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pmid: "42355453"
title: "Extrato fermentado de NaDES-gengibre atenua inflamação induzida por hiperglicemia e adesão endotelial no câncer colorretal através do eixo NF-κB/COX-2."
authors: "Wu KL, Chang SF, Chen CN, Lee KC"
journal: "Life (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2026 Jun 01"
doi: "10.3390/life16060927"
source: "PMC Full Text"

Extrato fermentado de NaDES-gengibre atenua inflamação induzida por hiperglicemia e adesão endotelial no câncer colorretal através do eixo NF-κB/COX-2.

Autores

Wu KL, Chang SF, Chen CN, Lee KC

Periodico

Life (Basel, Switzerland) (2026 Jun 01)

Conteudo

Extrato Fermentado de Gengibre com NaDES Atenua a Inflamação Induzida por Hiperglicemia e a Adesão Endotelial no Câncer Colorretal Através do Eixo NF-κB/COX-2
A hiperglicemia agrava a progressão do câncer colorretal (CRC) ao ativar vias inflamatórias e facilitar a adesão tumor-célula endotelial. O extrato de gengibre apresenta propriedades anti-inflamatórias bem conhecidas; no entanto, sua eficácia farmacológica sob tais condições de estresse metabólico permanece amplamente desconhecida. Neste estudo, os efeitos de um extrato fermentado de gengibre preparado utilizando solventes eutéticos naturais profundos (FNGE) foram examinados na patogênese induzida por alta glicose em células de CRC humano. Células DLD-1 foram expostas a condições de alta glicose com ou sem tratamento com FNGE. A expressão de mediadores inflamatórios (ciclooxigenase-2 [COX-2], prostaglandina E2 [PGE2], interleucina [IL-6] e IL-8), a capacidade de adesão das células de CRC a células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e a ativação da via de sinalização NF-κB foram examinadas. O tratamento com FNGE atenuou significativa e dose-dependentemente a regulação positiva induzida por alta glicose do mRNA de COX-2 e da secreção de PGE2, enquanto suprimia concomitantemente a expressão de IL-6 e IL-8. Além disso, o pré-tratamento com FNGE prejudicou marcadamente a adesão das células de CRC às HUVECs. Análises mecanísticas, incluindo knockdown direcionado de COX-2 e inibição farmacológica, revelaram que o FNGE exerce seus efeitos anti-inflamatórios e antiadesivos principalmente através da supressão da ativação de NF-κB, um regulador mestre transcricional dessas vias patogênicas. Esses achados in vitro demonstraram que o FNGE mitiga efetivamente a inflamação mediada por alta glicose e a adesão endotelial em células de CRC ao regular negativamente o eixo de sinalização NF-κB/COX-2. Assim, este estudo fornece uma base bioquímica preliminar para a potencial aplicação de fitoquímicos extraídos por métodos verdes sob estresse metabólico, destacando a necessidade de futura validação in vivo para confirmar sua relevância translacional.

1. Introdução
   O câncer colorretal (CRC) está entre os cânceres mais prevalentes e letais globalmente, representando consistentemente uma das principais causas de mortalidade associada ao câncer em diversos países. Apesar dos avanços substanciais no diagnóstico e nas abordagens terapêuticas do câncer, a recorrência persistente e a metástase continuam a representar desafios clínicos significativos, muitas vezes comprometendo potencialmente a eficácia geral das modalidades de tratamento existentes. O CRC surge de uma interação complexa de várias etiologias, abrangendo alterações genéticas intrínsecas e influências extrínsecas, incluindo hábitos alimentares, inflamação crônica e desregulação metabólica, todos os quais contribuem significativamente para a iniciação e progressão tumoral. A hiperglicemia, uma característica do diabetes mellitus, tem sido reconhecida como um fator de risco crítico na patogênese do CRC, em grande parte devido à sua capacidade de induzir um microambiente favorável ao tumor, caracterizado por inflamação aumentada, angiogênese e estresse oxidativo.
   A hiperglicemia contribui para a tumorigênese através de vários mecanismos interconectados. Ela aumenta a formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs), que se ligam ao seu receptor celular RAGE, ativando assim vias inflamatórias a jusante, notavelmente aquelas que envolvem o fator nuclear kappa B (NF-κB). Essa ativação leva à transcrição de genes envolvidos em inflamação, proliferação e sobrevivência. No CCR, a expressão aumentada de ciclooxigenase-2 (COX-2) e prostaglandina E2 (PGE2), com níveis de expressão correlacionados com a gravidade da doença, profundidade de invasão e mau prognóstico, tem sido bem documentada. Da mesma forma, a expressão elevada de IL-6 e IL-8 também foi relatada, ambas reguladas pelo NF-κB e que promovem crescimento tumoral, angiogênese e resistência à apoptose. A ativação persistente desses mediadores inflamatórios cria um ciclo de retroalimentação positiva que sustenta condições promotoras de tumor.

Na cascata metastática, a adesão das células cancerosas às células endoteliais vasculares é uma etapa crítica. Essa adesão facilita a extravasão e colonização das células tumorais em órgãos distantes. Sabe-se que níveis elevados de glicose aumentam a expressão de moléculas de adesão, promovendo assim a fixação de células tumorais circulantes ao endotélio e aumentando o potencial metastático. Interromper esses eventos facilitadores da adesão representa uma estratégia terapêutica promissora para limitar a disseminação do câncer.

Agentes naturais, particularmente aqueles derivados de plantas medicinais tradicionais, têm ganhado crescente interesse como agentes terapêuticos complementares ou alternativos em oncologia. O gengibre (Zingiber officinale), uma especiaria amplamente consumida com uma longa história na medicina tradicional, exibe diversas bioatividades, incluindo propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e anticancerígenas robustas. A literatura científica contém inúmeros relatos elucidando essas propriedades medicinais e atribuindo-as à rica composição de polifenóis, flavonoides e princípios pungentes característicos conhecidos como gingeróis. Estudos primários extensos destacaram o potente potencial anticancerígeno de extratos aquosos e orgânicos de gengibre contra o CCR. Especificamente, compostos fenólicos ativos como 6-, 8- e 10-gingerol, juntamente com shogaóis e paradóis, foram extensivamente documentados por sequestrar espécies reativas de oxigênio, modular cascatas inflamatórias (ex.: NF-κB e MAPK), inibir a proliferação de células tumorais e induzir apoptose em modelos celulares de CCR. A eficácia desses extratos, no entanto, é altamente dependente do método de preparação, que influencia diretamente a estabilidade, integridade estrutural e concentração dos metabólitos bioativos enriquecidos. Além disso, embora as propriedades anti-inflamatórias de base desses fitoquímicos sejam bem estabelecidas, sua eficácia farmacológica específica sob as condições de estresse metabólico severo de um microambiente tumoral hiperglicêmico permanece em grande parte inexplorada.
Solventes eutéticos naturais profundos (NaDES) emergiram recentemente, por meio de avanços na química verde, como alternativas sustentáveis aos solventes orgânicos convencionais para extração de plantas. Os NaDES são compostos por metabólitos naturais, como betaína, ácido lático e açúcares, e oferecem alta eficiência de extração, baixa toxicidade e compatibilidade ambiental. Os NaDES podem preservar a integridade funcional de fitoquímicos sensíveis, ao mesmo tempo que aumentam sua solubilidade e biodisponibilidade. Da mesma forma, a fermentação, um processo há muito utilizado na ciência de alimentos, pode biotransformar fitoquímicos em formas mais bioativas ou biodisponíveis. O gengibre fermentado microbiologicamente, especialmente com espécies de Lactobacillus, aumenta a atividade antioxidante e modula o perfil fitoquímico — como facilitar a biotransformação de gingeróis no altamente potente 6-shogaol — em direção a um potencial terapêutico aprimorado.

Em nossos estudos anteriores, desenvolvemos um extrato fermentado de gengibre com NaDES (FNGE) e demonstramos sua citotoxicidade seletiva contra células de CCR resistentes a medicamentos, poupando simultaneamente a mucosa colônica normal. Com base nesses achados, o presente estudo explora o impacto funcional do FNGE em processos patogênicos chave no CCR sob estresse hiperglicêmico. Especificamente, examinamos seus efeitos na produção de mediadores inflamatórios, ativação do NF-κB e adesão de células de CCR a células endoteliais. Investigamos se o FNGE pode atenuar a progressão do CCR impulsionada pela inflamação, fornecendo insights mecanísticos sobre seu potencial em condições semelhantes ao diabetes. Embora o eixo NF-κB/COX-2 seja uma via inflamatória bem conhecida no CCR generalizado, sua hiperativação específica impulsionada pela hiperglicemia sustentada continua sendo um desafio clínico crítico. Portanto, a novidade deste estudo reside no uso de uma plataforma de biotecnologia de extração verde (NaDES acoplado à fermentação) para interceptar especificamente esse processo de adesão inflamatória mediado pelo metabolismo.

2. Materiais e Métodos

2.1. Materiais

Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal bovino (FBS), antibióticos e outros reagentes para cultura de células foram adquiridos da Gibco (Grand Island, NY, EUA). Pó de gengibre foi obtido da Kemyth Biotech Co., Ltd. (Cidade de Taipei, Taiwan). Ditiocarbamato de pirrolidina (PDTC), betaína, ácido D,L-lático e outros produtos químicos de grau analítico foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

2.2. Preparação do Extrato Fermentado de Gengibre com NaDES (FNGE)
Os NaDES utilizados neste estudo foram preparados seguindo nossa metodologia anterior. Betaína e ácido D,L-láctico foram combinados em uma proporção molar de 1:2 e aquecidos a 60 °C por 1 h, seguido pela adição de água deionizada em uma proporção molar final de 1:2:2,5 (betaína–ácido láctico–água). O pó de gengibre foi misturado com o NaDES em uma proporção sólido-líquido de 1:15, e a extração assistida por ultrassom foi realizada a 200 W por 15 min. O extrato resultante foi filtrado e centrifugado. Antes da fermentação, o pH foi ajustado para 6,0. O extrato foi então inoculado com uma cepa probiótica selecionada, Lactobacillus reuteri, adquirida da coleção de culturas da Universidade Nacional de Chiayi (Chiayi, Taiwan). O inóculo inicial foi de aproximadamente 5% v/v, e a mistura foi incubada a 37 °C sob condições anaeróbicas por 48 h. Após a fermentação, a contagem bacteriana viável atingiu aproximadamente 1 × 10⁹ UFC/mL, e o pH final diminuiu naturalmente para aproximadamente 3,8–4,2. O FNGE foi filtrado (0,22 μm) para remover as células bacterianas, aliquotado e armazenado a −20 °C no escuro. Para garantir a consistência experimental e eliminar a variação entre lotes, um único lote agrupado de FNGE foi utilizado para todos os ensaios funcionais e mecanicistas neste estudo. A otimização e as vantagens específicas desta formulação de FNGE, incluindo sua superioridade na extração fitoquímica e biotransformação em comparação com extratos de gengibre não fermentados e extratos com solventes convencionais, foram estabelecidas de forma abrangente e detalhada em nosso estudo fundamental. Além disso, para descartar absolutamente a interferência do solvente nos ensaios funcionais atuais, apenas o NaDES (sem extração de gengibre) foi similarmente diluído no meio de cultura e utilizado como controle veicular. Nossas avaliações de controle confirmaram que este veículo NaDES diluído não apresentou atividade biológica basal nem afetou a viabilidade celular.
2.3. Cultura de Células
A linhagem celular de CCR humano DLD-1 foi fornecida pelo Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Indústria Alimentar de Taiwan e mantida em DMEM suplementado com 10% de SBF a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO₂. Microambientes normoglicêmicos e hiperglicêmicos foram simulados in vitro cultivando as células em meios contendo 5,5 mM ou 25 mM de D-glicose, respectivamente. A concentração de 5,5 mM reflete os níveis fisiológicos padrão de glicemia de jejum. A concentração de 25 mM foi selecionada para mimetizar a hiperglicemia clínica grave característica do diabetes mellitus mal controlado. Esta concentração elevada de glicose é um modelo in vitro amplamente aceito e rigorosamente validado para induzir estresse metabólico, hiperativar vias inflamatórias e investigar a interseção entre distúrbios metabólicos e progressão do câncer.
2.4. Ensaio de Viabilidade Celular
A viabilidade das células DLD-1 foi avaliada usando o ensaio MTT. As células foram semeadas a uma densidade de 5 × 10³ células/poço em placas de 96 poços e tratadas com FNGE por 24 h. Posteriormente, MTT (0,5 mg/mL) foi adicionado e incubado por 4 h. Os cristais de formazan resultantes foram dissolvidos em DMSO, e a absorbância foi medida a 570 nm usando um espectrofotômetro.
2.5. Ensaio de Adesão Celular
A adesão das células DLD-1 a células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foi avaliada por meio de um ensaio colorimétrico padronizado. Resumidamente, as células DLD-1 foram cultivadas durante a noite em meio com soro em baixas concentrações e subsequentemente estimuladas com glicose alta. As células (2 × 10⁵ células/mL) foram então co-cultivadas com HUVECs, após o que as células não aderentes foram removidas por lavagem suave com solução salina tamponada com fosfato. As células aderentes restantes foram fixadas com glutaraldeído a 1,0% e coradas com violeta cristal a 0,1% por 15 min. O excesso de corante foi removido por lavagem com água estéril, e as células coradas foram solubilizadas durante a noite em Triton X-100 a 0,1%. A adesão celular foi quantificada medindo a absorbância a 595 nm em um espectrofotômetro. A absorbância foi normalizada subtraindo a absorbância de fundo obtida de HUVECs coradas com violeta cristal cultivadas sozinhas.
2.6. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (PCR)
O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol, e o cDNA foi sintetizado a partir de 1 μg de RNA. A expressão gênica foi analisada usando qRT-PCR baseada em SYBR Green com primers específicos para COX-2 (forward: 5′-CAC TAC ATC CTG ACC CAC TT-3′, reverse: 5′-ATG CTC CTG CTT GAG TAT GT-3′), IL-6 (forward: 5′-ACT CAC CTC TTC AGA ACG AAT TG-3′, reverse: 5′-CCA TCT TTG GAA GGT TCA GGT TG-3′), IL-8 (forward: 5′-ACT GAG AGT GAT TGA GAG TGG AC-3′, reverse: 5′-AAC CCT CTG CAC CCA GTT TTC-3′) e GAPDH (forward: 5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3′, reverse: 5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′). Os níveis de expressão foram calculados usando o método 2−ΔΔCt. Cada experimento foi realizado em triplicata.
2.7. Transfecção de siRNA
siRNAs específicos e controle foram sintetizados pela Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EUA). As células DLD-1 foram transfectadas com 200 nM de siRNA usando Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A eficiência da transfecção foi verificada por análises de mRNA e proteína.
2.8. Ensaio de Atividade do Fator de Transcrição Nuclear Factor-κB p65
Extratos nucleares das células foram preparados usando um kit comercial (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA). A atividade de NF-κB p65 foi medida usando um ensaio de fator de transcrição baseado em ELISA conforme descrito anteriormente, e a absorbância foi medida a 450 nm.
2.9. Análise Estatística
Todos os dados quantitativos são expressos como média ± erro padrão da média (EPM). A reprodutibilidade foi rigorosamente garantida pela condução de todos os experimentos de forma independente, no mínimo três vezes, para constituir réplicas biológicas independentes (n ≥ 3), utilizando passagens celulares distintas. Dentro de cada réplica biológica independente, as avaliações quantitativas (incluindo RT-qPCR, ELISA e ensaios de adesão celular) foram realizadas em triplicatas técnicas. As avaliações estatísticas foram conduzidas utilizando o software SigmaPlot (versão 10.0; Systat Software, San Jose, CA, EUA). Para comparações envolvendo mais de dois grupos, foi utilizada a análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida pelo teste post hoc de Tukey. Para maximizar a transparência dos dados e representar visualmente os tamanhos de efeito e a variância, os gráficos de barras quantitativos são apresentados com pontos de dados individuais sobrepostos. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
3. Resultados
3.1. O Extrato Fermentado de NaDES–Gengibre Atenua a Expressão de COX-2 e a Produção de PGE2 Induzidas por Alta Concentração de Glicose
Para garantir que os efeitos anti-inflamatórios observados não fossem meramente secundários a um estresse citostático sutil ou morte celular, a citotoxicidade do FNGE em células DLD-1 foi primeiramente avaliada utilizando um ensaio de MTT. Os resultados confirmaram que o tratamento com FNGE em concentrações variando de 5 a 25 μg/mL não exerceu efeitos citotóxicos significativos (Figura Suplementar S1A). Observações morfológicas confirmaram que as células cultivadas dentro dessa faixa de concentração apresentaram crescimento saudável e aderente, sem quaisquer sinais de estresse celular (Figura Suplementar S1B). Tendo estabelecido e justificado essa faixa de trabalho não tóxica, descobrimos subsequentemente que o tratamento com FNGE atenuou significativa e dose-dependentemente a expressão de mRNA e proteína de COX-2 induzida por alta concentração de glicose em células DLD-1. Em comparação com o grupo estimulado por alta concentração de glicose, o co-tratamento com FNGE (5–25 μg/mL) resultou em uma diminuição acentuada no transcrito de COX-2, bem como nos níveis proteicos (Figura 1A,B). Concomitantemente, a secreção de PGE2 no meio de cultura foi reduzida significativamente após o tratamento com FNGE na mesma faixa de concentração (Figura 1C). Esses resultados demonstram que o FNGE neutraliza efetivamente a ativação do eixo COX-2/PGE2 impulsionada pela hiperglicemia, destacando sua capacidade anti-inflamatória em modelos de células de CCR.
3.2. O Extrato Fermentado de NaDES–Gengibre Reduz a Expressão de IL-6 e IL-8 em Células de Câncer Colorretal Expostas a Alta Concentração de Glicose
A estimulação por glicose elevada aumentou marcadamente a transcrição de citocinas pró-inflamatórias, elevando os níveis de mRNA de IL-6 (Figura 2A) e IL-8 (Figura 2B) em células DLD-1 em 6,6 vezes e 4,1 vezes, respectivamente, em comparação com controles normoglicêmicos. O tratamento com FNGE (5–25 μg/mL) suprimiu esses aumentos transcricionais de maneira dose-dependente. Notavelmente, na dose mais alta testada (25 μg/mL), o FNGE restaurou quase completamente os níveis de expressão de ambas as citocinas aos valores basais. Esses achados validam ainda mais a eficácia do FNGE em mitigar as respostas inflamatórias induzidas pela hiperglicemia.

3.3. Extrato Fermentado de NaDES–Gengibre Inibe a Adesão de Células de Câncer Colorretal às Células Endoteliais sob Condições Hiperglicêmicas

O impacto funcional do FNGE no potencial metastático foi avaliado através da capacidade de adesão das células DLD-1 às monocamadas de HUVEC. Conforme ilustrado na Figura 3, a exposição à glicose elevada aumentou significativamente a adesão das células DLD-1. No entanto, o pré-tratamento com FNGE aboliu esse comportamento adesivo induzido por glicose elevada de forma eficaz e dose-dependente. Isso sugere que o FNGE interrompe interações cruciais entre células CRC e endoteliais, impedindo potencialmente os estágios iniciais da metástase sob condições hiperglicêmicas.

3.4. O Silenciamento de COX-2 Suprime a Produção de PGE2 e Atenua a Adesão de Células de Câncer Colorretal às Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana

O papel específico da COX-2 nesse processo adesivo foi delineado através da transfecção de células DLD-1 com siRNA específico para COX-2. Primeiro, verificamos a eficácia funcional do silenciamento gênico, demonstrando que o knockdown direcionado de COX-2 suprimiu significativamente a produção de PGE2 induzida por glicose elevada (Figura 4A). Após essa validação, ensaios de adesão subsequentes revelaram que o silenciamento de COX-2 reduziu drasticamente a adesão induzida por glicose elevada das células DLD-1 às HUVECs (Figura 4B). Esses achados ligam firmemente o eixo COX-2/PGE2 à adesão metastática e validam a COX-2 como um efetor downstream crítico modulado pela ação antimetastática do FNGE.

3.5. Extrato Fermentado de NaDES–Gengibre Suprime a Ativação de NF-κB em Células de Câncer Colorretal

Os mecanismos moleculares upstream foram elucidados avaliando se o FNGE tem como alvo a via de NF-κB para exercer seus efeitos protetores. De fato, o tratamento com FNGE reduziu significativamente e de forma dose-dependente a atividade de NF-κB p65 em células DLD-1 expostas à glicose elevada (Figura 5A). Para corroborar ainda mais esse achado em nível proteico, a análise de Western blot revelou que o FNGE inibiu efetivamente a fosforilação da subunidade p65 de NF-κB induzida por glicose elevada (Figura 5B). Esse efeito inibitório pronunciado está alinhado com as reduções observadas na expressão de mediadores pró-inflamatórios e na adesão celular. Em conjunto, esses resultados confirmam que a eficácia terapêutica do FNGE na progressão do CCR associada à hiperglicemia está mecanicamente enraizada em sua capacidade de suprimir a cascata de sinalização de NF-κB.
3.6. O Fator Nuclear-κB Medeia a Inflamação e Adesão Induzidas por Glicose Elevada em Células de Câncer Colorretal
Para verificar conclusivamente que a supressão do NF-κB é diretamente responsável por reverter esses fenótipos patogênicos, células DLD-1 foram tratadas com o inibidor de NF-κB PDTC. Consistente com os efeitos do FNGE, a inibição farmacológica do NF-κB aboliu robustamente a regulação positiva da expressão de COX-2 induzida por glicose elevada (Figura 6A) e concomitantemente reduziu a adesão das células DLD-1 às HUVECs (Figura 6B). Esses achados estabelecem o NF-κB como o mediador upstream pivotal que impulsiona os processos inflamatórios e adesivos em células de CCR estressadas por hiperglicemia, validando ainda mais como o alvo funcional primário do FNGE.
4. Discussão
O CCR continua sendo um desafio formidável para a saúde global, principalmente devido à sua alta propensão à recorrência e metástase. A hiperglicemia, uma marca das doenças metabólicas como o diabetes mellitus, tem sido cada vez mais reconhecida como um fator crítico de exacerbação na progressão do CCR. Ela estabelece um microambiente pró-tumorigênico ao impulsionar o estresse oxidativo, amplificar a sinalização inflamatória e facilitar as interações patogênicas entre células cancerígenas e células endoteliais. No presente estudo, fornecemos evidências convincentes de que um extrato de gengibre fermentado em solvente eutético natural profundo (FNGE) — preparado usando uma plataforma de extração verde e sustentável — exibe profundas propriedades anti-inflamatórias e antiadesivas em células de CCR submetidas ao estresse hiperglicêmico. Esses achados avançam significativamente nossa compreensão dos mecanismos terapêuticos do FNGE, apoiando seu futuro desenvolvimento como uma modalidade anticancerígena complementar.
A inflamação crônica é uma marca registrada do microambiente tumoral impulsionado pela hiperglicemia. Nosso estudo demonstra que o tratamento com FNGE suprime significativamente a robusta regulação positiva do eixo de sinalização COX-2/PGE2 em células DLD-1 estimuladas por glicose elevada. A superexpressão de COX-2 em tumores colorretais é clinicamente bem documentada e está profundamente implicada na condução da progressão tumoral por meio da promoção da proliferação celular, evasão da apoptose e indução da angiogênese. Importante, nossos dados revelam que o FNGE atenua esse eixo tanto nos níveis transcricional (mRNA de COX-2) quanto translacional (proteína COX-2), consequentemente inibindo a síntese de seu mediador lipídico downstream, a PGE2. Essa inibição dose-dependente está alinhada com estudos anteriores que sugerem que compostos bioativos derivados do gengibre, como 6-shogaóis e compostos fenólicos relacionados, atuam como potentes moduladores de enzimas inflamatórias. Além da via COX-2, o FNGE também atenuou marcadamente a transcrição de duas citocinas pró-inflamatórias essenciais, IL-6 e IL-8. Dado que a IL-6 promove a sobrevivência das células cancerígenas e a evasão imunológica, enquanto a IL-8 orquestra respostas angiogênicas e quimiotáticas locais, a capacidade do FNGE de suprimir simultaneamente esses mediadores ressalta sua ampla capacidade de interromper os loops inflamatórios autócrinos e parácrinos que sustentam a agressividade tumoral.

Igualmente importante é o efeito inibitório observado do FNGE na adesão de células CRC à monocamada endotelial. A adesão de células tumorais ao endotélio vascular é uma etapa inicial obrigatória na cascata metastática, facilitando a ancoragem de células cancerígenas circulantes em leitos vasculares distantes e iniciando a extravasão. Embora se saiba que a hiperglicemia regula positivamente as moléculas de adesão e acelera a disseminação metastática, nosso modelo in vitro demonstrou que o pré-tratamento com FNGE efetivamente aboliu o comportamento hiperadesivo induzido por glicose elevada das células DLD-1 em direção às HUVECs. Mais notavelmente, por meio do silenciamento genético direcionado, demonstramos que a ablação de COX-2 não apenas suprimiu a produção de PGE2, mas também diminuiu diretamente a adesão celular. Extensa literatura indica que a ativação do eixo COX-2/PGE2 induzida por hiperglicemia regula positivamente moléculas de adesão como ICAM-1 e VCAM-1 na superfície das células endoteliais. Ao regular negativamente esse eixo upstream, o FNGE priva o microambiente dos sinais necessários para sustentar essas moléculas de adesão. Essa validação mecanicista destaca um papel anteriormente subestimado do eixo COX-2/PGE2 na regulação das interações CRC-células endoteliais sob estresse metabólico, confirmando esse eixo como uma vulnerabilidade crítica efetivamente alvejada pela ação antimetastática do FNGE.
Para fornecer uma justificativa bioquímica para esses profundos efeitos anti-inflamatórios e antiadesivos, é essencial considerar o perfil fitoquímico estabelecido de nossa formulação FNGE estritamente padronizada. Conforme caracterizado de forma abrangente por HPLC em nosso estudo metodológico fundamental, a fermentação do gengibre em NaDES facilita significativamente a biotransformação dos metabólitos do gengibre, levando a um enriquecimento acentuado no teor fenólico total e no composto bioativo altamente potente, 6-shogaol. A literatura extensa estabeleceu que o 6-shogaol e outros antioxidantes fenólicos atuam como inibidores excepcionalmente potentes da cascata de sinalização NF-κB, prevenindo efetivamente sua ativação e subsequentemente regulando negativamente a expressão de COX-2 e PGE2. Além disso, esses antioxidantes enriquecidos são amplamente relatados por mitigar o estresse oxidativo e a inflamação endotelial, que são fatores críticos na patogênese em microambientes hiperglicêmicos. Embora nossa análise anterior também tenha observado aumentos significativos em metabólitos biotransformados específicos, atualmente não caracterizados, após a fermentação, a presença firmemente estabelecida de 6-shogaol e constituintes fenólicos totais elevados fornece uma base molecular robusta para nossas descobertas. A interação sinérgica desses fitoquímicos enriquecidos corrobora diretamente a supressão farmacológica da adesão célula tumoral-endotelial induzida por hiperglicemia observada em nosso modelo DLD-1.
O NF-κB emergiu como o centro transcricional central coordenando essas respostas patogênicas. Observamos fosforilação robusta e ativação transcricional da subunidade p65 do NF-κB em condições de alta glicose, o que coincidiu com os aumentos fenotípicos na expressão de COX-2, IL-6 e IL-8, juntamente com adesão celular aumentada. O tratamento com FNGE reverteu esses eventos moleculares de forma dose-dependente, indicando seu potente papel como repressor do NF-κB.

O papel indispensável do NF-κB foi ainda verificado usando o inibidor farmacológico PDTC, que mimetizou os efeitos protetores do FNGE ao abolir marcadamente a expressão de COX-2 induzida por alta glicose e prejudicar a adesão de células de CCR. No entanto, o PDTC não é um inibidor exclusivamente específico do NF-κB; conforme documentado na literatura, ele também possui potentes propriedades antioxidantes e quelantes de metais. Especificamente, o PDTC pode sequestrar íons de metais de transição, que servem como cofatores essenciais para várias enzimas sensíveis a redox e moléculas de sinalização. Dado que a hiperglicemia está intrinsecamente ligada à geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) e à mobilização de íons metálicos intracelulares, esses efeitos pleiotrópicos também podem contribuir para os resultados observados. Consequentemente, o PDTC pode exercer seus efeitos protetores através de uma combinação de supressão do NF-κB e modulação mais ampla da sinalização oxidativa dependente de metais.

No entanto, a robustez de nossa afirmação mecanicista é significativamente fortalecida pelo fato de que os fenótipos antiadesivos observados com PDTC foram refletidos de perto pelo knockdown altamente específico de COX-2 usando siRNA (Figura 4). Essa convergência de evidências farmacológicas e genéticas sugere fortemente que, independentemente dos efeitos auxiliares do PDTC, a supressão do eixo NF-κB/COX-2 continua sendo um mecanismo pivotal através do qual o FNGE exerce seus efeitos. Em conjunto, esses insights mecanicistas sugerem fortemente que as atividades anti-inflamatórias e antiadesivas do FNGE são orquestradas principalmente através da profunda regulação negativa da cascata de sinalização do NF-κB, interrompendo assim efetivamente a ligação inflamação-metástase.
Embora nossos achados demonstrem claramente a supressão desta cascata clássica NF-κB/COX-2 pelo FNGE, a complexidade do microambiente tumoral sugere que reguladores upstream provavelmente estão envolvidos. Por exemplo, a glicose elevada induz o acúmulo de AGEs e desencadeia espécies reativas de oxigênio (ROS), ambas ativadoras upstream do NF-κB. Futuros estudos baseados em ômicas, incluindo transcriptômica e proteômica direcionada, são necessários para mapear as redes de sinalização mais amplas, como o eixo RAGE/ROS e vias alternativas das MAP quinases, moduladas por esta mistura fitoquímica única. Além da supressão direta do eixo NF-κB/COX-2, o potencial terapêutico dos bioativos derivados do gengibre no FNGE pode envolver uma rede regulatória mais ampla. Evidências recentes sugerem que fitoquímicos naturais de plantas medicinais exibem propriedades anticancerígenas multifacetadas ao modular simultaneamente a sinalização inflamatória, o estresse oxidativo e as vias apoptóticas. Especificamente, a atenuação de mediadores pró-inflamatórios frequentemente se correlaciona com níveis reduzidos de ROS intracelulares, o que pode sensibilizar ainda mais as células de CCR a estímulos apoptóticos e restringir sua plasticidade metastática. Embora o presente estudo se concentre principalmente na capacidade antiaderente do FNGE, é altamente plausível que a inibição do eixo COX-2/PGE2 contribua para um reequilíbrio mais amplo do microambiente inflamatório promotor de tumor. Tais interseções mecanísticas reforçam o potencial translacional do FNGE como uma estratégia multi-alvo para suprimir a progressão agressiva de tumores sólidos, particularmente sob o estresse metabólico da hiperglicemia.
Além disso, embora o estudo atual se concentre em mecanismos patogênicos sob estresse hiperglicêmico, ele se baseia no fundamento tecnológico estabelecido em nosso trabalho anterior. Demonstramos anteriormente que a combinação específica da extração verde com NaDES e fermentação microbiana enriquece superiormente os gingeroides bioativos em comparação com métodos de extração convencionais não fermentados ou aquosos/etanólicos. Assim, a aplicação desta formulação otimizada e de alta eficiência de FNGE nos permitiu investigar seletivamente seus efeitos anti-inflamatórios avançados no modelo metabólico de CCR sem a influência confundente de rendimentos de extração subótimos.
Do ponto de vista translacional, a implementação de NaDES para a extração de gengibre representa um paradigma altamente inovador e ecológico. Diferentemente dos solventes orgânicos voláteis convencionais, o NaDES é composto por metabólitos naturais não tóxicos que maximizam a eficiência de extração, preservando a integridade estrutural e potencialmente aumentando a biodisponibilidade de fitoquímicos sensíveis. Além disso, a fermentação microbiana usando Lactobacillus reuteri biotransforma e enriquece o perfil farmacológico do extrato. Conforme relatado anteriormente, tal biotransformação microbiana pode gerar metabólitos secundários com bioatividade superior e cinética de absorção melhorada.
Para concretizar plenamente o potencial de tradução clínica destes bioativos naturais, estudos futuros devem explorar estratégias avançadas de formulação. Conforme destacado na literatura recente, a integração de fitoquímicos bioativos com sistemas de entrega auxiliados por nanoformulações ou abordagens combinatórias pode superar significativamente as barreiras intrínsecas de biodisponibilidade e maximizar o desempenho terapêutico na terapia do câncer. Desenvolver o FNGE em tais plataformas de entrega especializadas poderia facilitar a liberação direcionada de gingeroides no cólon, maximizando assim a eficácia anti-inflamatória e minimizando as flutuações sistêmicas.

Embora os robustos efeitos anti-inflamatórios e antiadesivos tenham sido demonstrados neste estudo, esta pesquisa possui certas limitações que merecem consideração. Primeiro, as avaliações mecanísticas in vitro foram conduzidas principalmente utilizando uma única linhagem celular de CCR (DLD-1). Os tumores colorretais são altamente heterogêneos, e diferentes linhagens celulares possuem paisagens mutacionais distintas (por exemplo, mutações KRAS ou PIK3CA observadas em células HCT116 ou SW480) que podem influenciar sua plasticidade metabólica e responsividade a intervenções fitoquímicas. Portanto, estudos futuros devem validar a generalizabilidade da supressão de NF-κB/COX-2 mediada por FNGE em um painel mais amplo de linhagens celulares de CCR. Segundo, embora o perfil de segurança e a ausência de citotoxicidade do FNGE em relação às células epiteliais do cólon normais não cancerosas tenham sido amplamente estabelecidos em nossa investigação anterior, o estudo atual se concentra exclusivamente nas interações entre células cancerosas e células endoteliais. A plena aplicabilidade translacional desses achados requer, portanto, confirmação adicional usando sistemas de cocultura complexos ou modelos animais de CCR diabético in vivo. Terceiro, embora nossos ensaios de knockdown direcionado e inibição farmacológica demonstrem claramente que o eixo NF-κB/COX-2 é funcionalmente necessário para os fenótipos observados, a sequência causal precisa ainda precisa ser definitivamente estabelecida. Estudos futuros empregando modelos específicos de resgate, como suplementação exógena de PGE2 ou ativação constitutiva de p65, são necessários para determinar se a restauração dessa via abole completamente os benefícios antiadesivos do FNGE. Finalmente, devido a restrições práticas, o perfil fitoquímico por LC-MS/MS ou HPLC específico do lote não foi realizado no presente estudo; portanto, a base química depende do protocolo de extração estritamente padronizado validado em nosso trabalho fundamental anterior.
Em resumo, este estudo in vitro fornece uma justificativa bioquímica robusta para explorar o FNGE como uma potencial intervenção para o CCR, particularmente para pacientes com comorbidades metabólicas, como diabetes mellitus. Ao suprimir de forma abrangente o eixo NF-κB/COX-2, o FNGE simultaneamente mitiga a inflamação promotora de tumores e interrompe a adesão celular metastática precoce. Futuras investigações in vivo utilizando modelos complexos de CCR diabético são fortemente necessárias para validar esses achados celulares, avaliar a segurança sistêmica e explorar a potencial eficácia sinérgica do FNGE em combinação com regimes quimioterápicos padrão ou direcionados.

5. Conclusões
   O presente estudo in vitro demonstra que a formulação de FNGE estritamente padronizada atenua efetivamente as respostas inflamatórias impulsionadas pela hiperglicemia e a adesão celular em células de CCR. Baseada em nossa metodologia fundamental, o enriquecimento estabelecido da formulação em 6-shogaol e antioxidantes fenólicos fornece uma justificativa bioquímica robusta para essas observações funcionais. Verificamos que o FNGE suprime de forma dose-dependente a expressão de mediadores pró-inflamatórios e prejudica a adesão célula tumoral–célula endotelial, principalmente através da regulação negativa do eixo de sinalização NF-κB/COX-2. Em última análise, esses achados fornecem evidências mecanísticas fundamentais para interceptar a metástase exacerbada pelo estresse metabólico, destacando o potencial translacional desta plataforma de extração verde, ao mesmo tempo que enfatizam a necessidade de validação futura in vivo.

Embora esses achados destaquem o potencial farmacológico da integração da extração verde com NaDES e fermentação microbiana, reconhecemos que as evidências atuais são limitadas a modelos celulares. Portanto, os resultados devem ser interpretados como evidências mecanísticas fundamentais e não como uma estratégia terapêutica direta. Investigações in vivo abrangentes precisam ser conduzidas para estabelecer a aplicabilidade translacional do FNGE, avaliar sua biodisponibilidade sistêmica, perfil de segurança e eficácia em diversos contextos genéticos. Além disso, a exploração de estratégias avançadas, como a entrega assistida por nanoformulação, será essencial para preencher a lacuna entre esses achados celulares e seu potencial futuro como intervenções funcionais para malignidades metabolicamente impulsionadas.

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Materiais Suplementares
As seguintes informações complementares podem ser baixadas em: , Figura S1: Avaliação da viabilidade celular e morfologia em células DLD-1 tratadas com FNGE. (A) Viabilidade celular (%) de células DLD-1 tratadas com extrato fermentado de NaDES–gengibre (FNGE) em concentrações variando de 5 a 25 μg/mL. Nenhum efeito citotóxico significativo foi observado em comparação ao grupo controle. (B) Observações morfológicas representativas de células DLD-1 no grupo controle (CL) e naquelas tratadas com 25 μg/mL de FNGE. As células exibiram crescimento saudável e aderente com morfologia típica, sem sinais de estresse celular. Os dados são apresentados como média ± EPM de três experimentos independentes..
Contribuições dos Autores
K.-L.W.: Conceituação, curadoria de dados, investigação e redação—rascunho original. S.-F.C.: Metodologia, redação—rascunho original, curadoria de dados. C.-N.C. e K.-C.L.: Aquisição de financiamento, supervisão, redação—revisão e edição. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Conselho de Revisão Institucional
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados que apoiam os achados do presente estudo estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Referências
Estatísticas globais de câncer 2020: estimativas GLOBOCAN de incidência e mortalidade mundial para 36 tipos de câncer em 185 países
Novas estratégias para reverter a quimiorresistência no câncer colorretal
Mecanismos moleculares da progressão e metástase do câncer de cólon: insights e avanços recentes
Diabetes e risco de câncer colorretal: implicações clínicas e terapêuticas
Papel dos antioxidantes naturais no câncer
O papel da ciclooxigenase-2 no câncer colorretal
IL-6 e IL-8, secretadas por miofibroblastos no microambiente tumoral, ativam HES1 para expandir a população de células-tronco cancerígenas no tumor colorretal inicial
Uma triagem de alto conteúdo identifica medicamentos que restringem a extravasação de células tumorais através da barreira endotelial
A metformina inibe o desenvolvimento e a metástase do câncer colorretal
Mecanismos de ação de fitoquímicos de frutas e vegetais na prevenção do câncer colorretal
Efeitos vasculoprotetores do gengibre (Zingiber officinale Roscoe) e mecanismos moleculares subjacentes
Componentes farmacodinâmicos e mecanismos do gengibre (Zingiber officinale) na prevenção e tratamento do câncer colorretal
8-Gingerol regula a proliferação e migração de células de câncer colorretal através da via EGFR/STAT/ERK
6-Shogaol inibe a migração celular do câncer de cólon suprimindo o processo EMT através da via IKKβ/NF-κB/Snail
Solventes eutéticos profundos naturais na extração de fitonutrientes e outras aplicações
Progresso atual em solventes eutéticos profundos naturais para extração de componentes ativos de plantas
Inibição do NLRP3 pela quercetina fermentada diminui a quimiorresistência induzida por resistina ao 5-fluorouracil em células de câncer colorretal humano
Extrato de gengibre fermentado em solvente eutético natural profundo aumenta a citotoxicidade ao inibir a expressão do receptor de quimiocina CXC 4 mediada por NF-κB em células de câncer colorretal humano resistentes à oxaliplatina

O estresse oxidativo induzido por hiperglicemia promove a metástase tumoral ao regular positivamente a expressão de vWF em células endoteliais através do fator de transcrição GATA1

O 6-Shogaol antagoniza a resistência à 5-fluorouracila iniciada pelo meio condicionado de adipócitos em células de câncer colorretal humano através do controle do nível de SREBP-1

O ácido fúlvico atenua a adesão induzida por resistina de células de câncer colorretal HCT-116 a células endoteliais

Resistência ao CPT-11 em células de câncer colorretal humano DLD-1 através da regulação positiva do homólogo MutS 2

Carga global do câncer colorretal em 2020 e 2040: Estimativas de incidência e mortalidade do GLOBOCAN

Genes regulados pela ciclooxigenase-2: Uma via alternativa para o desenvolvimento de novos fármacos terapêuticos para o câncer colorretal

Potencial imunomodulador do 6-gingerol e 6-shogaol no extrato de Zingiber officinale fermentado por Lactobacillus plantarum em macrófagos murinos

Direcionamento do eixo de sinalização IL-6/JAK/STAT3 no câncer

O papel da IL-8 no desenvolvimento do câncer e seu impacto na resistência à imunoterapia

Princípios moleculares da metástase: Um marco do câncer revisitado

O papel da reprogramação metabólica na metástase do câncer e o potencial mecanismo de intervenção da medicina tradicional chinesa

A ligação entre anormalidades metabólicas e disfunção endotelial no diabetes tipo 2: Uma atualização

A hiperosmolaridade induzida por glicose alta contribui para a expressão de COX-2 e angiogênese: Implicações para a retinopatia diabética

O gingerol e/ou sorafenibe atenua o CHC induzido por DAB e a dilatação da veia porta hepática via expressão de ATG4/CASP3 e COIIV/COX-2/NF-kappaB

Efeito anti-inflamatório e protetor renal do gingerol em ratos diabéticos induzidos por dieta rica em gordura/estreptozotocina via mecanismo inflamatório

Extrato de Raiz de Gengibre Melhora a Saúde Gastrointestinal em Ratos Diabéticos ao Melhorar a Integridade Intestinal e a Função Mitocondrial

PDTC, composto quelante de metais, induz a parada do ciclo celular na fase G1 em células musculares lisas vasculares através da indução da expressão de p21Cip1: Envolvimento da proteína quinase ativada por mitogênio p38

Prunina: Um Flavonoide Anticancerígeno Emergente

Fitoquímicos como Agentes Quimiopreventivos e Moduladores de Moléculas Sinalizadoras: Papel Atual na Terapêutica do Câncer e Inflamação

Fermentação bacteriana de ácido lático como estratégia de biotransformação para aumentar a biodisponibilidade de antioxidantes fenólicos em frutas e vegetais: Uma revisão abrangente

Isorhamnetina: Revisando Desenvolvimentos Recentes em Mecanismos Anticancerígenos e Liberação por Nanoformulação
(A) Níveis de expressão relativa do mRNA de COX-2 em células DLD-1 tratadas com glicose alta (HG) e concentrações crescentes de extrato fermentado de gengibre com NaDES (FNGE). (B) Análise representativa de Western blot mostrando a supressão da expressão da proteína COX-2 pelo FNGE sob condições de HG de forma dose-dependente. (C) Quantificação da secreção de prostaglandina E2 (PGE2) em células DLD-1 após tratamento com HG e FNGE. O FNGE inibiu a produção de PGE2 de maneira dependente da concentração. Os dados são apresentados como média ± EPM de três experimentos independentes. * p < 0,05 em comparação com células controle; # p < 0,05 em comparação com o grupo apenas com HG.

Níveis de expressão do mRNA de (A) interleucina-6 (IL-6) e (B) IL-8 em células DLD-1 tratadas com glicose alta e várias concentrações de FNGE. A glicose alta aumentou significativamente os níveis de transcritos de IL-6 e IL-8, que foram suprimidos de forma dose-dependente pelo FNGE. Os dados são apresentados como alteração relativa (fold change) em comparação ao controle normoglicêmico. * p < 0,05 em comparação com células controle; # p < 0,05 em comparação com o grupo apenas com HG.

Quantificação da adesão de células DLD-1 a células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) após exposição à glicose alta. O tratamento com glicose alta (HG) aumentou significativamente a adesão. O pré-tratamento com FNGE reduziu a adesão induzida por HG de forma dose-dependente. Os resultados são representativos de três experimentos independentes. * p < 0,05 em comparação com células controle; # p < 0,05 em comparação com o grupo apenas com HG.

Efeito do silenciamento da ciclooxigenase-2 (COX-2) na produção de prostaglandina E2 (PGE2) e na adesão de células DLD-1 a células endoteliais da veia umbilical humana sob condições de glicose alta (HG): (A) Quantificação da secreção de PGE2 em células DLD-1 transfectadas com siRNA controle (si-CL) ou siRNA específico para COX-2 (si-COX-2). O silenciamento direcionado de COX-2 suprimiu significativamente a produção de PGE2 induzida por HG. (B) Determinação da capacidade de adesão de células DLD-1 a monocamadas de HUVEC. Células transfectadas com si-COX-2 exibiram adesão drasticamente reduzida sob estímulo de HG em comparação ao grupo controle. Esses resultados destacam o papel mediador do eixo COX-2/PGE2 na adesão metastática impulsionada por HG. * p < 0,05 em comparação com as células controle; # p < 0,05 em comparação com o grupo si-CL tratado com HG.

Efeito do extrato fermentado de gengibre com NaDES (FNGE) na ativação do NF-κB em células DLD-1 tratadas com glicose alta (HG): (A) Atividade do fator nuclear kappa B (NF-κB) p65 determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA). O FNGE inibiu de forma dose-dependente a atividade do NF-κB induzida por HG. (B) Análise representativa de Western blot demonstrando que o tratamento com FNGE suprimiu marcadamente a fosforilação de p65 (fosfo-p65) induzida por HG. A p65 total foi utilizada como controle interno. Os dados são apresentados como média ± EPM. * p < 0,05 em comparação com células controle; # p < 0,05 em comparação com o grupo apenas com HG.
Verificação do fator nuclear kappa B (NF-κB) como mediador central utilizando o inibidor farmacológico pirrolidina ditiocarbamato (PDTC). Células DLD-1 foram tratadas com PDTC sob condições de HG: (A) A inibição farmacológica do NF-κB aboliu robustamente a expressão de ciclooxigenase-2 (COX-2) induzida por HG. (B) O tratamento com PDTC reduziu concomitantemente a adesão de células DLD-1 a monocamadas de HUVEC induzida por HG. Cada barra representa média ± EPM. * p < 0,05 em comparação com as células controle; # p < 0,05 em comparação com o grupo tratado com HG.