentes e o direcionamento dessas células.

IL-23R, CCL5, CA13 e fatores adicionais emergiram deste trabalho como biomarcadores críticos do envelhecimento que estão ligados à abundância da expressão gênica de senescência sistêmica, são responsivos a senoterapêuticos e são possíveis mediadores da sinalização entre órgãos mediada por células senescentes. De acordo com os termos de ontologia gênica, as proteínas que estavam mais baixas no plasma envelhecido eram potencialmente de origem na membrana celular ou citoplasmática e possivelmente relacionadas a danos no DNA e defeitos transcricionais. Por exemplo, CA13 é uma enzima citosólica que catalisa a hidratação do dióxido de carbono e participa da regulação do bicarbonato e da homeostase do pH. A CA13 diminuiu no plasma de fêmeas envelhecidas e os níveis da proteína foram elevados pelas quatro estratégias senoterapêuticas farmacológicas, sugerindo um intrigante fator rejuvenescedor candidato sob controle senoterapêutico. Muitas das proteínas que estavam mais altas no plasma envelhecido eram fatores secretados. Por exemplo, CCL5 é uma quimiocina reguladora de células T e um fator SASP inflamatório estabelecido. Também identificamos IL-23R como uma notável proteína circulante aumentada com a idade que é suprimida por senoterapêuticos em ambos os sexos.
A via de sinalização IL-23–IL-23R é crítica na maturação de células T helper 17 (TH17) e na orquestração de sinais inflamatórios. Camundongos com déficit genômico de IL-23R não eliciam respostas TH17 e são resistentes à encefalomielite autoimune experimental, e a disfunção de IL-23R está ligada à suscetibilidade a várias doenças autoimunes. À medida que o corpo envelhece, as células TH17 pró-inflamatórias que são positivas para IL-23R aumentam. Além disso, a regulação positiva de IL-23 associada à idade pode facilitar mudanças de IL-23R na circulação em conjunto com outros mecanismos inflamatórios. Embora mais amplamente estudado em células imunológicas, IL-23R também é expresso em células não linfoides, incluindo células epiteliais tubulares renais, onde a deleção de IL-23R específica de células epiteliais tubulares suprime a inflamação renal patogênica in vivo. Nos contextos descritos, IL-23R é um receptor expresso na superfície; no entanto, as origens celulares e a influência mecanicista do IL-23R solúvel circulante não estão bem estabelecidas.

Detectada em humanos, mas ainda não confirmada em camundongos, uma variante de splicing de IL-23R é produzida como incapaz de ancoragem transmembrana e, portanto, escapa da célula como IL-23R solúvel, que pode ter uma função totalmente diferente de sua contraparte ligada à membrana. Além disso, a liberação do ectodomínio do IL-23R humano e murino pode ocorrer pela interação com enzimas ADAM, o que poderia ser outra fonte de IL-23R solúvel. Especulamos que o IL-23R circulante relacionado à idade pode corresponder a uma forma solúvel do receptor e/ou proteína associada a vesículas, que poderia se originar do IL-23R ligado à membrana. A superexpressão de IL-23R solúvel in vivo interfere na interação IL-23–IL-23R que promove inflamação. Importante, o laboratório de Elisseeff demonstrou recentemente o controle recíproco entre células senescentes e células T TH17 em modelos de envelhecimento e lesão, onde o direcionamento de qualquer uma das populações pode atenuar a patologia e/ou promover regeneração.

Relacionados a essas descobertas, descobrimos que a concentração plasmática de IL-23R aumenta tanto em amostras de plasma de camundongos idosos (usando ensaios Olink) quanto humanos (usando ELISA, já que os ensaios Olink não estão disponíveis). Através do controle senoterapêutico do IL-23R sistêmico, fornecemos evidências fundamentais de que o IL-23R circulante está ligado à senescência celular, mas ainda há muito a ser compreendido sobre os papéis moduladores do IL-23R na função distribuída por órgãos no envelhecimento. Nossos dados reforçam a conclusão de que o eixo IL-23R é um nó regulador central nas identidades celulares envelhecidas em todo o corpo, e estabelecemos o IL-23R circulante como um biomarcador de envelhecimento translacionalmente relevante para pesquisas clínicas e pré-clínicas em andamento.
Implementamos o perfil de expressão gênica em todo o sistema com o objetivo de rastrear biomarcadores circulantes até seus tecidos de origem. A expressão de Il23r aumentou no rim, fígado, tecido adiposo perigonadal e pulmão envelhecidos, o que pode refletir um aumento na abundância de células senescentes que expressam Il23r e/ou células imunes infiltrantes nos tecidos. A hibridização in situ confirmou que Il23r e Cdkn2a foram abundantemente expressos e colocalizados no seio renal e no interstício do rim envelhecido. Concluímos que o direcionamento de células senescentes foi mais eficaz na redução de Il23r no rim, com base na observação de que vários medicamentos foram eficazes em ambos os sexos. A redução do transcrito de Il23r por intervenção senolítica também foi alcançada no baço. Isso sugere que vários tecidos são fontes viáveis do aumento de IL-23R solúvel no plasma envelhecido, e as senoterapias podem atuar nesses tecidos para controlar sua abundância na circulação sanguínea. Destacamos o potencial da eliminação de células senescentes em um tecido primário para trazer benefícios a um tecido secundário por meio do controle circulatório.

Um relatório anterior mostrou que o VEN pode atingir células beta senescentes que expressam BCL2 no pâncreas, prevenindo a patologia diabética tipo I em camundongos. Embora não tenhamos estudado o pâncreas, ficamos intrigados ao descobrir que a intervenção senoterapêutica com LUT restaurou as concentrações plasmáticas da proteína GCG para níveis juvenis em fêmeas envelhecidas, o que pode coincidir com benefícios metabólicos originados no pâncreas. Além disso, observamos que a inibição de BCL2 por meio do VEN foi eficaz na redução dos marcadores de envelhecimento e senescência no rim e no baço. Detectamos uma expressão qualitativamente maior de Bcl2 e/ou Bcl2a1a no baço e rim envelhecidos, em comparação com outros tecidos analisados. Portanto, a eficácia direcionada ao BCL2 pode exigir um limiar de indução do alvo antes que a modulação possa ocorrer e/ou ser detectada.
Existem pelo menos três cenários pelos quais os fatores plasmáticos aumentados com a idade, descobertos aqui, podem ser alterados por senoterapêuticos. Primeiro, esses fatores podem se originar de células senescentes, e a eliminação dessas células poderia reduzir sua produção e secreção. Efeitos senomórficos também podem ocorrer, nos quais as células senescentes são modificadas, mas não mortas pelos tratamentos medicamentosos. Segundo, esses fatores podem ser secretados por células imunes ou outras células que estão sob o controle regulatório de células senescentes, onde o direcionamento das células senescentes poderia reduzir os fatores plasmáticos por meio de mecanismos não autônomos da célula. Terceiro, esses fatores podem ser secretados por células imunes ou outras células que não estão associadas a células senescentes, mas são moduladas pelos medicamentos. Relacionados aos pontos dois e três, inibidores de BCL2 e compostos flavanoides têm efeitos imunomoduladores que podem ou não envolver senescência. Observamos que Il23r/IL-23R é expresso em, e secretado por, fibroblastos senescentes. Testes senoterapêuticos paralelos revelaram que a modulação senolítica espelhou e, em vários casos, teve desempenho superior ao da abordagem transgênica p16-InkAttac. Esses resultados sugerem coletivamente que a eliminação de células senescentes positivas para p16 está por trás de uma parte, mas não de todas, as reduções em IL-23R e outros fatores plasmáticos relacionados à idade após intervenção senolítica. Os medicamentos senolíticos podem agir de forma mais ampla sobre outros tipos de células senescentes e potencialmente não senescentes, em comparação com a eliminação exclusiva de células que expressam p16ink4a, e os senoterapêuticos também podem conferir propriedades imunomoduladoras que não envolvem células senescentes. Desvendar os mecanismos dependentes e independentes de senescência alterados por senoterapêuticos e as interações entre células senescentes e células imunes são diretrizes importantes no campo da pesquisa translacional do envelhecimento.
Além dos principais fatores destacados acima, a amplitude de nossos resultados revela descobertas importantes que se baseiam em descobertas fundamentais anteriores. Por exemplo, Ccn1/Cyr61 foi recentemente identificado como um gene altamente regulado para cima no conjunto de genes de células senescentes 'SenMayo'. A CCN1 é uma proteína matricelular pró-inflamatória que induz a síntese de citocinas/quimiocinas em cooperação com o reparo tecidual por macrófagos ativados. Confirmamos que a CCN1 está significativamente aumentada no plasma de camundongos idosos e também está transcricionalmente aumentada no tecido adiposo idoso. A CCN1 plasmática correlacionou-se positivamente com outros fatores de senescência e inflamação, mas não foi significativamente alterada pela modulação senolítica de curto prazo. Observamos que a idade dos camundongos transgênicos idosos usados neste estudo (16–20 meses) pode refletir um início heterogêneo da velhice, e antecipamos que o tratamento de longo prazo e amostras maiores podem ser necessários para confirmar a modulação senoterapêutica de muitos biomarcadores emergentes de senescência, incluindo a CCN1. Além disso, observamos padrões de envelhecimento inversos para transcritos selecionados no cérebro, em relação aos órgãos periféricos. Isso foi verdadeiro para Il23r e p21. p21 é expresso em células progenitoras quiescentes, onde desempenha um papel na manutenção da capacidade tronco, provavelmente independente de um fenótipo de senescência. Embora a fonte do padrão de expressão antitética para Il23r seja indeterminada, especulamos que a abundância reduzida do transcrito p21 no envelhecimento pode refletir uma redução nas células progenitoras no cérebro idoso. O VEN aumentou a expressão de p21 no córtex de machos idosos para níveis mais próximos dos jovens; se isso reflete um efeito de rejuvenescimento das células progenitoras cerebrais ainda não se sabe. No entanto, essa descoberta levanta cautela contra o uso de p21 como um biomarcador único para identificação de células senescentes no cérebro idoso.
Selecionar as escolhas de delineamento do estudo incorporadas em nosso estudo justifica comentários. Um ponto forte do nosso delineamento é o alto número de comparações diretas. Comparar cinco drogas experimentais entre biomarcadores no plasma e seis tecidos para ambos os sexos fornece dados quantitativos e qualitativos valiosos como recurso, aplicáveis a uma infinidade de questões. No entanto, os tamanhos amostrais limitados necessários para a viabilidade do estudo desafiaram o poder estatístico. Não obstante, utilizamos testes estatísticos não paramétricos direcionados por hipóteses com correção para comparações múltiplas para examinar a modulação senoterapêutica do envelhecimento. A partir dessa abordagem, a identificação de padrões consistentes específicos de tecido e de resposta aos fármacos fomentou nossa descoberta de biomarcadores relacionados ao envelhecimento e à senescência no contexto de assinaturas moleculares bem estabelecidas. O camundongo transgênico p16-InkAttac, mantido em fundo C57BL/6, pode apresentar características variáveis em relação a outros camundongos idosos C57BL/6. Também selecionamos doses de drogas com base em nossa experiência e na literatura, mas experimentos adicionais de comparação de drogas e doses senolíticas são necessários para estudos de longevidade e saúde. Os achados aqui fornecidos serão muito úteis para investigações de senescência com agente único e/ou específicas de tecido, que podem incluir tamanhos amostrais maiores e paradigmas de tratamento alterados (por exemplo, estratégias de dosagem de longo prazo ou variáveis) para a investigação de alterações funcionais resultantes de fatores de sinalização específicos. O sexo é cada vez mais e adequadamente reconhecido como uma variável crítica na biologia do envelhecimento. No presente estudo, os dados de fêmeas e machos foram analisados separadamente, o que revelou resultados conservados entre os sexos e específicos de cada sexo. Os níveis de IL-17A foram significativamente maiores em camundongos machos idosos. CA13 e GCG alteraram-se significativamente no plasma de fêmeas idosas, e IL-23R foi significativamente maior tanto no plasma de fêmeas quanto de machos idosos. Curiosamente, esses fatores regulados pela idade foram revertidos por intervenções senolíticas selecionadas.
Nossos resultados sugerem que vários tecidos, e particularmente o rim, têm o potencial de se tornar mediadores endócrinos do envelhecimento por meio da expressão e secreção de Il23r, IL-23R e outros fatores controlados por células senescentes. A cinética de acúmulo, identidade e efeitos das células senescentes e dos perfis SASP são variáveis e heterogêneos. No entanto, genes-chave relacionados à senescência, incluindo p16 e Il23r, identificados pelo acúmulo no rim envelhecido, foram sujeitos a modulação aguda por senolíticos em camundongos envelhecidos. Mapear as origens celulares e os alvos de fatores progerônicos e rejuvenescedores na circulação, incluindo aqueles regulados pela senescência celular, é uma área importante de investigação que se espera avançar por meio de métodos emergentes, incluindo perfilamento de alta dimensão, multiômica em todo o sistema e marcação bioortogonal. Nossas descobertas se baseiam nessas trajetórias e fornecem uma visão fundamental sobre como os senoterapêuticos alteram diferencialmente os fatores circulantes relacionados à idade, os destinos moleculares dos órgãos secretores e o controle agudo sobre biomarcadores relacionados à senescência na velhice.
Métodos
Esta pesquisa está em conformidade com todas as regulamentações éticas, práticas de pesquisa e protocolos experimentais do Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional da Mayo Clinic e do Conselho de Revisão Institucional da Mayo Clinic.
Animais
Os experimentos com camundongos foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional da Mayo Clinic. Camundongos heterozigotos p16-InkAttac (fundo C57BL/6) machos e fêmeas foram usados neste estudo, e características específicas do sexo na idade foram analisadas de forma independente. Os camundongos foram alojados em grupos em gaiolas ventiladas com temperatura constante de 25 °C, umidade de 30–70% e ciclo claro/escuro de 12 horas. Água e a ração 5053 PicoLab Rodent Diet 20 foram fornecidas ad libitum. No momento da coleta de tecidos, os camundongos jovens tinham 3–4 meses de idade e os camundongos idosos tinham 16–20 meses de idade. Os camundongos foram eutanasiados com uma dose letal de pentobarbital. O sangue foi obtido da veia cava inferior com seringas revestidas de EDTA e armazenado em tubos revestidos de EDTA. As amostras de sangue foram centrifugadas (1.300g por 15 min, 4 °C), e as frações de plasma foram separadas e armazenadas a −80 °C. Após a coleta de sangue, os camundongos foram perfundidos transcardialmente com PBS gelado. Todos os camundongos foram examinados quanto à patologia macroscópica e prevalência de tumores, com exclusão de camundongos com esplenomegalia pronunciada. Córtex cerebral, fígado, rim, baço, pulmão e gordura perigonadal foram removidos imediatamente e colocados em TRIzol para análises de expressão gênica.
Tratamento senoterapêutico de camundongos
Para a diluição do fármaco AP20187, uma solução estoque de 12,5 mg ml−1 em etanol 100% foi preparada e armazenada a −20 °C. A solução de trabalho de AP20187 (1 ml; 2 mg kg−1) foi preparada misturando 40 µl da solução estoque com 100 µl de PEG-400 e 860 µl de Tween-20 a 2% em ddH2O. A solução foi vortexada e administrada a camundongos por injeção intraperitoneal (i.p.) dentro de 30 min após a diluição da solução estoque. O veículo correspondente foi composto de etanol, PEG-400 e Tween-20 e foi administrado a animais controle via injeção i.p. Para os compostos senolíticos, um veículo estoque para gavagem oral foi preparado como uma solução de 60% de fosfatidilcolina em propilenoglicol (Phosal 50 PG, Lipoid GmbH), 30% de PEG-400 e 10% de etanol. Os compostos senolíticos foram vortexados recentemente na solução veículo à temperatura ambiente e armazenados a 4 °C durante a semana das injeções. Camundongos p16-InkAttac idosos foram randomizados (com base no peso corporal e idade) para receber veículo ou AP20187 (2 mg kg−1, injeção i.p.), NAV (50 mg kg−1), VEN (50 mg kg−1), FIS (50 mg kg−1) ou LUT (30 mg kg−1) por gavagem oral. Todos os camundongos receberam tratamentos por gavagem e i.p., com os camundongos AP recebendo veículo de gavagem e os grupos de fármacos senolíticos também recebendo veículo via i.p. Camundongos p16-InkAttac controle jovens e idosos (YNG CON, OLD CON) receberam a mesma estratégia de dosagem do veículo (Fig. 3a). NAV (ABT-263, cat. no. 11500) e LUT (3′,4′,5,7-tetraidroxiflavona, cat. no. 10004161) foram adquiridos da Cayman Chemical. VEN (ABT-199, cat. no. A8194) foi adquirido da APExBio Technology. FIS (3,7,3′,4′-tetraidroxiflavona, cat. no. T0121) foi adquirido da TCI America. AP20187 foi adquirido da WuXi AppTec. Todos os outros reagentes, salvo indicação contrária, foram adquiridos da Sigma-Aldrich/Millipore.

Para o estudo focado na expressão gênica e perfil plasmático, os camundongos receberam cinco administrações diárias consecutivas durante 1 semana, 2 semanas de pausa e, em seguida, outro tratamento de 5 dias. Os tratamentos foram interrompidos 1 semana antes da necropsia (Fig. 3a). Tamanhos amostrais de cada grupo senoterapêutico, YNG CON: n = 6 fêmeas/5 machos; OLD CON: n = 6 fêmeas/8 machos; OLD AP: n = 5 fêmeas/8 machos; OLD VEN: n = 5 fêmeas/6 machos; OLD NAV: n = 7 fêmeas/7 machos; OLD FIS: n = 7 fêmeas/7 machos; OLD LUT: n = 7 fêmeas/7 machos. Para o estudo farmacocinético de acúmulo/eliminação do fármaco no tecido, camundongos de 18 meses de idade foram tratados uma vez ao dia com 2 mg kg−1 de AP (i.p.), 50 mg kg−1 de VEN (gavagem oral) ou veículo controle por 4 dias. Os camundongos foram eutanasiados 20 min, 2 h, 6 h ou 72 h após o quarto e último tratamento, perfundidos com PBS gelado, e os tecidos coletados foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido. Tamanhos amostrais de cada grupo farmacocinético de acordo com o tempo de coleta pós-injeção: veículo (20 min): duas fêmeas, dois machos; AP (20 min): duas fêmeas, dois machos; AP (2 h): duas fêmeas, dois machos; AP (6 h): quatro fêmeas; AP (3 dias): duas fêmeas, um macho; VEN (20 min): duas fêmeas, dois machos; VEN (2 h): duas fêmeas, dois machos; VEN (6 h): uma fêmea, um macho; VEN (3 dias): duas fêmeas, dois machos.
Amostras de tecido coletadas na necropsia foram armazenadas imediatamente em reagente TRIzol. O RNA foi isolado por precipitação com clorofórmio–isopropanol baseada em TRIzol, seguida de análise de concentração e pureza por nanodrop. Para todos os tecidos, 2 µg de RNA total foram utilizados para síntese de cDNA por transcrição reversa com M-MLV (Invitrogen, cat. no. 18091200). A RT-PCR foi realizada em um sistema QuantStudio5 RT-PCR (ThermoFisher) com PerfeCTa FastMix II Low ROX (Quantabio) e ensaios de qPCR Taqman PrimeTime da Integrated DNA Technologies (Tabela Suplementar 4). O software Quantstudio 5 Design and Analysis v.1.5.2 foi utilizado para coleta de dados dos valores de CT da PCR. Os genes experimentais foram normalizados pela expressão dos genes de referência Hprt ou Tbp. A expressão gênica relativa em comparação ao grupo controle jovem foi derivada do valor 2−ΔΔCT para cada amostra de tecido. Em estudos envolvendo análises de RT-PCR em tecidos jovens versus velhos, relatamos os valores de CT além dos resultados de expressão relativa (Figura de Dados Estendidos 1). Em comparações sistêmicas entre vários tratamentos farmacológicos, consideramos muito informativo examinar tanto a expressão relativa quanto a abundância total dos transcritos (valores de CT) de acordo com o tecido de origem e a idade. A comparação qualitativa da abundância total é viável, pois o cDNA foi sintetizado a partir da mesma quantidade de RNA de entrada por amostra de tecido (2 µg).
Hibridização in situ
Rins foram coletados de camundongos de 4 meses e 24 meses de idade, fixados em paraformaldeído a 4% por 24 h, embebidos em parafina e seccionados a 5 μm. O ensaio multiplex fluorescente RNAscope (ACD-Bio/Bio-Techne) foi realizado em tecido FFPE (fixado em formalina, embebido em parafina), de acordo com as especificações e protocolos do fabricante. A sonda Cdkn2a/p16ink4a (cat. no. 447491, Mm-Cdkn2a-tv2) foi usada no canal 1 e pareada com o fluoróforo TSA Vivid 520 (cat. no. 323271). Il23r (cat. no. 403751-C2, Mm-Il23r-C2) foi usada no canal 2 e pareada com o fluoróforo TSA Vivid 570 (cat. no. 323272). Cd3e (cat. no. 314721-C3, Mm-Cd3e-C3) foi usada no canal 3 e pareada com TSA Vivid 650 (cat. no. 323273). A sonda de controle negativo DapB (cat. no. 320871) foi usada em cortes paralelos como controle. Os fluoróforos TSA Vivid foram reconstituídos em 100 μl de dimetilsulfóxido e diluídos com TSA Buffer na concentração de 1:1.000. Os tecidos foram tratados com TrueBlackPlus (1× em PBS, Biotium) por 10 min antes da adição de Vectashield e lamínula. Os cortes foram imageados com um microscópio invertido Nikon Ti2 Eclipse com objetivas Plan Apo de ×10, ×20 e ×40, fonte de luz Spectra III de oito canais e usando a câmera sCMOS Orca Fusion BT com o software Nikon Elements AR; linhas de laser de 405, 488, 561 e 647 foram usadas com tempo de exposição de imagem de 100–200 ms por canal no modo de leitura de 16 bits.
Análise de proteínas plasmáticas de camundongos
O painel exploratório Olink Target 96 Mouse foi utilizado para analisar 92 biomarcadores proteicos do plasma de camundongos por PEA. Pares de anticorpos específicos para o alvo são ligados a oligonucleotídeos de DNA e, ao se ligarem à proteína alvo, os anticorpos são aproximados e os oligonucleotídeos hibridizam, permitindo a amplificação com quantificação do sinal. Os valores de CT das proteínas foram normalizados em escala log2, denominados expressão proteica normalizada (NPX). Um total de 67 proteínas foram analisadas e relatadas. 25 proteínas foram excluídas das comparações relacionadas à idade e senolíticas devido à baixa ou ausência de detecção. Foi utilizado 1 µl de plasma para PEA por amostra.
Análise de proteínas do plasma humano
As análises do plasma humano foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional da Mayo Clinic. Amostras de plasma humano arquivadas do Biobanco da Mayo Clinic foram utilizadas neste estudo. Todos os participantes do estudo forneceram consentimento informado por escrito no momento da coleta das amostras. As amostras corresponderam a 40 mulheres e 40 homens com idades entre 20 e 90 anos. Foram excluídos participantes com histórico de câncer, exceto câncer de mama e melanoma, antes dos 50 anos de idade, ou doenças autoimunes (por exemplo, artrite reumatoide, lúpus), e mulheres com índice de massa corporal (IMC) inferior a 18,5 kg m−2 ou superior a 40,0 kg m−2 e homens com IMC inferior a 18,5 kg m−2 ou superior a 38,0 kg m−2. Um participante do sexo masculino foi excluído como outlier com base no IMC pelo teste de outlier de Grubbs. O sangue em EDTA foi coletado e processado imediatamente em plasma pobre em plaquetas, e alíquotas foram congeladas a −80 °C até o uso. O plasma pobre em plaquetas com EDTA (1 ml) foi descongelado no gelo e centrifugado a 15.000 g, 4 °C por 5 min para remover partículas insolúveis. Os sobrenadantes foram transferidos para um tubo limpo novo, homogeneizados e realiquotados em alíquotas menores para uso a cada dia, a fim de evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, e essas alíquotas foram mantidas a −80 °C. Utilizamos o Kit de Reagentes Acessórios para ELISA (cat. no. DY008B, R&D Systems/Bio-Techne) e o par de anticorpos do Human IL-23R DuoSet ELISA (cat. no. DY1400-05, R&D Systems/Bio-Techne) para o desenvolvimento de um protocolo de ELISA com desempenho viável para quantificar a quantidade de IL-23R solúvel no plasma em EDTA. Acessamos a condição ideal para faixa linear, exatidão, precisão e paralelismo. Os experimentos foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante, exceto pelo tampão de bloqueio (BSA 2%, EDTA 4 mM em PBS) e diluente de amostra/padrão (BSA 1%, EDTA 4 mM, em PBS). A faixa linear foi de 94-6000 pg ml−1, e a recuperação variou de 80% a 105%. A densidade óptica foi lida usando iD3 Spectramax (Molecular Devices) e a regressão não linear de cinco parâmetros foi usada para gerar a curva padrão e interpolar os resultados usando o Software SoftMax Pro v.6.1 (Molecular Devices).
Cultura de células MEF e confirmação de senescência
Um modelo de cultura de fibroblastos foi utilizado para validar marcadores característicos da senescência. Fibroblastos de embriões de dia 13,5 foram coletados de camundongos C57BL/6 e cultivados em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) até a passagem 4 (P4). Células P4 foram plaqueadas em placas de seis poços ou frascos T75. A 40% de confluência, as células foram submetidas a condições simuladas (sham) ou irradiadas a 10 Gy (RadSource Technologies RS 2000). As células foram coletadas 24 h após o tratamento simulado ou 10 dias após a irradiação. 24 h antes da coleta ou fixação, o meio de cultura foi substituído por meio sem FBS. O meio condicionado foi coletado dos frascos T75, filtrado em 0,2 µm e congelado rapidamente a −80 °C. As células foram tripsinizadas, ressuspendidas em 1 ml de TRIzol e congeladas rapidamente a −80 °C antes do processamento para RT-PCR. Para a coloração de SA-β-gal, as células em placas de seis poços foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 10 min, lavadas com PBS e coradas com solução contendo tampão de ácido cítrico/Na₂HPO₄ 40 mM a pH 6,0, ferrocianeto de potássio 5 mM, ferricianeto de potássio 5 mM, NaCl₂ 150 mM, MgCl₂ 2 mM e 1 mg ml⁻¹ (25 mM) de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo (VWR) em água. As células foram coradas por 27,5 h a 37 °C com agitação suave. As células foram lavadas com PBS e contracoradas com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a 1 µg ml⁻¹ para colocalização nuclear. As imagens foram adquiridas com fluorescência de 405 nm e campo claro em um microscópio invertido Eclipse Ti (Nikon Instruments) para visualização do composto cromogênico convertido por SA-β-gal. O fluxo de trabalho de classificação de pixels do iLastik v.1.4.0 foi usado para criar uma máscara binária das imagens de campo claro. Regiões não coradas e regiões coradas com SA-β-Gal foram adicionadas manualmente para treinamento, com uma imagem por poço para ambos os grupos sham e IR incluídas no conjunto de treinamento. O classificador resultante foi então executado em todo o conjunto de imagens, produzindo máscaras binárias. O CellProfiler v.4.2.5 foi usado para quantificar e descrever as células e as regiões coradas com SA-β-Gal dentro de cada imagem. Arquivos Tiff da coloração DAPI foram usados para as células e os arquivos tiff produzidos pelo iLastik foram usados para SA-β-Gal. As imagens DAPI foram processadas pelo módulo ColorToGray para gerar uma imagem em escala de cinza, após o que tanto a imagem em escala de cinza DAPI quanto as imagens binárias SA-β-Gal do iLastik foram processadas pelos seguintes módulos (com configurações distintas): IdentifyPrimaryObjects, MeasureObjectSizeShape, OverlayOutlines, SaveImages e ExportToSpreadsheet. Os objetos identificados em IdentifyPrimaryObjects foram sobrepostos às imagens e salvos para revisão. Todas as medições foram exportadas para arquivos *.csv e utilizadas para quantificação.
Para o preparo celular, o meio condicionado foi aspirado das células cultivadas em frascos T75 e a monocamada celular foi lavada uma vez com 5 ml de PBS 1×; foram adicionados 2 ml de TrypLE (Gibco) por 4 min à temperatura ambiente, após o que os frascos foram batidos três vezes contra a bancada para desprender todas as células, e o TrypLE foi neutralizado com 5 ml de meio MEF. A suspensão celular foi pipetada sobre o frasco três vezes, transferida para um tubo de 15 ml, centrifugada a 188 g por 5 min a 22 °C, o sobrenadante foi aspirado, o pellet ressuspendido em 1 ml de Trizol, a solução foi transferida para um tubo de 1,5 ml e armazenada a −80 °C. A extração de RNA foi então realizada conforme descrito acima.
O meio condicionado de células sham e IR foi utilizado para ELISAs sanduíche multiplexados usando a plataforma Luminex (Bio-Techne). Anticorpos específicos para cada analito foram pré-revestidos em esferas magnéticas incorporadas com fluoróforos. Micropartículas, padrões e amostras de meio foram pipetados nos poços e os analitos de interesse foram ligados pelos anticorpos imobilizados. Após a lavagem do material não ligado, uma mistura de anticorpos biotinilados foi adicionada a cada poço. Após outra etapa de lavagem, o conjugado Estreptavidina-PE foi adicionado. Após uma lavagem final, as micropartículas foram ressuspendidas em tampão e lidas usando o Intelliflex xMAP para capturar magneticamente as esferas e ler os sinais de fluoróforos exclusivos de cada analito. O meio condicionado, com as amostras processadas em duplicata, também foi testado com o ensaio Olink PEA Target 96 Mouse Exploratory panel. Para as medições de PCR e analitos do meio condicionado, foram utilizadas seis amostras de sham e seis de experimentos irradiados.
Teste de medicamentos senolíticos em fibroblastos pulmonares senescentes
Fibroblastos pulmonares humanos primários foram adquiridos da ScienCell e cultivados em EMEM contendo 10% de SBF. A senescência foi induzida tratando as células com 20 µM de etoposídeo por 48 h, seguido de 6 dias em meio de cultura normal, conforme realizado anteriormente. Células proliferativas e senescentes foram então plaqueadas em placas de 96 poços e deixadas aderir. Após 6 h, o meio foi trocado para EMEM contendo 0% de SBF e a concentração indicada do composto foi adicionada. Após 72 h, as células foram fixadas com formalina a 4%, permeabilizadas com Triton X-100 a 0,25%, bloqueadas com BSA a 1% e imunomarcadas com um anticorpo para caspase-3 clivada (Cell Signaling, cat. no. 9661, RRID:AB_2341188, diluição 1:500). O anticorpo secundário anti-coelho Alexa Fluor-488 (ThermoFisher, cat. no. A-11008, RRID:AB_143165, diluição 1:1.000) foi incubado juntamente com DAPI. As imagens foram coletadas usando um microscópio automatizado Cytation5 (Biotek) com objetiva de ×4 e a intensidade de caspase-3 clivada foi quantificada usando o software integrado (Gen5). Para validar a detecção de apoptose, alternativamente, fibroblastos pulmonares humanos primários senescentes induzidos por etoposídeo foram cultivados por 24 h com 1 µM de estaurosporina para induzir apoptose e determinar o teto de atividade da caspase-3 clivada (Fig. Suplementar 4). As células foram fixadas e imunomarcadas para caspase-3 clivada e DAPI, com quatro amostras coletadas por grupo. A variação percentual na intensidade da caspase-3 clivada foi normalizada para a maior resposta, e as curvas de concentração-resposta foram ajustadas pela curva de Hill.

Análises farmacocinéticas
A quantificação de AP e VEN em plasma de camundongo, rim, fígado, cérebro e músculo foi realizada em um Sciex 6500 MS/MS interfaciado com um sistema de cromatografia líquida Sciex ExionLC 2.0. Amostras de plasma foram extraídas e as proteínas foram precipitadas misturando-se com três vezes v:v acetonitrila contendo carbamazepina como padrão interno. As amostras foram deixadas em gelo por aproximadamente 30 min com agitação ocasional antes da filtração através de uma placa de filtro de 0,2 µm. Os padrões foram preparados adicionando-se padrões de AP e VEN em plasma branco e processados usando o mesmo procedimento das amostras. Amostras de rim, fígado, cérebro e músculo foram diluídas três vezes (p:v) com PBS e dissociadas com um sonicador de ponta de sonda. Os homogenatos foram processados de forma similar às amostras de plasma. O VEN foi detectado em modo de íons positivos seguindo o íon parental 868,3 e o íon fragmento 636,2, e o AP utilizou o íon parental 742 e o íon fragmento 209,2.

Estatística e reprodutibilidade
Descrevemos uma abordagem estatística gradual para avaliar alterações dependentes da idade e do tratamento em proteínas plasmáticas e expressão gênica tecidual no Texto Suplementar e na Fig. Suplementar 1. Os dados não foram assumidos como normalmente distribuídos e testes não paramétricos foram usados para serem tão rigorosos quanto possível. Resumidamente, para a triagem inicial de plasma, testes de soma de postos de Kruskal–Wallis bicaudais foram usados para determinar diferenças entre grupos para qualquer uma das proteínas, separadamente para cada sexo. Apenas as proteínas nas quais há um valor de P geral do grupo < 0,10 foram selecionadas para testar a reversão pelo tratamento senoterapêutico. Realizamos então um teste bicaudal comparando cada grupo tratado de camundongos velhos (OLD AP, OLD VEN, OLD NAV, OLD FIS e OLD LUT) com OLD VEH, com significância definida em valor de P < 0,05 (Dados Fonte Figs. 1 e 3). Genes de RT-PCR com efeito de grupo etário no nível de significância P < 0,05 foram identificados para avaliação adicional. Para genes com uma diferença geral de grupo de P < 0,05, comparações bicaudais foram feitas entre o grupo velho tratado com fármaco e o grupo velho veículo para cada tipo de tecido. Os valores de P foram ajustados usando a correção de Dunnett para levar em conta comparações múltiplas em relação ao grupo OLD VEH. Correlações entre dados de RT-PCR e proteínas plasmáticas foram investigadas usando correlações de Spearman e a significância foi determinada com o critério P < 0,05. Os tamanhos amostrais foram determinados de acordo com os padrões atuais usados para camundongos em biologia experimental, com base no número mínimo de camundongos necessário para detectar significância com um alfa definido em 0,05 em teste bicaudal em um experimento com poder padrão. Os tamanhos amostrais foram de cinco a oito camundongos por grupo. A coleta e análise de dados dos camundongos foram realizadas pelo experimentador cego para as condições dos experimentos. GraphPad Prism v.9 e R v.4.1.2 foram usados para análises estatísticas.
Para expressão gênica de MEFs cultivadas ou medição de proteínas de seu meio condicionado, comparações foram feitas entre controle sham e amostras irradiadas usando teste de Mann–Whitney com significância em P < 0,05, ajustado para comparações múltiplas com o método de Holm–Sidak; n = 6 amostras por grupo.
Dados de IL-23R em plasma humano foram primeiro testados quanto à normalidade pelos testes de Shapiro–Wilk e Kolmogorov–Smirnov. Tanto os dados masculinos quanto femininos foram considerados normalmente distribuídos e melhor ajustados pela regressão linear de Pearson com valores de correlação R determinados.
Resumo do relatório
Mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Nature Portfolio Reporting Summary vinculado a este artigo.
Informações complementares
Dados originais
Dados estendidos
Valores de ciclo limiar da expressão gênica por RT-PCR em tecidos jovens (Y) e velhos (O) de camundongos fêmeas (rosa) e machos (azul).
O número máximo de ciclos para cada experimento foi 40. n = 11 Y KID, 14 O KID, 11 Y LIV, 14 O LIV, 11 Y SPLN, 14 O SPLN, 11 Y LNG, 14 O LNG, 11 Y FAT, 14 O FAT, 11 Y CTX, 14 O CTX. As barras resumem a média ± e.p.m.
Correlação entre expressão gênica tecidual e senescência de proteínas plasmáticas em camundongos jovens e idosos.
Correlações de Spearman entre a expressão gênica tecidual de fatores de senescência em camundongos jovens e idosos (A, B) rim, (C, D) fígado, (E, F) baço e (G, H) adiposo perigonadal, e as proteínas plasmáticas CA13, CCL2, CCL3, CCL5, CCN1, IL17A, IL23R e MIA para (A, C, E, G) fêmeas e (B, D, F, H) machos. Os valores de R são fornecidos, e os valores de p podem ser encontrados nos dados de origem. Tamanhos amostrais por grupo: fêmeas jovens n = 6; fêmeas idosas n = 6; machos jovens n = 5; machos idosos n = 8.

Dados de origem

Hibridização in situ (RNAscope) de células Il23r+ co-localizadas com p16ink4a e Cd3e no seio renal e áreas perivasculares do rim envelhecido de camundongo.
(A) Imagens representativas de p16ink4a (verde) e Il23r (vermelho) no tecido perivascular do rim envelhecido de C57BL/6 (21 meses de idade). A cor azul é um canal aberto para contraste da arquitetura tecidual. (B) RNAscope de p16ink4a (verde), Il23r (vermelho) e Cd3e (ciano) de tecido renal de camundongos jovens (topo, 2 meses) e idosos (fundo, 24 meses) em background p16-InkAttac. A coloração nuclear DAPI é representada em azul escuro. O rim idoso exibe nós imunes densos e perivasculares Cd3e + Il23r+. (C–F) Tecido renal jovem e (G–J) tecido renal idoso do RNAscope, semelhante ao mostrado em B. (C, D, G, H) O tecido intersticial e perivascular exibe co-localização de Cd3e, Il23r e p16ink4a no rim idoso, mas não no jovem. (E, I) Glomérulos envelhecidos mostram a presença de células Cd3e + Il23r+. (F, J) O tecido conjuntivo mostra acúmulo denso de células Cd3e+ tanto no rim jovem quanto no idoso, mas apenas o tecido idoso exibe co-localização com Il23r e p16ink4a. Todas as barras de escala = 100 μm. Os experimentos foram repetidos em 2 réplicas biológicas de camundongos jovens e 4 réplicas de camundongos idosos.
Genes associados à senescência e à idade, incluindo Il23r, são expressos em fibroblastos senescentes in vitro.
(A) Imagens representativas em 10x da coloração de β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) em fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) sham e irradiados (IR). Os painéis esquerdos são imagens de campo claro, os painéis direitos são imagens fluorescentes DAPI do mesmo campo de visão. Os experimentos foram repetidos em (B, C) São mostradas as quantificações para (B) porcentagem e (C) número total de células SA-β-gal por campo de imagem. (D) Quantificação da área nuclear em células sham e irradiadas conforme representado em A. Para B-D, as barras indicam média ± e.p.m., valores de p fornecidos vs. sham pelo teste U de Mann-Whitney bicaudal, com correção de Holm-Sidak para comparações múltiplas. n = 12 sham, n = 12 IR. (E) Expressão gênica por RT-PCR de marcadores associados à senescência e idade em MEFs sham (círculos azuis abertos) e irradiados (triângulo laranja sólido). Os valores são expressão relativa ao controle sham. (F) Concentrações de proteínas relacionadas à senescência em meio condicionado (MEF CM) medidas em pg/mL com ensaio multiplex Luminex. (G) Expressão proteica normalizada (NPX) de proteínas relacionadas à senescência em meio condicionado medida com ensaio Olink PEA. O inserto mostra os valores de IL-23R reescalonados. Para E-G, as barras indicam média ± e.p.m., * p < 0,05 vs. sham pelo teste U de Mann-Whitney bicaudal, com correção de Holm-Sidak para comparações múltiplas dos dados. n = 6 amostras por grupo.

Compostos senolíticos apresentam seletividade, potência e eficácia diferenciais na apoptose de células senescentes in vitro.
A atividade de caspase-3 clivada foi medida em fibroblastos pulmonares humanos primários proliferativos ou senescentes induzidos por etoposídeo. (A–D) Curvas dose-resposta para a variação percentual na intensidade de caspase-3 clivada em células senescentes (losangos vermelhos) ou proliferativas (círculos brancos) após incubação (3 dias) com compostos senolíticos (A) VEN, (B) NAV, (C) FIS ou (D) LUT. (E) Fibroblastos senescentes induzidos por etoposídeo ou (F) fibroblastos proliferativos curvas dose-resposta da intensidade de caspase clivada normalizada pela aplicação dos compostos VEN (círculos verdes), NAV (quadrados roxos), FIS (triângulos laranja) ou LUT (triângulos azuis para baixo). Os símbolos denotam média ± e.p.m., n = 4 amostras por grupo.

Dados de origem

Expressão do gene p16 em fígado, pulmão ou tecido adiposo perigonadal envelhecido em resposta ao direcionamento transgênico ou farmacológico de curto prazo de células senescentes.
RT-PCR foi utilizado para avaliar a expressão do gene p16 entre camundongos controle idosos (OLD CON) e tratados com fármacos senolíticos, no (A–D) fígado, (E–H) pulmão e (I–L) tecido adiposo perigonadal. (A, C, E, G, I, K) Os grupos femininos são mostrados em rosa, e (B, D, F, H, J, L) os machos são mostrados em azul. YNG CON versus OLD CON refletem as estatísticas fornecidas na Fig. 2 com valores de p exatos fornecidos. Testes de Kruskal-Wallis com correção para comparações múltiplas foram utilizados para comparação dos grupos de tratamento idosos com OLD CON. As barras resumem os valores medianos dos grupos. Tamanhos amostrais por grupo, YNG CON fêmea n = 6; OLD CON fêmea n = 6; OLD AP fêmea n = 5; OLD VEN fêmea n = 5; OLD NAV fêmea n = 7; OLD FIS fêmea n = 7; OLD LUT fêmea n = 7; YNG CON macho n = 5; OLD CON macho n = 8; OLD AP macho n = 8; OLD VEN macho n = 6; OLD NAV macho n = 7; OLD FIS macho n = 7; OLD LUT macho n = 7.

Expressão do gene p21 em tecidos envelhecidos em resposta ao direcionamento transgênico ou farmacológico de curto prazo de células senescentes.

RT-PCR foi utilizado para avaliar a expressão do gene p21 entre camundongos controle idosos (OLD CON) e tratados com fármacos senolíticos, no (A, B) rim, (C, D) fígado, (E, F) baço, (G, H) pulmão, (I, J) tecido adiposo perigonadal e (K, L) córtex. (A, C, E, G, I, K). Os grupos femininos são mostrados em rosa, e (B, D, F, H, J, L) os machos são mostrados em azul. YNG CON versus OLD CON refletem as estatísticas fornecidas na Fig. 2 com valores de p exatos fornecidos. Testes de Kruskal-Wallis com correção para comparações múltiplas foram utilizados para comparação dos grupos de tratamento idosos com OLD CON. Relatamos * p < 0,05 bicaudal, com base em nossa hipótese de que cada tratamento reverteria os níveis de cada fator associado à idade para níveis mais próximos dos juvenis. As barras resumem os valores medianos dos grupos. Tamanhos amostrais por grupo, YNG CON fêmea n = 6; OLD CON fêmea n = 6; OLD AP fêmea n = 5; OLD VEN fêmea n = 5; OLD NAV fêmea n = 7; OLD FIS fêmea n = 7; OLD LUT fêmea n = 7; YNG CON macho n = 5; OLD CON macho n = 8; OLD AP macho n = 8; OLD VEN macho n = 6; OLD NAV macho n = 7; OLD FIS macho n = 7; OLD LUT macho n = 7.

Nota do editor Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Dados estendidos
estão disponíveis para este artigo em 10.1038/s43587-024-00752-7.

Informações suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s43587-024-00752-7.
M.J.S., C.M.C. e S.L.R. conceberam e desenharam o estudo. A.J.H. e N.K.L. contribuíram para o desenho do estudo. D.J.B. e K.B.J. forneceram o protocolo de fibroblastos embrionários de camundongo e aconselhamento em sua aplicação. M.J.S., C.M.C. e S.L.R. gerenciaram as colônias de camundongos envelhecidos, realizaram tratamentos nos animais e coletaram e processaram tecidos animais. C.M.C., N.C.A., A.J.D. e M.J.S. analisaram dados e geraram figuras. E.J.A. realizou modelagem estatística e análise de dados. A.J.D. e N.C.A. realizaram experimentos in vitro com fibroblastos embrionários de camundongo. P.T.G. e E.A.L. forneceram assistência técnica nos experimentos. T.M.K. realizou e forneceu financiamento para os experimentos e análises farmacocinéticas. A.J.H. e M.G.W. conduziram testes comparativos de drogas senolíticas in vitro. J.M.E.-N. e C.M.C. analisaram amostras de plasma humano. M.J.S. forneceu financiamento para o estudo. C.M.C. e M.J.S. redigiram o artigo. Todos os autores revisaram e aprovaram o artigo.

Revisão por pares
Informações sobre revisão por pares
A Nature Aging agradece a Nathan Basisty e ao(s) outro(s) revisor(es) anônimo(s) por sua contribuição à revisão por pares deste trabalho.

Disponibilidade de dados
As contribuições originais apresentadas no estudo estão incluídas no artigo e nas Informações Suplementares. Os dados farmacocinéticos de AP20187 e venetoclax estão incluídos na Tabela Suplementar 1. Os valores de análise de componentes principais para expressão gênica combinada do rim e proteína plasmática estão incluídos na Tabela Suplementar 2 e também mostrados na Fig. Suplementar 3. Todos os ensaios de iniciadores usados para RT-PCR estão incluídos na Tabela Suplementar 4. Todos os dados que suportam as descobertas deste estudo também estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação. Os dados de origem estão incluídos neste artigo.

Disponibilidade de código
O código R usado para análise estatística de proteína plasmática e expressão gênica nas Figs. 1–6 está disponível publicamente via Code Ocean em 10.24433/CO.4129341.v1 (ref. ) e detalhes de seu uso estão incluídos nas Informações Suplementares. Os softwares iLastik e CellProfiler são de código aberto, bem documentados e disponíveis ao público.

Interesses concorrentes
M.J.S., C.M.C., A.J.H., E.J.A., N.K.L. e a Mayo Clinic possuem propriedade intelectual relacionada a esta pesquisa. Esta pesquisa foi revisada pelo Conselho de Revisão de Conflitos de Interesse da Mayo Clinic e foi conduzida em conformidade com as políticas de Conflitos de Interesse da Mayo Clinic. D.J.B. tem um potencial interesse financeiro relacionado a esta pesquisa. Ele é co-inventor de patentes detidas pela Mayo Clinic, pedidos de patente licenciados para ou depositados pela Unity Biotechnology, e acionista da Unity Biotechnology. A pesquisa no laboratório Baker foi revisada pelo Conselho de Revisão de Conflitos de Interesse da Mayo Clinic e está sendo conduzida em conformidade com as políticas de Conflitos de Interesse da Mayo Clinic. Os outros autores declaram não ter interesses concorrentes.

Referências
O supressor tumoral p16Ink4a regula a sobrevivência de linfócitos T
Um sistema imunológico envelhecido impulsiona a senescência e o envelhecimento de órgãos sólidos
Células espumosas íntimas senescentes são prejudiciais em todos os estágios da aterosclerose
O tratamento senolítico crônico alivia a disfunção vasomotora estabelecida em camundongos idosos ou ateroscleróticos
Senescência celular: implicações para doenças metabólicas
A senescência celular medeia a doença pulmonar fibrótica
O papel da senescência celular no envelhecimento e nas doenças endócrinas
A terapia senolítica ameniza a fibrose renal após lesão renal aguda ao aliviar a senescência renal
A senescência celular impulsiona a esteatose hepática dependente da idade
Caracterização da senescência celular no músculo esquelético envelhecido
A eliminação de células gliais senescentes previne a patologia dependente de tau e o declínio cognitivo
Rejuvenescimento do panorama de células imunes do cérebro envelhecido em camundongos através da eliminação de células senescentes positivas para p16
O microambiente sistêmico do envelhecimento regula negativamente a neurogênese e a função cognitiva
A parabipse heterocrônica regula a extensão da senescência celular em múltiplos tecidos
A expressão de Ink4a/Arf é um biomarcador de envelhecimento
Fenótipos secretores associados à senescência revelam funções não autônomas celulares do RAS oncogênico e do supressor tumoral p53
O fenótipo secretor associado à senescência: o lado sombrio da supressão tumoral
O calcanhar de Aquiles das células senescentes: do transcriptoma aos fármacos senolíticos
Um atlas proteômico de secretomas associados à senescência para o desenvolvimento de biomarcadores de envelhecimento
O secretoma associado à senescência como um indicador de idade e risco médico
A p21 produz um secretoma bioativo que coloca células estressadas sob imunovigilância
Indução sistêmica de senescência em camundongos jovens após uma única troca sanguínea heterocrônica
Marcas moleculares da parabipse heterocrônica em resolução de célula única
A eliminação de células senescentes positivas para p16Ink4a retarda os distúrbios associados ao envelhecimento
Visar células senescentes melhora a adipogênese e a função metabólica na velhice
Células naturalmente ocorrentes positivas para p16(Ink4a) encurtam a vida útil saudável
Carver, C. M. et al. Microglias senescentes e associadas a doenças são características modificáveis da substância branca cerebral envelhecida. Preprint em Research Square10.21203/rs.3.rs-3467812/v1 (2023).
A senólise local em camundongos idosos apenas replica parcialmente os benefícios da senólise sistêmica
Senolíticos melhoram a função física e aumentam a longevidade na velhice
Descoberta de um inibidor de pequena molécula biodisponível por via oral de proteínas pró-sobrevivência do linfoma de células B 2
ABT-199, um inibidor potente e seletivo de BCL-2, alcança atividade antitumoral enquanto poupa plaquetas
Flavonoides como inibidores da CD38 humana
Fisetina é um senoterapêutico que prolonga a saúde e a longevidade
Uma estratégia de farmacologia de rede para investigar o mecanismo anti-inflamatório da luteolina combinada com transcriptômica e proteômica in vitro
A superexpressão de BCL2A1a em células-tronco e progenitoras hematopoiéticas murinas diminui a apoptose e resulta em transformação hematopoiética
BCL-2: longo e tortuoso caminho da descoberta ao alvo terapêutico
Assinaturas transcricionais do envelhecimento
Caracterização da CA XIII, um novo membro da família das isoenzimas da anidrase carbônica
Redes inflamatórias durante a senescência celular: causas e consequências
Eixo CCL5/CCR5 em doenças humanas e tratamentos relacionados
Interleucina-23, em vez de interleucina-12, é a citocina crítica para a inflamação autoimune do cérebro
Interleucina-23: uma citocina chave em doenças inflamatórias
IL-23 e doença Th17 na artrite inflamatória
Ultrapassando os limites: IL-23 e seu papel na ligação entre inflamação da pele, intestino e articulações
Células Th17: de precursoras a participantes na inflamação e infecção
O eixo imune IL-23–IL-17: dos mecanismos ao teste terapêutico
O equilíbrio Th17/Treg é perturbado durante o envelhecimento
Caracterização de células T auxiliares produtoras de IL-17 semelhantes a células T autorreativas em camundongos idosos
A regulação positiva dependente do envelhecimento da expressão do gene IL-23p19 em células dendríticas está associada à ligação diferencial de fatores de transcrição e modificações de histonas
IL-23 remodela o metabolismo das células residentes nos rins e promove inflamação renal local
Um antagonista solúvel natural da IL-23 humana inibe o desenvolvimento e a função in vitro das células Th17 humanas
Melhora clínica e histopatológica da encefalomielite autoimune experimental por vetores AAV que expressam um receptor solúvel de interleucina-23
Os receptores de interleucina 23 humanos e murinos são novos substratos para as desintegrinas e metaloproteases ADAM10 e ADAM17
Interleucina 17 e células senescentes regulam a resposta a corpo estranho a implantes de materiais sintéticos em camundongos e humanos
IL-17 e senescência induzida imunologicamente regulam a resposta à lesão na osteoartrite
A sinalização de células T senescentes associada à idade promove imunidade tipo 3 que inibe a resposta regenerativa de biomateriais
Eliminação direcionada de células beta senescentes previne o diabetes tipo 1
Atividade anti-inflamatória da fisetina em mastócitos humanos (HMC-1)
Venetoclax confere padrões distintos de sensibilidade à morte celular e adaptabilidade em células T
Dois polifenóis dietéticos, fisetina e luteolina, reduzem a inflamação, mas aumentam a toxicidade induzida por danos ao DNA em células RPE humanas
Um novo conjunto de genes identifica células senescentes e prevê vias associadas à senescência em diferentes tecidos
A proteína matricelular CCN1 ativa um programa genético pró-inflamatório em macrófagos murinos
A proteína matricelular CCN1 induz a senescência de fibroblastos e restringe a fibrose na cicatrização de feridas cutâneas
O inibidor de quinase dependente de ciclina p21 controla a expansão de células-tronco neurais adultas regulando a expressão do gene Sox2
A repressão transcricional de Bmp2 por p21(Waf1/Cip1) liga a quiescência à manutenção de células-tronco neurais
A luteolina reduz as patologias da doença de Alzheimer induzidas por lesão cerebral traumática
Um efeito bystander de células senescentes: senescência induzida por senescência
Um programa secretor complexo orquestrado pelo inflamassoma controla a senescência parácrina
A sinalização Notch medeia a senescência secundária
O Biobanco da Mayo Clinic: um bloco de construção para a medicina individualizada
ilastik: aprendizado de máquina interativo para análise de imagens (bio)
CellProfiler 4: melhorias em velocidade, utilidade e usabilidade
Inibição de pequena molécula inovadora da ativação de IKK/NF-κB reduz marcadores de senescência e melhora a longevidade saudável em modelos de camundongos de envelhecimento
Atkinson, E. J. & Carver, C. M. IL23R é um biomarcador circulante e tecidual de envelhecimento ligado à senescência. Code Ocean10.24433/CO.4129341.v1 (2021).