pmid: "20837112"
title: "Inibidores de ciclooxigenase-2 no gengibre (Zingiber officinale)."
authors: "van Breemen RB, Tao Y, Li W"
journal: "Fitoterapia"
pubdate: "2011 Jan"
doi: "10.1016/j.fitote.2010.09.004"
source: "PMC Full Text"
Inibidores de ciclooxigenase-2 no gengibre (Zingiber officinale).
Autores
van Breemen RB, Tao Y, Li W
Periodico
Fitoterapia (2011 Jan)
Conteudo
Inibidores da ciclooxigenase-2 no gengibre (Zingiber officinale)
Raízes de gengibre têm sido usadas para tratar inflamação e foram relatadas como inibidoras da ciclooxigenase (COX). A cromatografia líquida de ultrafiltração acoplada à espectrometria de massas foi utilizada para rastrear uma partição de clorofórmio de um extrato metanólico de raízes de gengibre em busca de ligantes da COX-2, e 10-gingerol, 12-gingerol, 8-shogaol, 10-shogaol, 6-gingerdiona, 8-gingerdiona, 10-gingerdiona, 6-desidro-10-gingerol, 6-paradol e 8-paradol ligaram-se ao sítio ativo da enzima. O 10-gingerol, 8-shogaol e 10-shogaol purificados inibiram a COX-2 com valores de IC50 de 32 μM, 17,5 μM e 7,5 μM, respectivamente. Nenhuma inibição da COX-1 foi detectada. Portanto, o 10-gingerol, 8-shogaol e 10-shogaol inibem a COX-2, mas não a COX-1, o que pode explicar, em parte, as propriedades anti-inflamatórias do gengibre.
- Introdução
As ciclooxigenases (COX)-1 e COX-2 são os alvos dos fármacos anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) amplamente utilizados e são essenciais para processos fisiológicos como a manutenção do trato gastrointestinal, função renal e febre. A COX-1 é expressa constitutivamente em todos os tecidos, mas a COX-2 é induzida especificamente durante processos inflamatórios, degenerativos e neoplásicos. A COX-1 e a COX-2 catalisam a conversão do ácido araquidônico no endoperóxido prostaglandina (PG)H2, que pode formar uma variedade de prostaglandinas, tromboxanos e prostaciclina através da catálise por enzimas não limitantes da taxa ou por rearranjo não enzimático. Por exemplo, PGD2 e PGE2 podem ser formadas a partir de PGH2 de forma não enzimática ou por ação de sintases específicas. Ao inibir a COX-1 e/ou COX-2, os AINEs previnem a conversão enzimática do ácido araquidônico em endoperóxidos cíclicos pró-inflamatórios. Com base na suposição de que a inibição da COX-2, mas não da COX-1, poderia reduzir os efeitos colaterais observados em AINEs mais antigos, a descoberta de inibidores seletivos da COX-2 tornou-se uma área importante da pesquisa farmacêutica.
Investigações in vitro de preparações de gengibre (Zingiber officinalis Roscoe) e de alguns compostos isolados relacionados ao gingerol (veja as estruturas dos gingeróis e compostos relacionados na Figura 1) mostraram efeitos anti-inflamatórios do gengibre, incluindo inibição da COX, inibição do fator nuclear κB e inibição da 5-lipoxigenase. Estudos in vivo usando modelos animais de inflamação e ensaios clínicos confirmaram as atividades anti-inflamatórias das preparações de gengibre. Por exemplo, extratos de gengibre demonstraram inibir o inchaço articular em um modelo animal de artrite reumatoide e reduzir a dor no joelho em pacientes humanos com osteoartrite. Como os constituintes anti-inflamatórios do gengibre são incompletamente compreendidos, o presente estudo utilizou um ensaio de triagem baseado em espectrometria de massas para ajudar a identificar inibidores de um de seus alvos farmacologicamente importantes, a COX-2.
Inventada e desenvolvida em nosso laboratório, a espectrometria de massa por ultrafiltração pulsada é uma abordagem estabelecida para a triagem de misturas complexas, como extratos de suplementos dietéticos botânicos, plantas medicinais e bibliotecas combinatórias, para a descoberta de ligantes de alvos macromoleculares, como enzimas. Usando essa abordagem para triar um extrato clorofórmico de raiz de gengibre em busca de ligantes da COX-2, dez compostos relacionados ao gingerol, incluindo gingeróis, shogaóis, paradóis e gingerdionas, foram identificados como ligantes da COX-2 e classificados de acordo com sua ligação relativa. Três desses compostos, 10-gingerol, 8-shogaol e 10-shogaol, foram testados quanto à inibição da COX-1 e COX-2 usando um ensaio funcional baseado em cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em tandem (LC-MS-MS), e seus valores de IC50 foram determinados. Esses compostos podem ser responsáveis, em parte, pela atividade anti-inflamatória do gengibre e podem ser usados como compostos marcadores para a padronização química e biológica de suplementos dietéticos de gengibre. - Materiais e métodos
2.1. Materiais
COX-2 recombinante humana, COX-1 ovina, ácido araquidônico, PGE2, d4-PGD2 e d2-PGE2 (marcados com átomos de deutério nas posições 3 e 4) foram adquiridos da Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). Os cofatores, (-)epinefrina e hematina, foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Celecoxib foi adquirido da 3B PharmaChem International (Wuhan, China). Todos os solventes orgânicos eram de grau HPLC ou superior e foram adquiridos da Thermo Fisher (Hanover Park, IL). Ácido fórmico foi adquirido da EMD Chemicals (San Diego, CA). Água purificada foi preparada usando um sistema de purificação Millipore Milli-Q (Millipore, Billerica, MA). Todos os outros produtos químicos e solventes eram de grau reagente ACS, salvo indicação em contrário. 6-Gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol e 6-shogaol foram adquiridos da Chromadex (Santa Ana, CA). 8-Shogaol e 10-shogaol foram isolados de raiz de gengibre em pó conforme descrito anteriormente.
Raízes de gengibre em pó (Zingiber officinalis Roscoe) foram adquiridas da General Nutrition Corp. (Pittsburgh, PA; Lote nº 2533EE4596) e extraídas da seguinte forma. Aproximadamente 5 g do pó foram extraídos duas vezes à temperatura ambiente com 100 mL de metanol usando sonicação. Após evaporação do solvente sob pressão reduzida a 35 °C, o resíduo foi suspenso em 50 mL de água e extraído com clorofórmio (6 × 50 mL). A partição clorofórmica foi evaporada sob pressão reduzida a 25 °C para obter 1,14 g de resíduo. Uma solução estoque (0,1 mg/mL) deste material foi preparada em metanol e armazenada a 4 °C para análise.
2.2. Ultrafiltração pulsada LC-MS
A triagem utilizando ultrafiltração por LC-MS foi realizada com base no método de Nikolic et al.. Uma alíquota do extrato de gengibre (7 μL) foi diluída em 93 μL de tampão fosfato 50 mM (pH 7,4) e misturada com 45 μL de tampão contendo 150 pmol de COX-2 recombinante humana. No lugar do extrato de gengibre, preparações idênticas continham uma mistura de compostos isolados relacionados ao gingerol na concentração final de 1,3 μM cada. Os controles positivos continham o inibidor de COX-2 celecoxibe (1,2 μM, concentração final) no lugar do extrato de gengibre; e os controles negativos continham 45 μL de tampão branco no lugar da solução tampão de COX-2. Após incubação no escuro por 1 h a 37 °C para permitir que a ligação atingisse o equilíbrio, cada mistura foi filtrada através de um filtro centrífugo com corte de peso molecular de 30.000 Da, que havia sido pré-lavado com 150 μL de tampão fosfato por centrifugação a 10.000 g por 15 min. As amostras foram enxaguadas três vezes com porções de 150 μL de acetonitrila a 5% em água para remover compostos não ligados à COX-2 (para celecoxibe, água foi usada no lugar de acetonitrila em água).
Cada filtro foi transferido para um novo tubo de centrífuga para remover compostos que haviam se ligado de forma inespecífica ao recipiente, e os ligantes foram dissociados da COX-2 usando 400 μL de metanol/água (90:10; v/v). Após 10 min de incubação à temperatura ambiente, os ligantes dissociados foram coletados por ultrafiltração com centrifugação a 10.000 g por 10 min. O processo de dissociação foi repetido, e os ultrafiltrados foram combinados para cada amostra, secos sob uma corrente de gás nitrogênio e reconstituídos em 50 μL de metanol a 50% em água imediatamente antes da análise por LC-MS e LC-MS-MS.
Um espectrômetro de massas triplo quadrupolo Waters (Milford, MA) Quattro II equipado com um sistema HPLC Waters 2690 Alliance e ionização por electrospray em modo negativo foi utilizado para a separação e detecção de compostos relacionados ao gingerol conforme relatado anteriormente, exceto que o sistema de solventes consistiu em um gradiente linear de 20 min de 35% a 90% de acetonitrila em água a uma vazão de 250 μL/min para a análise de misturas de compostos isolados relacionados ao gingerol. A detecção seletiva de compostos relacionados ao gingerol foi realizada utilizando as técnicas de espectrometria de massas em tandem de perda neutra constante e monitoramento de reação selecionada, conforme descrito por Tao et al.. Resumidamente, a ionização por electrospray em modo negativo e a dissociação induzida por colisão com espectrometria de massas em tandem de perda neutra constante foram utilizadas para fragmentar moléculas desprotonadas de compostos relacionados ao gingerol, como gingeróis, shogaóis, paradóis, etc., formando íons produto através de perdas neutras de características estruturais comuns a esses compostos. Gingeróis e 6-desidrogingeróis foram detectados durante a varredura de perda neutra constante de 194 u, e shogaóis, paradóis e gingerdionas foram detectados durante a varredura de uma perda neutra característica de 136 u.
A dissociação induzida por colisão com monitoramento de reação selecionada (SRM) foi então utilizada para medir pares de íons únicos correspondentes a compostos desprotonados relacionados ao gengibre e seus íons fragmento estruturalmente informativos. Os pares de íons precursores e produtos utilizados durante o SRM para cada composto relacionado ao gengibre são mostrados na Tabela 1. A ligação específica de cada composto à COX-2 foi determinada comparando a área do pico de LC-MS-MS do composto após liberação da COX-2 durante a ultrafiltração pulsada com a área do pico correspondente para a incubação controle sem COX-2. A ligação relativa de cada ligante à COX-2 foi determinada comparando a área do pico de LC-MS-MS do composto liberado da COX-2 após ultrafiltração com a área do pico do composto não ligado recuperado no ultrafiltrado.
2.3. Ensaio de inibição da COX
A inibição da COX-1 e COX-2 pela partição em clorofórmio do extrato de gengibre, pelo controle positivo, celecoxibe, e por constituintes individuais do gengibre foi determinada usando o método de Cao et al.. Resumidamente, a concentração de PGE2 formada por COX-1 ou COX-2 na presença de um inibidor ou extrato de gengibre foi medida usando LC-MS-MS, e a porcentagem de inibição da COX por cada solução teste foi determinada comparando a quantidade de PGE2 produzida no experimento com aquela produzida na incubação controle negativo. Para determinação do valor de IC50, 12 concentrações diferentes de cada inibidor foram ensaiadas três vezes. O valor de IC50 de cada inibidor em relação à COX-1 ou COX-2 foi determinado plotando e analisando os dados da curva de inibição usando o software Graph Pad Prism 5 (Mountain View, CA).
- RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Triagem por espectrometria de massa com ultrafiltração pulsada de extrato de gengibre para ligantes da COX-2
Usando a triagem por cromatografia líquida de ultrafiltração pulsada acoplada à espectrometria de massas (LC-MS), o inibidor seletivo de COX-2 celecoxibe apresentou ligação significativa à COX-2 humana conforme esperado (dados não mostrados), e sua concentração IC50 foi determinada como 50 nM usando um ensaio enzimático funcional. Esses experimentos de controle positivo indicaram que esses ensaios estavam funcionando adequadamente. A partição em clorofórmio do extrato metanólico de raízes de gengibre foi então triada usando LC-MS-MS de ultrafiltração pulsada. Como apenas compostos relacionados ao gingerol (Figura 1) foram detectados como ligantes de COX-2 na preparação de gengibre, técnicas de perda neutra constante e monitoramento de reação selecionada (SRM) por LC-MS-MS foram usadas para melhorar a relação sinal-ruído dos analitos alvo, eliminando sinais de derivados não gingerol. Exemplos de análise por espectrometria de massas em tandem com ultrafiltração pulsada para cada uma das classes de compostos relacionados ao gingerol, mostrando ligação específica à COX-2, são apresentados na Figura 2. A determinação da ligação específica à COX-2 baseou-se no aumento da área do pico no LC-MS-MS após incubação com COX-2 ativa e extração por afinidade por ultrafiltração, em comparação com experimentos de controle sem enzima. A ligação específica de compostos relacionados ao gingerol ao sítio ativo da COX-2 foi confirmada repetindo o experimento de ultrafiltração pulsada na presença do inibidor de alta afinidade da COX-2, celecoxibe, que deslocou os compostos relacionados ao gingerol de ligação mais fraca do sítio ativo e reduziu suas áreas de pico nos cromatogramas de LC-MS-MS.
Seis classes de compostos relacionados ao gingerol foram detectadas durante a ultrafiltração pulsada, incluindo 4 gingeróis, 4 shogaóis, 3 paradóis, 2 gingerdióis, 3 gingerdionas e 3 desidrogingeróis. Os compostos na preparação de gengibre foram identificados por comparação com padrões ou por comparação dos espectros de massas em tandem com a literatura. Os tempos de retenção em HPLC, as massas das moléculas desprotonadas e as transições de monitoramento de reação selecionada usadas para detecção e medição desses compostos são mostrados na Tabela 1.
Exceto pelos gingerdióis, pelo menos alguns membros de cada classe de compostos relacionados ao gingerol apresentaram ligação específica ao sítio ativo da COX-2. Todas as 3 gingerdionas se ligaram à COX-2, mas apenas 2 gingeróis, 2 shogaóis, 2 paradóis e 1 desidrogingerol foram ligantes de COX-2. Entre os gingeróis, 10-gingerol e 12-gingerol, mas não 6-gingerol ou 8-gingerol, ligaram-se à COX-2; 8-shogaol e 10-shogaol foram ligantes de COX-2, mas não 6-shogaol ou 12-shogaol; e 6-paradol e 8-paradol, mas não 10-paradol, ligaram-se à COX-2. A afinidade relativa de cada um desses ligantes pela COX-2 foi determinada calculando uma razão ligado/livre, e esses valores são mostrados na Tabela 1.
Os paradóis apresentaram a maior afinidade pela COX-2, seguidos pelos shogaóis e, em seguida, pelos gingeróis e gingerdionas. Com afinidades relativas muito menores pela COX-2 estavam os deidrogingeróis e, por último, os gingerdióis, que não demonstraram ligação à COX-2 (Tabela 1). O grupo carbonila no carbono 3 (ver esquema de numeração na Figura 1) mostrou-se essencial para a ligação à COX-2, uma vez que os gingerdióis, que não possuem esse grupo carbonila, não se ligaram à COX-2. Dentro de cada classe de compostos relacionados ao gingerol, foi observado um comprimento ótimo da cadeia alquílica. Por exemplo, o 10-shogaol ligou-se à COX-2 com maior afinidade do que o 8-shogaol ou o 12-shogaol, e o 8-paradol ligou-se à COX-2 com maior afinidade do que o 6-paradol ou o 10-paradol.
3.2. Determinação dos valores de IC50 e análise quantitativa dos inibidores da COX
Os valores de IC50 do extrato de gengibre e dos ligantes da COX-2 10-gingerol, 8-shogaol e 10-shogaol foram determinados tanto para a COX-2 quanto para a COX-1 (Tabela 1), e exemplos de curvas dose-resposta para a determinação desses valores de IC50 são mostrados na Figura 3. Infelizmente, quantidades insuficientes de outros compostos relacionados ao gingerol estavam disponíveis para medições adicionais dos valores de IC50. As determinações de IC50 confirmaram que cada um desses ligantes da COX-2 era um inibidor da COX-2, mas não inibia a COX-1, o que significa que esses gingeróis e shogaóis são inibidores seletivos da COX-2. Entre esses três compostos, o inibidor mais potente da COX-2 foi o 10-shogaol, com um IC50 de 7,5 ± 0,6 μM, seguido pelo 8-shogaol (IC50 17,5 ± 2,2 μM) e pelo 10-gingerol (IC50 32,0 ± 1,5 μM). Essa ordem de atividade inibitória da COX-2 é consistente com os valores relativos de ligação determinados por ultrafiltração pulsada acoplada a LC-MS-MS (Tabela 1) e fornece validação para o uso dessa abordagem para classificar ligantes de acordo com sua afinidade por um receptor, conforme relatado originalmente por Sun et al..
Valores de IC50 previamente relatados para a inibição da COX-2 por 6-shogaol (2,1 μM), 8-shogaol (7,2 μM), 6-gingerol (>50 μM) e 8-gingerol (10 μM) são semelhantes aos observados aqui no que diz respeito à determinação de que os shogaóis são inibidores mais potentes da COX-2 do que os gingeróis correspondentes. No entanto, o presente estudo mostra que o 8-shogaol é um inibidor mais potente, e não mais fraco, da COX-2 do que o 6-shogaol, com um IC50 de 17,5 μM e nenhuma atividade de ligação à COX-2, respectivamente). Essa diferença pode ser resultado do uso de COX-2 recombinante humana purificada em vez do ensaio baseado em células no estudo citado.
A análise quantitativa de 10-gingerol, 8-shogaol e 10-shogaol no extrato de gengibre foi realizada por LC-MS-MS, e esses compostos foram determinados como sendo 3,4%, 1,0% e 0,5% (p/p) do extrato, respectivamente. A partição em clorofórmio do extrato metanólico das raízes de gengibre foi testada para inibição de COX-1 e COX-2, e os valores de IC50 foram de 20,0 ± 0,4 μM e 7,5 ± 0,6 μM, respectivamente (Tabela 1). Isso indica que esta preparação de gengibre exibe inibição fraca de COX, mas é um inibidor mais potente de COX-2 do que de COX-1. Esses dados são consistentes com um relatório recente que descobriu que frações de raiz de gengibre contendo quantidades substanciais de gingeróis e compostos relacionados aos gingeróis foram as mais eficazes na inibição da formação de PGE2, que é uma medida da atividade de COX.
- CONCLUSÕES
As preparações de gengibre têm uma longa história de uso humano por suas propriedades anti-inflamatórias, no entanto, apenas recentemente alguns dos compostos responsáveis por essa atividade e seus mecanismos de ação foram identificados. Este estudo fornece informações sobre a identificação de compostos relacionados aos gingeróis que possuem atividade anti-inflamatória por meio da inibição específica de COX-2. O desenvolvimento de ensaios baseados em espectrometria de massa para triagem de extratos botânicos em busca de ligantes de COX-2 e para medição de PGE2 como meio de determinar a inibição de COX-2 facilitou esta investigação.
Embora as atividades inibitórias enzimáticas observadas sejam fracas, pelo menos alguns compostos relacionados aos gingeróis, incluindo gingeróis e shogaóis, inibem seletivamente a forma indutível da ciclooxigenase, COX-2, mas não a forma constitutiva, COX-1. Como a inibição de COX-1 está associada à irritação gastrointestinal, a inibição seletiva de COX-2 deve ajudar a minimizar esse efeito colateral. No geral, verificou-se que a preparação de gengibre usada neste estudo inibe COX-2 aproximadamente três vezes mais do que COX-1, e essa propriedade deve contribuir para a atividade anti-inflamatória benéfica dos produtos de gengibre.
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ABREVIATURAS
SRM
monitoramento de reação selecionada
COX
ciclooxigenase
AINEs
medicamentos anti-inflamatórios não esteroides
PG
prostaglandina
- LITERATURA CITADA
Clonagem do gene humano que codifica a prostaglandina endoperóxido sintase e estrutura primária da enzima
As ciclooxigenases
Efeito de constituintes do gengibre e análogos sintéticos na enzima ciclooxigenase-2 em células intactas
Gengibre—um produto medicinal fitoterápico com amplas ações anti-inflamatórias
Inibição da biossíntese de prostaglandinas e leucotrienos por gingeróis e diaril-heptanoides
Efeitos comparativos de dois extratos de Zingiber officinale contendo gingerol na artrite reumatoide experimental
Efeitos de um extrato de gengibre na dor no joelho em pacientes com osteoartrite
Avaliação de inibidores da ciclooxigenase-2 utilizando espectrometria de massa por ultrafiltração pulsada
Aplicações da espectrometria de massa por ultrafiltração pulsada
Identificação e quantificação de gingeróis e compostos relacionados em suplementos alimentares de gengibre utilizando cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massa em tandem
Avaliação de inibidores da ciclooxigenase-2 utilizando espectrometria de massa por ultrafiltração pulsada
Medição da inibição da ciclooxigenase utilizando cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em tandem
Espectrometria de massa em tandem por ultrafiltração de estrogênios para caracterização da estrutura e afinidade por receptores de estrogênio humanos
Figuras e Tabela
Estruturas químicas do 10-gingerol e compostos relacionados ao gingerol da raiz de gengibre. Em cada grupo de compostos, o átomo de carbono na cadeia lateral alquílica adjacente ao anel fenil é definido como C1. Usando o gingerol como exemplo, se n=4, 6, 8 ou 10, então o composto é denominado 6-, 8-, 10- ou 12-gingerol.
Triagem por espectrometria de massa por ultrafiltração pulsada de uma partição em clorofórmio de um extrato metanólico de raiz de gengibre para ligantes da COX-2. LC-MS-MS com monitoramento de reação selecionada (SRM) foi utilizado para a detecção seletiva de compostos relacionados ao gingerol, incluindo A) 10-gingerol; B) 8-shogaol; C) 8-paradol; e D) 10-gingerdiona e 6-dehidro-10-gingerol. A ligação específica à COX-2 resultou em aumento de pico em comparação com incubações controle sem COX-2.
Curvas dose-resposta para inibição da COX-1 e COX-2 pelos compostos relacionados ao gingerol 8-shogaol e 10-shogaol.
Ligação por ultrafiltração pulsada LC-MS-MS e inibição de ciclooxigenases por compostos relacionados ao gingerol
Composto m/z Transição SRM m/za Tempo de retenção (min) Ligação relativa à COX-2b IC50 COX-1 μM IC50 COX-2 μM extrato de gengibre 20,0 ± 0,4c 7,5 ± 0,6c 6-gingerol 293 293 – 99 25,1 0 8-gingerol 321 321 – 193 33,5 0 10-gingerol 349 349 – 193 40,1 0,17 ± 0,03 >50 32,0 ± 1,5 12-gingerol 377 377 – 193 47,5 0,23 ± 0,01 6-shogaol 275 275 – 139 35,1 0 8-shogaol 303 303 – 167 42,3 0,27 ± 0,02 >50 17,5 ± 2,2 10-shogaol 331 331 – 195 49,7 0,35 ± 0,03 >50 7,5 ± 0,6 12-shogaol 359 359 – 223 56,0 0 6-paradol 277 277 – 141 38,6 0,41 ± 0. 01 8-paradol 305 305 – 169 45,2 0,70 ± 0,02 10-paradol 333 333 – 197 52,2 0 6-gingerdiol 295 295 – 280 24,1 0 8-gingerdiol 323 323 – 308 32,0 0 6-dehidro-6-gingerol 291 291 – 155 20,5 0 6-dehidro-8-gingerol 319 319 – 183 28,3 0 6-dehidro-10-gingerol 347 347 – 211 35,4 0,15 ± 0,01 6-gingerdiona 291 291 – 155 28,0 0,23 ± 0,02 8-gingerdiona 319 319 – 183 35,2 0,20 ± 0,03 10-gingerdiona 347 347 – 211 42,3 0,24 ± 0,05
Transições MS-MS usando monitoramento de reação selecionada (SRM)
Ligação relativa = (área do pico de ultrafiltração pulsada)/(área do pico do tampão de lavagem) μg/mL