pmid: "31815212"
title: "Estudos in vitro e in vivo de polímero superabsorvente de ácido poliaspártico e ácido poliacrílico sensível ao pH incorporado com GHK-Cu."
authors: "Sharma S, Anwar MF, Dinda A, Singhal M, Malik A"
journal: "ACS omega"
pubdate: "2019 Dec 03"
doi: "10.1021/acsomega.9b00655"
source: "PMC Full Text"

Estudos in vitro e in vivo de polímero superabsorvente de ácido poliaspártico e ácido poliacrílico sensível ao pH incorporado com GHK-Cu.

Autores

Sharma S, Anwar MF, Dinda A, Singhal M, Malik A

Periodico

ACS omega (2019 Dec 03)

Conteudo

Estudos In Vitro e In Vivo do Polímero Superabsorvente de Ácido Poliaspártico e Ácido Poliacrílico Sensível ao pH com GHK-Cu Incorporado
O principal objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência in vitro e in vivo do polímero superabsorvente à base de ácido poliaspártico e ácido acrílico. O polímero sintetizado foi primeiro investigado para verificar a compatibilidade sanguínea por meio de testes de adsorção de proteínas e coagulação sanguínea. Além disso, o peptídeo GHK-Cu foi incorporado ao polímero e estudos de liberação foram realizados para avaliar a eficiência de liberação de fármacos do polímero superabsorvente. O polímero com os melhores resultados de liberação do peptídeo foi posteriormente utilizado para análise in vivo de cicatrização de feridas. A eficiência de cicatrização do polímero com e sem peptídeo foi analisada por meio de fechamento de feridas, ensaios bioquímicos, estudos histopatológicos e de toxicidade.
Introdução
O corpo humano possui um sistema imunológico forte com capacidade de autocura. A pele protege o corpo do ambiente externo. A cicatrização de feridas é um processo ativo que entra em ação assim que a barreira protetora é rompida. Queimaduras graves e feridas associadas podem causar uma resposta de estresse patológico e também grandes cicatrizes que influenciam a vida do paciente. Diferentes níveis de queimaduras exigem cuidados e atenção distintos; por exemplo, queimaduras de primeiro grau, também conhecidas como queimaduras superficiais, causam danos mínimos. Geralmente são tratadas com remédios caseiros e requerem menos tempo de cicatrização. Queimaduras de segundo e terceiro graus são graves e apresentam o maior risco de complicações, como infecção e perda de sangue, resultando em feridas crônicas. O gerenciamento de feridas ganhou importância nos últimos anos. As técnicas de cicatrização melhoraram ao longo do tempo. As técnicas modernas de cicatrização ofuscam os métodos tradicionais. No início dos anos 1980, os produtos tradicionais para cuidados com feridas incluíam gaze, algodão e esponja, que foram substituídos por produtos avançados para cuidados com feridas, como materiais bioativos, após 2000. Esses materiais possuem um componente ativo que é liberado durante a cicatrização da ferida. A principal propriedade do material bioativo é sua capacidade de combater infecções bacterianas, o que promove a cicatrização de feridas. Essas feridas de queimaduras graves são tratadas com diferentes biomateriais, como hidrogéis, polímero superabsorvente (SAP), arcabouços e enxertos de pele.−
Os polímeros superabsorventes são cadeias poliméricas tridimensionais reticuladas com alta capacidade de absorção de fluidos. Esses materiais absorventes especiais são usados em uma variedade de aplicações, desde produtos de higiene pessoal e agricultura até engenharia de tecidos e outros produtos biomédicos. Devido a essas aplicações, esses polímeros estão agora sendo usados na área médica, incluindo cicatrização de feridas. O tamanho do mercado global de SAP foi estimado em 2,07 milhões de toneladas em 2014 e projetado para ultrapassar 3,1 milhões até 2023.
A maioria dos SAPs sintetizados são baseados em monômeros petroquímicos, como acrílico e acrilamida, devido à boa resistência mecânica e propriedade de absorção. A desvantagem do uso desse tipo de monômero é a falta de biocompatibilidade e biodegradabilidade. Assim, os cientistas hoje mudaram seu foco dos SAPs sintéticos para SAPs de base biológica sintetizados a partir de amido, celulose, gomas naturais, quitina, quitosana, alginatos e poli(aminoácidos).
− SAPs de base biológica fornecem alternativas ambientalmente sustentáveis aos materiais fósseis. Esses biopolímeros são candidatos potentes para a síntese de polímeros biocompatíveis, mas carecem de propriedades mecânicas e de absorção. Polímeros naturais, como poli(aminoácidos), polissacarídeos e proteínas, são conhecidos por exibir propriedades bioquímicas e biológicas. Os poli(aminoácidos) podem servir como alternativa aos polímeros derivados do petróleo devido à sua biocompatibilidade e biodegradabilidade. Diferentes poli(aminoácidos, como ácido poliaspártico (PASP), ácido poliglutâmico e poli(lisina), estão sendo amplamente estudados, resultando em polipeptídeos bioativos.
− Esses polipeptídeos possuem biofuncionalidade, o que os diferencia de outros polímeros sintéticos, e por isso estão sendo utilizados em engenharia de tecidos, medicina regenerativa, administração de fármacos, entrega de genes e cicatrização de feridas.
− Diferentes materiais sintéticos e naturais estão sendo usados para a síntese de SAPs. Atualmente, a pesquisa está mais focada em polímeros híbridos, onde polímeros naturais e sintéticos se reticulam para formar hidrogéis com alta absorção e boas propriedades mecânicas. Além disso, as aplicações potenciais desses polímeros híbridos na medicina, saúde e produtos farmacêuticos também devem beneficiar o crescimento do mercado de SAPs.
Os SAPs também são chamados de polímeros responsivos a estímulos, pois respondem a mudanças em estímulos externos, como pH, temperatura, umidade e campo magnético ou elétrico. Esses polímeros produzem alterações em micro ou nanoescala, como mudança na morfologia, ligações moleculares e movimento molecular. Recentemente, polímeros responsivos a estímulos têm atraído grande interesse devido às aplicações in vivo. Esses géis poliméricos estão sendo usados para armazenar, proteger e liberar fármacos no local alvo. Não apenas géis, mas também peptídeos, transportadores de metaloproteínas e materiais reticulados auto-montados à base de peptídeos estão sendo usados como transportadores de fármacos.
−
A cicatrização de feridas é um processo complexo que envolve a deposição sequencial de matriz extracelular, como colágeno e fibronectina. Essa deposição de moléculas da matriz auxilia na formação de novo tecido. GHK é um tripeptídeo complexo que tem sido utilizado na indústria cosmética desde 1973. O complexo GHK apresenta alta afinidade por íons de cobre(II), formando GHK-Cu. Esse complexo metal-peptídeo promove a regeneração tecidual e atua como agente de entrega de cobre necessário para funções celulares. O uso de GHK-Cu em vez de GHK tem aplicação mais potente, pois esse complexo peptídeo-cobre eleva a deficiência de cobre sem danos oxidativos. Esse complexo tripeptídeo-cobre na cicatrização de feridas desempenha um papel importante, pois estimula a produção de colágeno e ajuda a retomar o fluxo sanguíneo para o tecido danificado. Também auxilia na melhora da expressão do fator de crescimento básico de fibroblastos e do fator de crescimento endotelial vascular, que formam vasos sanguíneos.

Em nosso trabalho anterior, discutimos a síntese do polímero superabsorvente usando ácido poliaspártico como polímero natural e ácido acrílico (AA) como monômero sintético, que foram reticulados com dimetacrilato de etilenoglicol (EGDMA) e triacrilato de trimetilolpropano (TMPTA) para formar o polímero superabsorvente. A caracterização de intumescimento do polímero foi realizada expondo-os a diferentes fluidos fisiológicos, como água, soro fisiológico, solução de glicose e em soluções de diferentes valores de pH. Os polímeros sintetizados foram avaliados por técnicas físico-químicas como espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), análise termogravimétrica e microscopia eletrônica de varredura.

No entanto, nosso presente estudo é uma extensão do nosso trabalho anterior, que explicou o estudo in vitro e in vivo do polímero superabsorvente sintetizado a partir de ácido poliaspártico e ácido acrílico. Nosso estudo atual foca na encapsulação e estudos de liberação do peptídeo GHK-Cu. O peptídeo GHK-Cu tem sido utilizado para cicatrização de feridas (estudos in vivo) e produziu resultados satisfatórios. Em nosso trabalho de pesquisa, focamos no uso de GHK-Cu como fármaco e avaliaremos a liberação do peptídeo em feridas de queimadura. O polímero com e sem peptídeo foi então avaliado posteriormente para estudos in vivo. O estudo in vivo inclui fechamento de feridas, ensaio bioquímico, exame histopatológico e estudos de toxicidade.

Resultados e Discussão

Compatibilidade Sanguínea In Vitro do Polímero

Teste de Coagulação Sanguínea e Adsorção de Albumina Sérica Bovina (BSA)/Adsorção de Proteínas

A compatibilidade sanguínea do material polimérico foi avaliada através do teste de coagulação sanguínea e adsorção de proteínas. A análise de coagulação sanguínea explica a propriedade antitrombótica do polímero, enquanto a adsorção de soro bovino ajuda a explicar a trombose. Ambos os estudos auxiliam na escolha do polímero a ser utilizado posteriormente para estudos in vitro e in vivo.
O gráfico de barras na Figura 1 mostra claramente o índice de coagulação sanguínea e os valores de adsorção de proteínas dos polímeros superabsorventes sintetizados utilizando dois reticuladores diferentes, EGDMA e TMPTA.
(a) Índice de coagulação sanguínea
e (b) adsorção de proteínas das amostras de polímero.
Os polímeros superabsorventes foram sintetizados com ácido poliaspártico e ácido acrílico neutralizado, utilizando diferentes reticuladores e iniciador. Os reticuladores utilizados neste estudo foram dimetacrilato de etilenoglicol (EGDMA) e triacrilato de trimetilolpropano (TMPTA), um bifuncional e um trifuncional, respectivamente. O principal objetivo da síntese do polímero superabsorvente foi utilizar um polímero com capacidade de retenção de umidade. Como a umidade acelera a cicatrização de feridas, os polímeros utilizados para cicatrização de feridas devem ser projetados de forma a ter boa absorção e alta biocompatibilidade. A biocompatibilidade é explicada pelo BCI e pelo valor de absorção de proteínas em termos de trombogenicidade. Estudos de biocompatibilidade foram realizados para avaliar as propriedades de biocompatibilidade do polímero à base de ácido poliaspártico e ácido acrílico com os reticuladores EGDMA e TMPTA. O polímero sintetizado deve ter um alto valor de BCI (%) e uma baixa absorção de BSA, o que significa que o material tem alto efeito trombótico. Considerando a Tabela 1 e a Figura 1a, o polímero à base de EGDMA apresenta maior BCI e menores valores de absorção de proteínas do que o TMPTA (Figura 1b). Entre todas as seis amostras, o polímero EGDMA (1:1) apresentou a melhor compatibilidade sanguínea. Portanto, concluiu-se que o SAP à base de EGDMA possui melhor biocompatibilidade do que o SAP à base de TMPTA, o que pode ser posteriormente avaliado em estudos in vitro e in vivo. Estudos de biocompatibilidade sanguínea mostraram que as amostras de EGDMA são mais biocompatíveis.
Índice de Coagulação Sanguínea e Adsorção de Proteínas
de Polímeros à Base de EGDMA e TMPTA
polímero→ PASP:AA (1:5) PASP:AA (1:2) PASP:AA (1:1) parâmetros↓ EGDMA TMPTA EGDMA TMPTA EGDMA TMPTA índice de coagulação sanguínea (%) 58 ± 0,94 58 ± 1,02 51 ± 1,61 21 ± 0,98 71 ± 0,76 24 ± 0,86 adsorção de proteínas (mg/g) 30 ± 1,2 50 ± 1,01 20 ± 0,92 37 ± 1,02 15 ± 0,88 37 ± 1,14
Estudo de Liberação de Peptídeo
A análise in vitro foi realizada para estudar a eficiência do material polimérico com peptídeo. O peptídeo GHK-Cu foi incorporado no polímero com intumescimento e biocompatibilidade otimizados. A proporção de PASP:AA com melhor eficiência foi observada como sendo 1:1 no caso do EGDMA como reticulador e 1:5 no caso do TMPTA como reticulador. Os polímeros foram posteriormente utilizados para analisar as eficiências de liberação e encapsulamento do peptídeo, ou seja, GHK-Cu.
A Figura 2 explica a liberação de GHK-Cu do polímero de ácido poliaspártico e ácido acrílico com dois reticuladores diferentes (Figura 2a,b). A carga de peptídeo foi ainda confirmada por análises de FTIR e espectrometria de energia dispersiva (EDX) para confirmar a presença de GHK-Cu, Figura 3 (SI3). Entre todos os quatro modelos, a liberação de peptídeo das amostras à base de EGDMA e TMPTA segue o modelo de primeira ordem (Tabela 2). O encapsulamento do peptídeo foi confirmado por análises de FTIR e EDX para confirmar a presença de GHK-Cu, Figura 4.
Liberação de peptídeo de
(a) polímero superabsorvente à base de EGDMA e (b) TMPTA.
(a) Espectros de FTIR e (b) EDX do polímero à base de EGDMA encapsulado com peptídeo.
(a) Espectros de FTIR e (b) EDX do polímero à base de TMPTA encapsulado com peptídeo.
Modelos Cinéticos de
Liberação de Peptídeo
Amostras de Polímero
  PASP:AA (E) 1:1 PASP:AA (T) 1:5 modelo R2 n K R2 n K ordem zero 0,842 2,623 2,29 × 1032 0,834 1,506 1,023 × 1040 primeira ordem 0,961 –0,039 75,683 0,916 –0,016 60,815 Korsmeyer Peppas 0,853 0,469 23,1739 0,923 0,253 34,514 Higuchi 0,909 16,69 6,3 × 1012 0,901 9,589 5,88 × 1028
Os estudos in vitro foram realizados para avaliar o material polimérico para aplicação na liberação de fármaco/peptídeo. O peptídeo GHK-Cu foi utilizado como porção de fármaco para o estudo. A eficiência de encapsulamento do polímero na proporção monômero 1:1 com EGDMA como reticulador foi de 78,36%. As liberações do fármaco nos intervalos de tempo de 1, 2, 3, 4, 20 e 24 h são de 15,75 ± 2,01, 38,12 ± 3,38, 45,17 ± 4,72, 59,22 ± 2,78, 84,91 ± 4,06 e 92,61 ± 3,10%, respectivamente. Essa liberação do peptídeo do polímero foi ainda estudada utilizando quatro modelos matemáticos para investigar o mecanismo e o modelo de liberação. A cinética de liberação do polímero à base de EGDMA seguiu cinética de primeira ordem. A eficiência de encapsulamento do polímero com TMPTA foi de 66,01%. A Figura 2b descreve as liberações do fármaco (%) em intervalos de tempo pré-determinados de 1, 2, 3, 4, 20 e 24 h como sendo 30,20 ± 4,14, 42,77 ± 4,89, 48,26 ± 3,25, 55,58 ± 2,75, 69,25 ± 4,89 e 75,32 ± 3,67%, respectivamente. Além disso, o mecanismo de liberação foi avaliado utilizando quatro modelos, a saber: ordem zero, primeira ordem, Korsmeyer Peppas e Higuchi. Essa cinética de liberação do peptídeo do polímero à base de TMPTA seguiu o modelo de Korsmeyer Peppas. O encapsulamento do peptídeo foi confirmado por análises de FTIR e EDX para confirmar a presença de GHK-Cu (Figuras 3 e 4). O polímero à base de EGDMA na proporção 1:1 (PASP:AA) foi ainda avaliado em modelos animais (estudos in vivo), pois esse polímero apresentou boa eficiência de liberação de peptídeo.
Análise In Vivo
A análise in vitro foi realizada em duas amostras, uma com EGDMA como agente de reticulação com razão polímero/monômero 1:1 e outra com TMPTA como agente de reticulação com razão polímero/monômero 1:5, representadas como PASP:AA (E) (1:1) e PASP:AA (T) 1:5, respectivamente. O polímero superabsorvente com EGDMA como agente de reticulação, que apresentou melhores resultados de compatibilidade sanguínea e liberação de peptídeo, foi avaliado posteriormente para estudos in vivo. O polímero encapsulado com peptídeo foi utilizado para avaliar o potencial de cicatrização no leito da ferida. Os estudos in vivo incluem fechamento da ferida, ensaio bioquímico, exame histopatológico e estudos de toxicidade.

Os animais foram organizados como:
Grupo I = controle.
Grupo II (modelo) = ferida queimada (não tratada).
Grupo III (A) = polímero (ácido poliaspártico (PASP) e ácido acrílico).
Grupo IV (A″) = peptídeo encapsulado em polímero (GHK-Cu).
A contração de uma ferida mostra o efeito na cicatrização da ferida. A cicatrização de feridas é um processo complexo que é dificultado por diferentes fatores. Imagens de histopatologia nos ajudaram a prever o processo de cicatrização de feridas no 8º e 15º dias, conforme mostrado na Figura 8. A área de contração da ferida com a aplicação do polímero encapsulado com peptídeo, polímero e controle foi medida nos dias 0, 8 e 15. No dia 0, a ferida foi criada usando um termopar com 26 mm de diâmetro. No dia 0, a ferida foi criada usando termopar com 26 mm de diâmetro. A contração da ferida usando o polímero encapsulado com peptídeo apresentou o fechamento mais rápido da ferida em comparação com o polímero e o controle. No 8º dia, a contração foi observada de 26 para 10 mm com o peptídeo encapsulado no polímero (A″), enquanto para a amostra de polímero (A), a área da ferida foi de 15 mm. Uma cicatrização de 61,53% foi observada com o polímero encapsulado com GHK-Cu e 42,30% apenas com o polímero. No 15º dia, a contração da ferida registrada foi de 4 mm para o polímero encapsulado com peptídeo (A″) e 10 mm para o polímero (A). Assim, 84,61 e 61,58% de cicatrização foram observados com o polímero encapsulado com peptídeo (A″) e apenas com o polímero, respectivamente. A liberação de GHK-Cu na ferida mostrou melhora notável na ferida, com crescimento de pelos observado no leito da ferida no 15º dia. Para o modelo (Grupo II), as áreas da ferida foram medidas em 26, 23 e 25 mm (infecção) nos dias 0, 8 e 15, respectivamente. A análise de fechamento da ferida explica que a ferida tratada pelo polímero incorporado com peptídeo (A″) mostra recuperação rápida da camada epidérmica no 15º dia. As contrações da ferida (%) do polímero encapsulado com peptídeo (A″) no 8º e 15º dias foram de 61,53 e 84,61%, respectivamente. No entanto, as contrações da ferida (%) do polímero de ácido poliaspártico e ácido acrílico (A) no 8º e 15º dias foram de 42,30 e 61,53%, respectivamente. O controle (grupo I) mostra células inflamatórias, camada epitelial e anexos inalterados na pele saudável. O rato modelo (grupo II) apresentou células inflamatórias, tecidos rompidos e proliferação da epiderme com hiperqueratose no 8º dia, enquanto no 15º dia apresentou diminuição da inflamação, mas sem crescimento da camada epitelial. O polímero de ácido poliaspártico e ácido acrílico (grupo III) foi capaz de acelerar o crescimento da camada epitelial no 15º dia e epitelização parcial no 8º dia. O polímero incorporado com peptídeo (grupo IV) (A″) mostrou aumento da camada epitelial do 8º ao 15º dia. Aumento da angiogênese, poucos vasos sanguíneos, proliferação de fibroblastos e anexos presentes no 15º dia confirmam a cicatrização rápida da ferida. O exame histopatológico também confirmou a cicatrização mais rápida encontrada no polímero encapsulado com peptídeo. Os testes de toxicidade mostraram que o polímero com e sem peptídeo não causou toxicidade ao modelo animal utilizado (Figura 5).
Fechamento da ferida nos dias 0,
8 e 15 usando polímero com e
sem GHK-Cu encapsulado (n = 6) (p < 0,05).
Ensaio Bioquímico
Este estudo indica as alterações bioquímicas no 8º e 15º dias. Tecidos de granulação foram coletados no 8º e 15º dias para avaliação bioquímica e antioxidante. A estimativa quantitativa dos parâmetros bioquímicos do tecido da ferida é apresentada na Tabela 3, enquanto a representação gráfica é mostrada na Figura 6. A contração da ferida é ainda corroborada por ensaio bioquímico, histopatologia e estudos de toxicidade. Aumentos significativos (p < 0,05) nos teores de DNA, proteína, hexosamina e hidroxiprolina observados para o polímero encapsulado com peptídeo (A″) após o 8º dia foram de 47, 34, 28 e 29%, respectivamente, e após 15 dias, foram de 64, 43, 50 e 38%, em comparação ao modelo (grupo II). A hidroxiprolina é um marcador da biossíntese de colágeno, enquanto a hexosamina reflete o efeito no tecido de granulação, bem como a estabilização das moléculas de colágeno por interações eletrostáticas e iônicas. A estimativa do teor de DNA e proteína nas feridas indica o potencial mitótico do tecido da ferida.
Atividade de granulação
da ferida usando com (A″) e sem
(A) polímero encapsulado com peptídeo.
Atividade de Granulação da Ferida Usando
com (A″) e sem (A) Polímero Encapsulado com Peptídeo
granulação     modelo A A″ DNA (mg/g) dia 8 1,64 ± 0,12 1,96 ± 0,13 2,41 ± 0,14 dia 15 1,83 ± 0,12 2,41 ± 0,13 3,01 ± 0,13 proteína (mg/g) dia 8 93 ± 4,88 100 ± 4,05 125 ± 4,98 dia 15 98 ± 4,01 110 ± 4,01 140 ± 4,85 hexosamina (mg/g) dia 8 0,50 ± 0,09 0,59 ± 0,07 0,64 ± 0,09 dia 15 0,60 ± 0,08 0,79 ± 0,08 0,90 ± 0,08 hidroxiprolina (mg/g) dia 8 28 ± 1,90 30 ± 2,01 36 ± 1,94 dia 15 29 ± 1,89 34 ± 2,05 40 ± 2,07
Avaliação Antioxidante
As atividades das enzimas antioxidantes—catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa e grupos de espécies reativas de oxigênio (ROS), foram estudadas como uma indicação importante do processo de tratamento, e os valores são relatados na Tabela 4. As atividades enzimáticas foram calculadas usando a pele de todos os seis ratos de cada grupo, tomada como média e incluindo desvio padrão. Na introdução do PASP, polímero AA e polímero com GHK-Cu, esses níveis mudaram ainda mais, indicando reparo tecidual e normalização das concentrações de enzimas e proteínas. Aumento significativo na CAT, SOD e glutationa e diminuição na concentração de ROS foram observados proeminentemente para os grupos IV (A″) em comparação ao grupo II (modelo). Isso mostra uma melhora na cicatrização da ferida com o polímero com GHK-Cu. Uma melhora de 25–50% nos níveis de concentração foi observada com o polímero com GHK-Cu no 15º dia (Tabela 4). Aumento significativo na catalase, superóxido dismutase e glutationa e diminuição na concentração de ROS foram observados proeminentemente nas amostras de polímero encapsulado com peptídeo. A condição da ferida dos animais do grupo II (ferida não tratada) mostrou níveis reduzidos de CAT, SOD e glutationa e níveis aumentados de ROS no caso das amostras de controle.
Atividade Antioxidante
da Ferida Usando
com e sem Polímero Encapsulado com Peptídeo
atividade antioxidante     modelo A A″ catalase (U/mg proteína) dia 8 6,91 ± 0,98 7,96 ± 0,70 8,81 ± 0,50 dia 15 7,03 ± 0,87 8,60 ± 0,65 9,51 ± 0,90 glutationa (U/mg proteína) dia 8 1,48 ± 0,20 1,63 ± 0,23 2,09 ± 0,29 dia 15 1,51 ± 0,21 1,71 ± 0,28 2,20 ± 0,30 superóxido dismutase (U/mg proteína) dia 8 1,32 ± 0,08 1,41 ± 0,08 1,70 ± 0,09 dia 15 1,36 ± 0,07 1,55 ± 0,09 1,69 ± 0,09 espécies reativas de oxigênio (radicais livres) dia 8 3,50 ± 0,21 3,00 ± 0,20 2,16 ± 0,18 dia 15 3,26 ± 0,18 2,50 ± 0,19 1,98 ± 0,21
O efeito de cicatrização máximo foi observado para o polímero com GHK-Cu, que atingiu os valores desejados em comparação ao modelo. A cicatrização da ferida foi observada seguindo a seguinte tendência: modelo < PASP:AA < polímero com GHK-Cu (Figura 7).
Atividade antioxidante da ferida utilizando polímero com e sem peptídeo encapsulado no 8º e 15º dias.
Exame Histopatológico
A contração da ferida em uma ferida mostra o efeito na cicatrização. A cicatrização é um processo complexo que é dificultado por diferentes fatores. Imagens de histopatologia nos ajudaram a prever o processo de cicatrização. As áreas de contração da ferida após a aplicação do polímero encapsulado com peptídeo, do polímero e do controle foram medidas nos dias 0, 8 e 15, conforme mostrado na Figura 8. No dia 0, a ferida foi criada usando um termopar com 26 mm de diâmetro. O controle (grupo I) mostra células inflamatórias, camada epitelial e anexos inalterados na pele saudável. Para o modelo (Grupo II), as áreas da ferida foram de 26, 23 e 25 mm (infecção) nos dias 0, 8 e 15, respectivamente. O rato modelo (grupo II) apresentou células inflamatórias, tecidos rompidos e proliferação da epiderme com hiperceratose no 8º dia, enquanto no 15º dia houve diminuição da inflamação, mas sem crescimento da camada epitelial. No 8º dia, observou-se contração de 26 para 10 mm com o peptídeo encapsulado em polímero (A″), enquanto para a amostra de polímero (A), a área da ferida foi de 15 mm. Observou-se cicatrização de 61,53% com o polímero encapsulado com GHK-Cu e 42,30% com o polímero isolado. No 15º dia, a contração da ferida registrada foi de 4 mm para o polímero encapsulado com peptídeo (A″) e 10 mm para o polímero (A). Assim, foram observados 84,61% e 61,58% de cicatrização com o polímero encapsulado com peptídeo (A″) e com apenas o polímero, respectivamente. O polímero de ácido poliaspártico e ácido acrílico (grupo III) foi capaz de acelerar o crescimento da camada epitelial no 15º dia e a epitelização parcial no 8º dia. O polímero incorporado com peptídeo (grupo IV) (A″) mostrou aumento da camada epitelial do 8º ao 15º dia. O aumento da angiogênese, poucos vasos sanguíneos, proliferação de fibroblastos e anexos presentes no 15º dia confirmam a cicatrização rápida da ferida. A liberação de GHK-Cu na ferida mostrou melhora notável na ferida, com crescimento de pelos observado no leito da ferida no 15º dia. O exame histopatológico também confirmou a cicatrização mais rápida encontrada no polímero encapsulado com peptídeo. A contração da ferida usando o polímero encapsulado com peptídeo mostrou fechamento mais rápido da ferida do que o polímero e o controle. A análise do fechamento da ferida explica que a ferida tratada com o polímero incorporado com peptídeo (A″) mostra rápida recuperação da camada epidérmica no 15º dia.
Fotomicrografias histopatológicas de
diferentes grupos no 8º dia:
(a) controle (grupo I); (b) queimado (grupo II); e (c) grupos tratados com PASP:AA
(grupo III-A). (d) Polímero com GHK-Cu (grupo IV-A″)
e no 15º dia, (e) queimado (grupo II), (f) PASP:AA (grupo III-A),
e (g) polímero com GHK-Cu (grupo IV-A″).
Testes de Toxicidade
Os testes de toxicidade foram realizados para analisar o efeito tóxico do material polimérico e do material polimérico encapsulado com peptídeo no fígado e nos rins. Os testes foram realizados em soro separado do sangue. O procedimento para esses testes é explicado em detalhes nas Informações de Apoio (SI2). Há uma faixa de referência padrão para todos os testes de toxicidade mencionados na Tabela 5. Pela Tabela 5, fica claro que todos os testes de toxicidade realizados foram em série. Os animais do grupo controle e do grupo modelo não apresentaram toxicidade devido à aplicação do material polimérico (Figura 9).
Níveis de toxicidade encontrados em ratos após o uso de material
polimérico para
cicatrização de feridas.
Níveis de Toxicidade Encontrados
em Ratos Após
o Uso de Material Polimérico para Cicatrização de Feridas
testes hepáticos     controle modelo A A″ TGO (U/L) faixa de referência (45,7–80,8) dia 8 45 ± 2,43 48 ± 2,84 65 ± 2,55 50 ± 3,01 dia 15 46 ± 2,01 50 ± 2,76 61 ± 2,65 51 ± 2,98 TGP (U/L) faixa de referência (17,5–30,2) dia 8 18 ± 2,11 20 ± 2,21 25 ± 3,07 28 ± 3,11 dia 15 19 ± 2,15 27 ± 2,78 26 ± 2,98 29 ± 2,88 FAL (U/L) faixa de referência (0,2–0,8) dia 8 0,21 ± 0,01 0,28 ± 0,02 0,40 ± 0,03 0,30 ± 0,02 dia 15 0,22 ± 0,02 0,29 ± 0,01 0,41 ± 0,03 0,29 ± 0,03 Bilirrubina (mg/dL) faixa de referência (15–21) dia 8 16,00 ± 1,67 16,75 ± 1,37 19,34 ± 1,84 18,33 ± 1,99 dia 15 17,10 ± 2,01 16,18 ± 1,60 20,56 ± 1,92 19,23 ± 2,06 Testes Renais ureia nitrogênio (mg/dL) faixa de referência (56,8–128) dia 8 61 ± 3,87 64 ± 4,30 82 ± 3,77 67 ± 3,60 dia 15 62 ± 3,43 65 ± 3,98 85 ± 4,22 68 ± 4,01 creatinina (mg/dL) faixa de referência (0,2–0,55) dia 8 0,23 ± 0,02 0,30 ± 0,03 0,35 ± 0,02 0,27 ± 0,02 dia 15 0,25 ± 0,03 0,29 ± 0,04 0,38 ± 0,02 0,28 ±0,03
Conclusões
Para concluir, sintetizamos um polímero superabsorvente biocompatível à base de ácido poliaspártico. Esse superabsorvente sintetizado foi carregado com um peptídeo com propriedades cicatrizantes. O polímero encapsulado com peptídeo (A″) é mais eficiente para a cicatrização de feridas em comparação com os polímeros isolados (A). O GHK-Cu demonstrou produzir cicatrização eficaz de feridas. A notável cicatrização utilizando o polímero encapsulado com peptídeo foi confirmada por fechamento da ferida, ensaio bioquímico, exame histopatológico e estudos de toxicidade.
Seção Experimental
Preparação do Polímero à Base de Ácido Poliaspártico e Ácido Acrílico
A síntese do polímero superabsorvente à base de ácido poliaspártico e ácido acrílico foi discutida em detalhes em nosso trabalho anterior. Diferentes polímeros foram sintetizados variando a proporção de ácido poliaspártico (PASP), ácido acrílico (AA) com iniciador e reticulante (EGDMA e TMPTA) em uma faixa de temperatura constante de 80–85 °C. O polímero com maior intumescimento em água foi posteriormente estudado, conforme explicado em nossa última pesquisa. O polímero sintetizado foi colocado em saco de diálise (tamanho de poro) de 10 kDa em água por 7 dias para remover o monômero não reagido.
Estudos In Vitro
Compatibilidade Sanguínea In Vitro dos Polímeros Sintetizados
Adsorção de Albumina de Soro Bovino (BSA) / Adsorção de Proteínas
A quantidade de proteína adsorvida (mg/g) foi calculada usando a seguinte equação (SI1) onde
C0 = concentração de BSA antes da adsorção (mg/mL).
Ca = concentração de BSA após a adsorção (mg/mL).
W = peso do hidrogel intumescido (g).
V = volume da solução de BSA utilizado (mL).
Todas as medições foram feitas em triplicata e as médias desses valores, juntamente com o desvio padrão, foram relatadas.
Teste de Coagulação Sanguínea
O índice de coagulação sanguínea (BCI) foi calculado usando a seguinte equação (SI2): onde
ODt = densidade óptica da amostra teste.
ODc = densidade óptica da amostra controle.
Todas as medições foram feitas em triplicata e relatadas tomando-se a média e calculando o desvio padrão.
Encapsulação do Peptídeo
A eficiência de encapsulação foi medida comparando os espectros de absorção UV da amostra polimérica carregada com peptídeo usando a curva de calibração do peptídeo (SI3).
A eficiência de encapsulação foi calculada usando a seguinte equação
Estudos de Liberação do Peptídeo
A quantidade de peptídeo liberado foi medida a 605 nm usando espectrofotômetro UV em intervalos de tempo predeterminados, ou seja, 1, 2, 3, 4 e 24 h. Uma alíquota (3 mL) foi usada para a medição da absorbância. O volume da solução foi mantido retornando as alíquotas após a medição (SI4).
Estudos In Vivo
Agrupamento e Dosagem dos Animais
Grupo I = controle.
Grupo II (modelo) = ferida queimada (não tratada).
Grupo III (A) = polímero (ácido poliaspártico (PASP) e ácido acrílico).
Grupo IV (A″) = polímero encapsulado com peptídeo (GHK-Cu).
Foi utilizado um total de 24 ratos Wistar com peso de 220 ± 20 g. Os experimentos com animais foram realizados de acordo com a aprovação ética (949/IAEC/16) e as diretrizes do All India Institute of Medical Sciences, Nova Delhi, Índia. Os animais foram mantidos separadamente em gaiolas limpas e divididos em três grupos.
Os experimentos in vivo foram realizados em triplicata com seis animais em cada grupo II, III e IV e três animais no grupo controle.
Modelo de Ferida por Queimadura de Excisão
Ratos Wistar (220 ± 20 g) foram anestesiados, e os pelos dorsais foram raspados e higienizados usando etanol. Uma haste cilíndrica de aço inoxidável com 35 mm de diâmetro e cabo de borracha isolado foi usada para as queimaduras. A temperatura foi mantida pelo instrumento de acordo com a alimentação. A temperatura para queimadura de segundo grau foi de 100 °C. A duração da queimadura no rato Wistar foi de 30 s. Após criar a ferida por queimadura, os materiais poliméricos foram aplicados no leito da ferida.
Medição da Área da Ferida
A contração da ferida foi medida no 8º e 15º dias usando um paquímetro vernier. A taxa de cicatrização comparativa foi avaliada comparando a contração média da ferida em relação ao controle. A porcentagem de contração da ferida foi calculada usando a seguinte equação onde
W0 = área da ferida no dia zero.
Wn = área da ferida no n-ésimo dia (n = 8, 15).
Os tecidos foram coletados no 8º e 15º dias para análise bioquímica. Os tecidos de granulação foram avaliados quanto a DNA, proteína, hidroxiprolina e hexosamina. Os níveis antioxidantes no tecido foram avaliados estudando os níveis de glutationa, catalase, superóxido dismutase e espécies reativas de oxigênio. Todos os métodos estão descritos nas Informações de Suporte (SI5).
Avaliação Histopatológica
Para a avaliação histopatológica, os animais foram sacrificados no 8º e 15º dias, pois os tecidos da ferida foram fixados com solução de formalina a 10%. Blocos de tecido em parafina foram preparados e seccionados usando micrótomo (RM 2235, Alemanha). Os tecidos seccionados foram coletados em lâminas de vidro, corados com hematoxilina e eosina e avaliados ao microscópio. Os corantes Hematoxilina e Eosina foram utilizados para visualizar e diferenciar os tecidos de controle, modelo, polímero e polímero incorporado com peptídeo. Todos os parâmetros morfométricos foram registrados usando um analisador de imagens (microscópio Olympus BX61, Japão). As regiões epidérmica e dérmica foram avaliadas. Fotomicrografias digitais foram capturadas e as feridas foram avaliadas quanto à formação e regeneração de novos capilares sanguíneos.
Testes de Toxicidade
Os testes de toxicidade foram realizados para investigar o efeito do polímero e do polímero incorporado com peptídeo no fígado e nos rins. Amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca dos ratos. O soro separado do sangue foi utilizado para realizar testes hepáticos e renais. Esses testes hepáticos incluem SGOT, SGPT, FA e Bilirrubina, enquanto os testes de ureia nitrogenada e creatinina são para avaliar o teor de toxicidade presente no rato.− A explicação detalhada dos testes de toxicidade é apresentada nas Informações de Suporte (SI6).
Análise Estatística
Todos os valores são apresentados como média ± desvio padrão usando o software GraphPad Prism. As análises estatísticas foram realizadas usando o teste t. Valores de P < 0,005 foram considerados significativos.
Informações de Suporte Disponíveis
Hemocompatibilidade, liberação de peptídeo, análise bioquímica e análise de toxicidade (PDF)
As Informações de Suporte estão disponíveis gratuitamente no site da ACS Publications em DOI: 10.1021/acsomega.9b00655.
Material Suplementar
Endereço Atual do Autor
∥ Departamento de Química, Manav Rachna University, Faridabad 121004, Índia (S.S.).
Os autores declaram o(s) seguinte(s) interesse(s) financeiro(s) concorrente(s): O financiamento foi fornecido pela Universidade de Grant Commision, Nova Delhi, Índia (Nº do Grant: F.No. 42-255/2013 (SR)).
Abreviações
PASP
ácido poliaspártico
AA
ácido acrílico
SAP
polímeros superabsorventes
GHK-Cu
glicil-l-histidil-l-lisina-cobre
EDX
espectrometria de dispersão de energia
BSA
albumina sérica bovina
PBS
solução salina tamponada com fosfato
ACD
citrato dextrose ácido
BCI
índice de coagulação sanguínea
EGDMA
etilenoglicoldimetacrilato
TMPTA
trimetilolpropanotriacrilato
PASP:AA (E)
polímero superabsorvente à base de ácido poliaspártico e ácido acrílico usando reticulante EGDMA
PASP:AA (T)
polímero superabsorvente à base de ácido poliaspártico e ácido acrílico usando reticulante TMPTA
TCA
ácido tricloroacético
SGOT
transaminase glutâmico-oxaloacética sérica
SGPT
transaminase glutâmico-pirúvica sérica
ALP
fosfatase alcalina
BUN
nitrogênio ureico no sangue
Referências
Materiais de terceira geração para curativos
A fisiologia da cicatrização de feridas
Pele: histologia e fisiologia da cicatrização de feridas
Tratamento de Queimaduras
Cuidados com Feridas
Biorrecursos na farmacoterapia e cicatrização de queimaduras: Uma minirrevisão
Lesão por Queimadura: Desafios e avanços na cicatrização de feridas por queimadura, infecção, dor e cicatrizes
Curativos terapêuticos avançados para cicatrização eficaz de feridas - Uma revisão
Curativos de hidrogel para tratamento bioativo de feridas agudas e crônicas
Arcabouços nanofibrosos à base de amido para aplicações em cicatrização de feridas
Novas tendências na aplicação de células-tronco na cicatrização de feridas cutâneas
Materiais poliméricos superabsorventes: uma revisão
Avanços em aplicações não-higiênicas de materiais de hidrogel superabsorvente
Preparação e propriedades de hidrogéis superabsorventes de quitosana quaternária-g-poli(ácido acrílico-co-acrilamida)
Compreendendo a microestrutura e a taxa de absorção de polímeros superabsorventes à base de amido preparados sob alta concentração de amido
Liberação sustentada do fármaco atenolol usando hidrogéis compósitos biodegradáveis à base de goma dammar reticulada com poliacrilamida e zircônio
Modulação da higroscopicidade de hidrogéis à base de complexos polieletrolíticos de carboximetilquitosana/algina e sua aplicação como sistema de liberação sensível ao pH
Síntese livre de ureia de polímeros superabsorventes de acrilato à base de quitina sob condições homogêneas: Efeitos do grau de desacetilação e do peso molecular
Hidrogéis superabsorventes à base de polissacarídeos para aplicação na agricultura como condicionador de solo e transportador de nutrientes: Uma revisão
Polímeros superabsorventes à base de ácido poliaspártico
Hidrogéis termo/pH responsivos à base de PNIPAAm reticulados por ácido γ-poliglutâmico para liberação controlada de fármacos
Preparação, caracterização e avaliação da biocompatibilidade de hidrogéis de rede interpenetrante de poli(N-acriloil-L-lisina)/ácido hialurônico
Hidrogéis à base de carragenana para liberação de fármacos, engenharia de tecidos e cicatrização de feridas
Partículas poliméricas, filmes e hidrogéis multirresponsivos a estímulos para liberação de fármacos
Polímeros Superabsorventes e Suas Aplicações Médicas
Bioquímica, Fabricação e Aplicações Médicas
Nanocarreadores responsivos a estímulos internos para liberação de fármacos: Design, estratégias e aplicações
Design, síntese e aplicação de uma nova classe de materiais de separação responsivos a estímulos
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Nanofármacos metalo-fotodinâmicos supramoleculares baseados em pequenos peptídeos projetados por automontagem de coordenação multicomponente
Nanocarreadores injetáveis automontados à base de dipeptídeos para liberação tumoral e terapia fotodinâmica in vivo eficaz
Co-montagem de nanopartículas híbridas de heparina e polipeptídeo para entrega biomimética e terapia antitrombo
Matriz extracelular e cicatrização de feridas
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