pmid: "32867146"
title: "Complexo Ternário de Cu(II) com o Peptídeo GHK e"
authors: "Bossak-Ahmad K, Wiśniewska MD, Bal W, Drew SC, Frączyk T"
journal: "International journal of molecular sciences"
pubdate: "2020 Aug 27"
doi: "10.3390/ijms21176190"
source: "PMC Full Text"

Complexo Ternário de Cu(II) com o Peptídeo GHK e

Autores

Bossak-Ahmad K, Wiśniewska MD, Bal W, Drew SC, Frączyk T

Periodico

International journal of molecular sciences (2020 Aug 27)

Conteudo

Complexo Ternário de Cu(II) com o Peptídeo GHK e Ácido Cis-Urocânico como um Potencial Quelato de Cobre Fisiologicamente Funcional

O tripeptídeo NH2–Gly–His–Lys–COOH (GHK), o ácido cis-urocânico (cis-UCA) e os íons Cu(II) são constituintes fisiológicos do corpo humano e ocorrem juntos (por exemplo, na pele e no plasma). Embora o GHK seja conhecido como uma molécula ligante de Cu(II), descobrimos que o ácido urocânico também coordena íons Cu(II). Além disso, ambos os ligantes criam um complexo ternário de Cu(II) que provavelmente é uma espécie fisiologicamente funcional. Considerando as concentrações naturais das moléculas estudadas em alguns tecidos humanos, juntamente com as afinidades aqui relatadas, concluímos que o complexo ternário [GHK][Cu(II)][ácido cis-urocânico] pode ser parcialmente responsável pelos efeitos biológicos do GHK e do ácido urocânico descritos na literatura.

1. Introdução

O peptídeo Gly–His–Lys (GHK) é um constituinte nativo do sangue humano. Ele possui inúmeras ações, incluindo atividades de cicatrização de feridas, anti-inflamatórias e ansiolíticas, que podem resultar da interação com receptores não identificados. Importante, o GHK modula a expressão de muitos genes. Foi proposto que quase todos os efeitos observados do peptídeo são evocados por um complexo GHK–cobre(II).

O ácido urocânico (UCA) é um componente do fator de hidratação natural (NMF) na camada mais superficial da pele (estrato córneo). Também é encontrado no sangue e nos neurônios. O UCA é o produto da desaminação da histidina pela histidina amônia-liase (histidase). O isômero trans formado (trans-UCA) isomeriza-se em cis-UCA após exposição à radiação ultravioleta (Esquema 1). Ambos os isômeros se acumulam no estrato córneo, atingindo concentrações milimolares, e estão presentes no plasma em concentrações micromolares. Recentemente, foi descoberto que o UCA pode atravessar a barreira hematoencefálica e ser transportado para os neurônios. Além disso, a atividade da histidase também foi encontrada nos neurônios. Importante, há uma correlação positiva entre o conteúdo de histidina (o substrato para a produção de UCA) e a cicatrização de feridas. O UCA tem muitas funções, incluindo manutenção da hidratação da pele, regulação do pH, proteção UV e imunossupressão.

Mostramos anteriormente que o UCA pode ligar íons Ni(II). Tendo em mente a semelhança da formação de complexos de Ni(II) e Cu(II) com muitos compostos de baixo peso molecular, a ligação do cobre pelo UCA é concebível.

Interessantemente, o GHK e o UCA coexistem em alguns tecidos humanos e possuem atividades biológicas comuns, como influenciar os sistemas imunológico e nervoso. Como cada um também pode ligar íons metálicos, levantamos a hipótese de que as formas biologicamente ativas de GHK e UCA podem incluir um complexo ternário com íons Cu(II).

Neste trabalho, provamos que o GHK forma complexos ternários de Cu(II) com cis-/trans-UCA. Os resultados obtidos por espectrofotometria UV-vis e dicroísmo circular (CD), ressonância paramagnética eletrônica (EPR) à temperatura ambiente e potenciometria sugerem que tais complexos podem estar presentes no corpo humano.
2.1. Interação de Cu(II) com GHK
Para caracterizar minuciosamente a interação ternária do ácido urocânico, GHK e Cu(II), decidimos revisitar a coordenação de Cu(GHK) por meio de estudos espectroscópicos e potenciométricos. Esta etapa é necessária para a comparação precisa de experimentos envolvendo Cu/GHK e Cu/GHK/UCA. Nesse contexto, também detalhamos o Cu(GHK)2, o complexo que foi relatado anteriormente por Conato et al..
We report here a refined potentiometric model that incorporates mono- and bis- Cu(II) complexes with GHK and is supported by the spectroscopic characterization of these species.
GHK has four exchangeable protons, attached (in the decreasing order of pK values) to the lysine side chain nitrogen, N-terminal amine, histidine imidazole (Im) nitrogen, and C-terminal carboxylate.
Their protonation constants reported herein (Table S1) are in agreement with the literature data.
Potentiometry of Cu/GHK identified six Cu(II) species, namely Cu(II)aq, CuH(GHK), Cu(GHK), CuH−1(GHK), CuH−2(GHK), and CuH2(GHK)2.
The calculated logβ values and the ascribed protonation events are presented in Table S1.
We validated our potentiometric model by combining two sets of pH-metric titrations with spectroscopic detection, the first set using 0.95 mM GHK in the presence of 0.8 mM CuCl2 (Figure S1), and the second using a 20-fold molar excess of GHK (10.63 mM GHK and 0.5 mM CuCl2).
In an equimolar Cu/GHK solution, the variation in absorbance at 605 nm at low pH yielded a Hill coefficient of 2.03 ± 0.32, suggesting the cooperative formation of two species that can be ascribed to CuH(GHK) and Cu(GHK) stoichiometries.
These 3N complexes differ only by the protonation state of the C-terminal carboxyl group and have identical d–d bands.
Above pH 4.5, CD spectra obtained with a high excess of GHK exhibited a more prominent blue-shift compared with the equimolar complex.
This suggests the coordination of an external nitrogen donor at the fourth planar Cu(II) site.
Such complex corresponds to CuH2(GHK)2 stoichiometry.
However, the observed changes in the electronic spectra are very similar to those seen previously in ternary complexes of other Xaa-His peptides (where Xaa is any amino acid residue except Pro) with imidazole (3+1N coordination, where three nitrogen atoms, NH3+ (N-term), Namide, and NIm, are from the first peptide molecule, and one nitrogen atom is NIm from the second peptide molecule).
Therefore, we assign the 3+1N coordination to this complex and propose to call it “auto-ternary”, with the actual Cu(GHK)(H2GHK) stoichiometry.
Two additional deprotonations occur in the mono-complex at alkaline pH.
The first probably corresponds to a water molecule (pK = 9.61) within the equatorial plane of the Cu(GHK) species.
Another is associated with the ε-amino nitrogen (pK = 10.77) from a side chain of Lys residue.
The aforementioned assignment of the deprotonation to a water molecule instead of an imidazole N1 from another Cu(GHK) complex (with concomitant polynuclear species formation) is rationalized by the lack of drastic changes of CD parameters that would be expected upon formation of imidazole-bridged dimeric or tetrameric species.
O índice de competitividade (IC) é um parâmetro conveniente para comparar as afinidades aparentes de complexos com várias estequiometrias e estados de protonação. O valor do IC é igual ao logβ de um complexo MZ de um íon metálico (M) com um ligante teórico Z capaz de superar 50% do íon metálico do ligante testado ou sistema de ligantes em condições dadas, como pH específico e concentrações dos reagentes, quando [Z] = [L] (L é um ligante a ser comparado). A molécula Z deve ligar-se apenas em estequiometria 1:1 e não possuir grupos desprotonantes. Isso é equivalente à suposição de que . Em casos simples, o IC corresponde à constante de estabilidade condicional, cK. Utilizamos dados potenciométricos obtidos para Cu/GHK e o método IC para calcular as constantes de estabilidade condicional para o complexo equimolar Cu(II)/GHK em [GHK] = [Cu] = 1 µM em pH 7,4, cK7,4 = 4,17 × 1012 M−1 e pH 6,5, cK6,5 = 4,79 × 1010 M−1, correspondendo a constantes de dissociação condicional de 0,24 e 20,9 pM, respectivamente. O valor do IC aumenta para maior excesso de GHK sobre Cu(II), resultando da formação do complexo autoternário Cu(GHK)2. No entanto, o aumento notável do IC foi observado para concentrações milimolares de GHK (Figura S2).
Vários grupos estudaram anteriormente os complexos Cu/GHK. Nossos valores calculados de constantes de protonação e formação são os mais próximos daqueles obtidos por Lau et al. e Conato et al., dois grupos que também utilizaram potenciometria para calcular as constantes de ligação. Os valores publicados por outros (usando EPR e ITC) são ligeiramente maiores que os nossos, muito provavelmente decorrentes da omissão da estequiometria Cu(GHK)2 em seus modelos.
Conforme mencionado acima, o GHK coordena o cobre por meio de um quelato nitrogenado tridentado, com o quarto sítio de ligação aberto para coordenação por um ligante externo. Esse ligante pode ser uma molécula de solvente ou, no caso do Cu(GHK)2, um nitrogênio imidazólico de uma segunda molécula de GHK. Para caracterizar a formação desse complexo em pH fisiológico, acompanhamos a titulação de GHK em Cu(GHK) a pH 7,4 utilizando espectroscopias UV-vis, EPR e CD (Figura 1, Tabela S2), juntamente com calorimetria de titulação isotérmica (ITC, Figura S3, Tabela S3). O excesso de GHK causou um deslocamento para o azul do máximo de absorbância em 27 nm nos espectros UV-vis (Figura 1A) e em 28 nm nos espectros CD (Figura 1B). Espectros de EPR à temperatura ambiente revelaram a presença de duas espécies com média de movimento, delineadas por pontos isosbésticos claros (Figura 1C), confirmando a existência de apenas dois modos de coordenação de Cu(II). Simulações dos espectros de EPR, incluindo a estrutura hiperfina do ligante, foram consistentes com a atribuição de espécies 3N e 4N para Cu(GHK) e Cu(GHK)2, respectivamente (Figura S4, Tabela S2). O ajuste global de todos os dados espectroscópicos produziu um valor de cK7.4 = 237 ± 5 M−1 para o complexo Cu(GHK)2 (Figura 1D,E), enquanto a análise independente das titulações por ITC resultou em cK7.4 = 265 ± 46 M−1 (Figura S3). Esse valor é significativamente menor do que o valor de aproximadamente 500 M−1 que poderia ser inferido a partir das constantes de estabilidade potenciométricas relatadas por Conato et al.. A análise retrospectiva das condições experimentais no estudo deles, bem como no nosso, indica que interações tão fracas não poderiam ser determinadas de forma confiável por potenciometria, e nossa determinação espectroscópica é a única abordagem válida.
2.2. Interação de Cu(II) com UCA
Por analogia com a formação de Cu(GHK)2, outros ligantes externos poderiam contribuir para a esfera de coordenação de Cu(GHK). Ligantes baseados em imidazol podem aumentar a afinidade geral de complexos metálicos contendo ligantes tridentados em várias ordens de grandeza. O ácido urocrânico, um subproduto da L-histidina, contém um anel imidazólico que poderia formar um complexo ternário estável de Cu(II) com GHK de maneira semelhante a outros peptídeos Xaa-His, como Trp–His–Trp–Ser–Lys–Asn–Arg, Gly–His–Thr–Asp e Ala–His–His.
Uma série de experimentos de controle foi realizada tanto para cis- quanto trans-UCA na presença de Cu(II). Caracterizamos previamente a interação de cis- e trans-UCA com íons Ni(II) e descobrimos que os complexos eram suficientemente estáveis para ter relevância biológica potencial. Dos dois isômeros, o cis-UCA liga íons Ni(II) mais fortemente devido ao efeito quelato de seu nitrogênio imidazólico e oxigênio carboxílico. Assim, focamos nos complexos binários e ternários de Cu(II) com cis-UCA e GHK. As constantes de formação logarítmicas para os complexos Cu/cis-UCA são fornecidas na Tabela 1, e os dados espectroscópicos usados para validar o modelo potenciométrico são mostrados na Figura 2.
Como esperado com base na série de Irving–Williams, o valor de logβ do Cu(cis-UCA) é maior que o do Ni(cis-UCA) (4,941 vs 3,406). Analogamente, a constante de formação do Cu(cis-UCA)2 é maior que a do Ni(cis-UCA)2 (8,76 vs. 6,239). De modo semelhante ao complexo de Ni(II), a ligação da segunda molécula de cis-UCA é mais fraca em comparação com a primeira (por 1,12 unidades log). Isso pode ser atribuído tanto a um número reduzido de modos de ligação bidentada para o segundo ligante quanto à repulsão entre os grupos carboxila das duas moléculas de cis-UCA. Na aproximação octaédrica da estrutura do complexo, o primeiro fator é igual a 0,38 (log(24/10)), resultante da redução dos modos de ligação de 24 para a primeira molécula para 10 para a segunda. Assim, a repulsão entre grupos carboxila contribui mais fortemente para o enfraquecimento da ligação da segunda molécula de cis-UCA (0,74 unidade log). A constante de ligação dependente do pH para o complexo 1:1 Cu(cis-UCA) é cK7,4 = 7,16 × 10⁴ M⁻¹ e cK6,5 = 3,16 × 10⁴ M⁻¹, respectivamente, correspondendo a constantes de dissociação condicionais de 14,0 µM e 31,6 µM, respectivamente. No entanto, como as concentrações de cis-UCA são geralmente mais altas que a concentração de Cu(II) trocável, o complexo Cu(cis-UCA)2 é promovido, aumentando a afinidade aparente desta molécula por íons Cu²⁺. De fato, os valores de CI para tais complexos para 1 µM de Cu(II) e níveis milimolares de cis-UCA são aumentados em pelo menos uma unidade log (Figura S7). A redução do pH diminui ligeiramente a força da ligação do Cu(II) (em menos de uma unidade log). As maiores concentrações conhecidas de cis-UCA ocorrem no estrato córneo, e assim os complexos Cu(cis-UCA) podem ocorrer principalmente na pele; no entanto, uma constante de dissociação micromolar torna a formação do complexo Cu(cis-UCA) no sangue plausível.
O Cu(trans-UCA) foi propenso à precipitação sob as mesmas condições experimentais que o Cu(cis-UCA), o que impediu a caracterização adequada do complexo binário. Esta precipitação pode ter resultado da menor estabilidade do complexo Cu(trans-UCA), levando à formação de Cu(OH)₂ insolúvel em pH > 5. De fato, experimentos de controle confirmaram que um excesso molar de trans-UCA promoveu a formação de um complexo CuL₂ mais estável.
2.3. Formação do Complexo Ternário de Cu/GHK/Imidazol
Para quantificar a interação ternária de ligantes à base de imidazol com o complexo Cu(GHK) em pH 7,4, titulamos até 40 equivalentes molares de Im em soluções contendo 0,5 mM de Cu(II) e 0,63 mM de GHK e monitoramos as mudanças correspondentes nos espectros de UV-vis, CD e RPE (Figura 3). Concentrações crescentes de Im resultaram em um deslocamento para o azul das transições d-d nos espectros de absorbância (35 nm) e CD (43 nm) (Figura 3A,B). No entanto, não observamos qualquer diminuição na elipticidade total, indicando que um complexo Cu(GHK)(Im) foi formado em vez dos complexos aquirais Cu(Im)n (que são silenciosos em CD). O ponto isosbéstico em 601 nm (UV-vis) e o ponto isodicroico em 581 nm (CD) mostraram que Cu(GHK)(Im) foi formado pela substituição da água equatorial em Cu(GHK) por Im. Espectros de RPE à temperatura ambiente revelaram a presença de duas espécies com média de movimento delineadas por pontos isosbésticos claros (Figura 3C), confirmando a existência de apenas dois modos de coordenação de Cu(II), como no experimento Cu(GHK)/GHK. Simulações dos espectros de RPE, incluindo a estrutura hiperfina do ligante, foram consistentes com a atribuição de espécies 3N e 4N para Cu(GHK) e Cu(GHK)(Im), respectivamente (Figura S8, Tabela S2). O tempo de correlação rotacional de Cu(GHK)(Im) foi comparável ao de Cu(GHK), como esperado com base em seus pesos moleculares semelhantes. Os parâmetros magnéticos de Cu(GHK)(Im), no entanto, foram quase idênticos aos que caracterizam Cu(GHK)2, consistentes com sua primeira esfera de coordenação comum. Evidências adicionais para a estrutura proposta da espécie ternária foram obtidas substituindo 15NIm por 14NIm, o que produziu uma mudança no padrão hiperfino do ligante esperado para um ligante Im equatorial (Figura S8). O ajuste global de todos os dados espectroscópicos resultou em um valor de cK7,4 = 725 ± 22 M−1 (Figura 3D,E) para Cu(GHK)(Im), que é comparável aos valores previamente relatados para os peptídeos Xaa-His Trp–His–Trp–Ser–Lys–Asn–Arg (1022 ± 70 M−1) e Gly–His–Thr–Asp (440 ± 14 M−1). Também determinamos um valor de cK7,4 = 532 ± 44 M−1 para o complexo Cu(GHK)(Im) usando ITC (Figura S12 e Tabela S3). Esse valor é menor do que o obtido usando métodos espectroscópicos, e pode ser decorrente do uso do tampão HEPES nos experimentos de ITC.
Além disso, a análise do sistema ternário foi realizada utilizando titulações métricas de pH por CD e UV-vis de 0,95 mM de GHK, 0,8 mM de CuCl2 e 50 mM de Im, juntamente com uma série de titulações potenciométricas (Figura S13) nas proporções de 1:0,9:4, 1:0,9:6 e 1:0,9:8 (GHK):(Cu):(Im). Em pH abaixo de 5, cinco espécies de cobre foram identificadas, a saber: um íon aqua (absorção máxima em 816 nm), dois complexos de imidazol com cobre, Cu(Im) e Cu(Im)2, e dois complexos peptídicos 3N, CuH(GHK) e Cu(GHK). Sendo aquirais, os complexos de imidazol são silenciosos nos espectros de CD, mas produziram um pequeno ombro em 730 nm nos espectros de UV-vis em pH baixo. Um aumento do pH leva ao início do domínio de Cu(GHK) até que um imidazol externo comece a deslocar o ligante água equatorial do complexo. Isso é visível por um deslocamento de 43 nm da banda d-d nos espectros de CD (Figura S13A,B). Sob as condições dadas (0,95 mM de GHK, 0,8 mM de CuCl2, 50 mM de Im, pH 7,4), o complexo ternário corresponde a 96,5% do cobre disponível, enquanto 3,4% e 0,2% estão ligados a Cu(GHK) e Cu(GHK)2, respectivamente. Um pouco menos do complexo ternário (89,5%) é formado em pH 6,5, com Cu(GHK) correspondendo a 10,1% do cobre disponível, e os 0,4% restantes ligados a Cu(GHK)2 (Figura S13C).
2.4. Formação do Complexo Ternário de Cu/GHK/UCA
Sabendo como o imidazol interage com Cu(GHK), prosseguimos com os experimentos com Cu(GHK) e UCA. Devido à complexidade das interações biológicas e à possível translocação de UCA do estrato córneo para outros locais que diferem em pH, é importante caracterizar a distribuição de espécies do sistema Cu/GHK/UCA em uma ampla faixa de pH. Devido à interação mais forte de Cu(GHK) com o isômero cis-UCA e à menor estabilidade mencionada anteriormente de Cu(trans-UCA), focamos nas interações Cu/GHK/cis-UCA.
Primeiramente, utilizamos potenciometria para caracterizar a formação do complexo ternário Cu(GHK)(UCA). Em seguida, validamos o modelo de ligação usando titulações potenciométricas com UV-vis e CD (Figura S14). Sete espécies de cobre foram identificadas, a saber: o íon aqua cobre livre, Cu(cis-UCA), Cu(cis-UCA)₂ (minoritário), CuH(GHK), Cu(GHK), Cu(GHK)(cis-UCA) e uma espécie minoritária CuH₂(GHK)₂. O valor de logβ para o ternário Cu(GHK)(cis-UCA) é 19,29(2). Em pH baixo (para 0,95 mM de GHK, 0,8 mM de Cu e 6 mM de cis-/trans-UCA), os espectros de CD tanto de Cu/GHK/cis-UCA quanto de Cu/GHK/trans-UCA mostram uma banda d–d em 606 nm, devido à predominância de Cu(GHK) (Figura 4A,B). Simultaneamente, uma pequena proporção de complexos binários de ácido urocânico se manifestou como uma elipticidade reduzida em comparação com a amostra de Cu/GHK (Figura 4C,D). Tanto Cu(UCA) quanto Cu(UCA)₂ são silenciosos ao CD, mas perceptíveis nos espectros de absorbância em torno de 700 nm (Tabela S4, Figura S14, cf Figura 2). Com o aumento do pH, a espécie Cu(GHK) começa a dominar, mas é rapidamente substituída acima do pH 4,9 por Cu(GHK)(UCA). Evidências para esta última espécie são fornecidas pelo deslocamento para o azul da banda d–d correspondente à esfera de coordenação 3N do Cu(GHK) (Figura 4A,B) e por uma comparação da elipticidade das amostras de Cu/GHK e Cu/GHK/UCA em 650 nm (Figura 4C,D). O complexo Cu(GHK)(UCA) é formado entre pH 5–10 tanto para cis- quanto para trans-UCA, conforme deduzido pela elipticidade reduzida em 650 nm em comparação com o Cu(GHK) binário. Embora esta descrição seja qualitativa, pode-se estimar que a trans-UCA forma menos complexo ternário do que a cis-UCA sob as mesmas condições experimentais e, portanto, forma um complexo ternário de menor estabilidade.

Para quantificar a formação do complexo ternário tanto para cis- quanto para trans-UCA, foram realizadas titulações de Cu/GHK com cis- e trans-UCA em pH 6,5 e 7,4 para obter constantes de ligação condicionais. A adição de UCA a soluções de Cu(GHK) em pH 6,5 e 7,4 criou um deslocamento para o azul tanto nos espectros de CD quanto de UV-vis (Figura 5 e Figuras S15–S17) de aproximadamente 46 nm para a cis-UCA e 39 nm para a trans-UCA, sugerindo a coordenação de um ligante nitrogenado adicional. Como Cu(II) e GHK estavam quase equimolares, a formação de Cu(GHK)₂ é limitada e não pode ser a causa do deslocamento para o azul. A competição isolada entre Cu(GHK) e Cu(UCA)/Cu(UCA)₂ em pH 6,5 e 7,4 também pode ser excluída, uma vez que os complexos aquirais do ácido urocânico são silenciosos ao CD e, portanto, a competição causaria uma diminuição geral na elipticidade observada do complexo Cu(GHK). A dependência da concentração da elipticidade e das mudanças de absorbância em relação aos ligantes titulados mostra que a trans-UCA não atingiu o equilíbrio na mesma concentração que a cis-UCA, sugerindo que a trans-UCA tem menor afinidade pelo Cu(GHK) do que a cis-UCA. De fato, as constantes de estabilidade condicionais calculadas a partir de um ajuste global dos espectros de CD e UV-vis das titulações com cis- e trans-UCA (Figura 5 e Figuras S15–S17, Tabela 2) confirmam esta observação.
A pH 7.4, a cis-UCA liga-se ao Cu(GHK) com cK7.4 540 ± 17 M−1, semelhante ao imidazol, enquanto a ligação da trans-UCA é quase três vezes mais fraca, com cK7.4 200 ± 10 M−1. Isso significa que quando tanto GHK quanto UCA estão co-localizados no corpo humano (por exemplo, no sangue), a cis-UCA é favorecida para formar um complexo ternário. A redução do pH para 6.5 altera a situação, uma vez que a constante de ligação condicional para a trans-UCA não muda (cK6.5 = 186 ± 10 M−1), mas a ligação da cis-UCA ao Cu(GHK) é muito reduzida (cK6.5 = 345 ± 26 M−1). Assim, nas camadas superiores da pele, onde o pH é mais baixo, a formação de um complexo ternário não favorece muito a cis-UCA em relação à trans-UCA. A diferença observada na sensibilidade ao pH pode ser atribuída à maior basicidade do grupo imidazol na cis-UCA do que na trans-UCA (valores de pKa de 6.74 e 5.83, respectivamente).
2.5. Relevância Biológica
Escolhemos valores de pH de 7.4 e 6.5 para representar o pH do sangue e da pele, respectivamente. A UCA ocorre naturalmente na pele. O GHK é provavelmente liberado localmente durante a proteólise do colágeno ou da SPARC (Proteína Ácida Secretada e Rica em Cisteína) causada por danos na pele. O pH na superfície da pele saudável é relativamente baixo (ca. 5–6). No entanto, há um gradiente de pH (aumentando até 7.4) através de todas as camadas da pele. Importante, o pH da pele aumenta imediatamente após o dano, ficando mais próximo de 7.4, e até mesmo acima de 8. A persistência de pH alto é característica de uma ferida crônica. Levando isso em conta, a função conhecida do GHK como fator de cicatrização pode resultar de um complexo ternário estável Cu(GHK)(cis-UCA) em pH 7–8. A ligação do parceiro ternário (cis-UCA) aumenta a afinidade aparente do GHK pelo Cu(II) (Figura 6). Assim, a presença de tal complexo após dano na pele é plausível. O processo de cicatrização de feridas envolve várias etapas: hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação tecidual. O papel da cis-UCA na imunossupressão foi revelado. Portanto, parece provável que essa molécula, talvez na forma de um complexo ternário, impeça que a etapa de inflamação se desenvolva para o estado crônico. Nesse contexto, é interessante que a suplementação com histidina (um substrato para a síntese de UCA) acelere a cicatrização de feridas. Além disso, uma deficiência de histidina foi observada em feridas cutâneas.
A formação do complexo ternário também pode ser relevante para o uso recente de UCA ou Cu/GHK em cosméticos, materiais antialérgicos ou promotores de cicatrização de feridas, envolvendo GHK imobilizado em polímeros ou nanopartículas, ou dentro de lipossomos.
Dados da literatura sobre as concentrações dos principais componentes do fator de hidratação natural (NMF) no estrato córneo (43 mM de serina, 30 mM de glicina, 23 mM de ácido piroglutâmico, 18 mM de alanina, 14 mM de ácido lático e 14 mM de cis-UCA) e constantes de formação de complexos de Cu(II) podem ser usados para simular a especiação de Cu(II). Para este fim, calculamos as frações molares das espécies de Cu(II) em pH 7,4 (representando as condições encontradas em feridas; Figura 7) e 6,5 (correspondente à pele saudável; Figura S18). Também assumimos uma concentração de GHK de 0,6 µM, conforme encontrada no plasma humano. Pode-se especular que a concentração local de GHK pode ser ainda mais alta no local de dano à pele durante a cicatrização de feridas. Além disso, a aplicação de materiais para cicatrização de feridas contendo GHK como substância ativa pode levar a um aumento na concentração desse peptídeo. Assim, também calculamos a especiação de Cu(II) assumindo 6 e 60 µM de GHK. Em pH 7,4 e na concentração mais baixa de GHK, a maioria do Cu(II) está complexado com serina e glicina. No entanto, 46% do cobre ligado ao GHK está no complexo ternário Cu(GHK)(cis-UCA). Essa última porcentagem não muda para concentrações mais altas de GHK, mas Cu(GHK)(cis-UCA), Cu(GHK)(carboxilatos) (incluindo ácidos carboxílicos e aminoácidos ligando-se monodentadamente através de suas funções carboxílicas) e Cu(GHK) começam a dominar a especiação geral de Cu(II) (Figura 7). Apenas concentrações ligeiramente menores de Cu(GHK)(cis-UCA) e Cu(GHK) são previstas em pH 6,5 (Figura S18).
GHK e UCA também estão presentes no sangue, embora em concentrações mais baixas. A UCA atravessa a barreira hematoencefálica e foi encontrada até mesmo no líquido cefalorraquidiano e em neurônios. O GHK também foi encontrado sendo transportado para o cérebro. Permanece de grande interesse determinar a relevância do complexo ternário Cu(GHK)(cis-UCA) para o ambiente neuronal.
Outro aspecto importante dos nossos achados é a formação do complexo ternário de Cu(GHK) com doadores de imidazol em geral. O anel imidazol do resíduo de histidina em proteínas e peptídeos também pode formar um complexo ternário com afinidade aparente 1–2 ordens de grandeza maior que o Cu(GHK). Dada a alta abundância de resíduos de His, o complexo preferencial de Cu(II) com GHK será o ternário Cu(GHK)(NIm) em vez do binário Cu(GHK). Um complexo ternário não havia sido considerado antes, no entanto, com base em nossos dados, o Cu(GHK) “ligado” a peptídeos ou proteínas maiores pode ser a forma real disponível no sangue. De fato, pode-se especular que o isolamento de Cu(GHK) de uma fração proteica do sangue seja consequência da formação de complexo ternário. Um complexo Cu(GHK)(NIm) também pode ser a forma relevante para outros efeitos biológicos. Por exemplo, Miller et al. descobriram que o tratamento com Cu(GHK) inibe a peroxidação lipídica quando o ferro é proveniente da ferritina. Sugeriu-se que o complexo Cu(GHK) bloqueia fisicamente o canal da ferritina, impedindo o efluxo de íons de ferro. Implicamos que a formação de um complexo ternário Cu(GHK)(NIm) com um dos numerosos resíduos de His presentes na abertura do canal é responsável por essa ação.
3. Materiais e Métodos
3.1. Materiais
Gly-His-Lys (#G1887), Imidazol (#I5513), UCA-cis, UCA-trans, HCl, KNO3, HNO3 e CuCl2 foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). NaOH foi obtido da Chempur (Piekary Slaskie, Polônia). 65CuO (>99%) foi obtido da Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, MA, EUA). A solução de NaOH 0,1 M para titulações potenciométricas foi adquirida da POCH (Gliwice, Polônia) e padronizada por potenciometria usando ftalato ácido de potássio (Merck, Darmstadt, Alemanha).
3.2. Espectroscopia de UV-Vis & Dicroísmo Circular
Medidas espectroscópicas foram realizadas usando um espectrômetro de CD J-815 (JASCO, Easton, MD, EUA) e um espectrofotômetro UV/vis/NIR Lambda 950 (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) nas faixas espectrais de 270–800 e 270–850 nm, respectivamente. Todos os experimentos foram realizados a 25 °C em cubetas de quartzo com comprimento de caminho óptico de 1 cm.
3.2.1. Titulações pH-Métricas
Uma série de titulações foi registrada usando espectroscopias de UV-vis e CD. Para entender a interação Cu/GHK, titulamos (i) 0,95 mM GHK, 0,8 mM CuCl2 e (ii) 10,63 mM GHK, 0,5 mM CuCl2, garantindo um excesso de GHK sobre os íons de cobre. Adicionalmente, 4,0 mM de UCA-cis/trans, 0,8 mM CuCl2 foram titulados com NaOH nas faixas de pH 2,05–9,19 e 2,01–5,89 para UCA-cis e UCA-trans, respectivamente. Em valores de pH mais altos, observamos precipitação de hidróxido de cobre. Os três conjuntos finais de titulações visaram entender a interação ternária entre (i) 0,95 mM GHK, 0,8 mM CuCl2 e 50 mM imidazol e (ii) 0,95 mM GHK, 0,8 mM CuCl2 e 6 mM de UCA-cis/trans. Todos os experimentos foram realizados na faixa de pH 2,5–11,5 (salvo indicação contrária) com o pH ajustado pela adição de quantidades mínimas de NaOH.
3.2.2. Titulações de Ligantes
Interações ternárias foram estudadas em dois valores de pH, 6,5 e 7,4, por meio da titulação de Cu(GHK) com ligantes externos. O pH 6,5 mimetiza as condições predominantes nas camadas superiores da pele, enquanto o pH 7,4 mimetiza o ambiente sanguíneo. A titulação de imidazol em Cu(GHK) foi realizada utilizando 0,63 mM de peptídeo, 0,5 mM de CuCl2 e até 40 equivalentes molares de imidazol. Esta titulação foi realizada exclusivamente em pH 7,4 como experimento controle. Adicionalmente, uma titulação de Cu(GHK) (0,95 mM de peptídeo, 0,8 mM de CuCl2) com UCA cis-/trans foi realizada até 20 equivalentes molares de UCA.
3.3. Espectroscopia de RPE
As amostras foram preparadas com uma concentração de Cu(II) de 0,5 mM em água. Uma solução estoque concentrada de 65CuCl2 foi preparada dissolvendo 65CuO em HCl a 36% p/p, seguido pela remoção do excesso de HCl sob aquecimento e adição de água grau milliQ (Millipore, Burlington, MA, EUA). Uma amostra separada foi preparada para cada ponto da titulação, com o pH medido usando uma microsonda (Metrohm, Herisau, Suíça) e ajustado conforme necessário usando NaOH concentrado. Espectros de RPE de onda contínua na banda X (9,857 GHz) foram obtidos à temperatura ambiente (22 °C) usando um espectrômetro Bruker Elexsys E500 equipado com uma sonda de super-alto Q da Bruker (ER 4122SHQE, Billerica, MA, EUA) e uma célula plana de quartzo (Wilmad, WG-808-Q) para contenção da amostra. O equilíbrio foi permitido ser estabelecido, conforme verificado pela independência temporal dos espectros. As seguintes configurações instrumentais foram utilizadas em todo o experimento: potência de micro-ondas, 20 mW; amplitude de modulação do campo magnético, 5 G; frequência de modulação do campo, 100 kHz; constante de tempo do receptor, 40,96 ms; ganho do receptor, 80 dB; taxa de varredura, 10 gauss s−1; médias, 15. A correção da linha de base foi realizada por subtração ponderada do espectro obtido usando um branco de água. Simulações espectrais foram realizadas conforme descrito anteriormente.
Estudos de RPE de complexos de Cu(II) são frequentemente realizados em baixas temperaturas porque os espectros de soluções congeladas são independentes do peso molecular. Inicialmente, caracterizamos nossos sistemas ternários usando esta abordagem, mas descobrimos que a constante de ligação derivada da análise dos espectros de solução congelada era quase duas ordens de grandeza maior do que a obtida a partir dos espectros de UV-vis e CD. Em contraste, os experimentos de RPE à temperatura ambiente apresentados aqui produziram uma excelente concordância quantitativa com outras espectroscopias. Este aparente artefato de congelamento será investigado e apresentado em outro local.
3.4. Potenciometria
As medições potenciométricas foram realizadas utilizando um titulador automático 907 Titrando (Metrohm, Herisau, Suíça), com um eletrodo de vidro combinado Biotrode (Metrohm, Herisau, Suíça). O eletrodo foi calibrado diariamente por meio da titulação de uma solução de HNO3 4 mM/KNO3 96 mM. Uma solução de NaOH 100 mM (livre de dióxido de carbono) foi utilizada como titulante. As amostras de 1,5 mL foram preparadas em solução de HNO3 4 mM/KNO3 96 mM. Todas as titulações foram realizadas sob atmosfera de argônio a 25 °C, na faixa de pH de aproximadamente 2,7 a 11,5. Três a cinco titulações foram utilizadas para os cálculos das constantes de protonação e das constantes de formação de Cu(II). Os dados obtidos foram processados utilizando os programas SUPERQUAD e HYPERQUAD 2008.

3.4.1. Preparação do GHK
Os contra-íons acetato presentes nas preparações comerciais de GHK podem dificultar a análise dos dados potenciométricos. Antes dos experimentos, portanto, trocamos os contra-íons acetato por TFA por meio de dois ciclos de diluição do peptídeo em TFA a aproximadamente 0,1%, seguidos de liofilização.

3.4.2. Ligantes
Para calcular as constantes de protonação e a concentração da solução estoque, preparamos amostras com aproximadamente (i) 1 mM de GHK, (ii) 1–4 mM de Im e (iii) 1–4 mM de cis-UCA. Para cada ligante, 3–4 amostras foram preparadas em HNO3/KNO3.

3.4.3. Complexos Binários
A formação de complexos binários de cobre foi estudada para GHK e cis-UCA, respectivamente, utilizando diferentes proporções molares de CuCl2 e ligantes. Para Cu/GHK, seis amostras foram executadas em proporções molares de peptídeo para cobre de 1:0,9 (n = 2), 1:0,5, 1:0,3 (n = 2) e 1:0,2, enquanto para Cu/cis-UCA foram estudadas quatro proporções molares: 3:0,8, 4:0,8, 5:0,8 e 8:0,8.

3.4.4. Complexos Ternários
As proporções molares estudadas de GHK/Cu/Im foram: 1:0,9:4, 1:0,9:6 e 1:0,9:8. Para cada proporção molar, duas amostras foram preparadas. Para GHK/Cu/cis-UCA, cinco amostras foram preparadas nas proporções de 1:0,9:4; 1:0,9:5; 1:0,9:6; 1:0,9:7; e 1:0,9:8.

3.5. Calorimetria de Titulação Isotérmica
As titulações calorimétricas foram realizadas no calorímetro Nano ITC Standard Volume (TA Instruments, New Castle, DE, EUA). A célula de amostra (950 µL) e a seringa (250 µL) foram preenchidas com soluções tampão desgaseificadas (HEPES 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) e as titulações foram realizadas por dez injeções de volume de 24 µL adicionadas em intervalos de 1000 s, com agitação a 200 rpm, a 25 °C. A solução de GHK:CuCl2 na proporção 1:0,97 foi titulada com Im ou GHK em uma faixa de 0,4 a 40 ou 15 equivalentes molares, respectivamente. A concentração de Im na seringa foi de 12 mM. As concentrações de GHK na seringa foram de 6 ou 12 mM. As concentrações iniciais de GHK na célula foram de 0,1, 0,25, 0,35, 0,5 e 1,0 mM, para as titulações com Im, e de 0,25–0,5 mM, para as titulações com GHK. Os dados obtidos foram analisados com o software NanoAnalyze v. 3.11.0.

3.6. Cálculos das Constantes de Ligação
Cu(GHK)2. Uma abordagem autoconsistente foi utilizada para isolar os espectros de EPR, UV-vis e CD de Cu(GHK) e Cu(GHK)2 e determinar o cK7.4 para o equilíbrio CuL + L ⇌ CuL2, onde L = GHK: (1) Um palpite inicial foi feito para o valor de cK7.4, que foi usado para calcular a especiação teórica de CuL e CuL2 nos valores mínimo e máximo de n na titulação Cu/GHK 1:n (nmin ≤ n ≤ nmax); (2) A especiação acima forneceu fatores de ponderação que foram usados para subtrair algebricamente o espectro de Cu/L 1:nmax do espectro de Cu/L 1:nmin, e vice-versa, isolando assim os espectros de CuL e CuL2, respectivamente; (3) Combinações lineares desses espectros base foram usadas para realizar um ajuste por mínimos quadrados dos espectros experimentais obtidos em todas as estequiometrias intermediárias n; (4) Os valores obtidos de [CuL] e [CuL2] foram usados para derivar um valor de cK7.4 a partir do gradiente de um gráfico de [CuL2] versus [CuL] × ([Cu]T − [CuL] − 2[CuL2]), onde [Cu]T é a concentração total de todas as formas de Cu(II). Esse valor experimental de cK7.4 foi então usado como um novo palpite para cK7.4, e as etapas 1–4 foram repetidas iterativamente até que o valor experimental de cK7.4 diferisse do palpite mais recente em menos de 1%. O procedimento acima foi realizado separadamente para os conjuntos de dados de UV-vis, CD e EPR. Estes foram então combinados em um único gráfico de [CuL2] versus [CuL] × ([Cu]T − [CuL] − 2[CuL2]) e um valor global de cK7.4 foi determinado usando regressão não linear por mínimos quadrados (sem remoção de outliers) implementada no GraphPad Prism versão 8.1.1 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA, ), e o erro no cK7.4 foi calculado a partir do intervalo de confiança de 95% derivado da análise de regressão.

Cu(GHK)(Im), Cu(GHK)(trans-UCA) e Cu(GHK)(cis-UCA)
Usando as constantes de formação conhecidas para Cu(GHK) e Cu(GHK)₂, e os espectros previamente isolados de Cu(GHK) e Cu(GHK)₂, uma abordagem autoconsistente foi utilizada para isolar o espectro de Cu(GHK)(Im), Cu(GHK)(trans-UCA) e Cu(cis-UCA) e determinar o valor de cK₇.₄ e/ou cK₆.₅ para o equilíbrio CuL + A ⇌ CuLA, onde L = GHK e A = Im, trans-UCA ou cis-UCA: (1) Um palpite inicial foi feito para o valor de cK₆.₅ ou cK₇.₄ e a especiação teórica de CuL, CuL₂ e CuL foi calculada para os valores mínimo e máximo de n na titulação Cu/L/A 1:1,25:n (nmin ≤ n ≤ nmax); (2) A especiação acima forneceu fatores de ponderação que foram usados para subtrair algebricamente os espectros de CuL e CuL₂ do espectro obtido para Cu/L/A 1:1,25:nmax, resultando assim no espectro de CuLA; (3) Combinações lineares dos espectros base de CuL, CuL₂ e CuLA foram usadas para realizar um ajuste por mínimos quadrados dos espectros experimentais obtidos em todas as estequiometrias intermediárias n; (4) Os valores obtidos de [CuL], [CuL₂] e [CuLA] foram usados para derivar um valor de cK₆.₅ ou cK₇.₄ a partir do gradiente de um gráfico de [CuLA] versus [CuL] × ([A]T − [CuLA]), onde [A]T é a concentração total de todas as formas de Im, trans-UCA ou cis-UCA presentes na amostra. O valor experimental de cK₆.₅ ou cK₇.₄ foi então usado como um novo palpite para cK₆.₅ ou cK₇.₄, e as etapas 1–4 foram repetidas iterativamente até que o valor experimental de cK₆.₅ ou cK₇.₄ diferisse do palpite mais recente em menos de 1%. As constantes de ligação de CuImₙ (n = 1–4), Cu(trans-UCA)ₙ e Cu(cis-UCA)ₙ (n = 1–2) eram muito baixas para que essas espécies influenciassem os resultados e, portanto, não foram consideradas. O procedimento acima foi realizado separadamente para conjuntos de dados de UV-vis, CD e EPR. Estes foram então combinados em um único gráfico de [CuLA] versus [CuL] × ([A]T − [CuLA]), e um valor global de cK₆.₅ ou cK₇.₄ foi determinado usando regressão não linear por mínimos quadrados (sem remoção de outliers) implementada no GraphPad Prism versão 8.1.1 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA), e o erro em cK₆.₅ ou cK₇.₄ foi calculado a partir do intervalo de confiança de 95% derivado da análise de regressão.
4. Conclusões
Cu(II)-GHK é um hormônio tecidual que atua como fator de cicatrização de feridas. O ácido urocanico, presente como isômeros cis e trans, é o componente molecular abundante de baixo peso do fator de hidratação natural (NMF) da pele. Demonstramos que ambos os isômeros do ácido urocanico, e em particular o isômero cis estável, formam complexos ternários com Cu(GHK). A quantificação completa dos complexos parentais e ternários forneceu a base para simulações numéricas da distribuição de íons Cu(II) no NMF. Essas simulações indicaram que Cu(GHK)(cis-UCA), mas não o complexo binário Cu(GHK), é um componente significativo do pool de cobre no NMF. Este resultado, e em geral a formação de Cu(GHK)(Im), indica uma necessidade urgente de investigações das propriedades biológicas deste e de outros complexos ternários do GHK.
Materiais Suplementares
Materiais complementares podem ser encontrados em .
Contribuições dos Autores
Conceptualização, K.B.-A., W.B., S.C.D., e T.F.; metodologia, K.B.-A., W.B., S.C.D., e T.F.; análise formal, K.B.-A., S.C.D., e T.F.; investigação, K.B.-A., M.D.W., e S.C.D.; preparação do rascunho original — escrita, K.B.A. e T.F.; revisão e edição — escrita, K.B.-A., W.B., S.C.D., e T.F.; visualização, K.B.-A., S.C.D., e T.F.; supervisão, W.B. e T.F.; administração do projeto, T.F.; aquisição de financiamento, W.B. e S.C.D. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento
Este estudo foi financiado parcialmente pelo Projeto 2016/23/B/ST5/02253 do Centro Nacional de Ciência (Polônia). O equipamento utilizado foi patrocinado em parte pelo Centro de Pesquisa e Tecnologia Pré-Clínica (CePT), um projeto copatrocinado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional e pela Economia Inovadora, a Estratégia Nacional de Coesão da Polônia. S.C.D. foi apoiado em parte por uma bolsa concedida pela Faculdade de Medicina, Odontologia e Ciências da Saúde da Universidade de Melbourne.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses. Os financiadores não tiveram nenhum papel no delineamento do estudo; na coleta, análise ou interpretação dos dados; na escrita do manuscrito ou na decisão de publicar os resultados.
Abreviaturas
GHK peptídeo Gly-His-Lys Im imidazol UCA ácido urocânico
Referências
Ações Regenerativas e Protetoras do Peptídeo GHK-Cu à Luz dos Novos Dados Genéticos
Lipossomas de GHK-Cu aceleram a cicatrização de feridas por escaldadura em camundongos promovendo proliferação celular e angiogênese
O complexo tripeptídico GHK-Cu melhora a lesão pulmonar aguda induzida por lipopolissacarídeo em camundongos
Efeitos Ansiolíticos do Peptídeo Gly-His-Lys e Seus Análogos
GHK e DNA: Resetando o Genoma Humano para a Saúde
O Efeito do Peptídeo Humano GHK na Expressão Gênica Relevante para a Função do Sistema Nervoso e o Declínio Cognitivo
Fotoquímica e Fotobiologia do Ácido Urocânico
Modulação da esclerose múltipla pela exposição solar: Papel do ácido cis-urocânico
A Exposição Moderada aos Raios UV Melhora o Aprendizado e a Memória ao Promover uma Nova Via Biossintética de Glutamato no Cérebro
Avanços recentes em fotoquímica, fotobiologia e fotoimunologia do ácido urocânico
Efeito da imersão e do fator natural de hidratação nas propriedades de manuseio de água do estrato córneo
Hidratação e função de barreira da pele
Alta Taxa de Deficiência nos Aminoácidos Triptofano e Histidina em Pessoas com Feridas
A l-histidina e a l-carnosina aceleram a cicatrização de feridas através da regulação da corticosterona e da fosforilação de PI3K/Akt em modelos de envelhecimento induzido por d-galactose in vitro e in vivo
Ácido Urocânico: Um Regulador Endógeno das Células de Langerhans
Evidências para a Existência de um Processo Enzimático Autorregulado Dentro do Estrato Córneo Humano — Um Papel Inesperado para o Ácido Urocânico
Ácido cis-urocânico como uma potencial molécula de ligação ao níquel na pele humana
Complexos de cobre de glicil-histidil-lisina e dois de seus análogos sintéticos: Comportamento químico e atividade biológica
Bioquímica de Coordenação
Interações do α-Fator-1, um Feromônio de Levedura, e seu Análogo com Íons de Cobre(II) e Ligantes de Baixo Peso Molecular Produzem Complexos Muito Estáveis
Glic-His-Tre-Asp-Amida, um Peptídeo Ativador de Insulina do Pâncreas Humano É um Forte Quelante de Cu(II), mas um Fraco Quelante de Zn(II)
Estudos sobre complexos de metais de transição–peptídeos. Parte 9. Complexos de cobre(II) de tripéptidos contendo histidina
Estudo termodinâmico e espectroscópico de complexos de cobre(II)-glicil-L-histidilglicina em solução aquosa
Podem a GSH e a L-His contribuir para a ligação intracelular do zinco? Estudo termodinâmico e estrutural em solução de um complexo ternário
Modo de coordenação e susceptibilidade à oxidação de complexos de níquel(II) com 2′-desoxiguanosina 5′-monofosfato e L-histidina
Estudo termodinâmico da ligação de Cu2+ aos peptídeos DAHK e GHK por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) com o competidor mais fraco glicina
Especiação e estrutura de complexos de cobre(II) com peptídeos contendo histidina em meio aquoso: Um estudo combinado potenciométrico e espectroscópico
A interação do cobre(II) com glicil-L-histidil-L-lisina, um tripéptido modulador de crescimento do plasma
Interações da histidina e outros derivados de imidazol com íons de metais de transição em sistemas químicos e biológicos
Complexos de Cu2+ com ligante misto de um terapêutico modelo com o peptídeo β-amiloide da doença de Alzheimer e neurotransmissores monoamina
Troca de cobre e atividade redox de uma 8-hidroxiquinolina prototípica: Implicações para quelação terapêutica
O N-terminal da α-sinucleína forma oligômeros mediados por CuII
Sondando a estrutura quaternária de oligômeros de peptídeos mediados por metal
Desencadeando a mudança de coordenação do Cu em Cu(II)-Ala-His-His por ligantes externos
Investigação de equilíbrios em solução. Determinação de constantes de equilíbrio com o conjunto de programas HYPERQUAD
A estabilidade de complexos de metais de transição
SPARC é uma fonte de peptídeos ligantes de cobre que estimulam a angiogênese
Estimulação da síntese de colágeno em culturas de fibroblastos pelo complexo tripéptido-cobre glicil-L-histidil-L-lisina-Cu2+
O impacto do valor do pH na integridade da pele e na cicatrização de feridas cutâneas
Progressão do pH de feridas durante o curso da cicatrização em queimaduras
Aumento do pH de feridas como indicador de infecção local em queimaduras de segundo grau
Três Ensaios Randomizados de Fase I/IIa de Creme Emulsão de Ácido Cis-urócânico a 5% em Adultos Saudáveis e em Pacientes com Dermatite Atópica
Estudos In Vitro e In Vivo de Polímero Superabsorvente de Ácido Poliaspártico e Poliacrílico Sensível ao pH Incorporado com GHK-Cu
Nanopartículas Auto-montadas de GHK-Cu Fluorescentes e Antibacterianas para Aplicações em Cicatrização de Feridas
O ácido cis-urócânico tópico previne a irritação da superfície ocular em modelo de rato tanto independente quanto mediado por IgE
Cicatrização melhorada de úlceras em pacientes com diabetes por tratamento tópico com glicil-L-histidil-L-lisina
Complexação do hormônio liberador de tirotropina e seus compostos relacionados com íons de cobre(II) e níquel(II)
Tripéptido no soro humano que prolonga a sobrevivência de células hepáticas normais e estimula o crescimento em fígado neoplásico
Efeitos do Cu(II) quelado por glicil-histidil-lisil na peroxidação lipídica dependente de ferritina
A constante de dissociação de Cu2+ subpicomolar da albumina sérica humana
SUPERQUAD: Um programa geral aprimorado para cálculo de constantes de formação a partir de dados potenciométricos
Figuras, Esquema e Tabelas
Isomerização induzida por radiação UV do ácido trans-urocânico (UCA) e cis-UCA.
A constante de ligação condicional de Cu(II) cK7.4 = [Cu(GHK)2]/([Cu(GHK)][GHK]). (A) Espectros de UV-vis, (B) dicroísmo circular (CD) e (C) ressonância paramagnética eletrônica (EPR) de Cu/GHK 0,5:n (0,63 ≤ n ≤ 30 mM) a pH 7,4, 25 °C. (D) Diagrama de especiação obtido pela decomposição de todos os espectros de UV-vis (losangos), CD (quadrados) e EPR (círculos) (Figuras S4–S6). As linhas sólidas foram calculadas usando a constante de ligação derivada de (E) e log cK1 = [Cu(GHK)]/([GHK][Cu]) = 12,62 derivado da potenciometria. (E) Determinação da constante de ligação cK7.4 usando regressão de mínimos quadrados. A margem de erro deriva do intervalo de confiança de 95% (linhas tracejadas).
Espectros de UV-vis de 4 mM de cis-UCA e 0,8 mM de CuCl2 titulados de forma potenciométrica. (A) Os espectros são codificados por cores, de vermelhos (pH mais baixo) a roxos (pH mais alto). (B) Distribuição de espécies de complexos de Cu(II) de cis-UCA (vermelho, Cu(cis-UCA); azul, Cu(cis-UCA)2) a 25 °C, calculada para concentrações a partir de dados de UV-vis (apresentados no painel A), com base nas constantes de protonação e estabilidade mostradas na Tabela 1. O eixo esquerdo representa as frações molares dos complexos de Cu(II), o eixo direito representa a absorbância a 550 e 840 nm.
A constante de ligação condicional de Cu(II) cK7.4 = [Cu(GHK)(Im)]/([Cu(GHK)][Im]). (A) Espectros de UV-vis, (B) CD e (C) EPR de Cu/GHK/Im 0,5:0,63:n (0 ≤ n ≤ 25 mM) a pH 7,4, 25 °C. (D) Especiação de complexos de GHK obtida a partir da decomposição dos espectros de UV-vis, CD e EPR em função da concentração de Im (Figuras S8–S11). (E) Determinação da constante de ligação cK7.4 usando regressão de mínimos quadrados. A margem de erro deriva do intervalo de confiança de 95% (linhas tracejadas).
Espectros de 0,95 mM de GHK, 0,8 mM de CuCl2 e 6 mM de cis-UCA (A) ou trans-UCA (B) de forma potenciométrica. As setas indicam as mudanças espectrais de baixo para alto pH. A elipticidade a 650 nm foi lida dos painéis (A) e (B) e mostrada para cis-UCA (C) ou trans-UCA (D) (quadrados azul-marinho) justaposta aos dados obtidos por titulação potenciométrica de 0,95 mM de GHK com 0,8 mM de CuCl2 (círculos magenta).
A constante de ligação condicional de Cu(II) cK7.4 = [Cu(GHK)(cis-UCA)]/([Cu(GHK)][cis-UCA]). (A) Espectros de UV-vis e (B) CD de Cu/GHK/cis-UCA 0.8:0.95:n (0 ≤ n ≤ 22 mM) a pH 7.4, 25 °C. (C) Especiação dos complexos de GHK obtida a partir da decomposição dos espectros de UV-vis e CD em função da concentração de cis-UCA. (D) Determinação da constante de ligação cK7.4 usando regressão por mínimos quadrados. A margem de erro deriva do intervalo de confiança de 95% (linhas tracejadas).
Influência de concentrações variáveis de cis-UCA na afinidade aparente do sistema Cu/GHK/cis-UCA. Os valores de CI7.4 e CI6.5 na presença de cis-UCA (linha sólida azul e verde) são válidos para [Cu] = [GHK] = 1 µM, a pH 7.4 e 6.5, respectivamente. As linhas tracejadas representam os níveis de referência de CI7.4 e CI6.5 calculados para soluções sem cis-UCA.
Distribuição de espécies simulada para o fator de hidratação natural (NMF), 0.9 µM de íons Cu2+ e diferentes concentrações de GHK, a pH 7.4 (representando as possíveis condições em feridas). A menor concentração de GHK (0.6 µM) é igual às concentrações encontradas no plasma humano. Concentrações mais altas (6 e 60 µM) de GHK podem ocorrer em feridas e/ou após aplicação de cosméticos ou outros produtos com GHK como substância ativa. As constantes de protonação e constantes de estabilidade para complexos de Cu(II) foram retiradas da literatura e deste artigo. A constante condicional para a formação de complexos ternários de Cu(GHK) com carboxilatos (68 M−1) também foi incluída nos cálculos. As concentrações consideradas para os cálculos são 43 mM de serina, 30 mM de glicina, 23 mM de ácido piroglutâmico, 18 mM de alanina, 14 mM de ácido láctico e 14 mM de cis-UCA. Todos os complexos ternários de Cu(GHK) com os compostos mencionados com grupos carboxílicos foram combinados em “Cu(GHK)(carboxilatos)”. Apenas as espécies que excedem 1% de todas as espécies de Cu(II) são mostradas para clareza.
Constantes de protonação para cis-UCA (L) e constantes logarítmicas de formação de complexos para a interação de íons Cu(II) com cis-UCA, juntamente com os eventos de protonação atribuídos.
Espécie Logβ 1 pK Evento de Protonação H2L 9.541(6) 2.80 COOH HL 6.742(2) 6.74 NIm CuL 4.941(9) COOH, NIm CuL2 8.76(1) COOH, NIm
1 Valores determinados por potenciometria a 25 °C e I = 0.1 M (KNO3). Os desvios padrão nos dígitos menos significativos, fornecidos pelo HYPERQUAD, são apresentados entre parênteses.
Constantes de ligação de complexos binários de Cu(II) de GHK e complexos ternários de Cu(II) de GHK com ligantes contendo imidazol a pH 6.5 e 7.4, a 25 °C.
Equilíbrio cK6.5 (M−1) cK7.4 (M−1) 4.79 × 1010 1 4.17 × 1012 1 3.8 × 104 1 7.94 × 104 1 237 ± 5 2265 ± 46 3 725 ± 22 2532 ± 44 3 345 ± 26 4 540 ± 17 4 186 ± 10 4 200 ± 10 4
As constantes de ligação condicionais foram determinadas usando: 1 dados potenciométricos; 2 espectros de UV-vis, CD e EPR; 3 dados de ITC; 4 espectros de UV-vis e CD.