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pmid: "40894771"
title: "O tratamento senolítico com fisetina reverte a disfunção endotelial relacionada à idade parcialmente mediada pelo fator SASP CXCL12."
authors: "Mahoney SA, Mazan-Mamczarz K, Tsitsipatis D, VanDongen NS, Henry-Smith C, Okereke AN, Munk R, Darvish S, Murray KO, De S, Gorospe M, Seals DR, Rossman MJ, Herman AB, Clayton ZS"
journal: "bioRxiv : the preprint server for biology"
pubdate: "2025 Aug 18"
doi: "10.1101/2025.08.13.670216"
source: "PMC Full Text"

O tratamento senolítico com fisetina reverte a disfunção endotelial relacionada à idade parcialmente mediada pelo fator SASP CXCL12.

Autores

Mahoney SA, Mazan-Mamczarz K, Tsitsipatis D, VanDongen NS, Henry-Smith C, Okereke AN, Munk R, Darvish S, Murray KO, De S, Gorospe M, Seals DR, Rossman MJ, Herman AB, Clayton ZS

Periodico

bioRxiv : the preprint server for biology (2025 Aug 18)

Conteudo

Tratamento senolítico com fisetina reverte a disfunção endotelial relacionada à idade parcialmente mediada pelo fator SASP CXCL12

Background:
O avanço da idade é o fator de risco mais forte para doenças cardiovasculares (DCVs), principalmente devido à disfunção endotelial vascular progressiva. A senescência celular e o fenótipo secretor associado à senescência (SASP) contribuem para a disfunção endotelial relacionada à idade ao promover estresse oxidativo mitocondrial e inflamação, que reduzem a biodisponibilidade do óxido nítrico (NO). No entanto, as alterações moleculares nas células endoteliais senescentes e seu papel na disfunção endotelial com o envelhecimento permanecem incompletamente esclarecidos. Dessa forma, neste estudo buscamos identificar as vias de sinalização relacionadas à senescência das células endoteliais, os fatores SASP derivados do endotélio e seu impacto na função endotelial com o envelhecimento.

Methods:
A transcriptômica de célula única foi realizada em aortas de camundongos jovens (6 meses) e velhos (27 meses) com e sem tratamento senolítico in vivo com fisetina (100 mg/kg/dia administrado em um paradigma de dosagem intermitente) para caracterizar a senescência das células endoteliais e as alterações na expressão de transcritos. Os níveis circulantes de fatores SASP foram medidos para validar as alterações transcricionais. Experimentos de exposição ao plasma e adição e inibição de proteínas foram conduzidos em artérias de camundongos isoladas e células endoteliais humanas cultivadas para determinar o papel causal do ambiente SASP circulante e de fatores SASP específicos na mediação da disfunção endotelial e nos mecanismos de ação subjacentes.

Results:
Células endoteliais senescentes exibiram expressão elevada de fatores SASP, particularmente Cxcl12, que foi revertida pela suplementação com fisetina, com respostas também refletidas nas concentrações circulantes de CXCL12. O plasma de camundongos velhos prejudicou a função endotelial ao induzir senescência das células vasculares, reduzir o NO, aumentar o estresse oxidativo mitocondrial e promover a transição endotelial-mesenquimal—efeitos parcialmente impulsionados por CXCL12 e prevenidos pela fisetina.

Conclusions:
Esses resultados identificam o SASP e o CXCL12 como impulsionadores da disfunção endotelial relacionada à idade e estabelecem mecanismos de intervenção senolítica com suplementação de fisetina.

RESUMO GRÁFICO
Resumo
Este estudo fornece uma nova visão mecanicista de como as células endoteliais senescentes e seus produtos secretores—particularmente CXCL12—contribuem para a disfunção endotelial relacionada à idade. Ele demonstra ainda que o tratamento senolítico com fisetina reverte esses efeitos, destacando uma promissora estratégia translacional para direcionar o envelhecimento vascular e preservar a saúde endotelial.
O avanço da idade é o principal fator de risco para doenças cardiovasculares (DCVs), que continuam sendo a principal causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A função endotelial vascular prejudicada é um antecedente fundamental para o desenvolvimento de DCVs clínicas com o envelhecimento. A característica antagônica do envelhecimento, a senescência celular, contribui diretamente para a disfunção endotelial relacionada à idade, em parte ao promover inflamação crônica e estresse oxidativo mitocondrial. Apesar dos efeitos adversos da senescência celular na função endotelial, as alterações moleculares que ocorrem nas células endoteliais senescentes e os mecanismos diretos pelos quais as células senescentes induzem a disfunção endotelial com o avanço da idade permanecem obscuros.

Um mecanismo putativo pelo qual as células senescentes impulsionam a disfunção fisiológica é através da produção e secreção do microambiente circulante do fenótipo secretor associado à senescência (SASP), uma coleção de citocinas, quimiocinas, proteases e fatores de crescimento. O microambiente circulante do SASP é altamente heterogêneo e dependente do tipo celular e do indutor de senescência celular. Assim, os fatores específicos do SASP que são regulados positivamente com o envelhecimento em células endoteliais senescentes in vivo ainda precisam ser determinados. O microambiente circulante do SASP pode induzir disfunção em nível celular e tecidual ao impulsionar o estresse oxidativo mitocondrial, a inflamação crônica, a indução de senescência celular em células/tecidos vizinhos e a transdiferenciação celular (ou seja, transição endotelial-mesenquimal [EndoMT]). Importante, o microambiente circulante do SASP está em contato constante e direto com o endotélio, e as alterações que ocorrem na circulação contribuem diretamente para a disfunção endotelial relacionada à idade. Como tal, as células endoteliais podem ser mais suscetíveis a entrar em um estado senescente devido à interação constante com o microambiente circulante do SASP. No entanto, os fatores circulantes do SASP originários de células endoteliais senescentes e seu impacto potencial na função endotelial ainda não são completamente compreendidos. Assim, obter uma compreensão específica das células endoteliais dos mecanismos moleculares relacionados à senescência celular e ao microambiente circulante do SASP dentro do endotélio pode ser explorado como biomarcadores diagnósticos translacionais e pode servir como potenciais alvos terapêuticos para novas intervenções.
Senolíticos – compostos que visam e eliminam seletivamente células senescentes em excesso – demonstraram eficácia na supressão da senescência excessiva de células vasculares e na melhora da função vascular em camundongos idosos. Embora várias terapias senolíticas estejam atualmente sendo avançadas em estudos pré-clínicos e clínicos, o senolítico natural fisetina mostra eficácia em atingir células endoteliais senescentes em cultura e evocar efeitos favoráveis na função endotelial com o envelhecimento, além de apresentar um perfil de segurança encorajador para a tradução clínica. No entanto, os efeitos da fisetina nas células endoteliais senescentes e no SASP in vivo e como esses efeitos contribuem para os efeitos benéficos da fisetina na disfunção endotelial relacionada à idade são incompletamente compreendidos.

No presente estudo, buscamos caracterizar a vasculatura de camundongos jovens (6 meses) e idosos (27 meses) utilizando suplementação in vivo de fisetina para explorar os mecanismos moleculares, celulares e fisiológicos modulados com o envelhecimento e o tratamento senolítico. Os objetivos centrais deste estudo foram: 1) avaliar como o envelhecimento afeta a senescência de células endoteliais in vivo em nível de célula única e identificar as principais vias de sinalização associadas à senescência celular; 2) identificar fatores SASP regulados positivamente em células endoteliais senescentes com o envelhecimento que podem modular a função endotelial; e 3) avaliar as contribuições do microambiente SASP circulante e de fatores SASP específicos na mediação da disfunção endotelial relacionada à idade.

Primeiramente, descobrimos que, em relação a outros tipos de células vasculares, as células endoteliais eram altamente suscetíveis a se tornarem senescentes com o envelhecimento e foram efetivamente eliminadas pelo tratamento senolítico com fisetina. Dentro das células endoteliais senescentes, identificamos o mRNA de Cxcl12 como o mais altamente regulado positivamente com o envelhecimento e atenuado com o tratamento senolítico com fisetina, e observamos padrões semelhantes nas concentrações circulantes da proteína CXCL12. Finalmente, revelamos um papel causal do microambiente SASP circulante na indução da disfunção endotelial relacionada à idade, mediada, em parte, pela concentração elevada de CXCL12. No geral, essas descobertas distinguem as células endoteliais senescentes como alvos senolíticos, estabelecem o microambiente SASP circulante como um impulsionador da disfunção endotelial relacionada à idade e identificam CXCL12 como um fator SASP circulante específico que medeia a senescência e disfunção das células endoteliais com o envelhecimento, que pode ser modulado com o tratamento senolítico com fisetina. Além disso, descobrimos mecanismos subjacentes à disfunção endotelial mediada pelo microambiente SASP circulante e pela CXCL12, incluindo produção de NO, estresse oxidativo mitocondrial e transdiferenciação de células endoteliais.

MÉTODOS
Animais.
Experimentos com camundongos, incluindo importação, alojamento, procedimentos experimentais e eutanásia, foram realizados estritamente sob uma Proposta de Estudo Animal (ASP #496-LCS-2026) e emendas associadas, revisadas e aprovadas pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal (ACUC) do Instituto Nacional de Envelhecimento (NIA). Todos os camundongos foram alojados em grupos a 72°F de ponto de ajuste +/−3 sob um ciclo padrão de 12 h claro/escuro e alimentados ad libitum. A umidade relativa foi mantida entre 30–70%.

Para o período de intervenção, camundongos selvagens jovens (6 meses) e velhos (27 meses) foram aleatoriamente designados para receber veículo (10% etanol, 30% PEG400 e 60% Phosal 50 PG) ou fisetina (100 mg/kg/dia em veículo). O tratamento foi administrado por gavagem oral usando um paradigma de dosagem intermitente – uma semana com tratamento; duas semanas sem; uma semana com tratamento, conforme paradigma de dosagem senolítica previamente estabelecido (Figura 1A).

Sequenciamento de RNA de célula única da aorta.

A análise transcriptômica de célula única da aorta foi realizada, conforme descrito anteriormente. Resumidamente, aortas inteiras de três camundongos (por sexo e grupo de tratamento) foram coletadas, limpas e digeridas. Células viáveis foram separadas usando Classificação de Células Ativadas por Fluorescência para preparação da biblioteca 10x Genomics. As bibliotecas de célula única foram preparadas com o Chromium Next GEM Single Cell 3’ Kit v3.1 (10x Genomics) com o Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit (10x Genomics) de acordo com o protocolo do fabricante com o Chromium Controller (10x Genomics). Aproximadamente 10.000 células únicas foram usadas para a geração de GEM, e os cDNAs foram então verificados no Agilent Bioanalyzer com o kit High Sensitivity DNA (Agilent). Os cDNAs preparados foram então usados para a preparação da biblioteca, que foi verificada no Agilent Bioanalyzer com o kit DNA 1000 (Agilent Technologies). As bibliotecas foram sequenciadas com o sequenciador Illumina NovaSeq 6000 a uma profundidade de 70.000–120.000 leituras por célula. Os dados de sequenciamento estão depositados no repositório Gene Expression Omnibus do NCBI, GSE296698 (token: yrajmsyujxgjbql).

Os dados de sequenciamento de RNA de célula única foram processados usando o Cell Ranger (versão 8.0.1) com a referência de camundongo GRCm39–2024-A (10x Genomics). As matrizes de contagem de leituras obtidas foram subsequentemente analisadas em R usando o pacote Seurat, versão 5.2.0, com parâmetros padrão em todas as funções, salvo indicação em contrário. O teste de RNA diferencialmente abundante (DAR) foi realizado com os seguintes pontos de corte: valor de p ajustado < 0,05, mudança média log2 > 0,25 e porcentagem mínima de células em qualquer grupo > 0,1. A análise de vias foi realizada usando KEGG (versão 111.0) e Reactome (versão 90) e foi baseada no teste DAR.

Quantificação de proteínas plasmáticas.

Para análise multiplex, kits personalizados de ensaio Luminex murino foram projetados pela R&D Biosystems e executados de acordo com as instruções do fabricante.

Função endotelial vascular mediada pelo plasma.
Para avaliar o papel do milieu SASP circulante (plasma) e CXCL12 na função endotelial, um bioensaio ex vivo de artéria isolada foi utilizado, conforme descrito anteriormente. Em resumo, artérias carótidas foram excisadas de camundongos jovens (3–6 meses), selvagens sem intervenção prévia e canuladas em miógrafos de pressão. Plasma coletado de camundongos jovens veículo, velhos veículo e velhos tratados com fisetina foi diluído a 5% e perfundido luminalmente através das artérias pressurizadas por 24 h antes de avaliar a função endotelial. Após a perfusão do plasma, a função endotelial foi medida por dilatação dependente do endotélio (EDD) e dilatação independente do endotélio (EID) em resposta a doses crescentes de acetilcolina (ACh) e nitroprussiato de sódio (SNP), respectivamente, conforme descrito anteriormente. Todos os dados de resposta à dose são apresentados como percentual de dilatação em relação ao diâmetro máximo para considerar diferenças no diâmetro basal do vaso.

Células endoteliais cultivadas.
Células endoteliais aórticas humanas (HAECs) foram cultivadas em meio basal suplementado com 5% de plasma coletado de camundongos jovens, velhos veículo e velhos tratados com fisetina. A bioatividade do óxido nítrico (NO) e do superóxido mitocondrial das células endoteliais foi avaliada após 2 h de incubação com plasma, por meio de coloração com a sonda fluorescente Hoechst (corante nuclear; Thermo Fisher) e 10 µM de diaminorodamina-4M AM (DAR-4M AM; Sigma-Aldrich; para quantificar a produção de NO) por 45 min ou 5 µM de MitoSOX (Thermo Fisher; para quantificar a bioatividade do superóxido mitocondrial) por 30 min. A coloração para β-galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal) e as extrações de RNA para expressão gênica foram realizadas após 24 h de exposição ao plasma.

Adição e inibição da proteína CXCL12.
A proteína CXCL12 recombinante de camundongo (R&D Systems, Cat. #460-SD-050/CF) em PBS estéril foi adicionada de volta ao plasma de camundongos jovens e velhos tratados com fisetina, de modo que a concentração de CXCL12 correspondesse aos níveis médios em camundongos velhos tratados com veículo (3210 pg/ml) para experimentos de reposição de CXCL12. 1 µg/ml de LIT-927 (Selleckchem, Cat. #S8813) em DMSO foi adicionado ao plasma de velhos veículo para experimentos de inibição de CXCL12.

RESULTADOS
A transcriptômica de célula única da aorta inteira identifica uma população de células senescentes com o envelhecimento que são atenuadas com o tratamento senolítico.
Para obter insights sobre as alterações transcricionais vasculares que ocorrem com o envelhecimento, utilizamos o sequenciamento de RNA de célula única (RNAseq) para comparar aortas de camundongos jovens (6 meses) e velhos (27 meses) C57BL/6N. Para estudar os efeitos do tratamento senolítico in vivo no sistema vascular, suplementamos camundongos jovens e velhos com veículo ou fisetina, conforme descrito anteriormente (Figura 1A). Os fluxos de trabalho de RNAseq de célula única permitem a caracterização de perfis transcriptômicos de tipos celulares distintos da aorta para identificar alterações específicas de tipo celular com o envelhecimento. O agrupamento não supervisionado das amostras combinadas revelou 11 tipos celulares distintos na aorta (Figura 1A e Figura S1).
Em seguida, realizamos o RNAseq pseudo-bulk de aorta inteira para determinar as alterações transcriptômicas gerais com o envelhecimento e o tratamento senolítico, usando a análise de RNA diferencialmente abundante (DAR). As diferenças relacionadas à idade (jovem veículo vs. idoso veículo) revelaram 4589 DARs (2859 aumentados, 1730 diminuídos) (Figura 1B). A suplementação com fisetina em camundongos idosos revelou 3143 DARs com mais transcritos reduzidos do que elevados (1401 aumentados, 1742 diminuídos) em comparação com o veículo idoso (Figura 1B). Os camundongos idosos tratados com fisetina apresentaram um perfil transcriptômico mais semelhante ao dos camundongos jovens com veículo (974 aumentados, 931 diminuídos) em comparação com os camundongos idosos com veículo (Figura 1B). Os grupos jovens (veículo jovem vs. fisetina jovem) foram os menos diferentes, com 628 DARs (240 aumentados, 388 diminuídos) (Figura 1B). A análise de vias do Reactome revelou a senescência celular como a via mais altamente regulada positivamente com o envelhecimento, seguida por vias relacionadas à desregulação imunológica e à parada do ciclo celular (Figura 1C). Para obter insights sobre os transcritos relacionados à senescência celular na vasculatura que foram modulados com o envelhecimento e o tratamento senolítico, avaliamos genes na assinatura holística de células senescentes SenMayo que foram regulados positivamente com o envelhecimento (idoso veículo vs. jovem veículo) e regulados negativamente com o tratamento senolítico (idoso fisetina vs. idoso veículo). Encontramos diferenças em transcritos envolvidos no SASP, na manutenção da parada do ciclo celular e na sinalização pró-inflamatória (Figura 1D).

Dadas as alterações nas vias de senescência celular observadas na vasculatura com a idade, em seguida procuramos avaliar como as células endoteliais foram afetadas em relação a outros tipos de células vasculares. Aproveitando a pontuação de módulo do SenMayo, identificamos populações de células senescentes em vários tipos de células vasculares, incluindo populações de células endoteliais, macrófagos e semelhantes a neutrófilos em aortas de camundongos idosos com veículo (Figura 1E). Nas aortas de camundongos idosos, a fisetina teve os maiores efeitos na assinatura SenMayo na população de células endoteliais, reforçando os efeitos senolíticos da fisetina na carga de células endoteliais senescentes com o envelhecimento (Figura 1E). Diferenças marginais foram observadas na assinatura SenMayo nos grupos jovens, sugerindo efeitos mínimos da fisetina em camundongos jovens e saudáveis (Figura 1E). Em conjunto, esses dados demonstram uma mudança transcricional na vasculatura com o envelhecimento e sugerem que o tratamento senolítico com fisetina em camundongos idosos retorna o transcriptoma em direção a uma composição celular aórtica jovem, mitigando a carga de senescência de células vasculares, particularmente no endotélio.
Em seguida, realizamos uma investigação direcionada das alterações relacionadas à senescência celular na população de células endoteliais vasculares com o envelhecimento e o tratamento senolítico. Para isolar alterações específicas das células endoteliais, realizamos o agrupamento não supervisionado do cluster de células endoteliais, o que produziu 12 subclusters únicos com base em padrões de expressão de transcritos compartilhados (Figura 2A). A composição de células endoteliais revelou diferenças mínimas entre os grupos de tratamento na maioria dos subclusters, com exceção do subcluster 10 que aumentou com a idade (10,7 vezes, p<0,0001) e reduziu (0,02 vezes, p<0,0001) de volta aos níveis jovens, em camundongos idosos tratados com fisetina (Figura 2B).

Em seguida, utilizamos a assinatura de senescência específica de células endoteliais EndoSen para determinar quais subclusters foram enriquecidos por vias de sinalização associadas à senescência celular. A pontuação do módulo EndoSen revelou enriquecimento de senescência celular nos subclusters endoteliais 4, 7, 9 e 10, com a maior expressão no subcluster 10 (Figura 2C). Além disso, o subcluster endotelial 10 apresentou a maior expressão de mRNA do marcador canônico de senescência celular Cdkn1a em comparação com os outros subclusters (Figura 2D).

Para caracterizar melhor as células endoteliais senescentes, utilizamos o teste de DAR no subcluster 10 para identificar alvos gênicos que são modulados com o envelhecimento e o tratamento senolítico. As diferenças relacionadas à idade (idoso vs. veículo jovem) revelaram 435 DARs (278 aumentados, 135 reduzidos), sugerindo um grande impacto do envelhecimento no subcluster endotelial senescente 10 (Figura 2E). A suplementação de fisetina em camundongos idosos revelou 211 DARs com mais transcritos reduzidos do que elevados (34 aumentados, 177 diminuídos) (Figura 2E). Notavelmente, nenhum transcrito foi significativamente modulado entre idoso com fisetina e veículo jovem ou entre os grupos de camundongos jovens, sugerindo que as células endoteliais senescentes de camundongos idosos que receberam tratamento senolítico têm um perfil transcriptômico semelhante ao das células endoteliais de camundongos jovens e que a fisetina tem efeitos mínimos em células endoteliais jovens e saudáveis (Figura 2E).
Os DARs mais aumentados que distinguiram o putativo subcluster senescente 10 dos outros subclusters endoteliais representaram transcritos envolvidos na remodelação da matriz extracelular, sinalização de estresse, manutenção do ciclo celular e o SASP (Figura 2F). A análise de vias dos DARs do subcluster endotelial senescente 10 revelou vias envolvidas em patologia cardiovascular (isto é, aterosclerose e cardiomiopatia), senescência celular, câncer e uma desregulação geral das vias de sinalização (Figura 2G). Por fim, identificamos os 50 principais DARs que distinguiram o grupo veículo idoso das outras condições de tratamento, representando transcritos que estavam mais aumentados com o envelhecimento e menores com a suplementação de fisetina no subcluster endotelial 10 (Figura 2H). Descobrimos que esses transcritos abrangem amplamente marcadores canônicos de senescência (por exemplo, Cdkn1a) e fatores SASP. Em conjunto, esses achados demonstram aumento da expressão de vias de sinalização relacionadas à senescência celular e ao SASP em células endoteliais com o envelhecimento, que foram atenuadas com o tratamento senolítico com fisetina.

O tratamento senolítico atenua o SASP derivado do endotélio e circulante em camundongos idosos.

O SASP representa uma coleção de moléculas pró-inflamatórias, incluindo citocinas, quimiocinas, proteases e fatores de crescimento que têm papéis variados na modulação da função fisiológica. Nosso próximo objetivo foi identificar fatores SASP circulantes candidatos com base naqueles diferencialmente expressos no endotélio, particularmente aqueles que impulsionam os padrões observados no subcluster de células endoteliais senescentes 10. No subcluster 10, observamos vários fatores SASP com transcritos aumentados com a idade (veículo jovem vs. veículo idoso) que foram reduzidos com a fisetina (veículo idoso vs. fisetina idosa), incluindo os mRNAs de Ccl4, Ccl7, Timp4, Igfbp3, S100a9, Ccl8, Fgf1, Gdf15, Serpine1 e Cxcl12 (Figura 3A).

Diante das alterações observadas nos mRNAs que codificam fatores SASP de células endoteliais senescentes, buscamos determinar se esses fatores eram traduzidos e secretados no plasma circulante. Selecionamos proteínas SASP para medir com base em: a) magnitude das diferenças relacionadas à idade na expressão de transcritos endoteliais senescentes e se essas diferenças com o envelhecimento foram influenciadas pela suplementação com fisetina; e b) plausibilidade biológica de alterar a função endotelial. Medimos a concentração proteica dos fatores SASP candidatos no plasma dos animais tratados. Entre esses fatores, concentrações mais altas com o envelhecimento foram observadas em CCL8, FGF Básico, S100a9, PAI-1 e CXCL12 ao comparar camundongos veículo jovem e veículo idoso (Figura 3B). Notavelmente, a expressão proteica elevada de PAI-1 e CXCL12 com o envelhecimento foi atenuada pela suplementação com fisetina (fisetina idosa vs. veículo idoso) (Figura 3B).
PAI-1, uma proteína plaquetária que inibe a degradação da fibrina, é um marcador bem estabelecido de senescência celular. CXCL12 é uma quimiocina que regula a angiogênese e está implicada na progressão aterosclerótica. Dada a novidade e a plausibilidade biológica putativa da CXCL12 na regulação da função endotelial (enquanto a PAI-1 afeta principalmente as plaquetas), buscamos investigar se as concentrações de CXCL12 estavam diretamente implicadas na disfunção endotelial relacionada à idade transduzida pelo microambiente SASP circulante e se a mitigação da CXCL12 elevada era um mecanismo pelo qual a suplementação com fisetina exercia seus benefícios na função endotelial com o envelhecimento.

O tratamento senolítico atenua a disfunção endotelial induzida pelo microambiente SASP circulante com o envelhecimento.

Disfunção endotelial induzida pelo microambiente SASP circulante e pela CXCL12.

Dada a observação de que fatores selecionados do SASP circulante mudaram com o envelhecimento e com o tratamento senolítico com fisetina, nosso próximo objetivo foi avaliar o papel funcional do ambiente SASP circulante na disfunção endotelial relacionada à idade e os efeitos específicos da CXCL12 como um fator SASP circulante candidato que poderia ser responsável por transduzir o efeito do ambiente circulante na função endotelial. Primeiro, testamos os efeitos do plasma dos grupos jovem veículo, velho veículo e velho fisetina na função endotelial usando a dilatação dependente do endotélio (EDD) da artéria carótida após perfusão intraluminal de plasma. O pico médio de EDD foi menor após exposição ao plasma de camundongos velhos veículo em comparação com camundongos jovens (−17%; p<0,0001), sugerindo que o plasma de camundongos velhos induz diretamente disfunção endotelial (Figura 4A e Figura S2B). O pico de EDD foi 14% maior após exposição ao plasma de camundongos velhos fisetina em comparação com o plasma de camundongos velhos veículo (p=0,001) (Figura 4A e Figura S2A e S2B).

Para determinar o papel mecanístico da CXCL12 na disfunção endotelial mediada pelo microambiente SASP circulante, adicionamos CXCL12 recombinante de camundongo ao plasma de velhos fisetina de modo que as concentrações médias de CXCL12 plasmática fossem semelhantes às do plasma de velhos veículo. A adição de CXCL12 ao plasma de velhos fisetina reduziu o pico de EDD em comparação com o plasma de velhos fisetina sozinho (−22%, p<0,0001), amenizando as diferenças com o grupo velho veículo (p=0,465) (Figura 4A e Figura S2A e S2B). Não foram observadas diferenças na dilatação independente do endotélio entre nenhum dos grupos ou condições (p=0,342), indicando que as diferenças observadas em resposta à exposição ao plasma ocorreram de maneira dependente do endotélio (Figura 4B e Figura S2C e S2D). Em conjunto, esses dados sugerem que o microambiente SASP circulante está na base da disfunção endotelial relacionada à idade e seus efeitos prejudiciais são em parte mediados pela CXCL12 e amplamente revertidos pelo tratamento senolítico com fisetina.

Senescência de células vasculares induzida pelo SASP circulante e pela CXCL12.
Um mecanismo pelo qual o SASP exerce seus efeitos adversos é através da indução humoral de senescência celular. Assim, para investigar os mecanismos pelos quais o SASP circulante modula a função endotelial, buscamos avaliar a senescência celular induzida pelo SASP medindo o marcador canônico da carga de células senescentes, a intensidade da β-galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal) em artérias (anéis aórticos) expostas ao plasma de camundongos jovens veículo, idosos veículo e idosos fisetina. Descobrimos que, quando normalizado pela contagem total de células, houve um aumento nas células positivas para SA-β-Gal em artérias expostas ao plasma de idosos em comparação ao plasma de jovens (aumento de 6,1 vezes, p<0,0001) (Figura 4C e Figura S3A). As células positivas para SA-β-Gal foram menores em artérias expostas ao plasma de camundongos idosos tratados com fisetina em comparação com camundongos idosos veículo (−86%, p<0,0001) (Figura 4C e Figura S3A). A adição de CXCL12 exógeno ao plasma plasma de fisetina idoso aumentou as células arteriais positivas para SA-β-Gal (aumento de 4,8 vezes, p<0,0001) em comparação ao plasma de fisetina idoso sozinho (Figura 4D e Figura S3A).

Para isolar os efeitos da exposição ao plasma nas células endoteliais, expusemos o plasma dos animais tratados a células endoteliais da aorta humana cultivadas (HAECs). Semelhante às artérias, as HAECs expostas ao plasma veículo idoso tiveram maior intensidade de SA-β-Gal do que as HAECs expostas ao plasma veículo jovem (aumento de 5,6 vezes, p<0,0001) (Figura 4D e Figura S3B). As células positivas para SA-β-Gal foram menores em HAECs expostas ao plasma de camundongos idosos tratados com fisetina em comparação com camundongos idosos veículo (−56%, p<0,0001) (Figura 4D e Figura S3B). A inibição de CXCL12 com LIT-927 (um neutraligante de CXCL12) no plasma veículo idoso reduziu as células positivas para SA-β-Gal (−44%, p<0,0001) em comparação ao plasma veículo idoso sozinho (Figura 4D e Figura S3B). A adição de CXCL12 exógeno ao plasma aumentou as células positivas para SA-β-Gal em HAECs expostas ao plasma de fisetina idoso (82%, p<0,0001) em comparação ao plasma de fisetina idoso sozinho (Figura 4D e Figura S3B).
Além da atividade de SA-β-Gal, confirmamos os efeitos do SASP e do CXCL12 na senescência celular por meio da expressão de mRNA endotelial dos biomarcadores canônicos de senescência celular Cdkn1a e Cdkn2a. Descobrimos que as HAECs expostas ao plasma de camundongos idosos veículo apresentaram maior expressão de mRNA de Cdkn1a (45 vezes, p<0,0001) e Cdkn2a (6,2 vezes, p<0,0001) em comparação com o plasma jovem (Figura 4E e 4F e Figura S3A). Em relação à exposição ao plasma de idosos veículo, a exposição ao plasma de idosos com fisetina resultou em menor expressão de mRNA de Cdkn1a (−85%, p<0,0001) e Cdkn2a (−57%, p<0,0001) (Figura 4E e 4F e Figura S3C e S3D). A adição de LIT-927 ao plasma de idosos veículo reduziu a expressão de mRNA de Cdkn1a (−59%, p<0,0001) e Cdkn2a (−62%, p<0,0001) em comparação com o plasma de idosos veículo isoladamente (Figura 4E e 4F e Figura S3C e S3D). A adição de CXCL12 ao plasma de idosos com fisetina aumentou a expressão de mRNA de Cdkn1a (100%, p<0,0001) e Cdkn2a (128%, p<0,0001) em comparação com o plasma de idosos com fisetina isoladamente (Figura 4E e 4F e Figura S3C e S3D). Em conjunto, esses dados indicam que o microambiente SASP circulante induz diretamente a senescência de células endoteliais vasculares, em parte por meio do CXCL12, e que a senescência induzida pelo microambiente SASP circulante com o envelhecimento pode ser prevenida pela suplementação com fisetina.
Produção de NO e bioatividade do superóxido mitocondrial induzidas pelo SASP circulante e CXCL12.
A disfunção endotelial relacionada à idade é mediada principalmente pela redução da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO), que é uma característica fundamental das células endoteliais senescentes. Portanto, avaliamos a produção de NO em células endoteliais cultivadas expostas ao plasma, examinando os efeitos tanto da adição quanto da inibição do CXCL12. Isso nos permitiu determinar o papel direto do CXCL12 na mediação das diferenças na produção de NO pelas células endoteliais induzidas pelo microambiente SASP circulante no contexto do envelhecimento e da suplementação com fisetina. As HAECs expostas ao plasma de idosos veículo apresentaram menor produção de NO em comparação ao plasma jovem (−24%, p<0,0001) (Figura 4G e Figura S4A). Esse prejuízo na produção de NO relacionado à idade foi prevenido nas HAECs expostas ao plasma de idosos com fisetina (20% vs. plasma de idosos veículo, p<0,0001) (Figura 4G e Figura S4A). Em comparação com o plasma isoladamente, a adição de CXCL12 exógeno prejudicou a produção de NO nas HAECs expostas ao plasma de jovens veículo (−20%, p<0,0001) e de idosos com fisetina (−13%, p<0,0001) (Figura 4G e Figura S4A). Além disso, a inibição do CXCL12 pelo LIT-927 aumentou a produção de NO nas HAECs expostas ao plasma de idosos veículo (10%, p<0,0001) (Figura 4G e Figura S4A).
A redução da produção de NO pode ocorrer como resultado do estresse oxidativo mitocondrial, já que o excesso de superóxido sequestra o NO para reduzir sua biodisponibilidade. Assim, buscamos determinar se o microambiente circulante do SASP aumentou a bioatividade do superóxido mitocondrial e se isso foi mediado pelo CXCL12. Para isso, medimos a bioatividade do superóxido derivado de mitocôndrias em artérias isoladas (Figura 4H e Figura S4B) e em HAECs cultivadas (Figura 4I e Figura S4C) após exposição ao plasma com adição e inibição de CXCL12. A bioatividade do superóxido mitocondrial arterial foi maior nas aortas expostas ao plasma veículo de camundongos velhos em comparação ao plasma jovem (3,5 vezes, p<0,0001)(Figura 4H e Figura S4B). A bioatividade do superóxido mitocondrial foi menor nas artérias expostas ao plasma de camundongos velhos tratados com fisetina em comparação aos camundongos velhos tratados com veículo (−58%, p<0,0001)(Figura 4H e Figura S4B). Em comparação ao plasma de fisetina velho isolado, a adição de CXCL12 exógeno aumentou a bioatividade do superóxido mitocondrial (2,2 vezes, p=0,001)(Figura 4H e Figura S4B).

Semelhante às artérias, as HAECs expostas ao plasma veículo de camundongos velhos apresentaram maior bioatividade basal de superóxido mitocondrial do que o plasma jovem (14%, p<0,0001)(Figura 4I e Figura S4C). A bioatividade do superóxido mitocondrial foi menor nas HAECs expostas ao plasma de camundongos velhos tratados com fisetina em comparação aos camundongos velhos tratados com veículo (−6%, p<0,0001)(Figura 4I e Figura S4C). A inibição de CXCL12 com LIT-927 reduziu a bioatividade do superóxido mitocondrial em HAECs expostas ao plasma veículo de camundongos velhos (−10%, p<0,0001)(Figura 4I e Figura S4C). O CXCL12 exógeno induziu bioatividade de superóxido mitocondrial em HAECs expostas ao plasma de fisetina de camundongos velhos (5%, p=0,029)(Figura 4I e Figura S4C). Em conjunto, esses dados sugerem que o microambiente circulante do SASP prejudica a produção de NO e promove o excesso de bioatividade de superóxido mitocondrial em células endoteliais senescentes, e essas diferenças mediadas pelo SASP são impulsionadas, em parte, pelo CXCL12 e podem ser prevenidas pela suplementação com fisetina.

O tratamento senolítico mitiga a transição endotelial-mesenquimal (EndoMT) com o envelhecimento.
CXCL12 desempenha um papel crucial na promoção da EndoMT, um processo de transdiferenciação pelo qual as células endoteliais perdem suas características típicas, ao mesmo tempo que adquirem as características contráteis das células mesenquimais. De forma importante, a EndoMT está altamente implicada no envelhecimento vascular e estudos anteriores relatam mudanças nas células endoteliais senescentes em direção a propriedades mais contráteis e redução da produção de NO. Dessa forma, buscamos em seguida determinar se a EndoMT era um mecanismo subjacente mediando a disfunção induzida pelo SASP e pela CXCL12 em células endoteliais senescentes. Para isso, primeiro investigamos se as células endoteliais senescentes exibem características de EndoMT e, em seguida, avaliamos se a suplementação com fisetina poderia prevenir a EndoMT induzida pelo SASP circulante e pela CXCL12. Inicialmente, medimos transcritos específicos de células endoteliais e células mesenquimais no subagrupamento 10 de células endoteliais senescentes e descobrimos que o grupo veículo idoso demonstrou características endoteliais reduzidas e maiores marcadores mesenquimais em comparação com os outros grupos (Figura 5A).

Para determinar se o ambiente SASP circulante relacionado à idade promove a EndoMT e se esses efeitos são mediados pela CXCL12, expusemos HAECs ao plasma de camundongos tratados, com adição ou inibição de CXCL12. Em seguida, avaliamos a expressão dos marcadores endoteliais mais afetados (mRNA de Cdh5 e Pecam1) e marcadores mesenquimais (mRNA de Tgfb1 e Acta2). HAECs expostas ao plasma de camundongos idosos tratados com veículo mostraram expressão de mRNA significativamente reduzida de Cdh5 (−72%, p<0,0001) e Pecam1 (−54%, p<0,0001) em comparação com células expostas ao plasma de camundongos jovens. Esse aumento relacionado à idade foi atenuado pela exposição ao plasma de idosos com fisetina na expressão de mRNA de Cdh5 (3,1 vezes, p<0,0001) e Pecam1 (2 vezes, p<0,0001) em comparação com o plasma veículo idoso (Figura 5B e 5C e Figura S5A e S5B). A adição de LIT-927 ao plasma veículo idoso aumentou a expressão de mRNA de Cdh5 (4 vezes, p<0,0001) e Pecam1 (2,4 vezes, p<0,0001) em comparação com o plasma veículo idoso isoladamente (Figura 5B e 5C e Figura S5A e S5B). A adição de CXCL12 ao plasma de idosos com fisetina reduziu a expressão de mRNA de Cdh5 (−45%, p<0,0001) e Pecam1 (−55%, p<0,0001) em comparação com o plasma de idosos com fisetina isoladamente (Figura 5B e 5C e Figura S5A e S5B).
Ao contrário das alterações observadas nos marcadores endoteliais, as HAECs expostas ao plasma de camundongos idosos veículo apresentaram maior expressão de mRNA de Tgfb1 (21 vezes, p<0,0001) e Acta2 (7,7 vezes, p<0,0001) em comparação ao plasma jovem. Em comparação ao plasma de camundongos idosos veículo, a exposição ao plasma de idosos com fisetina reduziu a expressão de mRNA de Tgfb1 (−88%, p<0,0001) e Acta2 (−89%, p<0,0001) (Figura 5D e 5E e Figura S5C e S5D). A adição de LIT-927 ao plasma de idosos veículo reduziu a expressão de mRNA de Tgfb1 (−83%, p<0,0001) e Acta2 (−76%, p<0,0001) em comparação ao plasma de idosos veículo sozinho (Figura 5D e 5E). A adição de CXCL12 ao plasma de idosos com fisetina aumentou a expressão de mRNA de Tgfb1 (5,4 vezes, p<0,0001) e Acta2 (5,4 vezes, p<0,0001) em comparação ao plasma de idosos com fisetina sozinho (Figura 5D e 5E e Figura S5C e S5D). Em conjunto, esses dados indicam que o ambiente SASP circulante e o CXCL12 promovem EndoMT em células endoteliais senescentes e que essas alterações relacionadas à idade nos fenótipos celulares são prevenidas pela suplementação com fisetina.
DISCUSSÃO
No presente estudo, avaliamos a senescência celular vascular em resolução de célula única no contexto do envelhecimento e do tratamento senolítico com fisetina. Nossos achados demonstram que as células endoteliais são particularmente suscetíveis a sofrer senescência celular com o envelhecimento e que a fisetina, um composto senolítico natural, elimina efetivamente as células endoteliais senescentes em animais idosos. Nas células endoteliais senescentes e na circulação, um conjunto de fatores SASP aumentou com o envelhecimento e foi reduzido pela suplementação com fisetina. Dentre esses fatores, o mRNA de Cxcl12 emergiu como o mais diferenciado com o envelhecimento e a suplementação com fisetina. Essas alterações no ambiente SASP circulante contribuíram para a disfunção endotelial relacionada à idade, e os efeitos do ambiente SASP circulante foram amplamente mediados pelo CXCL12. As reduções induzidas pela fisetina no CXCL12 circulante contribuem para os efeitos benéficos da fisetina na função endotelial, atenuando o estresse oxidativo mitocondrial, melhorando a produção de NO e modulando favoravelmente a transdiferenciação endotelial. Esses resultados forneceram novos insights sobre o papel das células senescentes e do SASP no envelhecimento vascular e o potencial da terapia senolítica para mitigar a disfunção endotelial relacionada à idade.
A disfunção endotelial vascular é um fator de risco, indicador e preditor chave para DCV. A senescência celular emergiu como um mecanismo subjacente potente da disfunção endotelial relacionada à idade e um provável contribuinte para DCVs, incluindo aterosclerose, hipertensão e acidente vascular cerebral oclusivo. Estudos anteriores caracterizaram aumentos relacionados à idade na carga de senescência celular em amostras aórticas de camundongos, primatas e humanos. Células senescentes em excesso se acumulam na vasculatura de vários mamíferos, promovendo inflamação crônica de baixo grau e estresse oxidativo excessivo através do SASP. Mas apesar dessas evidências iniciais de melhora na saúde vascular com tratamento senolítico, há falta de informações sobre a senescência de células endoteliais in vivo e os efeitos do tratamento senolítico nas células endoteliais. No presente estudo, a caracterização de células senescentes na aorta identificou que as células endoteliais desenvolvem uma alta carga de senescência celular com o envelhecimento, a qual foi reduzida pelo tratamento senolítico com fisetina. Estudos anteriores demonstraram que a fisetina reduz a carga de senescência celular na aorta inteira in vivo, bem como em células endoteliais senescentes cultivadas in vitro. Em nível de célula única, nosso estudo explorou os efeitos da carga de senescência celular com o envelhecimento e após suplementação in vivo com fisetina em múltiplos tipos celulares e identificou que as células endoteliais sofrem senescência celular com o envelhecimento e podem ser eliminadas pelo tratamento senolítico in vivo com fisetina. Importante, a população de células endoteliais senescentes que identificamos estava envolvida em vias relacionadas a patologias CV e revelou uma alta expressão de transcritos relacionados ao SASP. Dessa forma, nossos achados estão alinhados com estudos anteriores que relatam a eficácia de agentes senolíticos na redução da carga de células senescentes em tecidos envelhecidos. No entanto, este estudo fornece a primeira evidência dos efeitos in vivo do tratamento senolítico na senescência de células vasculares em nível de célula única, revelando efeitos diretos do envelhecimento e da fisetina nas células endoteliais senescentes.
O microambiente SASP circulante é composto por uma coleção heterogênea de fatores pró-oxidantes e pró-inflamatórios que variam conforme a origem celular e a indução da senescência celular. Como tal, o microambiente SASP circulante é considerado um importante mediador dos efeitos adversos das células senescentes, mas as evidências diretas do impacto do SASP na função endotelial permanecem mínimas. Evidências emergentes indicam o microambiente SASP circulante como um motor da disfunção endotelial relacionada à idade; no entanto, o(s) componente(s) específico(s) da circulação responsável(is) por transduzir prejuízos na função endotelial ainda precisam ser elucidados. Um dos principais achados do presente estudo é a elucidação do papel do microambiente SASP circulante como mecanismo subjacente da disfunção endotelial relacionada à idade. Nossos experimentos de exposição plasmática em artérias isoladas estabelecem um papel causal do microambiente SASP circulante envelhecido na deterioração da função endotelial, com esses prejuízos relacionados à idade sendo em grande parte prevenidos em animais idosos que receberam tratamento senolítico com fisetina.

Em seguida, buscamos determinar fatores candidatos no microambiente SASP circulante que possam ser responsáveis por mediar a disfunção endotelial com o envelhecimento, pois a identificação dessas moléculas forneceria insights sobre os mecanismos pelos quais a senescência celular induz a disfunção endotelial e estabeleceria novos alvos terapêuticos. A quimiocina codificada pelo mRNA Cxcl12 surgiu como um fator mais altamente regulado positivamente em células endoteliais senescentes com o envelhecimento, com sua expressão reduzida após o tratamento senolítico com fisetina, conforme determinado por scRNA-seq. Além disso, a concentração de CXCL12 estava elevada no plasma de animais idosos e restaurada aos níveis jovens pela suplementação com fisetina. A adição e a inibição de CXCL12 em nossos experimentos de exposição plasmática apoiam um papel causal da CXCL12 na disfunção endotelial relacionada à idade, pois a inibição de CXCL12 no plasma veículo de animais idosos melhorou as respostas endoteliais e a adição de CXCL12 exógena ao plasma jovem induziu disfunção endotelial. Além disso, a adição de CXCL12 ao plasma de fisetina de animais idosos recapitulou a disfunção endotelial relacionada à idade, indicando que o tratamento senolítico com fisetina mitigou a disfunção endotelial relacionada ao microambiente SASP circulante, em parte, por meio da segmentação da CXCL12. Coletivamente, esses achados estabelecem um microambiente SASP circulante alterado como um mecanismo subjacente pelo qual o tratamento senolítico com fisetina melhora a função endotelial com o envelhecimento.
O ambiente SASP circulante estimula a disfunção endotelial por meio de mecanismos subjacentes que promovem inflamação crônica e estresse oxidativo. Notavelmente, o ambiente SASP circulante pró-inflamatório pode promover senescência celular sistemicamente e em células vizinhas, promovendo ainda mais a disfunção tecidual. Células endoteliais senescentes também contêm mitocôndrias disfuncionais, que são reguladoras-chave do SASP. Mitocôndrias disfuncionais em células endoteliais senescentes também produzem ROS em excesso, que sequestra o NO para reduzir sua biodisponibilidade. Aqui, mostramos que a exposição de artérias isoladas de camundongos jovens e células endoteliais arteriais cultivadas ao ambiente SASP circulante envelhecido induziu senescência celular humoral, reduziu a produção de NO e estimulou o estresse oxidativo mitocondrial. Importante, essas manifestações relacionadas à idade foram prevenidas em artérias e células endoteliais expostas ao plasma de animais idosos suplementados com fisetina. Esses resultados sugerem que a fisetina modula favoravelmente o ambiente SASP circulante para prevenir mecanismos de envelhecimento vascular que impulsionam a disfunção endotelial.

Considerando que o CXCL12 tem sido implicado em vias inflamatórias e relacionadas à senescência celular, seus efeitos como um fator SASP circulante fornecem insights mecanísticos sobre como a disfunção endotelial se desenvolve com o envelhecimento. O CXCL12 regula a transdução de vias de sinalização downstream envolvidas no EndoMT, um processo pelo qual as células endoteliais perdem seus fenótipos inerentes de células endoteliais e ganham propriedades contráteis aprimoradas. A disfunção endotelial mediada pelo ambiente SASP circulante foi amplamente estimulada por efeitos independentes do CXCL12, por meio da indução de senescência celular humoral, redução da produção de NO e estímulo do estresse oxidativo mitocondrial. Estudos anteriores demonstram que o CXCL12 derivado de células endoteliais promove a progressão da aterosclerose, e nossas descobertas apoiam que o CXCL12 induz disfunção endotelial provavelmente através do EndoMT, uma manifestação que é prevenida pelo tratamento senolítico. A capacidade da fisetina de melhorar a disfunção endotelial impulsionada pelo CXCL12 ressalta ainda mais seu potencial terapêutico na mitigação do envelhecimento vascular.

CONCLUSÕES
Em conclusão, este estudo identifica que células endoteliais senescentes se acumulam com o avanço da idade e promovem a secreção de fatores SASP na circulação. A intervenção senolítica com fisetina eliminou efetivamente as células endoteliais senescentes e destacou CXCL12 como um fator SASP crítico que aumenta com a idade avançada e é reduzido pelo tratamento senolítico. Mecanisticamente, descobrimos que o ambiente SASP circulante e CXCL12 induzem senescência celular, reduzem a produção de NO, promovem estresse oxidativo mitocondrial e estimulam a EndoMT para conferir disfunção endotelial. Ao demonstrar que o tratamento senolítico com fisetina reduz efetivamente os níveis de CXCL12 e melhora a função endotelial, nossos achados fornecem uma visão mecanística do potencial terapêutico dos compostos senolíticos no envelhecimento vascular. Importante, esses achados podem ter implicações importantes para ensaios clínicos em andamento que investigam a eficácia da suplementação com fisetina para melhorar a função endotelial em adultos saudáveis de meia-idade e idosos (NCT06133634). Esses resultados fornecem uma visão fisiológica e mecanística que apoia o desenvolvimento, estabelecimento e tradução das terapias senolíticas para melhorar a saúde cardiovascular com o envelhecimento.
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REFERÊNCIAS
Envelhecimento na América no século XXI: previsões demográficas da Rede de Pesquisa da Fundação MacArthur sobre uma Sociedade que Envelhece
Estatísticas de Doenças Cardíacas e AVC de 2024: Um Relatório de Dados dos EUA e Globais da American Heart Association
Envelhecimento arterial e cardíaco: principais acionistas nas empresas de doenças cardiovasculares: Parte I: artérias envelhecidas: uma “configuração” para doença vascular
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O sequenciamento de RNA de célula única da aorta inteira identifica uma população de células senescentes com o envelhecimento que são atenuadas pelo tratamento senolítico com fisetina.
Esquema do desenho do estudo utilizado em modelo animal resultando em 4 grupos: camundongos jovens veículo (Y VEH), jovens fisetina (Y FIS), velhos veículo (O VEH) e velhos fisetina (O FIS) tratados (A). Número de RNAs diferencialmente abundantes (DAR) entre grupos de tratamento selecionados (B). Análise da via Reactome dos DARs aumentados na aorta inteira com a idade (O VEH vs. Y VEH) (C). Análise de gráfico de pontos dos DARs relacionados à senescência celular (D). Aproximação e projeção de variedade uniforme (UMAP) da pontuação gênica de módulo usando a assinatura SenMayo para identificar células senescentes (E). *p<0,05 vs. Y VEH, ^p<0,05 vs. O VEH; triângulos representam fêmeas, quadrados representam machos.
As células endoteliais senescentes aumentam nas aortas com o envelhecimento e são atenuadas pelo tratamento senolítico com fisetina.
Aproximação e projeção de variedade uniforme (UMAP) (A) e porcentagem de subagrupamento (B) de células endoteliais aórticas (EC) de camundongos jovens veículo (Y VEH), jovens fisetina (Y FIS), velhos veículo (O VEH) e velhos fisetina (O FIS) tratados. Pontuação gênica de módulo usando a assinatura EndoSen para identificar células endoteliais senescentes (C). Gráfico de violino do marcador canônico de senescência celular Cdkn1a entre agrupamentos em células endoteliais (D). RNAs diferencialmente abundantes (DAR) entre grupos de tratamento selecionados no subagrupamento endotelial senescente 10 (E). Análise de gráfico de pontos dos 50 principais RNAs diferencialmente abundantes (DARs) no subagrupamento endotelial 10 vs. outros subagrupamentos endoteliais (F). Análise da via KEGG dos DARs aumentados no subagrupamento endotelial senescente 10 vs. outros subagrupamentos endoteliais (G). Análise de gráfico de pontos dos 50 principais DARs no subagrupamento endotelial 10 em veículo velho vs. outros grupos de tratamento (H). *p<0,05 vs. Y VEH, ^p<0,05 vs. O VEH; triângulos representam fêmeas, quadrados representam machos.
Fatores do fenótipo secretor associado à senescência (SASP) endotelial e circulante aumentam com a idade e são atenuados pelo tratamento senolítico com fisetina.
Gráficos de violino representando os principais RNAs diferencialmente abundantes (DARs) relacionados ao SASP no subagrupamento endotelial senescente 10 de camundongos jovens veículo (Y VEH), jovens fisetina (Y FIS), velhos veículo (O VEH) e velhos fisetina (O FIS) tratados (A). Abundância proteica circulante dos principais DARs relacionados ao SASP no plasma (B). *p<0,0001 vs. Y VEH, ^p<0,0001 vs. O VEH; triângulos representam fêmeas, quadrados representam machos.
A disfunção endotelial induzida pelo SASP circulante e CXCL12 com o envelhecimento e prevenção pelo tratamento senolítico com fisetina e inibição de CXCL12.
Dilatação dependente do endotélio (A) e dilatação independente do endotélio (B) em artérias carótidas isoladas de camundongos jovens após perfusão plasmática com e sem adição de Cxcl12 de camundongo recombinante. Sinal de β-Galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal) após exposição ao plasma com e sem adição de CXCL12 recombinante e seu inibidor, LIT-927, em artérias isoladas (C) e células endoteliais da aorta humana (HAECs) (D). mRNA dos biomarcadores de senescência celular Cdkn1a (E) e Cdkn2a (F) em HAECs após exposição ao plasma com e sem adição de CXCL12 recombinante e LIT-927. Bioatividade do óxido nítrico em células endoteliais da aorta humana (HAECs) após exposição ao plasma com e sem adição de CXCL12 recombinante e LIT-927 (G). Bioatividade do superóxido mitocondrial após exposição ao plasma com e sem adição de CXCL12 recombinante e LIT-927 em artérias isoladas (H) e HAECs (I). Os valores representam média ± EPM; *p<0,05 vs. controle jovem, ^p<0,05 vs. veículo velho; triângulos representam fêmeas, quadrados representam machos.

A suplementação de fisetina previne a transição endotelial-mesenquimal (EndoMT) induzida pelo SASP circulante e pelo Cxcl12.
Gráfico de pontos dos marcadores de mRNA de células endoteliais e mesenquimais no subcluster endotelial senescente 10 (A). Níveis de mRNA dos biomarcadores de células endoteliais Cdh5 (B) e Pecam1 (C) e biomarcadores de células mesenquimais Tgfb1 (D) e Acta2 (E) em células endoteliais da aorta humana (HAECs) após exposição ao plasma com ou sem adição de CXCL12 recombinante e seu inibidor, LIT-927. Os valores representam média ± EPM; *p<0,05 vs. controle jovem, ^p<0,05 vs. veículo velho; triângulos representam fêmeas, quadrados representam machos.

NOVELDADE E SIGNIFICÂNCIA:
O que é conhecido?
O avanço da idade é o principal fator de risco para doenças cardiovasculares, em parte devido à disfunção endotelial progressiva.
A senescência celular contribui para o comprometimento endotelial relacionado à idade através da secreção de um ambiente pró-inflamatório conhecido como fenótipo secretor associado à senescência (SASP), que pode afetar células vizinhas e a função tecidual.
Compostos senolíticos eliminam seletivamente células senescentes e melhoram a função vascular em modelos pré-clínicos de envelhecimento.

Que nova informação este artigo contribui?
As células endoteliais são altamente suscetíveis à senescência com o envelhecimento in vivo e são eliminadas seletivamente pelo tratamento senolítico com o composto natural fisetina.
O perfil transcriptômico de célula única identifica o CXCL12 como o fator SASP mais altamente regulado positivamente em células endoteliais senescentes e na circulação com o envelhecimento, ambos revertidos pelo tratamento senolítico com fisetina.
Identificamos um fator SASP circulante específico, o CXCL12, como um mediador parcial da disfunção endotelial ao induzir estresse oxidativo mitocondrial, prejudicar a biodisponibilidade do óxido nítrico e promover a transição endotelial-mesenquimal (Endo, que é restaurada pelo tratamento senolítico com fisetina.