pmid: "35035511"
title: "Yijin-Tang Atenua a Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica Induzida por Fumaça de Cigarro e Lipopolissacarídeo em Camundongos."
authors: "Rho J, Seo CS, Hong EJ, Baek EB, Jung E, Park S, Lee MY, Kwun HJ"
journal: "Evidence-based complementary and alternative medicine : eCAM"
pubdate: "2022"
doi: "10.1155/2022/7902920"
source: "PMC Full Text"

Yijin-Tang Atenua a Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica Induzida por Fumaça de Cigarro e Lipopolissacarídeo em Camundongos.

Autores

Rho J, Seo CS, Hong EJ, Baek EB, Jung E, Park S, Lee MY, Kwun HJ

Periodico

Evidence-based complementary and alternative medicine : eCAM (2022)

Conteudo

Yijin-Tang Atenua a Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica Induzida por Fumaça de Cigarro e Lipopolissacarídeo em Camundongos

Introdução
A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) refere-se a um distúrbio pulmonar associado a sintomas de dispneia, tosse e produção de escarro. Tradicionalmente, o Yijin-tang (YJT), uma mistura de Pinellia ternata, Poria cocos, gengibre, alcaçuz chinês e casca de tangerina, tem sido prescrito para o tratamento de doenças do sistema respiratório causadas por fleuma-umidade. Este experimento investigou o efeito terapêutico do YJT em um modelo murino de DPOC induzida por fumaça de cigarro (CS) e lipopolissacarídeo (LPS).

Métodos
A DPOC foi induzida expondo camundongos ao CS por 1 hora por dia durante 8 semanas, com administração intranasal de LPS nas semanas 1, 3, 5 e 7. O YJT foi administrado nas doses de 100 e 200 mg/kg 1 hora antes da exposição ao CS durante as últimas 4 semanas.

Resultados
O YJT suprimiu significativamente os aumentos induzidos por CS e LPS nas contagens de células inflamatórias e reduziu os níveis de interleucina-1 beta (IL-1β), IL-6, fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e proteína quimioatraente de monócitos-1 (MCP-1) no líquido de lavagem broncoalveolar (BALF) e no tecido pulmonar. Além disso, o YJT não apenas diminuiu a espessura da parede das vias aéreas, o intercepto alveolar médio e a fibrose pulmonar, mas também suprimiu a expressão da metalopeptidase de matriz (MMP)-7, MMP-9 e do fator de crescimento transformador beta (TGF-β), bem como a deposição de colágeno. Ademais, o YJT suprimiu a fosforilação do fator nuclear kappa B (NF-κB), assim como a expressão da ciclooxigenase-2 (COX-2) e da óxido nítrico sintase induzível (iNOS).

Conclusão
Coletivamente, nossos achados mostram que o YJT atenua a inflamação respiratória e o remodelamento das vias aéreas causados pela exposição ao CS e ao LPS; portanto, aplicações terapêuticas na DPOC podem ser consideradas.

1. Introdução
   A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) refere-se a um distúrbio pulmonar caracterizado por fluxo aéreo prejudicado acompanhado de dispneia, tosse e produção de escarro. A resistência persistente ao fluxo aéreo é causada por uma combinação de doença inflamatória bronquiolar, destruição estrutural do parênquima e enfisema. A inflamação crônica das vias aéreas associada à DPOC é caracterizada pela migração extensa de vários subconjuntos de leucócitos, incluindo neutrófilos, eosinófilos, macrófagos e linfócitos. A inalação de poluentes atmosféricos desencadeia o engajamento de receptores de reconhecimento de padrões, causando o recrutamento de leucócitos pela liberação de numerosas quimiocinas e citocinas pró-inflamatórias. Esses compostos secretados medeiam a promoção das limitações crônicas e progressivas do fluxo aéreo que acompanham a fibrose e a inflamação.
   A ocorrência de DPOC tem aumentado consistentemente de forma proporcional ao aumento da população fumante. Tratamentos recentemente disponíveis, como corticosteroides, β2-agonistas e inibidores da fosfodiesterase (PDE) tipo 4, são altamente eficazes para sinais clínicos, incluindo dispneia e intolerância ao exercício, e atenuam as manifestações mais extremas da doença. No entanto, essas terapias não podem inibir a progressão da doença e apresentam potencial para intolerância a medicamentos e efeitos colaterais graves. Portanto, agentes alternativos com maior eficácia e menor toxicidade para o tratamento da DPOC estão sendo explorados.
   Yijin-tang (YJT; Erchen-tang em chinês e Nichin-to em japonês), uma prescrição tradicional composta por Pinellia ternata, Poria cocos, gengibre, alcaçuz chinês e casca de tangerina, tem sido usada para a prevenção e tratamento de diversos sintomas. Os principais componentes bioativos do YJT incluem flavonoides (como liquiritina, liquiritigenina, hesperidina, rutina, naringina, neohesperidina e poncirina), triterpenoides (como glicirrizina, ácido pachímico e ácido eburicoico), ácidos fenólicos (como ácido homogentísico) e princípios picantes (como 6-gingerol e 6-shogaol). Esses compostos, originários dos constituintes individuais da medicina herbal, possuem diversas propriedades farmacológicas, incluindo atividades anticancerígenas, anti-inflamatórias, antibacterianas e antioxidantes. Consequentemente, o YJT tem sido amplamente utilizado para tratar sintomas como náusea, vômito, úlceras gastroduodenais e gastrite crônica. Na medicina oriental, umidade-fleuma refere-se à mistura de fleuma e umidade interna como uma entidade que causa doença, na qual a umidade interna é caracterizada por fluxo impedido e turbidez do fluido corporal devido ao aumento da viscosidade, resultando em sensações de peso. Fleuma é uma secreção excessiva patológica de fluido corporal no trato respiratório que tem sido associada a várias doenças, incluindo DPOC. No entanto, nenhum experimento científico foi conduzido para investigar os efeitos terapêuticos do YJT na DPOC. Em nosso estudo, exploramos se o YJT tem efeitos protetores contra a DPOC usando um modelo de camundongo de DPOC induzida por CS e LPS.
2. Métodos
   2.1. Materiais Vegetais
   Os cinco materiais vegetais crus que constituem o YJT, listados na Tabela S1, foram obtidos dos mercados de ervas: HMAX Co. Ltd. (Jecheon, Coreia) e Omniherb Co. Ltd. (Daegu, Coreia). Cada medicamento herbal foi validado pelo Dr. Goya Choi, do Centro de Pesquisa de Recursos de Medicamentos Herbais, Instituto Coreano de Medicina Oriental (KIOM; Naju, Coreia), com base em “The Dispensatory on the Visual and Organoleptic Examination of Herbal Medicine”. O espécime testemunha (2008KE08–1 a 2008KE08–5) foi depositado na Divisão de Pesquisa em Medicamentos Herbais, KIOM.
   2.2. Produtos Químicos e Reagentes
   Os seis compostos padrão a seguir, utilizados para análises quantitativas, foram adquiridos dos fornecedores indicados: liquiritina apiosídeo (Cat. No. 74639-14-8, pureza: 98,0%) da Shanghai Sunny Biotech (Xangai, China); glicirrizina (Cat. No. 1405-86-3, pureza: 99,4%), liquiritina (Cat. No. 551-15-5, pureza: 99,6%) e 6-gingerol (Cat. No. 23513-08-8, pureza: 98,3%) da Wako Chemicals (Osaka, Japão); e narirutina (Cat. No. 14259-46-2, pureza: 99,5%) e hesperidina (Cat. No. 520-26-3, pureza: 98,6%) da Biopurify Phytochemicals (Chengdu, China). As estruturas químicas desses compostos de referência padrão, utilizados para a análise quantitativa por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) das amostras de YJT, são mostradas na Figura Suplementar 1. Os solventes (metanol, acetonitrila e água) utilizados para as análises simultâneas foram de grau HPLC e adquiridos da JT Baker (Phillipsburg, NJ, EUA). O ácido fórmico (grau reagente ACS, Cat. No. 64-18-6, pureza: 100,0%) e o dimetilsulfóxido (grau reagente ACS, Cat. No. 67-68-5, pureza: 99,9%) foram adquiridos da Merck KGaA (Darmstadt, Alemanha).
   2.3. Preparação do Extrato Aquoso de YJT
   Um extrato aquoso de YJT foi preparado primeiramente misturando as cinco ervas—Pinellia tuber (1272,74 g), Citri Unshius (636,36 g), Pericarpium (636,36 g), Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (318,18 g) e Zingiberis Rhizoma Recens (636,36 g)—e, em seguida, extraindo a mistura com 3,5 L de água destilada. Os procedimentos de extração e pré-tratamento foram realizados de acordo com um método previamente relatado. O extrato foi liofilizado, e um total de 640,3 g de pó (rendimento de 18,3%) foi obtido como produto final.
   2.4. Preparação das Soluções Amostra e Padrão para Análise por HPLC
   Soluções amostra (10 mL) para quantificação dos componentes fitoterápicos foram preparadas nas concentrações de 1 mg/mL (liquiritina apiosídeo, liquiritina, narirutina, hesperidina e glicirrizina) ou 10 mg/mL (6-gingerol) em metanol a 70%. As soluções amostra assim preparadas foram filtradas utilizando uma membrana de 0,2 μm (Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI, EUA) e analisadas por HPLC.
   A solução padrão para cada analito foi preparada no nível de 1.000 μg/mL em metanol (liquiritina apiosídeo, liquiritina, narirutina, glicirrizina e 6-gingerol) ou metanol-DMSO (1:1) (hesperidina) e, em seguida, armazenada a ∼4°C até o uso.
   2.5. Sistema e Condições de HPLC para Análise Quantitativa Simultânea de Seis Analitos Marcadores
   Os seis analitos marcadores foram quantitativamente analisados conforme descrito anteriormente (Seo e Shin, 2017) utilizando um sistema Shimadzu Prominence LC-20A (Kyoto, Japão) combinado a um detector de arranjo de fotodiodos. Uma coluna de fase reversa SunFire C18 (Waters, Milford, MA, EUA) foi utilizada, e as amostras foram eluídas em gradiente com fases móveis compostas de água destilada e acetonitrila, ambas contendo 0,1% (v/v) de ácido fórmico. Outras condições de análise específicas são mostradas na Tabela S2.
   2.6. Animais
   Male C57BL/6 mice (7 weeks of age) were bought from Orient Bio (Seongnam, Korea). During the experiment, the mice were raised in constant conditions such as a temperature of 22°C ± 2°C, a relative humidity of 50% ± 5%, and a 12 h light/dark cycle. Standard rodent chow and filtered water were provided freely. The mice were quarantined and acclimatized for one week prior to the experiments. Experiments that involved animals in this study were reviewed and approved by the Animal Ethics Committee (Daejeon, South Korea).

2.7. Induction of COPD

The animals were classified into five groups after the acclimatization period (n = 7-8 per group). The five groups are as follows: (i) normal control (CON) group; (ii) CS exposure/LPS intranasal administration (CS + LPS) group; (iii) CS exposure/LPS administration + 5 mg/kg roflumilast p.o (RO) group (used as a positive control group); (iv) CS exposure/LPS administration + 100 mg/kg YJT p.o (YJT100) group; and (v) CS exposure/LPS administration + 200 mg/kg YJT p.o (YJT200) group. Cigarette smoke (CS) was generated by burning 3R4F research cigarettes manufactured from the Tobacco and Health Research Institute at the University of Kentucky (KY, USA). We exposed mice to CS from 8 cigarettes for 60 min/day in an exposure chamber with air pumps providing fresh, clean air. The CS lasted for 8 weeks with 5 days in a week. LPS (10µg per mouse) was anesthetized and exposed to animals via intranasal administration a total of four times on weeks 1, 3, 5, and 7. Roflumilast and YJT were administered to animals via p.o 1 hour before CS exposure for the last 4 weeks.

2.8. Collection of Blood and Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF)

The animals were euthanized 48 hours after the last induction of CS. Animals were fasted for 12 hours before the sacrifice. Serum was collected via the caudal vena cava and centrifuged at 1500 rpm for 15 min. It was stored at −80°C deep freezer for further investigations. BALF was collected through tracheal intubation with the help of a cannula. Bronchoalveolar was washed by 1.5 mL of Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), pumping three times. It was then centrifuged, with its supernatant collected and kept in a 70°C deep freezer. Cell pellets were stained trypan blue and evaluated by counting alive cells in five squares of a hemocytometer. In addition, Diff-Quik stain (B4132-1A; IMEB Inc., IL, USA) was performed with another aliquot of BALF (100 μL) on a slide. The cells were centrifuged by the Cytospin system (Hanil Science Industrial, Seoul, Korea), followed by drying slides. Following fixation, cells were stained with Diff-Quik stain reagents in accordance with the instructions.

2.9. Histopathological Examination
Os tecidos pulmonares foram fixados em formalina tamponada neutra a 10% (FTN) por 24 horas. Os tecidos foram tratados como parte do processo de rotina dos tecidos e corados com hematoxilina e eosina. Para investigar alterações pulmonares, o intercepto linear médio (ILM) foi medido em cinco imagens de 4 animais selecionados aleatoriamente em cada grupo, de acordo com o estudo anterior. 5 linhas horizontais igualmente espaçadas com aumento de 20X foram visualizadas. Em seguida, o comprimento total de todas as linhas contadas foi dividido pelo número total de interceptos por campo. A espessura média da membrana basal do bronquíolo foi medida em 20X de um bronquíolo de tamanho semelhante selecionado aleatoriamente. A coloração com vermelho Sirius foi realizada por incubação por 50 minutos à temperatura ambiente, seguida de reidratação.
2.10. Ensaio de Imuno-histoquímica (IHQ)
Para realizar a IHQ, o anticorpo primário contra a matriz metalopeptidase (MMP)-7 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) foi aplicado durante a noite em uma solução diluída de 200:1 de acordo com o guia do fabricante. A área positiva foi calculada em cada tecido pulmonar de pelo menos 4 animais por grupo.
2.11. Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA)
Os níveis de interleucina (IL)-6 e fator de necrose tumoral (TNF)-α no LBA foram investigados por kits comercialmente disponíveis (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Após incubação por 10 minutos no escuro, o nível foi determinado por absorbância óptica a 450 nm com um leitor de microplacas (Infinite m200pro; Tecan, Männedorf, Suíça).
2.12. Extração de RNA e Análise de PCR em Tempo Real da Expressão de mRNA
O RNA total dos pulmões foi isolado pelo reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) após homogeneização do tecido pulmonar. O nível de RNA foi determinado pela detecção da intensidade óptica no comprimento de onda de 260 nm, e sua pureza foi detectada pela razão da absorbância de 260 nm para 280 nm. O cDNA foi sintetizado a partir de 1 μg de RNA total com um kit de transcrição reversa (Toyobo, Japão) de acordo com as instruções. Uma reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada em um sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technologies, CA, EUA) usando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA, EUA) de acordo com as instruções. Os primers de PCR utilizados nestes experimentos estão listados na Tabela 1. Os dados de PCR foram analisados usando o software Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems), e a razão da mudança na expressão do gene alvo em relação ao controle endógeno (GAPDH) foi calculada usando o método 2−ΔΔCt, conforme descrito anteriormente (Park et al., 2018)..
2.13. Análise de Western Blot
As amostras de pulmão foram maceradas em tampão de lise RIPA (Cell Signaling Technology, MA, EUA) e combinadas com coquetéis de inibidores. Medimos quantidades equivalentes de proteínas pulmonares (30 μg), carregadas em SDS-PAGE 8%, eletroforizadas a 60V, e transferimos as proteínas para fluoreto de polivinilideno (PVDF) a 250V por 2 horas. As membranas transferidas foram bloqueadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) e 5% de leite desnatado por 1 hora e incubadas durante a noite a 4°C com anticorpos anti-fator nuclear kappa B (NF-κB), anti-fosfo-NF-κB (Cell Signaling Technology, MA, EUA), anti-ciclooxigenase-2 (COX-2; Abcam, Cambridge, Reino Unido), óxido nítrico sintase induzível (iNOS; Abcam) ou anti-β-actina (Sigma-Aldrich, MO, EUA). Incubamos as membranas com anticorpos por 1 hora e detectamos a expressão proteica por luminógrafo (ATTO, Tóquio, Japão).

2.14. Análise Estatística

Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP). As comparações estatísticas foram realizadas por análise de variância unidirecional (ANOVA) usando GraphPad Prism 6 (GraphPad, CA, EUA). Se os dados fossem significativos, foi realizado um teste post hoc com ajuste de Tukey. A significância estatística foi determinada por valor de P < 0,05.

3. Resultados

3.1. Otimização das Condições Cromatográficas por CLAE e Análise Quantitativa de Seis Analitos Marcadores

As condições ideais de análise para os seis analitos marcadores (liquiritina aplosídeo, liquiritina, narirutina, hesperidina, glicirrizina e 6-gingerol) na amostra YJT foram estabelecidas da seguinte forma: coluna, SunFire C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); temperatura do forno da coluna, 40°C; sistema de fase móvel, água destilada-acetonitrila (ambas contendo 0,1% de ácido fórmico). A aplicação dessas condições de análise à amostra YJT resultou na separação de todos os componentes em 35 minutos (Figura 1). Os fatores de adequação do sistema, fator de capacidade (k′), fator de seletividade (α), resolução (Rs), número de pratos teóricos (N) e fator de cauda (Tf) do ensaio também foram aceitáveis (Tabela S3).

Uma curva de calibração para a análise quantitativa dos seis componentes marcadores foi preparada como a razão da área do pico (y) versus a concentração correspondente (x) ao longo da faixa mostrada na Tabela 2. O coeficiente de determinação resultante foi ≥ 0,9999, mostrando excelente linearidade. As faixas de limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) foram calculadas como 0,03–0,13 μg/mL e 0,09–0,40 μg/mL, respectivamente. Esses resultados, resumidos na Tabela 2, demonstram que o método analítico de CLAE estabelecido é adequado para a determinação quantitativa dos seis analitos marcadores na amostra YJT.

Cada um dos seis analitos nas amostras YJT foi quantificado por referência à curva de calibração correspondente usando as condições de análise de CLAE indicadas, com a glicirrizina quantificada a 255 nm, liquiritina aplosídeo e liquiritina a 275 nm, e narirutina, hesperidina e 6-gingerol a 280 nm. As concentrações dos seis analitos marcadores nas amostras YJT variaram de 0,28 a 12,88 mg/g (Tabela 3).
3.2. Efeitos do YJT na Lesão Histológica Pulmonar
Para avaliar se o YJT afeta as alterações histopatológicas induzidas pela exposição ao CS e LPS, coramos a região alveolar e a região peribrônquica no tecido pulmonar com H e E. Conforme mostrado na Figura 2, animais expostos a CS e LPS apresentaram infiltração severa de células imunológicas nos bronquíolos e alvéolos, aumento da espessura da parede das vias aéreas e interceptos alveolares médios, refletindo o grau de enfisema. No entanto, a infiltração de células inflamatórias, a espessura da parede das vias aéreas e os interceptos alveolares médios diminuíram nos grupos tratados com roflumilaste e YJT em comparação com os grupos expostos a CS e LPS (Figura 2).
3.3. Efeitos do YJT nas Células Inflamatórias no BALF
Para investigar os efeitos do YJT nas respostas inflamatórias desencadeadas por CS e LPS, determinamos o número de células e o status de subclasses no BALF. O número de células totais, linfócitos e macrófagos no BALF foi determinado. Como resultado, o número de células totais, linfócitos e macrófagos aumentou no BALF de camundongos expostos a CS e LPS em comparação com camundongos controle (Figura 3). Notavelmente, o número de células totais, linfócitos e macrófagos no BALF diminuiu significativamente em animais tratados com roflumilaste ou YJT em comparação com animais expostos a CS e LPS (Figura 3).
3.4. Efeitos do YJT nos Níveis de IL-6 e TNF-α no BALF
Conforme demonstrado na Figura 4, os níveis de IL-6 e TNF-α aumentaram acentuadamente no BALF do grupo exposto a CS e LPS em comparação com camundongos controle. Esse efeito foi atenuado pelo roflumilaste e YJT, que diminuíram significativamente os níveis de IL-6 e TNF-α no BALF em comparação com camundongos expostos a CS e LPS (Figura 4).
3.5. Efeitos do YJT nos Níveis de mRNA de IL-1β, IL-6, TNF-α e MCP-1 em Tecidos Pulmonares
Os níveis de mRNA para IL-1β, IL-6, TNF-α e MCP-1 aumentaram notavelmente em camundongos expostos a CS e LPS em comparação com camundongos controle (Figura 5). Consistente com seus efeitos no BALF, o roflumilaste e o YJT diminuíram significativamente os níveis de mRNA de IL-1β, IL-6, TNF-α e MCP-1 nos tecidos pulmonares em comparação com camundongos expostos a CS e LPS (Figura 5).
3.6. Efeitos do YJT na Ativação de NF-κB e Expressão de COX-2 e iNOS
A fosforilação de NF-κB, COX-2 e iNOS é essencial nas respostas inflamatórias. Conforme mostrado na Figura 6(a), a fosforilação de NF-κB p65 nos tecidos pulmonares aumentou acentuadamente em camundongos induzidos por CS e LPS, um efeito que foi significativamente reduzido nos grupos de tratamento com roflumilaste e YJT. Da mesma forma, a expressão de COX-2 e iNOS foi maior em camundongos expostos a CS e LPS do que em camundongos controle, mas atenuada em animais administrados com roflumilaste ou YJT (Figura 6(b)).
3.7. Efeitos do YJT no Remodelamento Tecidual no Pulmão
A remodelação tecidual no parênquima pulmonar danificado é um mecanismo crítico da DPOC. As principais alterações arquitetônicas nos pulmões com DPOC são o aumento da deposição de matriz extracelular (MEC) intersticial e fibrose peribronquiolar. A coloração com vermelho Sirius mostrou aumento da fibrose peribronquiolar nos pulmões de camundongos expostos a CS e LPS, alterações que foram acentuadamente reduzidas em camundongos tratados com roflumilaste ou YJT (Figura 7(a)). Além disso, a área positiva de MMP-7 aumentou em camundongos expostos a CS e LPS, mas essa elevação foi atenuada em animais tratados com roflumilaste ou YJT (Figura 7(a)). Marcadores de remodelação estrutural, como níveis de MMP-7, MMP-9 e TGF-β nos pulmões de animais expostos a CS e LPS, foram maiores do que em camundongos controle. Novamente, a expressão desses fatores foi acentuadamente menor em animais tratados com roflumilaste ou YJT em comparação com camundongos expostos a CS e LPS (Figura 7(b)).

4. Discussão

No presente estudo, os efeitos protetores do YJT na progressão da DPOC foram investigados por meio de um modelo murino de DPOC induzida por CS e LPS. O YJT inibiu significativamente o recrutamento de células inflamatórias e a produção de citocinas no tecido pulmonar no BALF e nos tecidos pulmonares expostos a CS e LPS. Também atenuou o espessamento da parede das vias aéreas, o enfisema e a fibrose, e reprimiu efetivamente a expressão de MMPs e TGF-β, e a deposição de colágeno em camundongos expostos a CS e LPS.

A DPOC pode ser desencadeada por várias respostas imunológicas nos pulmões devido à inalação crônica de irritantes. O CS contém inúmeros produtos químicos tóxicos, alguns dos quais podem danificar diretamente as membranas celulares, enquanto outros podem danificar indiretamente os pneumócitos ao produzir espécies reativas de oxigênio (ERO). Agindo por qualquer uma das vias, o CS induz uma resposta inflamatória que pode causar secundariamente enfisema ou estreitamento das pequenas vias aéreas. Essa inflamação crônica é caracterizada pelo recrutamento de células inflamatórias para os pulmões, incluindo neutrófilos, macrófagos e linfócitos. Por sua vez, essas células produzem citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α, IL-6, IL-1β e MCP-1. O TNF-α, produzido principalmente por macrófagos, pode promover a expressão de CXCL10, um potente quimioatraente que recruta neutrófilos, monócitos e células T auxiliares do tipo 1, consequentemente causando enfisema pulmonar. A IL-6, também predominantemente secretada por macrófagos, tem efeitos quimiotáticos para neutrófilos, o que pode afetar a gravidade da doença e o prognóstico em pacientes com DPOC. A IL-1β promove fibrose nas paredes das vias aéreas, aumenta a produção de mucina e recruta agregados linfocitários nas vias aéreas. A MCP-1 é um fator importante que recruta células inflamatórias para os pulmões de pacientes com DPOC. Nosso experimento mostrou que o tratamento com YJT atenuou significativamente o número de células inflamatórias e os níveis de pró-inflamatórios no BALF e nos tecidos pulmonares de camundongos induzidos por CS e LPS. Esses resultados mostram que o YJT suprime a resposta inflamatória associada à DPOC.
As principais características histopatológicas observadas em biópsias de pacientes com DPOC são caracterizadas por anormalidades na arquitetura do pulmão, incluindo espessamento da membrana basal, fibrose epitelial e aumento da espessura do interstício dos alvéolos, com intenso recrutamento de células inflamatórias. Esses eventos celulares são chamados de remodelamento tecidual. Envolve uma modificação severa da MEC, que é crítica para a função fisiológica do pulmão. As MMPs, uma família de endopeptidases, podem degradar proteínas da MEC. Em condições normais, as MMPs desempenham um papel no remodelamento da MEC e regulam as respostas imunes ao clivar citocinas e quimiocinas inativadas em formas ativas. Em condições de DPOC, no entanto, as MMPs levam à inflamação pulmonar excessiva e à destruição anormal do tecido. Em pacientes com DPOC, os níveis de MMP-7 e MMP-9 estão aumentados no soro, plasma, escarro, LBA e tecido pulmonar, respectivamente. Essas MMPs podem destruir a arquitetura alveolar, exacerbar as respostas inflamatórias nos tecidos pulmonares e induzir enfisema, causando perda de função pulmonar. A MMP-9 também é responsável pela ativação e produção de TGF-β nas células epiteliais alveolares. O TGF-β é um dos fatores de crescimento mais importantes envolvidos na patogênese da DPOC. A ativação da via de sinalização do TGF-β causa fibrose das vias aéreas e o desenvolvimento de enfisema, principalmente ao afetar a produção e degradação de colágeno na MEC. Neste estudo, o tratamento com YJT atenuou o acúmulo de colágeno nos bronquíolos e reduziu o espessamento das paredes alveolares e o intercepto alveolar. Também suprimiu significativamente os níveis elevados de MMP-7, MMP-9 e TGF-β em camundongos expostos a LPS e CS. Esses resultados sugerem que o YJT pode melhorar a DPOC ao suprimir o remodelamento das vias aéreas.
No presente estudo, camundongos expostos a CS e LPS exibiram fosforilação aumentada de NF-κB em comparação com camundongos controle, e o tratamento com YJT suprimiu a ativação de NF-κB causada pela exposição a CS e LPS. TNF-α, IL-6 e IL-1β parecem amplificar a inflamação na DPOC, em parte através da ativação do fator de transcrição NF-κB e MAPK, levando assim ao aumento da expressão de múltiplos genes inflamatórios. Foi demonstrado anteriormente que a fosforilação de NF-κB está significativamente aumentada em pacientes com DPOC e modelos animais. A ativação de NF-κB é promovida por estímulos pró-inflamatórios como CS, LPS e TNF-α, que causam a degradação da proteína inibidora de NF-κB, IκB. O NF-κB é então translocado para o núcleo, onde induz a transcrição de iNOS, COX-2 e MMP-9, todos reguladores-chave das respostas inflamatórias das vias aéreas. Nossos resultados mostram que a ativação de NF-κB é maior em camundongos expostos a CS e LPS, em associação com níveis elevados de MMP-9, iNOS e COX-2 no tecido pulmonar, em comparação com os controles. No entanto, camundongos tratados com YJT exibiram uma redução acentuada no NF-κB fosforilado, com diminuições em MMP-9, iNOS e COX-2 em relação aos camundongos expostos a CS e LPS. Esses resultados sugerem que o YJT é capaz de suprimir as respostas inflamatórias e o remodelamento das vias aéreas causados pela exposição a CS e LPS, em parte pela regulação negativa da ativação de NF-κB.
5. Conclusão
Em suma, nosso estudo demonstrou que o YJT proporciona um efeito protetor contra a DPOC induzida por LPS e CS em um modelo de camundongo, reduzindo as respostas inflamatórias e o remodelamento das vias aéreas, efeitos que podem estar relacionados à supressão da via de NF-κB. Portanto, nosso estudo demonstra que o YJT pode ser um agente potencial para o tratamento da DPOC.
Abreviaturas
DPOC:
Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica
COX-2:
Ciclooxigenase-2
CS:
Fumaça de cigarro
IL-1β:
Interleucina-1
IL-6:
Interleucina-6
iNOS:
Óxido nítrico sintase induzível
MCP-1:
Proteína quimiotática de monócitos-1
MMP-7:
Metalopeptidase de matriz-7
MMP-9:
Metalopeptidase de matriz-9
NC:
Controle negativo
NF-κB:
Fator nuclear kappa B
p.o.:
Per os
RO:
Roflumilaste
TGF-β:
Fator de transformação do crescimento-β
TNF-α:
Fator de necrose tumoral-α
s.c.:
Subcutâneo
YJT:
Yijin-tang.
Disponibilidade de Dados
Os dados gerados a partir dos achados deste estudo estão incluídos no artigo.
Aprovação Ética
Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Nacional de Chungnam (número de aprovação: CNU-01141).
Consentimento
Não aplicável.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Contribuições dos Autores
JR, como investigador principal, desenhou o estudo e coordenou a avaliação científica. CSS desenvolveu os métodos e realizou os experimentos. EJH realizou o exame histológico de todas as seções de tecido. EBB realizou os experimentos, análise de dados e preparação do manuscrito. EJ e SP realizaram experimentos adicionais e análise de dados para revisão. MYL forneceu financiamento de pesquisa e revisou o manuscrito. HJK supervisionou o estudo e forneceu financiamento de pesquisa. Todos os autores leram e aprovaram o conteúdo final do manuscrito. Jinhyung Rho e Chang-Seob Seo contribuíram igualmente para este trabalho.
Materiais Suplementares
A revisão de 2011 da estratégia global para o diagnóstico, manejo e prevenção da DPOC (GOLD)-por que e o quê?
Mudanças no volume expiratório forçado em 1 segundo ao longo do tempo na DPOC
A imunopatogênese da doença pulmonar obstrutiva crônica: insights de pesquisas recentes
Terapia inalatória de longa duração (beta-agonistas, anticolinérgicos e esteroides) para DPOC: uma metanálise em rede
Doença pulmonar obstrutiva crônica
Antagonistas de receptores muscarínicos de longa duração para o tratamento de doenças crônicas das vias aéreas
Determinação simultânea de nove compostos bioativos em Yijin-tang por cromatografia líquida de alta eficiência e cromatografia líquida-espectrometria de massas com ionização por electrospray
Análise química da medicina herbal chinesa Gan-Cao (alcaçuz)
As atividades antiangiogênicas do ácido glicirrízico na progressão tumoral
Identificação e avaliação fisiológica dos componentes de frutas cítricas como potenciais fármacos para anticorpulência e anticâncer
Ácido pinélico do tubérculo de Pinellia ternata Breitenbach como um adjuvante oral eficaz para vacina nasal contra influenza
Efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios comparativos de [6]-gingerol, [8]-gingerol, [10]-gingerol e [6]-shogaol
Triterpenos de Poria cocos suprimem o crescimento e a invasividade de células de câncer pancreático através da regulação negativa de MMP-7
Efeito anti-inflamatório do ácido pachímico promove a diferenciação odontoblástica via HO-1 em células da polpa dentária
Análise simultânea de seis compostos em Yijin-tang por HPLC-PDA
Superexpressão condicional do fator de crescimento transformador β1 bioativo no pulmão de camundongos neonatais
Efeitos gastroprotetores de Hwanglyeonhaedok-tang contra lesão celular gástrica induzida por Helicobacter pylori
A regulação da via de sinalização NF-κB/MAPK atenua a inflamação pulmonar aguda em ratos com pneumonia por Klebsiella mediante tratamento com mollugin
Sinalização de NF-kappaB na doença inflamatória crônica das vias aéreas
Remodelação das vias aéreas na doença pulmonar obstrutiva crônica e asma: o papel da metaloproteinase-9 da matriz
Indução da polarização M2 de macrófagos murinos pelo extrato de fumaça de cigarro via via JAK2/STAT3
Ações duplas antioxidante e anti-inflamatória do 17-oxo-DHA eletrofílico derivado da ciclooxigenase-2 na inflamação induzida por lipopolissacarídeo e fumaça de cigarro
Deleção de Keap1 no pulmão atenua o estresse oxidativo e a inflamação induzidos por fumaça de cigarro aguda
Indução de interferon γ de enfisema pulmonar no pulmão murino adulto
Terapia anti-TNFα em doenças pulmonares inflamatórias
Níveis elevados de PCR marcam comprometimento metabólico e funcional na DPOC avançada
Interleucina-1β causa inflamação pulmonar, enfisema e remodelamento das vias aéreas no pulmão murino adulto
Os níveis sanguíneos de MCP-1 estão aumentados em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica com enfisema prevalente
Inflamação e remodelamento na doença pulmonar obstrutiva crônica
Remodelamento e inflamação dos brônquios na asma e na doença pulmonar obstrutiva crônica
Metaloproteinases da matriz na patologia pulmonar destrutiva
O macrófago na doença pulmonar obstrutiva crônica
A metaloproteinase-9 da matriz pulmonar se correlaciona com o tabagismo e a obstrução do fluxo aéreo
Concentração de metaloproteinase-9 da matriz no soro de pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica e grau de obstrução das vias aéreas e progressão da doença
MMP1 e MMP7 como potenciais biomarcadores sanguíneos periféricos na fibrose pulmonar idiopática
O VEF1 se correlaciona inversamente com as metaloproteinases 1, 7, 9 e PCR na DPOC por exposição à fumaça de biomassa
A melatonina reduz a inflamação das vias aéreas na asma induzida por ovalbumina
A metaloprotease-9 da matriz induz a produção de fator de crescimento transformador beta (1) no epitélio das vias aéreas através da ativação de receptores do fator de crescimento epidérmico
Vias de sinalização do TGF-β em diferentes compartimentos das vias aéreas inferiores de pacientes com DPOC estável
Sinalização do TGF-β e a resposta fibrótica
Efeito protetor do extrato aquoso de HwangRyunHaeDok-Tang contra a doença pulmonar obstrutiva crônica induzida por fumaça de cigarro e lipopolissacarídeo em um modelo murino
Tabagismo e inflamação
A exposição à fumaça de cigarro regula negativamente a expressão do receptor β2-adrenérgico e aumenta a inflamação em macrófagos alveolares
Um cromatograma de HPLC de solução padrão (a) e amostra de Yijin-tang (b). Liquiritina apiosídeo (1), liquiritina (2), narirutina (3), hesperidina (4), glicirrizina (5) e 6-gingerol (6).
O YJT inibiu o dano pulmonar induzido por CS e LPS. Visão histológica do pulmão e análise. (a) Coloração H&E. (b) Espessura da parede das vias aéreas. (c) Intercepto alveolar médio, representando o grau de enfisema, quantificado de acordo com o intercepto linear médio (ILM). CON, controle; CS + LPS, camundongos expostos a CS/LPS; RO, roflumilaste (10 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS; YJT100, YJT (100 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS; YJT200, YJT (200 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS. Os resultados são apresentados como médias ± DP (#P < 0,05, ##P < 0,01 em comparação com o grupo CON; ∗P < 0,05, ∗∗P < 0,01 em comparação com o grupo CS + LPS).
O YJT reduziu o número de células inflamatórias no BALF. (a) Número total de células. (b) Número de linfócitos. (c) Número de macrófagos. CON, controle; CS + LPS, camundongos expostos a CS/LPS; RO, roflumilaste (10 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS; YJT100, YJT (100 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS; YJT200, YJT (200 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS. Os resultados são apresentados como média ± DP (#P < 0,05, ##P < 0,01 em comparação com o grupo CON; ∗P < 0,05, ∗∗P < 0,01 em comparação com o grupo CS + LPS).

O YJT reduziu as citocinas pró-inflamatórias no BALF. (a) Concentração de IL-6. (b) Concentração de TNF-α. CON, controle; CS + LPS, camundongos expostos a CS/LPS; RO, roflumilaste (10 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS; YJT100, YJT (100 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS; YJT200, YJT (200 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS. Os resultados são apresentados como média ± DP (#P < 0,05, ##P < 0,01 em comparação com o grupo CON; ∗P < 0,05, ∗∗P < 0,01 em comparação com o grupo CS + LPS).

O YJT reduziu a expressão de mRNA de citocinas inflamatórias no pulmão. Níveis de IL-1β (a), IL-6 (b), TNF-α (c) e MCP-1 (d), medidos por PCR em tempo real. CON, controle; CS + LPS, camundongos expostos a CS/LPS; RO, roflumilaste (10 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS; YJT100, YJT (100 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS; YJT200, YJT (200 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS. Os resultados são apresentados como média ± DP (#P < 0,05, ##P < 0,01 em comparação com o grupo CON; ∗P < 0,05, ∗∗P < 0,01 em comparação com o grupo CS + LPS).

O YJT diminuiu a atividade de NF-κB e a expressão de iNOS e COX-2. Fosforilação de NF-κB p65 (a) e expressão de iNOS e COX-2 (b) em tecidos pulmonares, avaliadas por análise de western blot. CON, controle; CS + LPS, camundongos expostos a CS/LPS; RO, roflumilaste (10 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS; YJT100, YJT (100 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS; YJT200, YJT (200 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS. Os resultados são apresentados como média ± DP (#P < 0,05, ##P < 0,01 em comparação com o grupo CON; ∗P < 0,05, ∗∗P < 0,01 em comparação com o grupo CS + LPS).

O YJT suprimiu os níveis de MMPs e TGF-β. (a) Coloração com Sirius-red e imuno-histoquímica de MMP-7 (X200). (b) Expressão de mRNA de MMP-7, MMP-9 e TGF-β no pulmão. CON, controle; CS + LPS, camundongos expostos a CS/LPS; RO, roflumilaste (10 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS; YJT100, YJT (100 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS; YJT200, YJT (200 mg/kg) + camundongos expostos a CS/LPS. Os resultados são apresentados como média ± DP (#P < 0,05, ##P < 0,01 em comparação com o grupo CON; ∗P < 0,05, ∗∗P < 0,01 em comparação com o grupo CS + LPS).

Sequências dos primers.
Alvo Sequência IL-1β 5′-AGG ACC CAA GCA CCT TCT TT-3′ (direto)5′-AGA CAG CAC GAG GCA TTT T-3′ (reverso) IL-6 5′-TAG TCC TTC CTA CCC CAA CT-3′ (direto)5′-TTG GTC CTT AGC CAC TCC TT-3′ (reverso) TNF-α 5′-GTC TGT GCC TCA GCC TCT TC -3′ (direto)5′-CCC ATT TGG GAA CTT CrC CT-3′ (reverso) MCP-1 5′-GCA TCC ACG TGT TGG CTC A-3′ (direto)5′-CTC CAG CCT ACT TCA TTG GGA TC-3′ (reverso) MMP-7 5′-GTT TTT GAT GCT ATT GCT GA-3′ (direto)5′-CCC ACA TTT GAC GTC CAG TCC AGA G-3′ (reverso) MMP-9 5′-ACG ACA TAG ACG CCA TCC AGT-3′ (direto)5′-AGG TAT AGT GGG ACG ACT GGG-3′ (reverso) TGF-β 5′-TTG CTT CAG CTC CAC AGA GA-3′ (direto)5′-TGG TTG TAG AGG GCA AGG AC-3′ (reverso) GAPDH 5′-ACA GCA ACA GGG TGG TGG AC-3′ (direto)5′-TTT GAG GGT GCA GCG AAC TT-3′ (reverso)
Faixa linear, equação de regressão, r2, LODs e LOQs para os analitos marcadores (n = 3).
Analito Faixa linear (μg/mL) Equação de regressãoa (y = ax + b) r2 LODb (μg/mL) LOQc (μg/mL) Liquiritina apiosídeo 0,47–30,00 y = 13919,31x + 1750,37 0,9999 0,09 0,28 Liquiritina 0,47–30,00 y = 23478,34x + 2764,20 1,0000 0,07 0,23 Narirutina 0,78–50,00 y = 16945,14x + 3555,47 1,0000 0,13 0,40 Hesperidina 0,78–50,00 y = 16439,25x + 2890,32 1,0000 0,09 0,26 Glicirrizina 0,47–30,00 y = 7344,40x + 533,61 1,0000 0,03 0,09 6-Gingerol 0,47–30,00 y = 6451,07x + 686,49 1,0000 0,03 0,09

a
y: área do pico (mAU) de cada analito; x: concentração (μg/mL) de cada analito. bLOD = 3,3 × σ/S. cLOQ = 10 × σ/S (onde σ é o desvio padrão do intercepto y, e S é a inclinação da curva de calibração).
Concentração dos seis analitos marcadores na amostra de Yijin-tang (n = 3).
Analito Lote nº 1 2 3 Média (mg/g) ± DPa (×10−1) DPR (%) Média (mg/g) ± DP (×10−1) DPR (%) Média (mg/g) ± DP (×10−1) DPR (%) Liquiritina apiosídeo 6,16 ± 1,06 1,72 6,49 ± 0,80 1,23 6,29 ± 0,31 0,49 Liquiritina 3,22 ± 0,55 1,71 3,39 ± 0,35 1,03 3,28 ± 0,20 0,61 Narirutina 8,09 ± 1,15 1,42 8,51 ± 0,95 1,12 8,25 ± 0,71 0,86 Hesperidina 12,24 ± 1,98 1,62 12,88 ± 1,15 0,89 12,49 ± 1,02 0,81 Glicirrizina 6,77 ± 1,51 2,23 7,11 ± 0,43 0,61 6,88 ± 0,68 0,99 6-Gingerol 0,28 ± 0,0,04 1,48 0,28 ± 0,05 1,91 0,28 ± 0,02 0,71

aDP significa desvio padrão.