pmid: "35204307"
title: "Melhora do Dano em Fibroblastos Dérmicos Humanos por 3,5,7-Trimetoxiflavona do Gengibre Preto ("
authors: "Lee S, Jang T, Kim KH, Kang KS"
journal: "Antioxidants (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2022 Feb 19"
doi: "10.3390/antiox11020425"
source: "PMC Full Text"
Melhora do Dano em Fibroblastos Dérmicos Humanos por 3,5,7-Trimetoxiflavona do Gengibre Preto (
Autores
Lee S, Jang T, Kim KH, Kang KS
Periodico
Antioxidants (Basel, Switzerland) (2022 Feb 19)
Conteudo
Melhora dos Danos em Fibroblastos Dérmicos Humanos pela 3,5,7-Trimetoxiflavona do Gengibre Preto (Kaempferia parviflora)
As espécies reativas de oxigênio (ERO) são geradas durante o envelhecimento intrínseco (cronológico) e extrínseco (fotoenvelhecimento) da pele. Portanto, antioxidantes que inibem a produção de ERO podem estar envolvidos no retardo do envelhecimento cutâneo. Neste estudo, investigamos os potenciais efeitos de compostos isolados do gengibre preto, Kaempferia parviflora, uma planta medicinal tradicional, em fibroblastos dérmicos humanos normais no contexto de inflamação e estresse oxidativo. Os compostos isolados foram caracterizados estruturalmente como 5-hidroxi-7-metoxiflavona (1), 3,7-dimetoxi-5-hidroxiflavona (2), 5-hidroxi-3,7,3,4-tetrametoxiflavona (3), 7,4-dimetilapigenina (4), 3,7,4-trimetilcaempferol (5) e 3,5,7-trimetoxiflavona (6), utilizando análises de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) e cromatografia líquida–espectrometria de massas (CL/EM). Esses flavonoides foram primeiramente avaliados quanto à sua capacidade de suprimir a degradação da matriz extracelular em fibroblastos dérmicos humanos normais. Dentre eles, a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) inibiu significativamente a alta expressão e secreção de metaloproteinase de matriz (MMP)-1 induzida pelo fator de necrose tumoral (TNF)-α pelas células. Descobrimos ainda que a 3,5,7-trimetoxiflavona suprimiu o aumento excessivo de ERO, proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), Akt e ciclooxigenase-2 (COX-2) e aumentou a expressão de heme oxigenase (HO)-1. A expressão de citocinas pró-inflamatórias, incluindo interleucina (IL)-1β, IL-6 e IL-8, também foi suprimida pela 3,5,7-trimetoxiflavona (6). Em conjunto, nossos resultados indicam que a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) isolada de K. parviflora é um candidato potencial para melhorar os danos à pele.
- Introdução
A pele é um importante órgão de defesa formado a partir do ectoderma humano; ela desempenha funções sensoriais, de controle e protetoras quando em contato direto com fatores prejudiciais latentes. O envelhecimento intrínseco surge com uma diminuição gradual da atividade celular da pele com a idade, e é causado por espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidas a partir do processo metabólico celular. O envelhecimento externo e os danos à pele ocorrem mediante exposição direta ao ambiente externo e são causados por riscos ambientais, como poluição, produtos químicos, tabagismo e radiação ultravioleta (UV). A radiação UV contribui substancialmente para várias lesões e doenças de pele, incluindo envelhecimento cutâneo e doenças inflamatórias da pele. A radiação UV induz a formação intracelular de ROS, causando danos inflamatórios generalizados da epiderme à derme, resultando em danos cutâneos acumulativos, como pigmentação da pele e fotoenvelhecimento. A geração de ROS causa danos oxidativos e alterações intracelulares, como desnaturação do DNA, destruição da membrana celular e respostas inflamatórias, causando problemas funcionais. Substâncias estranhas nocivas podem causar o acúmulo de ROS, que são produzidas pela fosforilação oxidativa nas mitocôndrias. O excesso de ROS na pele induz a formação de rugas devido à clivagem de fibras elásticas e proteínas fibrosas, como o colágeno, que compõem a matriz extracelular (MEC) da pele. A metaloproteinase-1 da matriz (MMP-1) é uma colagenase que degrada o colágeno. A principal causa do envelhecimento extrínseco é uma reação complexa induzida por ROS, que são produzidas pela absorção da luz ultravioleta pela pele. Portanto, substâncias que inibem a produção de ROS e MMP-1 podem ser eficazes na prevenção de danos à pele, como o envelhecimento cutâneo.
Quando a pele é exposta à luz UV, a óxido nítrico sintase induzível (iNOS), a ciclooxigenase-2 (COX-2), o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e as interleucinas (ILs) são induzidos direta ou indiretamente. Em particular, o dano aos fibroblastos da pele causado pelas respostas inflamatórias acelera o fotoenvelhecimento. A hipersecreção de TNF-α aumentada pelo UV B estimula as células imunes a promover a produção de colagenase, o que leva à degradação da MEC e ao envelhecimento da pele, como rugas. A supressão da produção de colágeno e a indução da degradação do colágeno resultam em alterações negativas, como perda de elasticidade e rugas. Além disso, a exposição prolongada aos raios ultravioleta torna a inflamação crônica, o que causa diversas doenças de pele. Portanto, muitos estudos anteriores examinaram a melhora das rugas da pele, com foco na inibição da colagenase.
A citocina inflamatória TNF-α, secretada por queratinócitos e fibroblastos irradiados por UV, desempenha um papel importante na mediação do envelhecimento da pele, bem como em doenças inflamatórias. Com relação ao envelhecimento da pele, o TNF-α suprime a biossíntese de colágeno em fibroblastos da pele e regula a produção de colágeno por meio de várias vias de sinalização. Além disso, o TNF-α induz a produção de colagenase intersticial MMP (MMP-1) e a degradação das fibras de colágeno. Portanto, a regulação da atividade do TNF-α pode ser uma abordagem poderosa para o desenvolvimento de novos tratamentos para prevenir doenças inflamatórias da pele e o envelhecimento.
K. parviflora, também conhecida como ginseng tailandês ou gengibre preto, é uma planta medicinal pertencente à família Zingiberaceae. K. parviflora, conhecida como Krachaidum na Tailândia, é nativa do norte e nordeste da Tailândia. Seus rizomas são populares como uma erva comercial promotora da saúde, e tem sido usada na medicina tradicional para tratar várias doenças, incluindo úlceras, inflamação, gota, alergia, abscessos e osteoartrite. Vários estudos farmacológicos anteriores sobre o rizoma de K. parviflora revelaram seus valiosos efeitos terapêuticos, incluindo atividades antimicrobiana, anti-inflamatória, antialérgica, antioxidante, estimulante sexual, neuroprotetora, de relaxamento vascular, anticancerígena e cardioprotetora. Devido às propriedades farmacológicas de seus rizomas, K. parviflora foi minuciosamente investigada quanto aos seus fitoquímicos bioativos, e as metoxiflavonas foram identificadas como os principais constituintes bioativos em K. parviflora. Um composto representativo nos rizomas de K. parviflora, a 5,7,3′,4′-tetrametoxiflavona, exibe diversas propriedades farmacológicas. As vias de sinalização β-catenina e EP/cAMP/PKA foram significativamente inibidas pela 5,7,3′,4′-tetrametoxiflavona em condrócitos de rato cultivados, levando à proteção da cartilagem articular e dos condrócitos. Além disso, a 5,7,3′,4′-tetrametoxiflavona exerceu efeitos antiplasmódicos contra o Plasmodium falciparum, com valores de IC50 de 3,70 μg/mL. Nesse contexto, diversos compostos bioativos de K. parviflora têm sido atraentes para químicos de produtos naturais na descoberta de novos agentes bioativos.
Como parte de um estudo contínuo para descobrir produtos naturais bioativos a partir de recursos naturais, exploramos potenciais flavonoides bioativos de K. parviflora, uma planta medicinal tradicional, porque a atividade antioxidante de tais flavonoides pode suprimir danos oxidativos intracelulares e prevenir danos relacionados ao estresse oxidativo na MEC da pele. Neste estudo, separamos metoxiflavonas de um extrato metanólico de rizomas de K. parviflora usando cromatografia em coluna e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) sob a orientação de análise baseada em cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS). Examinamos ainda seus efeitos protetores contra danos de envelhecimento induzidos por TNF-α em fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDFs) e avaliamos o mecanismo de ação desses compostos. - Materiais e Métodos
2.1. Material Vegetal
Rizomas de K. parviflora foram coletados em janeiro de 2020 na cidade de Chiang Mai, norte da Tailândia. Este material foi autenticado por K. H. Kim. Uma amostra testemunha (SKKU-BG 1908) foi armazenada no herbário da Faculdade de Farmácia, Universidade Sungkyunkwan, Suwon, Coreia.
2.2. Extração de Rizomas de K. parviflora e Separação/Isolamento de Compostos
Rizomas secos de K. parviflora (132 g) foram triturados e extraídos com 80% MeOH/H₂O (2,0 L, 24 h × 2) à temperatura ambiente, e em seguida o resíduo dos rizomas de K. parviflora foi extraído com 80% MeOH/H₂O (3,0 L, 12 h) sob refluxo. Os extratos filtrados foram extraídos a 20 ± 5 °C, combinados sob refluxo e, em seguida, evaporados sob pressão reduzida para obter um extrato bruto de MeOH (9,2 g) utilizando um evaporador rotatório. O extrato resultante foi aplicado em suspensão com 700 mL de água destilada, e o extrato suspenso foi particionado por solvente empregando quatro solventes orgânicos (cada um com 700 mL), especificamente hexano, diclorometano (CH₂Cl₂), acetato de etila (EtOAc) e n-butanol (BuOH), três vezes. Como resultado, foram obtidas quatro frações: a fração solúvel em hexano (1,0 g), solúvel em CH₂Cl₂ (3,2 g), solúvel em EtOAc (0,4 g) e solúvel em n-BuOH (0,5 g). A análise por LC-MS de cada fração foi realizada em um equipamento de HPLC Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), equipado com um detector de arranjo de diodos (DAD) e um espectrômetro de massa ESI 6130 Series, utilizando uma coluna analítica Kinetex C18 100 Å (Phenomenex, Torrance, CA, EUA, 100 × 2,1 mm, 5 μm) a uma vazão de 0,3 mL/min. Com base na referência a um banco de dados de biblioteca UV desenvolvido internamente, a análise por LC-MS das quatro frações revelou a presença da maioria dos flavonoides na fração solúvel em hexano. A cromatografia em camada fina foi realizada para detectar as manchas dos compostos utilizando placas pré-revestidas de sílica gel F254 e placas RP-C18 F254s (Merck, Darmstadt, Alemanha). A fração solúvel em hexano (1,0 g) foi submetida a cromatografia em coluna de sílica gel (eluída com n-hexano/EtOAc [10:1→1:1], CH₂Cl₂/MeOH [10:1→1:1], sistema de solvente gradiente) para obter seis frações (H1–H6). A fração H2 (91,5 mg) foi separada por cromatografia em coluna Sephadex LH-20 (CH₂Cl₂/MeOH 2:8]) para obter cinco subfrações (H21–H25). A subfração H22 (29,2 mg) foi isolada utilizando HPLC de fase reversa semipreparativa com 78% MeOH/H₂O (vazão de 2 mL/min) para obter os compostos 1 (1,5 mg) e 2 (2,4 mg). A fração H5 (112,7 mg) foi submetida a cromatografia em coluna Sephadex LH-20 [CH₂Cl₂/MeOH (2:8)] para obter duas subfrações (H51 e H52). A subfração H52 (28,2 mg) foi separada utilizando HPLC de fase reversa semipreparativa com 83% MeOH/H₂O (vazão de 2 mL/min) para isolar os compostos 3 (2,2 mg), 4 (2,5 mg) e 5 (0,5 mg). Finalmente, a fração H6 (271,8 mg) foi fracionada por cromatografia em coluna Sephadex LH-20 (CH₂Cl₂/MeOH [2:8]) para obter quatro subfrações (H61–H64). A subfração H64 (46,3 mg) foi isolada utilizando HPLC de fase reversa semipreparativa com 78% MeOH/H₂O (vazão de 2 mL/min) para obter o composto 6 (3,0 mg).
2.3. Cultura de Células e Preparações de Amostras
Compramos NHDFs da PromoCell GmbH (Heidelberg, Alemanha). As células foram mantidas em meio Eagle modificado por Dulbecco (Corning, Manassas, VA, EUA). O meio consistiu em 10% de soro fetal bovino (Atlas, Fort Collins, CO, EUA) e 100 U/mL de solução de penicilina-estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EUA). As células foram cultivadas em atmosfera úmida contendo 5% de CO2 a 37 °C. Os seis compostos isolados para tratamento celular foram preparados dissolvendo-os em dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), e a concentração final foi mantida abaixo de 0,1%. TNF-α (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA) foi preparado dissolvendo-se em 1% de albumina sérica bovina.
2.4. Viabilidade Celular
Semeamos NHDFs a 1 × 10⁴ células/poço em placas de 96 poços e as incubamos por 24 h. Para criar condições de privação, o meio foi então trocado para meio livre de soro. A privação de soro leva todas as células a uma fase de parada do crescimento, fazendo com que todas as células tenham o mesmo ciclo celular. Após 24 h, as NHDFs foram expostas a cada concentração do composto. Após 24 h, para medir a viabilidade celular, a solução EZ-Cytox (Dogen, Seul, Coreia) foi adicionada a cada poço contendo células, e a absorbância foi então determinada após incubação por 2 h. A medição foi realizada utilizando um dispositivo SPARK 10M (Tecan Group Ltd., Männedorf, Suíça), e o comprimento de onda foi ajustado para 450/600 nm. A viabilidade celular para cada amostra foi apresentada como percentual do controle veículo.
2.5. Avaliação de ROS Intracelular
Semeamos NHDFs a 1 × 10⁴ células/poço em placas pretas de 96 poços, incubamos por 24 h e, em seguida, substituímos o meio por meio livre de soro para criar condições de privação. Após 24 h, as células foram tratadas com 3,5,7-trimetoxiflavona por 24 h. As células foram então expostas a 20 ng/mL de TNF-α (PeproTech, Rocky Hill, NJ, EUA) por 15 min. Após 15 min de incubação, a coloração foi realizada com diacetato de diclorofluoresceína (DCFDA; Sigma-Aldrich) e lavada com solução salina tamponada com fosfato (Welgene, Gyeongsangbuk, Coreia). A imagem de fluorescência foi realizada usando um microscópio de fluorescência IX51 (Olympus, Tóquio, Japão). A fluorescência foi medida usando um SPARK 10M, e o comprimento de onda foi ajustado para 485/535 nm. Os resultados de ROS intracelular foram apresentados como percentual do controle veículo.
2.6. PCR de Transcrição Reversa Quantitativa em Tempo Real
Semeamos NHDFs a 3 × 10⁵ células/poço em placas de 6 poços, incubamos por 24 h e, em seguida, substituímos o meio por meio sem soro para criar condições de jejum. Após 24 h, as células foram tratadas com 3,5,7-trimetoxiflavona por 24 h. As células foram então expostas a 20 ng/mL de TNF-α por 15 min. Para medir a expressão de IL-1β, IL-6, IL-8 e β-actina, as células foram coletadas após 4 h. Para testar MMP-1 e procolágeno I α1 (COLIA1), as células foram coletadas após 24 h. Em seguida, as células foram coletadas e o RNA celular foi isolado usando o RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemanha). A síntese de DNA complementar foi realizada usando o kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). A PCR em tempo real foi realizada usando PowerUp SYBR PCR Master Mix (Applied Biosystems, Waltham, MA, EUA). A reação foi realizada usando o sistema QuantStudio™ 3 de PCR em tempo real (Applied Biosystems), e as condições térmicas foram ajustadas para 40 ciclos (95 °C por 15 s, 60 °C por 30 s, 95 °C por 30 s). As sequências dos iniciadores são mostradas em um artigo anterior, e a β-actina foi usada como gene de referência.
2.7. Ensaio de Imunoadsorção Enzimática (ELISA)
Semeamos NHDFs a 2 × 10⁴ células/poço em placas de 48 poços, incubamos por 24 h e, em seguida, substituímos o meio por meio sem soro para criar condições de jejum. Após 24 h, as NHDFs foram tratadas com 3,5,7-trimetoxiflavona por 1 h, seguidas de exposição a 20 ng/mL de TNF-α. Para medir a expressão proteica de IL-1β, IL-6 e IL-8, o meio foi coletado das células após 12 h. Para medir a expressão proteica de MMP-1 e procolágeno I α1 (COLIA1), o meio foi coletado das células após 24 h. A secreção de proteínas foi determinada usando o kit ELISA DuoSet Total MMP-1 humano e o kit ELISA DuoSet Pro-Colágeno I alfa 1 humano (R&D systems, Minneapolis, MN, EUA). A absorbância foi medida usando um espectrofotômetro SPARK 10M, e o comprimento de onda foi ajustado para 550/600 nm. Os resultados da secreção de proteínas foram apresentados como porcentagem do controle veicular.
2.8. Western Blotting
Plaqueamos NHDFs a 3 × 10^5 células/poço em placas de 6 poços, incubamos por 24 h e, em seguida, substituímos o meio por um meio sem soro para criar condições de privação. Após 24 h, as células foram tratadas com 3,5,7-trimetoxiflavona por 24 h. As células foram então expostas a 20 ng/mL de TNF-α. Para testar fosfo-ERK, ERK, fosfo-p38, p38, fosfo-JNK, JNK e GAPDH, as células foram coletadas após 15 min. Para testar fosfo-Akt, Akt, COX-2, heme oxigenase 1 (HO-1) e GAPDH, as células foram coletadas após 6 h. As células foram lisadas com tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) 1× (Tech & Innovation, Gangwon, Coreia). O lisado foi centrifugado e o sobrenadante foi preparado como amostras de proteína eluídas. A concentração de proteínas foi determinada usando um kit de ensaio de proteínas BCA (Merck). Níveis iguais de proteínas foram analisados por Western blotting. Os anticorpos primários, fosfo-ERK, ERK, fosfo-p38, p38, fosfo-JNK, JNK, fosfo-Akt, Akt, COX-2, HO-1, COX-2 e GAPDH (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) foram reagidos por 4 h a 20 ± 5 °C. Os anticorpos secundários, IgG-HRP anti-coelho de cabra e IgG-HRP anti-camundongo de cabra (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA), foram incubados por 1 h à temperatura ambiente. As bandas de proteínas foram visualizadas usando o substrato quimioluminescente de máxima sensibilidade SuperSignal® West Femto (Thermo Fisher Scientific) e o sistema de quimioluminescência Fusion Solo (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemanha). As densidades das bandas foram calculadas com base na razão em relação à banda de GAPDH. Os resultados foram calculados a partir da densidade da banda e apresentados como percentual do controle veículo.
2.9. Análise Estatística
Os dados experimentais são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). As diferenças de cada grupo foram avaliadas usando análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste HSD de Tukey (diferença honestamente significativa). Um valor de p de 0,05 ou menos foi considerado estatisticamente significativo.
3. Resultados
3.1. Isolamento e Identificação Estrutural dos Compostos
O extrato metanólico dos rizomas de K. parviflora foi submetido sequencialmente a partição com solventes, empregando quatro solventes orgânicos, especificamente hexano, CH2Cl2, AcOEt e n-BuOH, para obter quatro frações. Como resultado da análise por LC-MS de cada fração, foi confirmado que a fração hexânica apresentava o maior teor de flavonoides com potencial antioxidante. Seis metoxiflavonas (1–6; Figura 1) foram isoladas da fração hexânica usando cromatografia em coluna repetida e separação por HPLC semipreparativa. Essas metoxiflavonas isoladas foram caracterizadas estruturalmente como 5-hidroxi-7-metoxiflavona (1), 3,7-dimetoxi-5-hidroxiflavona (2), 5-hidroxi-3,7,3′,4′-tetrametoxiflavona (3), 7,4′-dimetilapigenina (4), 3,7,4′-trimetilcaempferol (5) e 3,5,7-trimetoxiflavona (6) por comparação de seus dados de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (Figuras S1–S6) com aqueles previamente relatados, bem como dados de EM obtidos a partir de análises por LC-MS.
3.2. Efeito dos Flavonoides 1–6 Isolados de K. parviflora na Viabilidade de NHDFs
Antes de investigar os efeitos antienvelhecimento dos flavonoides 1–6 isolados de K. parviflora, seus efeitos na viabilidade celular de NHDFs foram medidos. Conforme mostrado na Figura 2, os flavonoides 1–6 não exibiram citotoxicidade considerável contra NHDFs a 100 µM. Portanto, todos os flavonoides foram utilizados em experimentos subsequentes em concentrações de até 100 µM.
3.3. Efeito dos Flavonoides Isolados de K. parviflora na Secreção de MMP-1 em NHDFs Estimuladas por TNF-α
Em seguida, investigamos os efeitos inibitórios dos seis flavonoides (1–6) medindo a secreção de MMP-1 por NHDFs estimuladas por TNF-α. Conforme mostrado na Figura 3, o TNF-α (20 ng/mL) aumentou significativamente a secreção de MMP-1 em 3,37 ± 0,08 vezes (p < 0,01) em comparação com o controle veicular. Entre os seis flavonoides de K. parviflora, a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) reduziu potentemente a secreção de MMP-1 induzida por TNF-α. O tratamento com 50 e 100 µM de 6 suprimiu a secreção de MMP-1 para 1,99 ± 0,05 vezes (p < 0,01) e 1,76 ± 0,06 vezes (p < 0,01), respectivamente, em comparação com o controle. Portanto, focamos na 3,5,7-trimetoxiflavona em estudos posteriores para elucidar o mecanismo pelo qual ela demonstra efeitos protetores contra danos em NHDFs causados por TNF-α.
3.4. Efeito da 3,5,7-Trimetoxiflavona no Acúmulo de ROS Intracelular em NHDFs Estimuladas por TNF-α
O TNF-α é um estimulador que pode causar estresse oxidativo em NHDFs. Portanto, avaliamos o efeito da 3,5,7-trimetoxiflavona no acúmulo de ROS em NHDFs estimuladas por TNF-α. Conforme mostrado na Figura 4, a exposição a 20 ng/mL de TNF-α demonstrou um aumento drástico no acúmulo de ROS em 2,54 ± 0,06 vezes (p < 0,05) em comparação com o controle veicular. Em contraste, a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) reduziu significativamente o acúmulo de ROS. O tratamento com 50 e 100 µM de 6 suprimiu a produção de ROS para 1,88 ± 0,14 vezes (p < 0,05) e 1,33 ± 0,09 vezes (p < 0,01), respectivamente, em comparação com o controle.
3.5. Efeito da 3,5,7-Trimetoxiflavona na Fosforilação de MAPKs Induzida por TNF-α em NHDFs
Para melhorar a compreensão do mecanismo da ação citoprotetora da 3,5,7-trimetoxiflavona (6), avaliamos seu efeito na fosforilação de MAPK em NHDFs estimuladas por TNF-α. A expressão da proteína MAPK foi analisada utilizando Western blotting. Conforme mostrado na Figura 5, a exposição a 20 ng/mL de TNF-α mostrou ativação de ERK, JNK e p38 em NHDFs, a qual foi reduzida após o tratamento com 6. A fosforilação de ERK pela estimulação com TNF-α aumentou 2,72 ± 0,35 vezes, enquanto o tratamento com 6 suprimiu a fosforilação de ERK para 1,30 ± 0,42 vezes (50 µM) e 0,77 ± 0,30 vezes (100 µM, p < 0,05) em comparação com o controle. A fosforilação de JNK pela estimulação com TNF-α aumentou 8,15 ± 0,45 vezes, enquanto o tratamento com 6 a suprimiu para 4,88 ± 0,24 vezes (50 µM, p < 0,05) e 4,86 ± 0,13 vezes (100 µM, p < 0,05) do controle. Além disso, a estimulação com TNF-α aumentou a fosforilação de p38 em 6,43 ± 0,17 vezes, enquanto o tratamento com 6 a suprimiu para 5,58 ± 0,42 vezes (50 µM) e 5,20 ± 0,31 vezes (100 µM) em comparação com o controle; no entanto, essa diferença não foi significativa. Esses resultados indicam que a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) pode suprimir a fosforilação de MAPK induzida pela estimulação com TNF-α.
3.6. Efeito da 3,5,7-Trimetoxiflavona na Fosforilação de Akt e na Expressão de COX-2 e HO-1 em NHDFs Estimuladas por TNF-α
A produção excessiva de ROS ativa a Akt, o que causa inflamação ao regular positivamente a COX-2. Para determinar o efeito protetor da 3,5,7-trimetoxiflavona (6) contra a resposta inflamatória, avaliamos seu efeito na fosforilação de Akt e na expressão de COX-2 em NHDFs estimuladas por TNF-α. Western blotting foi utilizado para medir os níveis de expressão proteica de p-Akt, Akt e COX-2. Conforme mostrado na Figura 6, a exposição a 20 ng/mL de TNF-α induziu a fosforilação de Akt em NHDFs em comparação com o controle veicular, a qual foi reduzida após o tratamento com 6. A estimulação com TNF-α aumentou a fosforilação de Akt em 2,61 ± 0,38 vezes, enquanto o tratamento com 6 a suprimiu para 1,13 ± 0,28 vezes (50 µM) e 0,90 ± 0,12 vezes (100 µM, p < 0,05) em comparação com o controle. Além disso, a estimulação com TNF-α aumentou a expressão de COX-2 em 5,85 ± 0,11 vezes, enquanto o tratamento com 6 a suprimiu para 4,78 ± 0,61 vezes (50 µM) e 2,36 ± 1,00 vezes (100 µM) em comparação com o controle; no entanto, essa diferença não foi significativa. Esses resultados indicaram que a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) suprimiu a ativação da inflamação pela estimulação com TNF-α. Portanto, a 3,5,7-trimetoxiflavona tem um efeito atenuante na inflamação induzida pelo acúmulo de ROS.
Um aumento na HO-1 através da ativação transcricional do Nrf2 suprime a produção de radicais livres, prevenindo assim danos inflamatórios e apoptose em células da pele humana. Na Figura 6, a exposição a 20 ng/mL de TNF-α não mostrou alteração na expressão de HO-1 em NHDFs em comparação com o controle veicular; no entanto, isso foi aumentado pelo tratamento com 6. A expressão de HO-1 aumentou 1,68 ± 0,29 vezes (50 µM) e 3,03 ± 0,36 vezes (100 µM, p < 0,05) em relação ao controle após o tratamento com 6. Esses resultados sugerem que a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) inibe o acúmulo de ROS induzido pela estimulação com TNF-α através da captura de radicais livres pela HO-1.
3.7. Efeito da 3,5,7-Trimetoxiflavona na Expressão de mRNA e Proteína de MMP-1 e Pro-Colágeno I α1 em NHDFs Estimuladas por TNF-α
A radiação UV induz o acúmulo de ROS, que altera a estrutura e função de genes e proteínas, causando, em última análise, danos à pele. Ela aumenta a expressão e secreção da colagenase MMP-1 e induz a degradação do colágeno. Eventualmente, a MEC da pele se desintegra, levando a danos cutâneos como rugas. Portanto, substâncias que inibem a atividade da colagenase são consideradas candidatos terapêuticos potenciais para danos à pele. Na Figura 7A, a exposição a 20 ng/mL de TNF-α mostrou aumento da expressão de MMP-1 em NHDFs em comparação com o controle veicular; isso foi reduzido pelo tratamento com 3,5,7-trimetoxiflavona (6). A estimulação com TNF-α também aumentou a expressão de mRNA de MMP-1 em 3,76 ± 0,03 vezes, enquanto o tratamento com 6 a suprimiu em 2,53 ± 0,13 vezes (50 µM) e 1,70 ± 0,23 vezes (100 µM, p < 0,05) em comparação com o controle. Como mostrado na Figura 3, a secreção de MMP-1 foi induzida pela estimulação com TNF-α, enquanto o tratamento com 6 a suprimiu. Esses resultados indicam que a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) inibe a expressão de MMP-1 induzida pela estimulação com TNF-α.
O pró-colágeno é secretado para fora da célula, uma parte do peptídeo N-terminal é clivada por enzimas, e o pró-colágeno clivado é combinado com a ajuda de oxigênio, íons de ferro e ácido ascórbico para formar colágeno na forma de fibras. Portanto, a expressão do pró-colágeno COLIA1 foi examinada para avaliar indiretamente a síntese de colágeno. Na Figura 7A, a exposição a 20 ng/mL de TNF-α mostrou uma diminuição na expressão de COLIA1 em NHDFs em comparação com o controle veicular. A estimulação com TNF-α reduziu a expressão do mRNA de COL1A1 para 0,38 ± 0,06 vezes, mas isso permaneceu inalterado após o tratamento com 3,5,7-trimetoxiflavona (6) a 50 e 100 µM. Na Figura 7B, a secreção de COLIA1 induzida pela estimulação com TNF-α diminuiu para 12,59 ± 1,24 ng/mL, em comparação com o controle veicular (21,13 ± 1,86 ng/mL). O tratamento com 100 µM de 6 aumentou COLIA1 para 15,65 ± 0,46 ng/mL; no entanto, essa diferença não foi significativa. Apesar da falta de significância, esse resultado indicou que a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) pode reverter a diminuição de COLIA1. Em resumo, esses resultados sugerem que a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) tem o potencial de suprimir a degradação avançada da MEC cutânea induzida pelo estresse oxidativo.
3.8. Efeito da 3,5,7-Trimetoxiflavona nas Citocinas Pró-inflamatórias em NHDFs Estimuladas por TNF-α
Quando ocorre estresse oxidativo, a resposta é a hipersecreção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8. Consequentemente, a resposta inflamatória é regulada positivamente, levando ao envelhecimento da pele e a várias lesões. Para avaliar o efeito da 3,5,7-trimetoxiflavona (6) nas respostas relacionadas à inflamação em células da pele, os níveis de IL-1β, IL-6 e IL-8 foram avaliados em NHDFs estimuladas por TNF-α.
Na Figura 8A, a exposição a 20 ng/mL de TNF-α mostrou um aumento de IL-1β, IL-6 e IL-8 nas NHDFs em comparação com o controle veicular, o qual foi reduzido pelo tratamento com 3,5,7-trimetoxiflavona (6). A expressão do mRNA de IL-1β aumentou 10,45 ± 0,29 vezes após a estimulação com TNF-α (p < 0,01); no entanto, o tratamento com 6 suprimiu-a em 4,16 ± 1,24 vezes (50 µM, p < 0,01) e 3,08 ± 0,53 vezes (100 µM, p < 0,01) do controle. A expressão do mRNA de IL-6 aumentou 5,68 ± 0,53 vezes (p < 0,05) após a estimulação com TNF-α; no entanto, o tratamento com 6 suprimiu-a em 2,60 ± 0,10 vezes (50 µM, p < 0,05) e 2,01 ± 0,20 vezes (100 µM, p < 0,05) do controle. A expressão do mRNA de IL-8 aumentou 6,24 ± 0,30 vezes (p < 0,05) após a estimulação com TNF-α; no entanto, o tratamento com 6 suprimiu-a em 3,83 ± 0,92 vezes (50 µM) e 2,38 ± 0,38 vezes (100 µM, p < 0,01) do controle. Conforme mostrado na Figura 8B, a secreção de IL-1β aumentou para 20,30 ± 0,27 pg/mL (p < 0,01) após a estimulação com TNF-α em comparação com o controle veicular (4,77 ± 0,04 pg/mL), e o tratamento com 6 suprimiu-a para 17,25 ± 2,61 ng/mL (50 µM) e 7,34 ± 0,84 pg/mL (100 µM, p < 0,05). A secreção de IL-6 aumentou para 78,51 ± 6,32 ng/mL (p < 0,05) após a estimulação com TNF-α em comparação com o controle veicular (22,51 ± 0,63 ng/mL), e o tratamento com 6 suprimiu-a para 43,98 ± 5,47 ng/mL (50 µM, p < 0,05) e 53,29 ± 5,37 ng/mL (100 µM, p < 0,05). A secreção de IL-8 aumentou para 53,77 ± 5,37 ng/mL (p < 0,05) após a estimulação com TNF-α em comparação com o controle veicular (15,87 ± 0,53 ng/mL), e o tratamento com 6 suprimiu-a para 35,14 ± 3,37 ng/mL (50 µM) e 21,66 ± 5,89 ng/mL (100 µM, p < 0,05).
Esses resultados indicam que a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) suprime as citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e IL-8 induzidas pela estimulação com TNF-α. Portanto, a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) tem potencial para suprimir respostas inflamatórias na pele causadas por citocinas pró-inflamatórias.
4. Discussão
A pele é o maior órgão do corpo. Ela atua como uma barreira contra poluentes químicos e físicos e protege os órgãos internos. As proteínas da matriz extracelular são geradas pelos fibroblastos presentes na derme e são responsáveis pela elasticidade e resistência da pele. A degradação da MEC da derme resulta no envelhecimento da pele. Existem muitos tipos de colágenos na MEC dérmica (III, V, VII); no entanto, o colágeno tipo I é a proteína estrutural mais importante. A principal causa da pele envelhecida, que parece fina, lisa, seca e inelástica, é uma diminuição nas fibras de colágeno e na produção de colágeno tipo I. No processo de envelhecimento da pele, a colagenase MMP-1 destrói as fibrilas de colágeno. Foi demonstrado que, com o envelhecimento, os níveis de MMP-1 aumentam e a expressão de colágeno na pele humana diminui. Além disso, a degradação excessiva da MEC da derme pela MMP-1 contribui para a inflamação do tecido conjuntivo. Portanto, o equilíbrio entre a expressão de MMP-1 e colágeno tipo I desempenha um papel importante no envelhecimento da pele.
A pele pode envelhecer internamente por um processo de envelhecimento temporal que afeta todos os órgãos do corpo ou externamente devido a fatores ambientais, como exposição ao sol e tabagismo. O envelhecimento cutâneo externo e interno produz citocinas inflamatórias, que estão intimamente relacionadas à inflamação da pele causada por eles. No processo de envelhecimento intrínseco e extrínseco, várias células da pele produzem a citocina inflamatória TNF-α, que funciona como um importante regulador do metabolismo e da atividade celular. A irradiação UV estimula receptores de superfície celular, que são os principais contribuintes para o envelhecimento da pele. Dos ligantes para esses receptores, o TNF-α induz aumento da expressão de MMP e diminuição da expressão de colágeno, levando à ruptura da MEC. Além disso, o TNF-α é considerado um importante modulador de sintomas e doenças dermatológicas inflamatórias. O TNF-α aumenta citocinas pró-inflamatórias como IL-1 e IL-6, que ativam o NF-κB. Portanto, a regulação da atividade do TNF-α pode ser um método estratégico atraente para a busca de substâncias candidatas para prevenir danos e envelhecimento da pele.
Na presente pesquisa, estudamos os efeitos de metoxiflavonas isoladas do gengibre preto (K. parviflora), incluindo 5-hidroxi-7-metoxiflavona (1), 3,7-dimetoxi-5-hidroxiflavona (2), 5-hidroxi-3,7,3,4-tetrametoxiflavona (3), 7,4-dimetilapigenina (4), 3,7,4-trimetilcaempferol (5) e 3,5,7-trimetoxiflavona (6) sobre danos induzidos por TNF-α em fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) com a medição da expressão de MMP-1 e COLIA1. Entre as metoxiflavonas, a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) teve a capacidade intensa de proteger fibroblastos que foram danificados pelo TNF-α, o que inibiu a secreção de MMP-1. Com base nas atividades observadas, a relação estrutura-atividade (SAR) pode ser investigada através de quatro grupos dos compostos isolados, incluindo (1) compostos 1 e 4, (2) compostos 2 e 6, (3) compostos 3 e 5 e (4) compostos 4 e 5. A análise de SAR sugeriu que os grupos 3-OCH3 e metoxila no anel B não estão associados aos efeitos protetores com base nas atividades de 1/4, 3/5 e 4/5. Em contraste, a porção 5-OCH3 desempenhou um papel crítico na atividade, considerando que o composto 6 com 5-OCH3 mostrou atividade potente, enquanto o composto 2 com 5-OH foi inativo.
COX-2, IL-1 e IL-6 são mediadores pró-inflamatórios que desempenham um papel importante na causa do envelhecimento da pele e dos sintomas inflamatórios cutâneos. No envelhecimento da pele, a COX-2 atua como mediadora da biossíntese da prostaglandina E2, que contribui para a produção de MMPs. IL-1 e IL-6 são reguladores que contribuem para a formação de rugas na pele, incluindo a inibição da biossíntese de colágeno. A luteolina, um flavonoide isolado e relatado a partir de diversos produtos naturais, suprime as ROS e os mediadores pró-inflamatórios e promove o fotoenvelhecimento da epiderme e derme para reduzir IL-6, IL-22, IL-17 e COX-2. Da mesma forma, a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) inibe significativamente a expressão de IL-1β, IL-6 e COX-2 induzida por TNF-α e espera-se que tenha um efeito protetor contra danos na pele com base na inibição de reações relacionadas à inflamação.
O estresse oxidativo também é um fator importante relacionado ao envelhecimento da pele. As espécies reativas de oxigênio geradas pelo envelhecimento intrínseco (crônico) e pelo envelhecimento total permeável (óptico) estimulam a expressão de MMP, suprimem a sinalização do fator de crescimento beta, suprimem a degradação do colágeno e desencadeiam a biossíntese de fibras colágenas. Portanto, o desenvolvimento de antioxidantes para a pele com produtos naturais é uma das principais estratégias de desenvolvimento de produtos para cuidados com a pele na indústria cosmética. De acordo com um estudo recente de Li et al., o óleo de cravo de laranja de baixa temperatura tem um alto teor de polimetoxiflavonas e foi eficaz na prevenção de danos oxidativos induzidos por UVB na pele de camundongos. Da mesma forma, neste estudo, a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) teve o efeito de suprimir as espécies reativas de oxigênio produzidas pela estimulação com TNF-α em NHDFs. A posição e o número de grupos metoxi na estrutura da polimetoxiflavona relacionados às propriedades antioxidantes sugerem uma relevância para esses efeitos farmacológicos.
A MAPK desempenha um papel central no controle de danos à pele em combinação com duas vias a jusante associadas ao estresse oxidativo e respostas inflamatórias, AP-1 e NF-κB. Além disso, a ativação da MAPK induz a fosforilação e rearranjo do NF-κB, produzindo MMP-1 e citocinas inflamatórias. Portanto, o movimento retrógrado dessa via desempenha um papel importante no retardamento do envelhecimento da pele. Relatos anteriores mostraram que o tratamento com inibidores de MAPK reverteu o processo de fotoenvelhecimento. NHDFs tratadas com 3,5,7-trimetoxiflavona (6) apresentaram fosforilação diminuída de MAPK. Isso resultou na inibição da produção de MMP-1 e na degradação do colágeno. Neste estudo, a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) também foi demonstrada como um potencial inibidor de MAPK, Akt e COX-2. NHDFs tratadas com 3,5,7-trimetoxiflavona (6) apresentaram fosforilação reduzida de MAPK, fosforilação reduzida de Akt e COX-2 reduzida.
Em resumo, entre as metoxiflavonas isoladas do gengibre preto (K. parviflora), a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) possui efeito preventivo potente na lesão induzida por TNF-α em HDFs, suprimindo a expressão de MMP-1 e recuperando a expressão de COLIA1. Em HDF estimuladas por TNF-α, o mecanismo de proteção cutânea da 3,5,7-trimetoxiflavona (6) envolve a redução de espécies reativas de oxigênio e de mediadores anti-inflamatórios, incluindo a produção de COX-2, IL-1, IL-6 e IL-8, por meio da inibição do estresse oxidativo e da resposta inflamatória. Além disso, a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) alivia a fosforilação de MAPK e Akt, o que inibe a produção de MMP-1 e a degradação das fibras de colágeno.
No entanto, este estudo teve algumas limitações. Por exemplo, o potencial da 3,5,7-trimetoxiflavona (6) para prevenir o envelhecimento cutâneo foi estudado apenas em HDFs. Para compreender completamente o efeito antienvelhecimento da 3,5,7-trimetoxiflavona (6), a pesquisa precisa ser estendida a muitas linhagens celulares diferentes, como melanócitos, queratinócitos e modelos de pele 3D orgânicos.
Nosso estudo anterior mostrou que a 5,7,4′-trimetoxiflavona é eficaz em baixas concentrações de 6,25 e 12,5 μM. Como a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) (composto 6) é eficaz em 50 ou mais, a questão sobre sua baixa atividade pode ser levantada. No entanto, os melhoradores da pele penetram diretamente na pele para mostrar seus efeitos. Portanto, o composto ativo deve penetrar na barreira cutânea sem causar irritação na pele. Estudos recentes relataram que a formulação de microemulsão de quercetina aumenta a penetração cutânea. Assim, acredita-se que estudos adicionais, como liberação tópica e transdérmica, são necessários para determinar se uma abordagem fisiológica é possível.
5. Conclusões
Os resultados deste estudo indicam que a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) isolada de K. parviflora tem efeitos inibitórios sobre a MMP-1 induzida por TNF-α em NHDFs. Verificou-se que a 3,5,7-trimetoxiflavona inibiu a ROS induzida por TNF-α, que desempenha um papel fundamental na resposta inflamatória e na degradação da MEC que ocorre durante danos cutâneos, como envelhecimento da pele e várias lesões cutâneas. As alterações pelas quais a 3,5,7-trimetoxiflavona (6) reduz as respostas estimuladas por TNF-α em NHDFs estão correlacionadas com a supressão da ativação de Akt, COX-2, MAPK e a indução de HO-1. Além disso, a 3,5,7-trimetoxiflavona reduziu a expressão de mediadores de citocinas pró-inflamatórias induzidos pela estimulação com TNF-α, incluindo IL-1β, IL-6 e IL-8. Essas descobertas fornecem evidências de que as 3,5,7-trimetoxiflavonas podem proteger contra danos cutâneos causados pelo acúmulo de estresse oxidativo. Experimentos adicionais são necessários para compreender completamente o mecanismo de atividade da 3,5,7-trimetoxiflavona; no entanto, é uma substância potencial para prevenir danos cutâneos, incluindo envelhecimento da pele e várias lesões cutâneas.
Nota do Editor: A MDPI permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Materiais Suplementares
Os seguintes estão disponíveis online em , Figura S1: Espectro de 1H-RMN do composto 1 (em CDCl3), Figura S2: Espectro de 1H-RMN do composto 2 (em CDCl3), Figura S3: Espectro de 1H-RMN do composto 3 (em CDCl3), Figura S4: Espectro de 1H-RMN do composto 4 (em CDCl3), Figura S5: Espectro de 1H-RMN do composto 5 (em CDCl3), Figura S6: Espectro de 1H-RMN do composto 6 (em CDCl3).
Contribuições dos Autores
Conceituação, K.H.K. e K.S.K.; validação, S.L. e T.J.; análise formal, S.L.; preparação do rascunho original, S.L. e T.J.; escrita—revisão e edição, S.L.; administração do projeto, K.H.K. e K.S.K. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento
Esta pesquisa foi apoiada pelo Ministério do Comércio, Indústria e Energia (MOTIE), Instituto Coreano para o Avanço da Tecnologia (KIAT), por meio do Programa para Construção de Infraestrutura de Especialização Inteligente (p0014630) e pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), Ministério da Educação, por meio do Programa de Pesquisa Básica em Ciências (2019R1C1C100791413). Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiados pelo governo coreano (MSIT) (números de subsídio 2019R1A5A2027340 e 2021R1A2C2007937). Este estudo também foi financiado pela Universidade de Gachon com o número de subsídio GC-202103600001.
Declaração do Comitê de Ética em Pesquisa
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados estão contidos no artigo e nos materiais suplementares.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Envelhecimento intrínseco da pele: O papel do estresse oxidativo
Envelhecimento da pele
Fatores intrínsecos e extrínsecos no envelhecimento da pele: Uma revisão
Envelhecimento da pele e seu tratamento
Radiação ultravioleta e envelhecimento da pele: Papéis das espécies reativas de oxigênio, inflamação e ativação de proteases, e estratégias para prevenção da degradação da matriz induzida por inflamação—Uma revisão
Fotoproteção da pele por polifenóis naturais: Mecanismos anti-inflamatórios, antioxidantes e de reparo do DNA
Envelhecimento da pele
Fotoenvelhecimento: Mecanismo, prevenção e terapia
Um papel do complexo II mitocondrial humano na produção de espécies reativas de oxigênio na pele humana
Espécies reativas de oxigênio na saúde e na doença
O papel das espécies reativas de oxigênio e do estresse oxidativo no patomecanismo das doenças oculares relacionadas à idade e outras patologias dos segmentos anterior e posterior do olho em adultos
Espécies reativas de oxigênio (ERO) mitocondriais e liberação de ERO induzida por ERO
Degradação acelerada pelo fator de necrose tumoral-α do colágeno tipo I na pele humana está associada a níveis elevados de metaloproteinase de matriz (MMP)-1 e MMP-3 ex vivo
Eventos de oxidação e envelhecimento da pele
Alteração induzida pela luz ultravioleta na pele
Expressão de cox-2 induzida por ultravioleta B (UVB) na pele murina: Um estudo imuno-histoquímico
Lesão induzida pela luz ultravioleta: Efeitos imunológicos e inflamatórios
Protegendo o fotoenvelhecimento da pele pelo inibidor de NF-κB
Efeitos antioxidantes e fotoprotetores de cumarinas isoladas de Fraxinus chinensis
Inibição da síntese de procolágeno tipo I por colágeno danificado em pele fotoenvelhecida e por colágeno degradado por colagenase in vitro
Inibição da colagenase por flavonoides de ocorrência natural
O galato de epigalocatequina (−) prejudica a destruição do colágeno e a ativação da colagenase em fibroblastos dérmicos humanos irradiados com ultravioleta-B: Envolvimento da proteína quinase ativada por mitógeno
O papel das citocinas no envelhecimento da pele
Fator de necrose tumoral alfa e a rede de citocinas na psoríase
O extrato de gengibre preto aumenta o desempenho físico e a resistência muscular ao melhorar a inflamação e o metabolismo energético
Efeitos clínicos de Krachaidum (Kaempferia parviflora): Uma revisão sistemática
Kaempferia parviflora e suas metoxiflavonas: Química e atividades biológicas
Supressão da hipertrofia de adipócitos por polimetoxiflavonoides isolados de Kaempferia parviflora
Glicosídeos fenólicos de Kaempferia parviflora
5, 7, 3′, 4′-Tetrametoxiflavona exibe atividade condroprotetora ao direcionar a sinalização de β-catenina in vivo e in vitro
Flavonoides bioativos de Kaempferia parviflora
Fenóis antifúngicos de Woodfordia uniflora coletados em Omã
Cogumelos: Uma fonte importante de compostos bioativos naturais
Sesquiterpenos tricoteceno e tremulano de um cogumelo alucinógeno Gymnopilus junonius e sua citotoxicidade
Esteroide pregnano anti-adipogênico de um fungo associado a Hydractinia, Cladosporium sphaerospermum SW67
Os efeitos antienvelhecimento do equol protegem contra agressões ambientais ao aumentar a defesa antioxidante da pele e as proteínas da MEC, enquanto diminuem o estresse oxidativo e a inflamação
Antioxidantes de plantas protegem contra o fotoenvelhecimento da pele
A privação de soro induz sincronização do ciclo celular que facilita a reprogramação de células somáticas humanas
Eficácia da alpinumisoflavona isolada do fruto de maclura tricuspidata no dano induzido pelo fator de necrose tumoral-α em fibroblastos dérmicos humanos
Síntese e atividade inibitória da PGE 2 de 5, 7-dihidroxiflavonas e seus análogos de flavona o-metilados
Flavonoides citotóxicos das folhas de Cryptocarya chinensis
RMN de uma série de novas hidroxiflavotionas
Flavonoides e compostos aromáticos dos rizomas de Zingiber zerumbet
Inibição de proteases virais por extratos de Zingiberaceae e flavonas isoladas de Kaempferia parviflora
Luteolina como moduladora do envelhecimento da pele e da inflamação
Fisetina inibe a ação inflamatória induzida por TNF-α e o dano oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio em células de queratinócitos humanos HaCaT através da expressão de heme oxigenase-1 mediada por PI3K/AKT/Nrf-2
Papel essencial do Nrf2 na proteção de queratinócitos contra UVA pela quercetina
O papel da elastina e do colágeno no envelhecimento cutâneo: Envelhecimento intrínseco versus fotoexposição
Irradiação ultravioleta-B e metaloproteinases da matriz: Da indução via sinalização aos eventos iniciais
Possível envolvimento de gelatinases no dano à membrana basal e na formação de rugas em camundongos sem pelos cronicamente expostos à radiação ultravioleta B
A biossíntese de colágeno
Estresse oxidativo e envelhecimento do tecido conjuntivo da pele humana
Conexão cérebro-pele: Estresse, inflamação e envelhecimento da pele
7,8-Dihidroxiflavona atenua o envelhecimento cutâneo induzido por TNF-α em células fibroblásticas dérmicas humanas Hs68 através da regulação negativa das vias de sinalização MAPKs/Akt
NF-κB: Um fator de transcrição essencial na psoríase
Efeitos antiapoptóticos dos glicosaminoglicanos via inibição da sinalização ERK/AP-1 em fibroblastos dérmicos humanos estimulados por TNF-α
Prostaglandina E2 induz o envelhecimento da pele via E-prostanoide 1 em fibroblastos dérmicos humanos normais
Mecanismos moleculares do envelhecimento dérmico e abordagens antienvelhecimento
Estratégias antienvelhecimento da pele
Efeitos protetores do óleo de casca de laranja prensado a frio, rico em polimetoxiflavonas, contra o fotoenvelhecimento induzido pela radiação ultravioleta B na pele de camundongos
Efeito protetor das polimetoxiflavonas isoladas de Kaempferia parviflora contra o dano em fibroblastos dérmicos humanos induzido por TNF-α
Quercetina em microemulsão a/o: Penetração cutânea in vitro e in vivo e eficácia contra danos cutâneos induzidos por UVB avaliados in vivo
O esquema de separação (a) e as estruturas químicas (b) dos compostos 1–6.
Sobrevivência de fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDFs) sob tratamento com flavonoides 1–6 isolados de K. parviflora. Semeamos NHDFs a 1 × 10⁴ células/poço em placas de 96 poços, incubamos por 24 h e substituímos o meio por meio sem soro para criar condições de privação. Após 24 h, os NHDFs foram expostos a cada concentração dos compostos. Após 24 h, a medição da viabilidade celular foi realizada com a solução EZ-Cytox. Os resultados da viabilidade celular foram apresentados como percentual do controle veicular. Os resultados foram obtidos através de três experimentos replicados, e os gráficos são representados como média ± EPM.
Efeitos dos flavonoides 1–6 isolados de K. parviflora na secreção de MMP-1 em fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDFs). Semeamos NHDFs a 2 × 10⁴ células/poço em placas de 48 poços, incubamos por 24 h e substituímos o meio por meio sem soro para criar condições de privação. Após 24 h, as células foram tratadas com 50 e 100 μM de 6 por 1 h, e as células foram expostas a 20 ng/mL de TNF-α por 24 h. Após 24 h, medimos a secreção de MMP-1 com um kit ELISA. Os resultados da secreção de MMP-1 foram apresentados como percentual do controle veicular. Os resultados foram obtidos através de três experimentos replicados, e os gráficos são representados como média ± EPM. ##
p < 0,01 vs. controle veicular. ** p < 0,01 e *** p < 0,001 vs. controle estimulado por TNF-α.
Efeitos da 3,5,7-trimetoxiflavona (6) no acúmulo intracelular de ROS em fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDFs) estimulados por TNF-α. (A) Bandas de expressão proteica. (B) Gráficos de barras da expressão relativa. Semeamos NHDFs a 1 × 10⁴ células/poço em placas pretas de 96 poços, incubamos por 24 h e substituímos o meio por meio livre de soro para criar condições de privação. Após 24 h, as células foram tratadas com 50 e 100 μM de 6 por 1 h, e as células foram expostas a 20 ng/mL de TNF-α por 15 min. As células foram coradas com diacetato de diclorofluoresceína (DCFDA) por 15 min, e as fotografias foram observadas com um microscópio IX51. A medição da fluorescência foi realizada usando um SPARK 10M. Os resultados de ROS intracelular foram apresentados como percentual do controle veicular. Os resultados foram obtidos através de três experimentos replicados, e os gráficos são representados como média ± EPM. #
p < 0,05 vs. controle veicular. * p < 0,05 e ** p < 0,01 vs. controle estimulado por TNF-α.
Efeitos da 3,5,7-trimetoxiflavona (6) na fosforilação de MAPK em fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDFs) estimulados por TNF-α. (A) Bandas de expressão proteica. (B) Gráficos de barras da expressão relativa. NHDFs foram semeados a uma densidade de 3 × 10⁵ células/poço em placas de 6 poços e incubados por 24 h, e então o meio foi substituído por meio livre de soro para criar condições de privação. Após 24 h, as células foram tratadas com 50 e 100 μM de 6 por 1 h, e as células foram expostas a 20 ng/mL de TNF-α por 15 min. A comparação relativa dos níveis de expressão das proteínas p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38, p38 e GAPDH foi determinada por Western blotting. Os resultados de cada expressão proteica foram apresentados como percentual do controle veicular. Os resultados foram obtidos através de três experimentos replicados, e os gráficos são representados como média ± EPM. #
p < 0,05 vs. controle veicular. * p < 0,05 vs. controle estimulado por TNF-α.
Efeitos da 3,5,7-trimetoxiflavona (6) na fosforilação de MAPK em fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDFs) estimulados por TNF-α. (A) Bandas de expressão proteica. (B) Gráficos de barras da expressão relativa. Semeamos NHDFs a 3 × 10⁵ células/poço em placas de 6 poços, incubamos por 24 h, e então substituímos o meio por meio livre de soro para criar condições de privação. Após 24 h, as células foram tratadas com 50 e 100 μM de 6 por 1 h, e as células foram expostas a 20 ng/mL de TNF-α por 6 h. As expressões das proteínas p-Akt, Akt, COX-2, HO-1 e GAPDH foram determinadas por Western blotting. Os resultados de cada expressão proteica foram apresentados como percentual do controle veicular. Os resultados foram obtidos através de três experimentos replicados, e os gráficos são representados como média ± EPM. #
p < 0,05 e ##
p < 0,01 vs. controle veicular. * p < 0,05 vs. controle estimulado por TNF-α.
Efeitos da 3,5,7-trimetoxiflavona (6) sobre MMP-1 e COLIA1 em fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDFs) estimulados por TNF-α. (A) As expressões de mRNA de MMP-1 e COLIA1. Semeamos NHDFs a 3 × 10⁵ células/poço em placas de 6 poços, incubamos por 24 h e, em seguida, substituímos o meio por um meio sem soro para criar condições de privação. Após 24 h, as células foram tratadas com 50 e 100 μM de 6 por 1 h, e as células foram expostas a 20 ng/mL de TNF-α por 12 h. As expressões de mRNA de MMP-1 e COLIA1 foram determinadas por RT-qPCR. Os resultados de cada expressão de mRNA foram apresentados como percentual do controle veicular. (B) A secreção proteica de COLIA1. Semeamos NHDFs a 2 × 10⁴ células/poço em placas de 48 poços, incubamos por 24 h e, em seguida, substituímos o meio por um meio sem soro para criar condições de privação. Após 24 h, os NHDFs foram expostos a 20 ng/mL de TNF-α na presença ou ausência de 6 por 24 h. A secreção proteica de COLIA1 foi determinada com um kit ELISA. Os resultados foram obtidos por meio de três experimentos replicados, e os gráficos são representados como média ± EPM. ##
p < 0,01 e ###
p < 0,001 vs. controle veicular. * p < 0,05 e ** p < 0,01 vs. controle estimulado por TNF-α.
Efeitos da 3,5,7-trimetoxiflavona (6) sobre citocinas pró-inflamatórias como IL-1β, IL-6 e IL-8 em fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDFs) estimulados por TNF-α. (A) As expressões de mRNA de IL-1β, IL-6 e IL-8. Semeamos NHDFs a 3 × 10⁵ células/poço em placas de 6 poços, incubamos por 24 h e, em seguida, substituímos o meio por um meio sem soro para criar condições de privação. Após 24 h, os NHDFs foram expostos a 20 ng/mL de TNF-α na presença ou ausência de 6 por 4 h. As expressões de mRNA de IL-1β, IL-6 e IL-8 foram determinadas por RT-qPCR. Os resultados de cada expressão de mRNA foram apresentados como percentual do controle veicular. (B) A secreção proteica de IL-1β, IL-6 e IL-8. Semeamos NHDFs a 2 × 10⁴ células/poço em placas de 48 poços e incubamos por 24 h, e então substituímos o meio por um meio sem soro para criar condições de privação. Após 24 h, as células foram tratadas com 3,5,7-trimetoxiflavona por 24 h. As células foram então expostas a 20 ng/mL de TNF-α por 12 h. A secreção proteica de IL-1β, IL-6 e IL-8 foi determinada com um kit ELISA. Os experimentos foram realizados em triplicata, e os gráficos são representados como média ± erro padrão da média (EPM). #
p < 0,05 e ##
p < 0,01 vs. controle veicular. * p < 0,05 e ** p < 0,01 vs. controle estimulado por TNF-α.