pmid: "36647352"
title: "Efeito anti-inflamatório e mecanismo de sinalização do 8-shogaol e 10-shogaol em um modelo de colite induzida por sulfato de sódio dextrano em camundongos."
authors: "Kim HR, Noh EM, Kim SY"
journal: "Heliyon"
pubdate: "2023 Jan"
doi: "10.1016/j.heliyon.2022.e12778"
source: "PMC Full Text"

Efeito anti-inflamatório e mecanismo de sinalização do 8-shogaol e 10-shogaol em um modelo de colite induzida por sulfato de sódio dextrano em camundongos.

Autores

Kim HR, Noh EM, Kim SY

Periodico

Heliyon (2023 Jan)

Conteudo

Efeito anti-inflamatório e mecanismo de sinalização do 8-shogaol e 10-shogaol em um modelo de colite induzida por sulfato de dextrana sódica em camundongos

Relevância etnofarmacológica
O gengibre (Zingiber officinale Roscoe) tem sido utilizado na alimentação e aplicado na medicina Ayurvédica na Índia há milhares de anos. Com reputação de possuir fortes propriedades anti-inflamatórias, tem sido usado para tratar resfriados, enxaquecas, náuseas, artrite e pressão alta na China e no Sudeste Asiático. A atividade fisiológica do gengibre é atribuída aos seus componentes funcionais, incluindo gingerol e shogaol, e seus derivados.

Objetivo do estudo
Visamos investigar os efeitos do 8- e 10-shogaol e seus mecanismos de sinalização bioativa em um modelo de colite induzida por sulfato de dextrana sódica (DSS) em camundongos. A eficácia anticolite dos derivados 6-, 8- e 10- de gingerol e shogaol foi analisada comparativamente.

Materiais e métodos
A colite foi induzida fornecendo aos camundongos água potável contendo 5% de DSS (p/v) por 8 dias. Os derivados 6-, 8- e 10- de gingerol e shogaol foram administrados por via oral durante duas semanas na dose de 30 mg/kg. Alterações no peso corporal e no índice de atividade da doença foram medidas. Os níveis de citocinas pró-inflamatórias, iNOS e COX-2, bem como a fosforilação de NF-κB foram analisados por ELISA, PCR ou Western blotting. A expressão de mucina e os níveis de mRNA foram medidos por coloração com azul alciano e PCR, respectivamente. As proteínas associadas à junção ocludina e ZO-1 foram avaliadas por coloração imuno-histoquímica.

Resultados
Os derivados 6-, 8- e 10- de gingerol e shogaol exibiram efeitos anti-inflamatórios ao regular a sinalização de NF-κB. Entre os compostos administrados, o 10-shogaol foi o mais eficaz contra a inflamação induzida por DSS. A análise comparativa da estrutura química mostrou que o shogaol, um análogo desidratado do gingerol, foi mais eficaz. O 6- e 10-shogaol apresentaram efeitos semelhantes nas alterações morfológicas induzidas por DSS na camada de muco colônico, na expressão de mucina e nas proteínas de junção.

Conclusões
O 6-, 8- e 10-gingerol e o 6-, 8- e 10-shogaol melhoraram significativamente os sintomas clínicos e os danos na barreira epitelial intestinal na colite induzida por DSS em camundongos. Os derivados inibiram eficazmente a inflamação induzida por DSS através da regulação da sinalização de NF-κB. Além disso, o 10-shogaol apresentou o efeito anti-inflamatório mais potente entre os seis compostos utilizados neste estudo. Os resultados indicam que o 8- e o 10-shogaol, ambos ingredientes principais do gengibre, podem servir como candidatos terapêuticos para o tratamento da colite.

Introdução
A doença inflamatória intestinal (DII) é caracterizada por inflamação intestinal crônica recorrente e inclui colite ulcerativa (CU) e doença de Crohn. A CU causa inflamação persistente e úlceras em todo o cólon e mucosa retal. Os principais sintomas da CU são perda de peso, diarreia e sangramento retal. A regulação positiva de proteínas específicas, como ciclooxigenase (COX)-2 e óxido nítrico sintase induzível (iNOS), influencia a desregulação imunológica na CU. Além disso, o fator nuclear kappa B (NF-κB) participa da patogênese da CU ao controlar a ativação de várias citocinas pró-inflamatórias, como interleucina (IL)-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral-α (TNF-α).

Apesar da pesquisa sobre a patogênese da CU e dos esforços para descobrir novas terapêuticas, um tratamento curativo ainda não foi desenvolvido. O tratamento farmacológico da DII é frequentemente acompanhado de complicações ou efeitos colaterais. O uso prolongado de medicamentos como aminossalicilato e corticosteroides para o tratamento da CU é limitado devido aos seus consideráveis efeitos colaterais. Portanto, o desenvolvimento de medicamentos mais seguros e eficazes é necessário. Muitos estudos sobre produtos naturais e seus compostos funcionais foram conduzidos em esforços para identificar um potencial tratamento para a CU.

O gengibre (Zingiber officinale Roscoe) tem sido usado há muito tempo como alimento tradicional em todo o mundo. Tem sido usado como diurético, antiemético e fitoterápico para várias doenças, como dor abdominal, diarreia, náusea, asma e artrite. Em um modelo de colite em camundongos induzida por sulfato de sódio dextrana (DSS), o gengibre retardou a progressão da colite por meio da perda de peso, diminuiu o índice de atividade da doença (IAD) e regulou a expressão de iNOS. Allah et al. relataram que a administração de gengibre preveniu significativamente a colite induzida por ácido acético, reduzindo a expressão de NF-κB e os níveis colônicos de TNF-α, IL-10 e peróxido total. O gengibre é rico em compostos fenólicos e terpênicos ativos, como gingerol, shogaol e paradol. Esses compostos exibem propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, antibacterianas e anticancerígenas. O gingerol é abundante no gengibre fresco, mas é convertido em shogaol por desidratação em altas temperaturas. A dupla ligação do shogaol foi relatada por aumentar sua atividade biológica ao facilitar a eliminação de radicais livres. Como o gingerol e o shogaol são estruturalmente semelhantes, vários estudos compararam seus efeitos farmacológicos.
Vários estudos relataram que gingeróis e shogaóis melhoraram os sintomas da DII por meio de suas atividades antioxidantes e anti-inflamatórias. Zhang et al. mostraram que 6-, 8- e 10-gingerol melhoraram a CU induzida por DSS em camundongos através de efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios. Os resultados mostraram que 6-, 8- e 10-gingerol reduziram significativamente os níveis elevados de TNF-α e IL-1β induzidos por DSS no soro de camundongos com CU. Além disso, Hui et al. relataram que o 6-shogaol repara danos no tecido mucoso de camundongos com CU ao modular a sinalização Notch. Até onde sabemos, nenhum estudo relatou o uso de 8- e 10-shogaol para o tratamento de colite. Com base em relatos anteriores, espera-se que 8- e 10-shogaol exerçam efeitos farmacológicos semelhantes no tratamento da CU. Portanto, investigamos o efeito anticolite e os mecanismos moleculares de 8- e 10-shogaol usando um modelo de camundongo com colite induzida por DSS e comparamos a eficácia de 6-, 8- e 10-gingerol e 6-, 8- e 10-shogaol.
Métodos e materiais
Reagentes
6-Gingerol (Cat. No. CFN99931), 8-gingerol (Cat. No. CFN99131) e 10-gingerol (Cat. No. CFN99132) e 6-shogaol (Cat. No. CFN99531), 8-shogaol (Cat. No. CFN92299) e 10-shogaol (Cat. No. CFN92300) (pureza: ≥98%) foram adquiridos da ChemFaces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, China). O DSS foi obtido da MP Biomedicals (Cat. No. 9011-18-1; Irvine, CA, EUA). Kits comerciais de ensaio imunoenzimático (ELISA) foram fornecidos pela R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA). Neste estudo, utilizamos anticorpos anti-iNOS (Cat. No. #13120), anti-fosfo–NF–κB (Cat. No. #3031), anti–NF–κB (Cat. No. #3033) e anti-β-actina (Cat. No. #3700) da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA) e anticorpos anti-COX-2 (Cat. No. ab15191), anti-ocludina (Cat. No. ab216327) e anti-ZO-1 (Cat. No. ab216880) da Abcam (Cambridge, Reino Unido). Todos os outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), salvo indicação em contrário.
Animais
Camundongos BALB/c (machos, 5 semanas de idade) livres de patógenos específicos (SPF) foram adquiridos da Damul Science (Daejeon, Coreia) e aclimatados por 1 semana. Os camundongos foram alojados em uma sala mantida sob ciclo claro/escuro de 12 h a 22 ± 2 °C e umidade relativa de 55 ± 5%. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais do Instituto de Materiais AgroBio de Jeonju (JAMI IACUC 2021001, Jeonju, Coreia).
Grupos experimentais
Os animais foram divididos em sete grupos (cinco camundongos/grupo) de acordo com o tratamento: grupos N (normal), NC (5% DSS; controle negativo), 6G (6-gingerol + 5% DSS), 8G (8-gingerol + 5% DSS), 10G (10-gingerol + 5% DSS), 6S (6-shogaol + 5% DSS), 8S (8-shogaol + 5% DSS) e 10S (10-shogaol + 5% DSS). As amostras foram dissolvidas em azeite de oliva e administradas por via oral a 30 mg/kg uma vez ao dia por 2 semanas antes do tratamento com DSS. Os grupos N e NC receberam azeite de oliva como veículo.
Indução de inflamação colônica
Escore do Índice de Atividade da Doença (DAI).
Tabela 1
Perda de Peso (%) Forma das Fezes Sangue Oculto/Fezes com Sangue Escore 0 Normal Negativo 0 1–5 Fezes amolecidas Negativo 1 6–10 Fezes amolecidas Sangue oculto 2 11–15 Diarreia Sangue oculto 3 >15 Diarreia Fezes com sangue 4
A colite aguda foi induzida usando DSS. Camundongos foram autorizados a consumir água potável contendo 5% (p/v) de DSS (36–50 kDa) por 8 dias consecutivos e foram sacrificados um dia após esse período. Após o início do tratamento com DSS, o peso corporal e o índice de atividade da doença (DAI) foram medidos diariamente antes da administração das amostras. O escore DAI atribuído dependia das características das fezes e variava de 0 (normal) a 4 (atividade máxima da doença) (Tabela 1).
Avaliação de biomarcadores no soro e tecido do cólon
Sequências dos primers.
Tabela 2
Gene Sequências iNOS F: 5′-CGAAACGCTTCACTTCCAA-3′R: 5′-TGAGCCTATATTGCTGTGGCT-3′ COX-2 F: 5′-TTTGGTCTGGTGCCTGGTC-3′R: 5′-CTGCTGGTTTGGAATAGTTGCTC-3′ MUC2 F: 5′-GCAGTCCTCAGTGGCACCTC-3′R: 5′-CACCGTGGGGCTACTGGAGAG-3′ MUC3 F: 5′-CGTGGTCAACTGCGAGAATGG-3′R: 5′-CGGCTCTATCTCTACGCTCTC-3′ β-actina F: 5′-CGGTTCCGATGCCCTGAGGCTCTT-3′R: 5′-CGTCACACTTCATGATGGAATTGA-3′
Os níveis séricos do fator de necrose tumoral (TNF)-α (Cat. No. #MTA00B), interleucina (IL)-1 β (Cat. No. #MLB00C), IL-6 (Cat. No. #M6000B) e interferon (IFN)-gama (Cat. No. #MIF00) foram determinados usando kits de ELISA comerciais, de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de expressão de mRNA dos genes iNOS, COX-2, MUC2 e MUC3 foram determinados usando PCR quantitativo em tempo real com transcrição reversa (qRT-PCR). O tecido do cólon foi interceptado e homogeneizado em reagente TRIzol gelado (Cat. No. TR118; MRC, Cincinnati, OH, EUA). Subsequentemente, o cDNA foi sintetizado por transcrição reversa de 1 μg de amostras de RNA usando o BioFact™ 2 × RT Pre-Mix (Cat. No. BR441-096; BioFact, Daejeon, Coreia). A RT-qPCR foi realizada usando um kit TB Green® Premix Ex Taq™ II (Cat. No. RR820A; TaKaRa, Japão). As sequências dos primers utilizados estão listadas na Tabela 2. Os níveis relativos de mRNA foram calculados usando o método Ct comparativo com β-actina como gene de referência. Os tecidos do cólon foram homogeneizados em tampão RIPA gelado (Cat. No. 89901; Invitrogen, CA, EUA) contendo coquetel de inibidores de protease e fosfatase (Cat. No. 78440; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Amostras de proteína (20 μg por poço) foram separadas usando SDS-PAGE e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (Cat. No. #1620174; Bio-Rad, Munique, Alemanha). Os blots foram analisados usando os anticorpos especificados e desenvolvidos usando um sistema de quimioluminescência aprimorada (ECL) (Cat. No. RPN2235; Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). A análise quantitativa foi realizada usando varredura densitométrica (Amersham Imager 600, GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido).
Histologia
Tecidos do cólon de camundongos foram fixados em paraformaldeído a 4% e embebidos em parafina. Cortes de tecido foram preparados em lâminas de 4 μm de espessura e corados com hematoxilina e eosina (H&E) ou azul alciano (AB). Para a análise imuno-histoquímica (IHQ) de ZO-1 e ocludina, os cortes foram desparafinizados, reidratados e incubados durante a noite a 4 °C com anticorpos, seguido de tratamento com o Kit Anti-Coelho Envision Plus Polymer (Cat. No. K4065; Dako, Glostrup, Dinamarca). Os cortes foram corados com hematoxilina. As características morfológicas dos cortes corados e a expressão da IHQ foram observadas usando um microscópio óptico (Olympus, Tóquio, Japão) e fotografadas. Os escores histológicos foram medidos e calculados como as médias dos graus para cada parâmetro, conforme relatado anteriormente.

Análise estatística
Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP), e todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software Sigmaplot v16.0 (Systat Software Inc., San Jose, CA, EUA). A análise estatística foi realizada para identificar as diferenças, seguida por análise de variância (ANOVA) de uma via e teste de comparação múltipla de Duncan. Um valor de P < 0,05 foi considerado para indicar diferença significativa. Os valores exatos de P para cada grupo foram fornecidos no Arquivo Suplementar.

Resultados
Efeito preventivo de 8- e 10-shogaóis na colite induzida por DSS
Estrutura de 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis. (A) As estruturas químicas dos compostos do gengibre usados neste estudo. (B) Alterações no peso corporal dos camundongos. 6-, 8- e 10-Gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis foram administrados por via oral (30 mg/kg) por 2 semanas antes do tratamento com DSS. O peso corporal foi avaliado. Os grupos foram: N (normal), NC (DSS a 5%; controle negativo), 6G (6-gingerol + DSS a 5%), 8G (8-gingerol + DSS a 5%), 10G (10-gingerol + DSS a 5%), 6S (6-shogaol + DSS a 5%), 8S (8-shogaol + DSS a 5%) e 10S (10-shogaol + DSS a 5%). Todos os valores representam a média ± DP (n = 5 por grupo). Os dados foram analisados pelo teste de comparação múltipla de Duncan, mas não foram observadas diferenças significativas.

Fig. 1
Efeitos de 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis no peso corporal, IAD e comprimento do cólon na colite induzida por DSS. (A) Alteração no peso corporal. (B) Alteração no peso corporal aos 9 dias na colite induzida. (C) Índice de atividade da doença. (D) Índice de atividade da doença aos 9 dias na colite induzida. (E) Parágrafo do cólon. (F) Comprimento do cólon. Os grupos N (normal), NC (DSS a 5%; controle negativo), 6G (6-gingerol + DSS a 5%), 8G (8-gingerol + DSS a 5%), 10G (10-gingerol + DSS a 5%), 6S (6-shogaol + DSS a 5%), 8S (8-shogaol + DSS a 5%) e 10S (10-shogaol + DSS a 5%) são mostrados. Todos os valores representam a média ± DP (n = 5 por grupo). Os dados foram analisados pelo teste de comparação múltipla de Duncan. ***P < 0,001 versus grupo N; #P < 0,05, ##P < 0,01 e ###P < 0,001 versus NC. †P < 0,05 versus gingerol de comprimento de cadeia alquila igual.

Fig. 2
As estruturas químicas dos compostos utilizados neste estudo são mostradas na Fig. 1A. De acordo com relatos anteriores, camundongos induzidos por DSS apresentam progressão da doença para perda de peso, encurtamento do cólon e fezes com sangue. Após administração oral de 6-, 8- e 10-gingerol e 6-, 8- e 10-shogaol na dose de 30 mg/kg por duas semanas, água potável contendo 5% de DSS foi fornecida por 8 dias para induzir CU. Durante o período de tratamento de duas semanas, nenhum dos compostos induziu alterações no peso corporal (Fig. 1B), distúrbios alimentares ou comportamentos anormais (dados não mostrados). No grupo tratado com DSS (NC, controle negativo), o peso corporal (Fig. 2A e B) e o comprimento do cólon (Fig. 2E e F) foram significativamente diminuídos, e o DAI foi aumentado em comparação ao grupo normal (N) (Fig. 2C e D). Em contraste, a administração de 6-, 8- e 10-gingerol (grupos experimentais 6G, 8G e 10G) e 6-, 8- e 10-shogaol (grupos experimentais 6S, 8S e 10S) preveniu notavelmente a perda de peso induzida por DSS (Fig. 2B), a redução do comprimento do cólon (Fig. 2E e F) e o aumento do DAI (Fig. 2C e D) em comparação ao tratamento NC. Os grupos 8S e 10S mostraram maior efeito do que aqueles tratados com os outros compostos, e o 10S inibiu significativamente a perda de peso induzida por DSS em comparação com o 10G (Fig. 2B). A diminuição do comprimento do cólon induzida por DSS foi significativamente inibida em todos os grupos tratados com derivados de gingerol e shogaol em comparação ao grupo NC. Além disso, análogos com a mesma cadeia lateral alquílica foram mais eficazes no grupo tratado com shogaol do que no grupo tratado com gingerol (Fig. 2D e C). Especificamente, o grupo 8S mostrou inibição significativa da redução do comprimento do cólon induzida por DSS em comparação com o grupo 8G (Fig. 2E e F). Portanto, 8S e 10S produziram um efeito terapêutico na CU induzida por DSS, semelhante a outros análogos.

Efeito dos 8- e 10-shogaóis na produção de citocinas pró-inflamatórias induzida por DSS

Efeitos dos 6-, 8- e 10-gingeróis e dos 6-, 8- e 10-shogaóis sobre as citocinas pró-inflamatórias na colite induzida por DSS. Níveis de (A) fator de necrose tumoral (TNF)-α, (B) interleucina (IL)-1β, (C) IL-6 e (D) interferon (IFN)-gama no soro de camundongos com colite induzida por DSS. São mostrados os grupos N (normal), NC (5% DSS; controle negativo), 6G (6-gingerol + 5% DSS), 8G (8-gingerol + 5% DSS), 10G (10-gingerol + 5% DSS), 6S (6-shogaol + 5% DSS), 8S (8-shogaol + 5% DSS) e 10S (10-shogaol + 5% DSS). Todos os valores representam a média ± DP (n = 5 por grupo). Os dados foram analisados usando o teste de comparação múltipla de Duncan. ***P < 0,001 versus grupo N; #P < 0,05, ##P < 0,01 e ###P < 0,001 versus NC. †P < 0,05, ‡P < 0,01 e ¥P < 0,001 versus gingerol de igual comprimento de cadeia alquílica.
Fig. 3
Citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α, IL-1β, IL-6 e IFN-γ, foram relatadas como desempenhando papéis-chave na patogênese da UC. O DSS aumentou significativamente os níveis das citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-1β, IL-6 e IFN-γ no soro de camundongos (Fig. 3). Após a administração de 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis por aproximadamente 2 semanas, os níveis de produção de IL-1β, IL-6 e IFN-γ diminuíram em todos os grupos. Além disso, a produção de TNF-α induzida por DSS foi significativamente diminuída nos grupos 8S e 10S em comparação com o grupo NC, e o grupo 10S apresentou os resultados mais eficazes (Fig. 3A). Entre as citocinas-alvo, os níveis de IL-1β, IL-6 e IFN-γ foram os mais baixos nos grupos 10G, 10G e 10S, respectivamente (Fig. 3B–D).

Efeitos dos 8- e 10-shogaóis na expressão de iNOS e COX2 e na via de sinalização NF-κB na colite induzida por DSS
Efeito dos 6-, 8- e 10-gingeróis e dos 6-, 8- e 10-shogaóis na via de sinalização NF-κB na colite induzida por DSS. Os níveis de mRNA de (A) iNOS e (B) COX-2 foram analisados por PCR quantitativo em tempo real. Os níveis proteicos de (C) iNOS e COX-2, bem como a fosforilação de NF-κB no cólon, foram analisados por immunoblotting. (D) Densitometria de cada banda quantificada por análise de imagem. A densidade das bandas de iNOS e COX-2 foi normalizada usando β-actina, e a NF-κB fosforilada normalizada para NF-κB total. São mostrados os grupos N (normal), NC (5% DSS; controle negativo), 6G (6-gingerol + 5% DSS), 8G (8-gingerol + 5% DSS), 10G (10-gingerol + 5% DSS), 6S (6-shogaol + 5% DSS), 8S (8-shogaol + 5% DSS) e 10S (10-shogaol + 5% DSS). Todos os valores representam a média ± DP (n = 5 por grupo). Os dados foram analisados usando o teste de comparação múltipla de Duncan. ***P < 0,001 versus grupo N; #P < 0,05, ##P < 0,01 e ###P < 0,001 versus NC. †P < 0,05 versus gingerol de comprimento de cadeia alquílica igual. As imagens não cortadas de (C) estão referidas no arquivo suplementar.
Fig. 4
iNOS induz uma resposta imune mediada pela produção de NO, enquanto a COX-2 é uma enzima induzível induzida por citocinas pró-inflamatórias. Esses fatores são fortemente induzidos na UC induzida por DSS. O grupo tratado com DSS apresentou regulação positiva significativa da expressão de mRNA e proteína de iNOS e COX-2 em comparação ao grupo NC (Fig. 4A). Camundongos tratados com 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis mostraram expressão de mRNA e proteína de iNOS e COX-2 significativamente reduzida em comparação com os camundongos controle induzidos por DSS (Fig. 4A e B). Entre os compostos tratados, o 10S foi o mais eficaz na redução da expressão de COX-2 induzida por DSS (Fig. 4C e D). Estudos anteriores mostraram que o NF-κB é um importante fator de transcrição que atua como mediador central da resposta inflamatória por meio da ativação de iNOS, COX-2 e citocinas pró-inflamatórias. Investigamos se os efeitos anti-inflamatórios dos 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis envolviam as vias de sinalização do NF-κB no modelo de colite em camundongos. O tratamento com DSS estimulou a fosforilação do NF-κB no tecido do cólon; no entanto, esse efeito foi significativamente reduzido pela administração de 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis (Fig. 4C e D). Em particular, o 10S mostrou a maior eficácia em bloquear a fosforilação do NF-κB induzida por DSS (Fig. 4C e D), semelhante ao seu efeito inibitório na expressão de COX-2. Esses resultados indicam que os efeitos anti-inflamatórios do 8S, 10S e seus análogos estão relacionados à via de sinalização do NF-κB na colite induzida por DSS.
Efeitos dos 8- e 10-shogaóis no dano histológico do cólon e na mucina na colite induzida por DSS
Efeito dos 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis na avaliação histológica na colite induzida por DSS. Imagens representativas da coloração (A) H&E e (B) Azul Alciano do tecido do cólon. Magnificação: 200× e, barra de escala: 50 μm. O (C) escore histológico foi avaliado usando coloração H&E (n = 8 por grupo). Os níveis de mRNA de (D) MUC2 e (E) MUC3 foram analisados no tecido do cólon usando PCR quantitativo em tempo real (n = 3 por grupo). Os grupos N (normal), NC (5% DSS; controle negativo), 6G (6-gingerol + 5% DSS), 8G (8-gingerol + 5% DSS), 10G (10-gingerol + 5% DSS), 6S (6-shogaol + 5% DSS), 8S (8-shogaol + 5% DSS) e 10S (10-shogaol + 5% DSS) são mostrados. Todos os valores representam a média ± DP (n = 5 por grupo). Os dados foram analisados usando o teste de comparação múltipla de Duncan. ***P < 0,001 versus grupo N; #P < 0,05, ##P < 0,01 e ###P < 0,001 versus NC. (Para interpretação das referências à cor nesta legenda de figura, o leitor é direcionado à versão Web deste artigo.)
Fig. 5
A histopatologia do cólon foi avaliada usando coloração H&E e Azul Alciano (AB) de cortes de tecido. O grupo tratado com DSS mostrou deterioração das criptas, perda de células caliciformes, edema submucoso e infiltração de células inflamatórias em comparação ao grupo N (Fig. 5A). Todos os seis compostos preveniram danos intestinais induzidos por DSS, protegeram significativamente contra inflamação colônica e reduziram significativamente o escore histológico (Fig. 5A e C). Com base nos escores histológicos, os compostos podem ser organizados na seguinte ordem de acordo com seu efeito protetor: 6S > 10S > 8S > 6G > 10G > 8G (Fig. 5C). A coloração AB foi realizada para determinar os níveis de muco nas células caliciformes intestinais. Consistente com o efeito anti-inflamatório dos compostos teste, os grupos que receberam derivados de gingerol e shogaol mostraram muco corado por AB significativamente aumentado na colite em comparação ao grupo tratado com DSS (Fig. 5B). As células epiteliais intestinais são afetadas pelos principais constituintes da camada de muco (MUC2) e mucina ligada à membrana (MUC3) no cólon. Os níveis reduzidos de mucina MUC2 e MUC3 pelo DSS foram atenuados após o tratamento com 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis; 6S e 10S foram os mais eficazes na regulação de MUC2 e MUC3 induzidos por DSS, respectivamente (Fig. 5D e E).
Efeitos dos 8- e 10-shogaóis na função da barreira intestinal na colite induzida por DSS
Efeitos dos 6-, 8- e 10-gingeróis e dos 6-, 8- e 10-shogaóis na ocludina e ZO-1 na colite induzida por DSS. Análise imuno-histoquímica das proteínas de junção apertada (A) ZO-1 e (B) ocludina no tecido do cólon. Aumento: 200× e, barra de escala: 50 μm. (C, D) O escore histológico foi avaliado (n = 4 por grupo). Os grupos N (normal), NC (DSS 5%; controle negativo), 6G (6-gingerol + DSS 5%), 8G (8-gingerol + DSS 5%), 10G (10-gingerol + DSS 5%), 6S (6-shogaol + DSS 5%), 8S (8-shogaol + DSS 5%) e 10S (10-shogaol + DSS 5%) são mostrados. Todos os valores representam a média ± DP (n = 5 por grupo). Os dados foram analisados usando o teste de comparação múltipla de Duncan. ***P < 0,001 versus grupo N; #P < 0,05, ##P < 0,01 e ###P < 0,001 versus NC.
Fig. 6
As proteínas de junção oclusiva (TJ) são essenciais para a manutenção da barreira epitelial intestinal. Portanto, a expressão das proteínas TJ ZO-1 e ocludina foi avaliada por imunohistoquímica. No grupo normal, ZO-1 e ocludina foram expressas uniformemente ao redor da membrana superficial e das criptas do epitélio. No entanto, o tratamento com DSS comprometeu a integridade da barreira do cólon e a estrutura das criptas, resultando em diminuição da expressão das proteínas TJ. Em contraste, a administração de derivados de gingerol e shogaol causou a preservação e manutenção da integridade da barreira intestinal, associada a altos níveis de expressão de ZO-1 e ocludina ao longo das membranas epiteliais e criptas do cólon intactas (Fig. 6A e B). A proteção contra a perda induzida por DSS das proteínas TJ foi mais significativa no grupo 10S do que nos outros grupos (Fig. 6C e D). Esses resultados indicam que a administração de 10S e 8S protege contra a disrupção da função da barreira intestinal induzida por DSS, prevenindo a perda das proteínas TJ.

Discussão
Neste estudo, demonstramos, pela primeira vez, que 8-shogaol e 10-shogaol produziram efeitos terapêuticos promissores em camundongos com colite induzida por DSS. O modelo animal de colite induzida por DSS é o modelo quimicamente indutível de inflamação intestinal mais amplamente utilizado devido às suas semelhanças com a RCU. A administração de 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis por 2 semanas antes do tratamento com DSS suprimiu significativamente os sintomas clínicos da colite e protegeu contra danos à mucosa. Consistente com nossos resultados, 6-, 8- e 10-gingerol e 6-shogaol foram previamente relatados como melhoradores da colite induzida por DSS em camundongos. No entanto, os efeitos protetores de 8- e 10-shogarol contra a colite ainda não foram estabelecidos. Os efeitos de 8- e 10-shogarol foram avaliados usando um modelo de camundongo com colite induzida por DSS e comparados aos de seus análogos. Descobrimos que 8- e 10-shogarol melhoraram a colite, conforme indicado pelos efeitos na perda de peso, comprimento do cólon, características histológicas e pontuações do DAI. Especificamente, 8- e 10-shogaol melhoraram mais efetivamente o encurtamento do comprimento do cólon e as pontuações do DAI do que os outros análogos. Os derivados de shogaol foram mais eficazes do que o derivado de gingerol correspondente no tratamento dos sintomas de RCU causados por DSS; nossos resultados foram semelhantes aos de relatos anteriores.
Citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-1β, TNF-α, IFN-γ e IL-6, são importantes mediadores da inflamação e estão elevadas na colite induzida por DSS. A IL-1β desempenha um papel crítico na patogênese e progressão da inflamação aguda e crônica através da ativação de neutrófilos. O TNF-α desorganiza a barreira epitelial para induzir apoptose de células epiteliais e secreção de quimiocinas por células epiteliais intestinais; é um alvo importante para o tratamento inicial da colite e lesões no cólon. A IL-1β e a IL-6 são os principais mediadores da retocolite ulcerativa (RCU). Antagonistas do receptor de IL-1β e anticorpos anti-IL-1β murino foram relatados como inibidores de sintomas patológicos, incluindo infiltração de células inflamatórias no cólon e expressão de mRNA de IL-6, em um modelo animal de colite. O 6-gingerol, 8-gingerol e 10-gingerol reduzem os níveis de IL-1β e TNF-α no soro de ratos. O 6-shogaol inibiu a produção de TNF-α e IL-6 em mastócitos humanos e lesões endometrióticas. Neste estudo, o aumento de citocinas inflamatórias induzido pela ingestão de DSS foi inibido pela administração de 6-, 8- e 10-gingerol e 6-, 8- e 10-shogaol. Ao comparar os efeitos inibitórios da produção de citocinas pró-inflamatórias induzida por DSS entre os análogos, o 10-shogaol foi o mais eficaz para TNF-α e IFN-γ, enquanto o 10-gingerol foi o mais eficaz para IL-6 e IL-1β. Esses resultados sugerem que o aumento do comprimento da cadeia alquílica do gingerol ou shogaol pode produzir um efeito potente na melhora da inflamação induzida por DSS.

A iNOS e a COX-2 são fatores de sinalização que induzem estresse oxidativo e estão intimamente relacionados ao início e desenvolvimento da inflamação. Krieglstein et al. relataram que a colite induzida por DSS foi significativamente atenuada em camundongos knockout para iNOS. Além disso, a COX-2 é expressa em baixos níveis no intestino saudável, mas está significativamente elevada na doença de Crohn e na RCU. Neste estudo, 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis inibiram a expressão de iNOS e COX-2 induzida por DSS no tecido do cólon, e o 10-shogaol suprimiu completamente o aumento induzido por DSS na expressão proteica e de mRNA da COX-2. Consistente com nossos resultados, 10-shogaol, 8-shogaol e 10-gingerol foram relatados como inibidores da COX-2, com os compostos organizados em ordem decrescente de atividade inibitória da seguinte forma: 10-shogaol > 8-shogaol > 10-gingerol. Coletivamente, nossos resultados sugerem o potencial de 8- e 10-shogaol para serem utilizados como agentes terapêuticos para melhorar a inflamação através da modulação da atividade da COX-2.
Além disso, a ativação do NF-κB é um fator de transcrição importante na patogênese da DII. Foi demonstrado que regula a expressão de citocinas pró-inflamatórias e proteínas inflamatórias, como COX-2 e iNOS. O extrato de gengibre e o 6-gingerol, um componente funcional do gengibre, foram relatados por terem efeitos protetores na artrite inflamatória e na colite ulcerativa induzida por DSS por meio da regulação da via do NF-κB. Descobrimos que a administração de 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis inibiu a fosforilação do NF-κB induzida por DSS no tecido do cólon, sendo o 10-shogaol o mais eficaz.

Alterações nas estruturas patológicas, como destruição de criptas, ulceração, infiltração de células inflamatórias e depleção de muco do cólon, são fatores importantes na avaliação e determinação da eficácia do tratamento da colite. O gengibre e o 6-gingerol aliviam o dano à barreira intestinal induzido por lipopolissacarídeos, e o shogaol suprime a expressão de marcadores de células-tronco intestinais na colite. Além disso, foi demonstrado que 6-, 8- e 10-gingerol previnem danos ao tecido do cólon induzidos por DSS, como destruição de criptas, depleção de células caliciformes e ulceração grave da mucosa. Em nosso estudo, o tratamento com DSS resultou em infiltração de células inflamatórias e perda de células caliciformes, enquanto 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis protegeram eficazmente contra o dano intestinal induzido por DSS. A camada de muco é importante na proteção, secreção e absorção. As mucinas epiteliais são um grande grupo de glicoproteínas de alto peso molecular (compreendendo mais de 20 genes identificados) que conferem viscosidade ao muco. Verificou-se que a expressão de mucina apresenta uma correlação negativa com a gravidade da colite ulcerativa, e a deficiência na expressão de MUC2 e MUC3 foi observada nas células caliciformes de pacientes com colite ulcerativa. O grupo de tratamento com DSS mostrou uma redução significativa em MUC2 e MUC3, e o pré-tratamento com 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis preveniu significativamente essa redução. O 6-shogaol e o 10-shogaol exibiram os efeitos mais fortes sobre MUC2 e MUC3, respectivamente. Esses resultados sugerem que o shogaol é mais eficaz no controle de MUC do que o gingerol; no entanto, o efeito não foi dependente da cadeia lateral alquila de cada derivado. O complexo TJ é um aglomerado de proteínas que forma uma barreira fisiologicamente ativa nas células epiteliais intestinais, e ZO-1 e ocludina são proteínas-chave do TJ. O extrato de gengibre e o 6-gingerol foram relatados por regular as proteínas TJ. Neste estudo, 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis inibiram a expressão de ZO-1 e ocludina induzida por DSS no tecido do cólon, sendo o 10-shogaol o mais eficaz. Esses resultados sugerem que o 10-shogaol é o mais eficaz entre os compostos gingerol e shogaol na proteção contra a lesão da barreira intestinal induzida por DSS.
Uma vez que o modelo de colite induzida por DSS causa colite aguda, projetamos um modelo de pré-tratamento com gingerol e shogaol por 2 semanas para avaliar o efeito. Para confirmar o efeito deste desenho experimental, são necessários estudos adicionais utilizando outros modelos de colite e análise comparativa com estudos anteriores.
Conclusões
Neste estudo, 6-, 8- e 10-gingeróis e 6-, 8- e 10-shogaóis mostraram efeitos anti-inflamatórios significativos através da via de sinalização NF-κB e regulação da barreira epitelial intestinal na colite induzida por DSS. Entre eles, o 10-shogaol foi considerado o mais eficaz na supressão dos sintomas e inflamação da colite e mais eficaz do que o análogo de gingerol correspondente. Portanto, nossos resultados sugerem que o 8-shogaol e o 10-shogaol podem ser usados como agentes terapêuticos derivados de fontes naturais para a colite.
Declaração de conflito de interesses
Todos os autores declaram que não há conflito de interesses.
Referências
Redefinindo as DIIs usando fenotipagem molecular em escala genômica
Mecanismos que regulam a integridade da barreira intestinal e suas implicações patológicas
A base fundamental da doença inflamatória intestinal
Óxido nítrico na doença inflamatória intestinal: um mensageiro universal em um quebra-cabeça não resolvido
O papel da COX-2 na inflamação intestinal e no câncer colorretal
NF-kappaB na doença inflamatória intestinal
NF-kappaB: um papel chave em doenças inflamatórias
Caracterização química e comparação de atividades antioxidantes em gengibre fresco, seco, frito em frigideira e carbonizado
Lycopodium mitiga o estresse oxidativo e a inflamação na mucosa colônica de colite induzida por ácido acético em ratos
Extratos de albumina de semente de ervilha (Pisum sativum L.) mostram efeito anti-inflamatório no modelo DSS de colite em camundongos
O extrato de raiz de ginseng atenua a inflamação inibindo a via de sinalização MAPK/NF-kappaB e ativando a autofagia e a sinalização p62-Nrf2-Keap1 in vitro e in vivo
Adendo a uma revisão sistemática recente sobre gengibre
Gengibre: uma revisão etnomédica, química e farmacológica
Gengibre desde os tempos antigos até a nova perspectiva
O gengibre alivia a gravidade da colite ulcerativa induzida por DSS melhorando a diversidade e a função da microbiota intestinal
Papel da serotonina e do fator nuclear kappa B no efeito benéfico do gengibre na colite induzida por ácido acético
Compostos bioativos e bioatividades do gengibre (Zingiber officinale Roscoe)
Formação de 6-, 8- e 10-shogaol no gengibre através da aplicação de diferentes métodos de secagem: atividade antioxidante e antimicrobiana alterada
Farmacocinética de 6-gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol e 6-shogaol e metabólitos conjugados em indivíduos humanos saudáveis
A possibilidade de usar shogaol para o tratamento de colite ulcerativa
6-gingerol alivia a lesão inflamatória em camundongos com colite ulcerativa induzida por DSS regulando a sinalização NF-kappaB
[6]-Shogaol inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias através da regulação de NF-kappaB e fosforilação de JNK em células HMC-1
Efeitos terapêuticos do 6-gingerol, 8-gingerol e 10-gingerol na colite ulcerativa aguda induzida por sulfato de dextrano sódico em ratos
Efeitos do 6-Shogaol na via de sinalização Notch em células epiteliais do cólon de camundongos com colite ulcerativa
Padrões distintos de citocinas identificados a partir de perfis multiplex de colite murina induzida por DSS e TNBS
Um guia para avaliação histomorfológica da inflamação intestinal em modelos de camundongos
Neoplasia associada à colite induzida por sulfato de dextrano sódico: um modelo promissor para o desenvolvimento de intervenções quimiopreventivas
Doença inflamatória intestinal: mecanismos, considerações redox e alvos terapêuticos
Métodos de indução de doença inflamatória intestinal em camundongos
Modelos de camundongos quimicamente induzidos de inflamação intestinal aguda e crônica
Efeito do shogaol na expressão de marcadores de células-tronco intestinais em colite induzida experimentalmente em camundongos BALB/c
Aumento dos efeitos inibitórios do crescimento em células cancerígenas humanas e potência anti-inflamatória dos shogaols de Zingiber officinale em relação aos gingeróis
Papel das citocinas na doença inflamatória intestinal
Novas estratégias para o tratamento da doença inflamatória intestinal
A produção de IL-1 e seu antagonista do receptor em explantes de cólon está desequilibrada na doença inflamatória intestinal (DII)
A interleucina-1beta atinge a interleucina-6 na progressão da colite experimental induzida por sulfato de dextrano sódico
Regulação da inflamação intestinal murina por metabólitos reativos de oxigênio e nitrogênio: papéis divergentes do superóxido e do óxido nítrico
Inibidores da ciclooxigenase-2 no gengibre (Zingiber officinale)
O extrato de gengibre suprime as ativações das vias NF-kappaB e Wnt e protege contra artrite inflamatória
Efeito da cúrcuma na histologia do cólon, peso corporal, úlcera, IL-23, MPO e glutationa na doença inflamatória intestinal induzida por ácido acético em ratos
Gengibre e 6-gingerol previnem danos à barreira intestinal induzidos por lipopolissacarídeo e lesão hepática em camundongos
Disfunção da barreira intestinal nas doenças inflamatórias intestinais
Barreira mucosa na colite ulcerativa e doença de Crohn
Perda da proteína de junção oclusiva ZO-1 na colite induzida por sulfato de dextrano sódico
O gengibre atenua a inflamação em um modelo de camundongo de colite induzida por sulfato de dextrano sódico
O componente do gengibre 6-shogaol previne a perda de barreira induzida por TNF-alfa através da inibição da sinalização PI3K/Akt e NF-kappaB
Abreviaturas
AB
azul alciano
COX-2
ciclooxigenase-2
DAI
índice de atividade da doença
DSS
sulfato de dextrano sódico
H&E
hematoxilina e eosina
DII
doença inflamatória intestinal
IFN
interferon
IL
interleucina
iNOS
óxido nítrico sintase induzível
NF-κB
fator nuclear κB
TNF-α
fator de necrose tumoral α
TJ
junção oclusiva
UC
colite ulcerativa
Dados suplementares
A seguir estão os dados suplementares relacionados a este artigo:
Os dados suplementares relacionados a este artigo podem ser encontrados em https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2022.e12778.