pmid: "36844542"
title: "Estudo de Citotoxicidade da Síntese de Nanopartículas de Ouro Usando"
authors: "Malik S, Niazi M, Khan M, Rauff B, Anwar S, Amin F, Hanif R"
journal: "ACS omega"
pubdate: "2023 Feb 21"
doi: "10.1021/acsomega.2c06491"
source: "PMC Full Text"

Estudo de Citotoxicidade da Síntese de Nanopartículas de Ouro Usando

Autores

Malik S, Niazi M, Khan M, Rauff B, Anwar S, Amin F, Hanif R

Periodico

ACS omega (2023 Feb 21)

Conteudo

Estudo de Citotoxicidade da Síntese de Nanopartículas de Ouro Usando Extrato de Aloe vera, Mel e Extrato de Folha de Gymnema sylvestre
Nanopartículas de ouro (AuNPs) ganharam importância no campo da pesquisa biomédica e diagnóstico devido às suas propriedades físico-químicas únicas. Este estudo teve como objetivo sintetizar AuNPs usando extrato de Aloe vera, mel e extrato de folha de Gymnema sylvestre. Parâmetros físico-químicos para a síntese ideal de AuNPs foram determinados usando 0,5, 1, 2 e 3 mM de sal de ouro em temperaturas variadas de 20 a 50 °C. A difração de raios X foi usada para avaliar a estrutura cristalina das AuNPs, que se revelou uma estrutura cúbica de face centrada. A microscopia eletrônica de varredura e a análise de espectroscopia de raios X por dispersão de energia confirmaram o tamanho e a forma das AuNPs entre 20 e 50 nm para o Aloe vera, mel e Gymnema sylvestre, bem como nanocubos de grande porte no caso do mel, com 21–34% em peso de teor de ouro. Além disso, a espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier confirmou a presença de uma banda larga de amina (N–H) e grupos álcool (O–H) na superfície das AuNPs sintetizadas, o que as impede de aglomeração e proporciona estabilidade. Bandas largas e fracas de éter alifático (C–O), alcano (C–H) e outros grupos funcionais também foram encontradas nessas AuNPs. O ensaio de atividade antioxidante DPPH mostrou um alto potencial de sequestro de radicais livres. A fonte mais adequada foi selecionada para posterior conjugação com três fármacos anticancerígenos, incluindo 4-hidroxi Tamoxifeno, inibidor do HIF1 alfa e o Inibidor Solúvel da Guanilil Ciclase 1 H-[1,2,4] oxadiazolo [4,3-alfa]quinoxalin-1-ona (ODQ). A evidência da conjugação do fármaco peguilado com as AuNPs foi reforçada por espectroscopia ultravioleta/visível. Essas nanopartículas conjugadas com fármacos foram posteriormente testadas em células MCF7 e MDA-MB-231 quanto à sua citotoxicidade. Esses fármacos conjugados com AuNPs podem ser um bom candidato para o tratamento do câncer de mama, levando a sistemas de administração de fármacos seguros, econômicos, biocompatíveis e direcionados.
Introdução
As nanopartículas de ouro (AuNPs) são candidatos promissores para aplicações biomédicas devido às suas propriedades físico-químicas únicas. Suas aplicações incluem óptica para diagnóstico médico, propriedades radiossensibilizantes, fototérmicas e antioxidantes para terapêutica, administração direcionada de fármacos/genes, catálise, sensoriamento e condutância eletrônica, entre outras. As AuNPs como veículos de administração de fármacos podem atingir células específicas devido à sua fácil modificação de superfície, biocompatibilidade e eficiências de supressão. Vários fármacos quimioterápicos baseados em AuNPs, como Aurimune (CYT-6091), nanoclusters de prata conjugados com DNA (DNA-AgNCs), nanocompósitos de nanotubos de carbono (La(OH)₃-OxMWCNT), nanopartículas de cobre (poli T30-Cu NPs), auroshell, nanoemulsões, dendrímeros, para citar alguns, estão sendo progressivamente empregados como estratégias de tratamento.
Métodos químicos são mais frequentemente utilizados para a síntese de AuNPs. No entanto, as desvantagens dessa abordagem são o uso de compostos como etilenoglicol, ácido ascórbico e NaBH4, que resultam na produção de resíduos tóxicos durante a síntese e funcionalização de nanopartículas (NPs). Esses resíduos tóxicos podem ser prejudiciais à saúde humana através da contaminação da cadeia alimentar e do ecossistema. Portanto, nas últimas décadas, os métodos biológicos têm ganhado considerável interesse na síntese de vários tipos de NPs.

− Métodos biológicos utilizando microrganismos, compostos orgânicos, insetos e seus produtos, e mais popularmente extratos vegetais têm sido explorados devido à sua capacidade de reduzir o ácido cloroáurico (HAuCl4). Esses métodos são ecologicamente corretos, economicamente viáveis e biologicamente compatíveis. Chandran et al. utilizaram extrato de Aloe vera para produzir nanotriângulos de ouro. Os autores atribuíram a formação dos nanotriângulos à redução lenta dos íons de ouro e aos carbonilos direcionadores de forma no extrato. Talib et al. prepararam o extrato de Aloe vera, que reduziu e estabilizou as AuNPs, e estudaram suas propriedades físico-químicas sob diferentes condições fisiológicas. Eles relataram complexos estáveis em faixas de pH neutro ou ligeiramente ácido. Philip utilizou mel pela primeira vez para a produção verde de AuNPs. O autor descobriu que a redução provavelmente se devia à frutose, seguida pela estabilização proteica das NPs. Nakkala et al. produziram nanopartículas de prata e ouro usando extrato de Gymnema sylvestre. Eles descobriram que as NPs sintetizadas exibiam atividade antioxidante substancial e toxicidade contra a linhagem celular Hep2. Uma revisão detalhada de outros estudos sobre a redução baseada em plantas de nanopartículas de prata e ouro pode ser encontrada em outro lugar. Apesar de sua importância, muito poucos relatos foram apresentados sobre a síntese verde de AuNPs usando extratos vegetais. Além disso, não existe nenhum estudo comparativo sobre as fontes escolhidas como feito neste estudo. Dados excessivos estão disponíveis sobre a síntese de AuNPs a partir de fontes orgânicas, o que comprova as essencialidades associadas aos métodos orgânicos de síntese. No entanto, encontramos uma lacuna na literatura em relação aos parâmetros físico-químicos mais apropriados que são úteis para os protocolos de síntese de fontes orgânicas selecionadas. Para superar essa lacuna, este estudo focou no efeito de diferentes parâmetros, como concentração do precursor e temperatura, para obter condições otimizadas para a preparação de AuNPs com tamanho e morfologia controlados.
Neste estudo, AuNPs foram sintetizados utilizando mel cru, extratos de folhas de Gymnema sylvestre e gel de Aloe vera em diferentes temperaturas e concentrações de sais de ouro. A síntese verde de AuNPs a partir dessas fontes foi escolhida para superar limitações como citotoxicidade, alto custo e poluição ambiental. Esses parâmetros influenciam fortemente a distribuição do tamanho e da forma e, consequentemente, as propriedades físico-químicas dos NPs. Os AuNPs foram posteriormente caracterizados por espectroscopia ultravioleta-visível (UV–vis), difração de raios X (DRX), espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e microscopia eletrônica de varredura com espectroscopia de raios X por dispersão de energia (MEV–EDS), e avaliados quanto às suas propriedades antioxidantes. Finalmente, esses nanopartículas foram revestidas com polietilenoglicol (PEG), seguidas pela conjugação com três fármacos anticâncer aprovados pela FDA: 4-hidroxi Tamoxifeno, inibidor de HIF1-α e ODQ, e seus efeitos anticâncer foram avaliados nas linhagens celulares MCF-7 e MDA-MB-231. Os resultados foram analisados para auxiliar pesquisas futuras sobre veículos de administração de fármacos anticâncer e para modificar os protocolos de administração de fármacos direcionados.

Resultados e Discussão

Efeito da Concentração do Sal de Ouro e da Temperatura na Síntese de AuNPs

A distribuição de tamanho e as propriedades físico-químicas dos NPs dependem de parâmetros como concentrações de sais metálicos, diferentes temperaturas, pH, tempo de reação e concentração de agentes redutores. Em uma abordagem tradicional, um fator é variado por vez, mantendo todos os outros constantes. Quatro concentrações diferentes de sal de ouro foram incubadas com o extrato de cada fonte biológica. Essas misturas reacionais foram incubadas em diferentes temperaturas para otimizar as condições para a formação de AuNPs por essas fontes. A cor inicial transparente a amarelo-pálido da mistura reacional foi observada no tempo t = 0. A redução dos íons de ouro foi monitorada através da mudança de cor das misturas reacionais após 24 h. Essa mudança de cor de amarelo-pálido para marrom e roxo escuro demonstrou a formação de AuNPs a partir de Aloe vera, mel e extrato de folhas de Gymnema sylvestre (GYLE) (Figura S1A–C). Em contraste, amostras controle com extrato puro das fontes ou HAuCl4 não mostraram mudança de cor quando incubadas sob condições semelhantes. A amostra de extrato de gel de Aloe vera incubada com solução de sal de ouro a 1 e 2 mM a 40 e 50 °C apresentou uma cor acinzentada-púrpura (Figura S2A e Tabela S1). Por outro lado, o extrato de mel incubado com solução de sal de ouro a 0,5 mM a 30 °C demonstrou uma mudança de cor de amarelo-pálido para vermelho-púrpura (Figura S2B). O GYLE apresentou uma mudança de cor desejada para vinho e vermelho-acastanhado quando incubado com solução de sal de ouro a 1 e 2 mM a 30 e 40 °C (Figura S2C), respectivamente. Os extratos de GYLE e mel reduziram os íons de ouro, Au3+, para Au0 devido à presença de uma ou mais moléculas oxidáveis nas misturas reacionais sob as condições fisiológicas desejadas.

Caracterização dos AuNPs

Análise Espectral UV–Vis
Os controles consistindo de extrato de gel de Aloe vera, mel e GYLE, e as misturas de reação incubadas por 24 h com diferentes concentrações de soluções salinas e temperaturas variadas foram submetidos a espectroscopia UV–vis com comprimentos de onda variando de 200 a 800 nm. Os controles não apresentaram pico por volta de 500 nm, que é uma região de interesse para AuNPs, conforme mostrado na Figura S2. O pico de absorbância observado na região de comprimento de onda de 500–570 nm para os AuNPs sintetizados a partir de três fontes diferentes é devido à oscilação coletiva de elétrons em sua superfície causada pelo fenômeno de ressonância de plasmon de superfície (SPR). Além disso, um pico único indica NPs de formato esférico, enquanto a ocorrência de duas ou mais bandas de plasmon representa o formato anisotrópico dos AuNPs.
Otimização dos Parâmetros Físico-Químicos para a Biossíntese de AuNPs
Altas temperaturas aumentam a taxa de reação para a síntese uniforme de AuNPs. Além disso, a geometria e a dimensão das NPs são definidas por cada parâmetro físico e biológico. Extratos livres de células são fontes de agentes redutores e estabilizadores, que podem afetar o crescimento e a nucleação das NPs. Uma maior concentração de agentes redutores pode ser atribuída à alta concentração de proteínas provenientes do extrato. Em contraste, uma concentração aumentada de íons de ouro na mistura de reação produz nanopartículas que são termodinamicamente instáveis. No caso do extrato de gel de Aloe vera, a temperatura desempenhou um papel crítico na determinação da melhor condição para a síntese de AuNPs, analisada por espectroscopia UV/Vis (Figura 1A–D). Pode-se observar que, à medida que a temperatura da mistura de reação aumenta, a absorbância também aumenta, indicando um alto rendimento de AuNPs. O aumento da absorbância com o aumento da temperatura foi semelhante para AuNPs sintetizados a partir de concentrações de solução salina de 1, 2 e 3 mM, exceto para a concentração de 0,5 mM, onde sua absorbância diminuiu a 50 °C (Figura 1D). No geral, as melhores temperaturas de reação foram 40 e 50 °C (Tabela S1), e as concentrações ótimas de solução de sal de ouro foram 1 e 2 mM.
(A–D)
Espectro UV/vis de AuNPs preparados a partir de extrato de Aloe veragel em diferentes
concentrações de sal e temperaturas.
Padrões de reação semelhantes foram observados para AuNPs preparados a partir do extrato de mel e os resultados de UV–vis neste caso são mostrados na Figura 2A–D. Os detalhes da mistura de reação em resposta a variações de temperatura e molaridade da solução de sal de ouro podem ser observados na Tabela S1 (Material Suplementar). No caso do mel, apenas a concentração de 0,5 mM de sal de ouro a 30 °C de temperatura apresentou o melhor pico (Figura 2B). Portanto, ambas as condições foram selecionadas para a síntese posterior de AuNPs a partir do extrato de mel. O mel é um material complexo contendo 400 compostos diferentes, incluindo álcoois, cetonas, aldeídos, ácidos, terpenos, hidrocarbonetos, benzeno e derivados de furano. No entanto, os dois principais monossacarídeos, frutose e glicose, no mel atuam como agentes redutores. Portanto, as nanopartículas reduzidas pelo mel existiam em várias formas e tamanhos.
(A–D): Espectro UV/vis
de AuNPs preparados a partir de Mel contra diferentes
concentrações de sal e temperaturas.
A análise espectroscópica UV/vis dos AuNPs sintetizados a partir de GYLE (Figura 3A–D) mostrou que o efeito de molaridades variáveis da solução de sal de ouro é mais proeminente em diferentes temperaturas da mistura de reação. Em todas as quatro temperaturas, a absorbância dos AuNPs aumentou com o aumento da concentração de sal de ouro até 2 mM. No geral, os resultados mostraram que a concentração de sal ideal para a síntese de alto rendimento de AuNPs a partir de GYLE foi de 1 e 2 mM a 30 e 40 °C, respectivamente. Detalhes de várias misturas de reação foram elaborados na Tabela S1 (Material suplementar). Curiosamente, os AuNPs reduzidos por GYLE mostraram um ombro fraco em torno de 650–700 nm, o que é uma indicação de partículas anisotrópicas.
(A–D):
Espectro UV/Vis de AuNPs preparados a partir de GYLE contra
diferentes concentrações de sal e temperatura.
Análise de DRX
A Figura 4 mostra o gráfico do espectro de DRX das três melhores amostras selecionadas após a otimização dos experimentos físico-químicos. O gráfico representa valores de 2θ de 38,34, 44,27, 64,64 e 77,94° correspondentes aos planos cristalinos (111), (200), (220) e (311), respectivamente. Os picos estão ligeiramente deslocados para valores de 2θ maiores no caso das nanopartículas sintetizadas a partir do mel, o que indica uma diminuição na constante de rede.
Comparação dos espectros de DRX
de AuNPs sintetizados de diferentes fontes. Aloe vera (A), mel (B) e GYLE (C).
As constantes de rede para as três amostras foram calculadas e apresentadas na Tabela 1. As constantes de rede calculadas estão próximas do valor relatado anteriormente. Os picos amorfos largos abaixo de 20° correspondem à faceta (100) do SiO2 devido à cobertura não homogênea do substrato de vidro.
Índices de Miller, Tamanho do Cristalito,
Parâmetro de Rede e Deformação da Rede para Todas as Amostras Calculadas
a partir dos Dados de DRX
amostra ângulos correspondentes aos índices (hkl) tamanho do cristalito (Å) dhkl = λ/2sinθ (Å) parâmetro de rede, a = dhkl * √(h2 + k2 + l2) (Å) (111) (200) (220) (311) Aloe vera 38,34 44,27 64,64 77,94 78,524 2,346 4,063 mel 38,37 44,55 64,66 77,45 78,527 2,345 4,062 G. Sylvester 38,35 44,45 64,91 77,96 188,136 2,346 4,063
Análise por MEV
A análise por MEV confirmou o tamanho e a forma das NPs sintetizadas por três fontes. As AuNPs sintetizadas a partir do extrato de gel de Aloe vera foram observadas como uniformemente dispersas e esféricas, com diâmetro variando de 30 a 45 nm (Figura 5A–C). As AuNPs sintetizadas a partir do mel apresentaram tamanhos e formas variados; nanocubos de ouro de grande tamanho e nanoesferas de ouro de pequeno tamanho são mostrados na Figura 5B. Isso pode ser atribuído à redução simultânea das AuNPs pela frutose e glicose presentes no mel. Por exemplo, o crescimento de nanoestruturas mais complexas, como nanotriângulos e nanoprismas, foi relatado utilizando mel. A cinética de reação de tais sistemas pode ser descrita pela função exponencial esticada. Além disso, alguns dímeros de nanocubos (indicados por círculos amarelos) também foram observados na amostra. As AuNPs sintetizadas a partir do GYLE eram esféricas, com tamanho médio de partícula de 30–40 nm (Figura 5A–C). O GYLE é conhecido por sua capacidade de sequestrar radicais livres. A atividade antioxidante das AuNPs reduzidas por GYLE já foi relatada anteriormente. Essas NPs mostraram citotoxicidade notável contra células Hep2. Condições de reação otimizadas podem levar à aglomeração controlada das NPs, o que pode ser benéfico para armazenamento de longo prazo e aplicações em sensoriamento. As AuNPs reduzidas por GYLE também exibiram formação de dímeros, conforme indicado pelos círculos amarelos na Figura 5C.
Imagens de MEV das AuNPs derivadas do extrato de Aloe vera (A), mel (B) e GYLE (C).
Análise por EDS
A espectroscopia EDS das AuNPs foi realizada para todas as amostras mostradas na Figura 6A–F. O percentual em peso correspondente para Au em AuNPs derivadas de Aloe vera, mel e GYLE foi de 21, 25,8 e 34,68%, respectivamente.
(A–F) Análise por EDS de todas as amostras. (A–C)
Imagens
de MEV das AuNPs sintetizadas a partir de Aloe vera, mel e GYLE, respectivamente. D–F representam as micrografias de EDS correspondentes para as três amostras.
Análise por FTIR
A análise por FTIR foi realizada para avaliar diferentes grupos funcionais nas amostras. Esses grupos funcionais, presentes em produtos químicos e enzimas, são necessários para a biossíntese das NPs, pois atuam como agentes estabilizadores e de capeamento para elas. Os grupos funcionais que envolvem as AuNPs derivadas do extrato de gel de Aloe vera mostraram bandas nítidas em 1627, 3423 e 3562 cm–1, representando as vibrações de estiramento do grupo amina (N–H) e do grupo álcool (O–H); enquanto bandas médias largas e fracas em 1101 e 2906 cm–1 descrevem o estiramento de éter alifático (C–O) e a vibração de estiramento de alcano (C–H), respectivamente (Figura 7).
Espectros de infravermelho das AuNPs
sintetizadas a partir de Aloe
vera, mel e GYLE. Aloe vera (linha preta), mel (azul) e GYLE (verde).
No caso de AuNPs sintetizados a partir do mel, as bandas mostradas em 3440,8 cm–1 são devidas à vibração de estiramento do grupo amina primária alifática (N–H). A banda em 2347 cm–1 representa o estiramento (C=O=C). As bandas para álcool primário (C–H) aparecem em 2395 cm–1. C=O representa o grupo carbonila na ligação amida em proteínas. Uma ligação sulfato está presente devido a resíduos de aminoácidos contendo enxofre em 1057 cm–1. AuNPs mediados por microrganismos possuem afinidade de ligação a amidas e tióis, presentes em proteínas. A presença desses grupos funcionais confirma que grupos amino livres podem formar uma camada de revestimento nos AuNPs, evitando assim sua aglomeração (Figura 7).
Para AuNPs derivados de GYLE, a banda mostrada em 3445 cm–1 é devida à vibração de estiramento de álcoois (O–H) que mostra ligação forte e a banda que aparece é larga. As bandas para álcool primário (C–H) aparecem em 2892 cm–1. A banda em 2078 cm–1 representa o estiramento (N=C=S), que indica um grupo isotiocianato com ligação forte. C=C representa o grupo alceno conjugado nas ligações amida em proteínas. O estiramento do composto halo (C–Br) é visto em 649 cm–1 devido à mistura inicial da amostra com KBr.
O grupo funcional álcool está presente em todas as amostras. Amina apareceu como um grupo funcional em AuNPs derivados de mel e Aloe vera. Os grupos funcionais alcano e éter alifático foram exclusivos dos AuNPs derivados de Aloe vera, enquanto os grupos carbonila e sulfato foram características dos AuNPs sintetizados usando mel. Quanto aos AuNPs sintetizados com GYLE, os grupos isotiocianato e alceno tiveram características distintas, enquanto o estiramento do composto halo (C–Br) foi visto em 649 cm–1, que foi devido à mistura inicial da amostra com KBr para processamento. Esses grupos impedem a aglomeração dos AuNPs devido ao revestimento de grupos amino livres nos AuNPs e fornecem estabilidade às nanopartículas de ouro biossintetizadas (Figura 7).
Atividade Antioxidante
Ensaio DPPH
Os resultados do ensaio DPPH revelaram que a capacidade de sequestro de AuNPs e ácido ascórbico aumenta com o aumento da concentração de AuNPs e ácido ascórbico. AuNPs preparados a partir de Gymnema, mel e Aloe vera mostraram uma capacidade máxima de sequestro de ∼83,29, 90,4, 9 e 93% a 2000 μg/mL, respectivamente, em comparação com 94,4% da capacidade máxima de sequestro mostrada pelo ácido ascórbico (controle positivo). Esses resultados mostraram que os AuNPs possuem capacidade antioxidante significativa em comparação com os antioxidantes naturais, mas existe uma diferença significativa em suas porcentagens de atividades de sequestro. A Figura 8 mostra a capacidade de sequestro de AuNPs de Aloe vera, mel e Gymnema sylvestre contra o ácido ascórbico na faixa de 517 nm (Figura 8).
Ensaio DPPH mostrando a porcentagem de atividade de sequestro de radicais de diferentes
conc. de ácido ascórbico vs AuNPs preparados a partir de todas as três fontes
biológicas. Linha azul para (ácido ascórbico), cinza (Aloe
vera), verde (mel) e laranja (Gymnema
sylvestre).
Conjugação de Fármaco: Confirmação da PEGuilação e Conjugação de Fármaco
(Z)-4-Hidroxitamoxifeno, Inibidor do Fator Induzível por Hipóxia-1 alfa (HIF-1-alfa) e H-[1, 2 e 4] oxadiazol [4, 3, −a] quinoxalina-1 (ODQ) foram utilizados para tratar o câncer de mama. Um mililitro de (10% PEG) foi adicionado a 9 tubos Falcon contendo 5 mL de suspensão de pellet de NP, misturados bem por agitação em vórtex em alta velocidade. A PEGuilação das NPs preparadas foi confirmada por meio de um deslocamento do pico plasmônico em 540–560 nm. No entanto, a PEGuilação não foi bem-sucedida em todos os 9 tubos de reação, pois nenhum aumento específico no valor de absorbância foi observado em nenhum dos tubos de reação. Após agitação vigorosa em vórtex dos pellets e sonicação com sonda, os pellets contendo PEG e fármacos ligados foram suspensos em água deionizada. Ambas as soluções de pellets, juntamente com a solução sobrenadante separada, foram verificadas por UV–vis. Um aumento no tamanho das AuNPs de 540 para 550–560 nm (NPs PEGuiladas) e finalmente para 570–580 nm (NPs conjugadas com fármacos) confirmou a conjugação dos fármacos.
Ensaio de Citotoxicidade

As linhagens celulares MCF7 (ATCC-HBT-22) e MDA-MB-231 (ATCC-HTB-26) são células de carcinoma ductal invasivo da mama. As células MCF7 são positivas para receptores de estrogênio e progesterona e respondem ao modulador seletivo do receptor de estrogênio tamoxifeno, enquanto a linhagem celular MDA-MB-231 é de câncer de mama triplo-negativo. A ausência do receptor de estrogênio tornou a MDA-MB-231 insensível aos tratamentos antiestrogênicos amplamente utilizados nas terapias endócrinas do câncer de mama.− As células MCF7 dependem da produção de ATP a partir da fosforilação oxidativa em condições normóxicas, mas aumentam sua atividade glicolítica sob hipóxia, enquanto as células MDA-MB-231 dependem da glicólise para a produção de ATP tanto em condições normóxicas quanto hipóxicas. As AuNPs geradas a partir de Aloe vera e GYLE foram conjugadas com (Z)-4-Hidroxitamoxifeno, Inibidor do Fator Induzível por Hipóxia-1 (Alfa) (HIF-1-alfa) e H-[1, 2 e 4] oxadiazol [4, 3, −a] quinoxalina-1 (ODQ) para a liberação direcionada de fármacos às células do câncer de mama, reduzindo a citotoxicidade contra células normais. Para controle, foram utilizados soro fisiológico no meio, fármacos não ligados e AuNPs sozinhas; enquanto para tratamento, foram utilizadas AuNPs conjugadas com esses fármacos individualmente. As AuNPs derivadas tanto de Aloe vera quanto de GYLE não apresentaram efeitos citotóxicos e, portanto, mostraram-se biologicamente seguras. No caso das AuNPs derivadas de Aloe vera, foi observada uma diferença significativa no caso das linhagens celulares tratadas com (Z)-4-Hidroxitamoxifeno (P < 0,001 ***) e das linhagens celulares tratadas com (Z)-4-Hidroxitamoxifeno conjugado com AuNP de GYLE (P < 0,001 ), enquanto os outros fármacos livres ou conjugados comparativamente não induziram diferença significativa em ambas as linhagens celulares (Figura 9). No caso das AuNPs derivadas de GYLE, foi observada uma diferença significativa nas linhagens celulares tratadas com (Z)-4-Hidroxitamoxifeno (P < 0,01) e nas linhagens celulares tratadas com (Z)-4-Hidroxitamoxifeno conjugado com AuNP de GYLE (P < 0,001**) em comparação com AuNPs de GYLE livres e conjugadas com outros fármacos.
Porcentagem de viabilidade

das células MCF-7 e MDA-MB-231 usando fármacos livres e
AuNPs conjugados a fármacos derivados de (A) Aloe vera e (B) GYLE.
Discussão
Esta pesquisa fez parte de um estudo abrangente e seu objetivo foi comparar diferentes métodos para a formação de AuNPs a fim de estabelecer o melhor método. Evidentemente, três fontes foram utilizadas para sintetizar AuNPs a partir de uma fonte biológica, ou seja, extrato de Gymnema sylvestre, extrato de gel de Aloe vera e mel cru. Todas essas fontes apresentaram resultados muito semelhantes, ou seja, um bom rendimento de AuNPs monodispersas com facilidade de síntese e sem adição de produtos químicos nocivos para redução, recobrimento ou funcionalização das AuNPs. Essas NPs foram altamente estáveis em temperaturas elevadas por um longo período. Isso foi verificado pela autoclavagem das soluções de reação antes da caracterização e análise da atividade biológica, e os resultados ainda são excelentes. Ao realizar a análise dos parâmetros físico-químicos para a formação de AuNPs a partir de diferentes concentrações de solução de ácido cloroáurico, observou-se que molaridades mais baixas do sal de ouro proporcionaram um maior rendimento de nanopartículas em comparação com molaridades mais elevadas. O papel da temperatura de incubação na síntese de AuNPs a partir de diferentes fontes orgânicas foi analisado colocando amostras a 20, 30, 40 e 50 °C. A temperatura ótima foi encontrada próxima a 40–50 °C para todas as amostras, enquanto a concentração mais ótima da solução de sal de ouro, ou seja, 1–2 mM, e temperatura de incubação de 50 °C produziram a maior quantidade de AuNPs.
As AuNPs recentemente sintetizadas foram submetidas a várias técnicas de caracterização, como análise espectral UV-vis, MEV, DRX, FTIR e EDS. O UV-vis detalhou que essas partículas se situam em uma faixa de comprimento de onda de 500–600 nm com um valor de absorbância de pico em torno de 540 nm, que é o valor característico de absorbância de pico das AuNPs. O tamanho e a forma das AuNPs variaram conforme as diferentes fontes. No entanto, a análise por MEV revelou que as partículas são majoritariamente de formato esférico e variam de 30 a 50 nm de tamanho. A análise por FTIR delineou os grupos funcionais nas amostras de AuNPs sintetizadas, que garantem sua conjugação com outras biomoléculas e ajudam a fornecer proteção e estabilidade.
As AuNPs são consideradas seguras e não tóxicas para todos os tipos de células vivas e acredita-se que não apresentem toxicidade, conforme relatado por muitos cientistas. As AuNPs não apresentam o efeito do mecanismo de formação de espécies reativas de oxigênio na célula hospedeira, ao contrário do mecanismo de ação de outras nanopartículas, o que pode ser a razão pela qual são consideradas uma opção mais segura. No entanto, para AuNPs carregadas positivamente de tamanho extremamente pequeno, a toxicidade foi relatada como dependente da dose, enquanto as AuNPs catiônicas do mesmo tamanho foram consideradas não tóxicas.
O uso de AuNPs para conjugação de fármacos não é um conceito novo, pois diversos estudos têm sido conduzidos para utilizar nanopartículas na conjugação de fármacos antibacterianos, conjugação de fármacos antifúngicos e como veículo de entrega de fármacos antivirais e anticancerígenos. Devido aos efeitos colaterais dos fármacos quimioterápicos, diferentes agentes de entrega de fármacos foram introduzidos e desenvolvidos. Entre eles estão lipossomas, dendrímeros, nanopartículas e nanotubos que são utilizados como carreadores de fármacos. As AuNPs possuem uma alta área superficial que resulta em sua alta capacidade de ligação a diferentes moléculas e apresentam uma alta meia-vida no corpo. Portanto, elas se ligam com uma alta carga útil aos fármacos quimioterápicos, diminuem a necessidade de administração de altas doses dos fármacos e reduzem seus efeitos tóxicos sobre as células não cancerosas no corpo.

Após uma análise completa dos resultados apresentados neste estudo, pode-se entender claramente que as AuNPs têm um enorme potencial em relação ao tratamento do câncer como veículos de entrega. A síntese das nanopartículas pode ser ainda mais verificada em diferentes pH, intervalos de tempo e várias intensidades de luz que possam afetar sua estabilidade. As nanopartículas também podem ser submetidas a testes mais sensíveis, como detecção de carga por potencial zeta, análise morfológica com microscopia eletrônica de transmissão (MET) e estudos sobre as propriedades dos materiais do nível atômico ao mícron, que também poderiam ser conduzidos por microscopia de força atômica (MFA).

Outro passo importante adiante é o teste de citotoxicidade e a análise de bioatividade das nanopartículas em linhagens celulares cancerosas. A maioria das vias de síntese de nanopartículas, sua bioatividade e citotoxicidade ainda são desconhecidas. Além disso, as interações das AuNPs com os componentes bioquímicos tumorais ainda precisam ser modeladas. Portanto, no futuro, estudos poderiam ser delineados para investigar os mecanismos subjacentes à ação das nanopartículas e as vias bioquímicas que elas visam; isso poderia ser verificado por meio de abordagens in silico, como Redes de Petri ou outros softwares de análise comparativa. Informações adicionais sobre genes e proteínas do ciclo celular podem fornecer dados úteis sobre suas vias moleculares e funcionamento que levam à citotoxicidade das AuNPs.

Conclusões
O presente estudo investiga a síntese de AuNPs a partir de três fontes biológicas. Um grande número de experimentos foi conduzido para configurar os melhores parâmetros para a síntese de AuNPs a partir das três fontes selecionadas. Após uma análise espectral UV–vis minuciosa, propusemos que as melhores temperaturas de reação no geral foram 40 e 50 °C, e a concentração ideal da solução de sal de ouro foi 1 e 2 mM para todas as três fontes de síntese. Além disso, outras técnicas ajudaram a estabelecer as características das nanopartículas fabricadas. A UV–vis detalhou que essas nanopartículas exibem o pico de plasmon na faixa de comprimento de onda de 500 a 600 nm com o valor de absorbância do pico característico em torno de 540 nm. A análise de SEM revelou que, em sua maioria, as partículas são de formato esférico e variam de 30 a 50 nm. Além disso, a análise de FTIR delineou a presença de grupos funcionais presentes nas amostras das AuNPs sintetizadas, o que garante sua estabilidade e pode ajudar a conjugar adjuvantes de fármacos na superfície das nanopartículas. Adicionalmente, a análise da atividade de eliminação de radicais livres das AuNPs utilizando o antioxidante padrão DPPH revelou que as AuNPs preparadas exibem atividades antioxidantes altamente significativas, o que poderia agregar valor na elaboração de protocolos de fármacos anticâncer baseados em nanomateriais.

O objetivo deste estudo foi estabelecer protocolos essenciais para a síntese de AuNPs a partir de plantas e fontes orgânicas. Um perfil citotóxico desses protocolos foi delineado, o que ajudará a comunidade científica no futuro a configurar experimentos nas melhores condições, economizar tempo e recursos e configurar os melhores resultados de estudo. Ao estabelecer esses protocolos, abrimos uma porta para que biólogos do câncer possam continuar trabalhando em protocolos de conjugação de fármacos anticâncer com AuNPs para realizar mais experimentos para projetos de terapêutica de fármacos direcionados. Os estudos devem continuar no domínio destacado da ciência, para que, no futuro, melhores opções terapêuticas estejam disponíveis para a redução da carga de saúde associada ao câncer.

Além disso, AuNPs também foram conjugadas com três fármacos anticâncer, a saber, ((Z)-4-Hidroxitamoxifeno, Inibidor do Fator Induzível por Hipóxia 1 (Alfa) (HIF-1-alfa), e H-[1, 2 e 4] oxadiazol [4, 3, −a] quinoxalin-1 (ODQ)). A análise espectral UV–vis revelou que essas AuNPs podem carregar fármacos anticâncer e, portanto, podem atuar como carreadores de fármacos anticâncer para o tratamento direcionado do câncer de mama. Para estudos futuros, é altamente crucial desenvolver AuNPs com tamanho e forma uniformes, com estabilidade aprimorada e de longo prazo, juntamente com segurança biológica e características ajustáveis, para garantir a síntese dos melhores candidatos para o desenvolvimento baseado em nanotecnologia de práticas de saúde e uma nanomedicina mais eficaz e personalizada no futuro.
Seção Experimental
Materiais
Ácido cloroáurico (HAuCl4·3H2O, 99,99%), brometo de potássio (KBr, 99%), polietilenoglicol 6000 (PEG), 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH) (99%), brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT), 4-(1-[4-(dimetilaminoetoxi) fenil]-2-fenil-1-butenil) fenol (4 Hidroxi Tamoxifeno) foram adquiridos da Sigma-Aldrich, EUA. Solventes como metanol (99%), etanol (99%), tampão fosfato, meio RPMI 1640, penicilina–estreptomicina (10.000 U/mL) e soro fetal bovino (FBS) foram adquiridos da Fisher Scientific, Reino Unido. O inibidor de HIF-1-alfa e ODQ (1H-[1,2,4]oxadiazolo [4,3, −a] quinoxalina-1) foram adquiridos da Chem Cruz, EUA.
Síntese de AuNPs a partir do Extrato de Gel de Aloe vera
As folhas de Aloe vera foram descascadas para coletar o gel viscoso. Este gel foi triturado para obter uma textura uniforme. Uma diluição de 30% do gel foi preparada adicionando 30 mL do gel em 70 mL de água destilada, que foi fervida a 100 °C por 5–10 min e filtrada através de papel de filtro Whatman para obter o extrato de gel de Aloe vera. Em um frasco cônico, 10 mL do extrato de gel foram reagidos com 10 mL de quatro concentrações diferentes (0,5–3 mM) de HAuCl4·3H2O. As misturas reacionais foram incubadas em diferentes temperaturas de incubação (20–50 °C) para otimizar as condições para a formação de AuNPs. Em seguida, os frascos foram agitados a uma taxa de rotação de 150 rpm no escuro. A mudança de cor da mistura reacional de marrom claro para roxo foi observada.
Síntese de AuNPs a partir do Mel
Mel orgânico sem conservantes adicionados foi obtido de um mercado local em Islamabad, Paquistão. O extrato foi preparado dissolvendo 1 mL de mel com 50 mL de água destilada em um frasco Erlenmeyer, seguido de aquecimento em uma chapa aquecedora com agitador magnético a 60 °C. Um total de 16 tubos de reação contendo 10 mL de extrato de mel foram incubados a 20–50 °C com quatro concentrações diferentes (0,5–3 mM) de HAuCl4·3H2O e agitados a uma taxa de rotação de 150 rpm no escuro.
Síntese de AuNPs a partir do Extrato de Folhas de Gymnema sylvestre
As folhas foram lavadas com água destilada, seguidas de secagem em estufa a 40 °C (ULE-500, Memmert, Alemanha). Posteriormente, as folhas foram moídas em um pó fino usando um liquidificador elétrico (SM-2460, Sanyo, Japão). Para preparar o GYLE aquoso, um grama de seu pó fino foi misturado com 100 mL de água duplamente destilada em um frasco Erlenmeyer de 250 mL e fervido a 60 °C por 30 min em uma chapa aquecedora com agitador magnético (US152, Buch Holm, EUA). O extrato aquoso bruto foi filtrado usando papel de filtro Whatman nº 1 e armazenado a 4 °C para experimentos posteriores. Para a síntese biológica de AuNPs, 6 mL de GYLE foram misturados com quatro concentrações diferentes de solução de sal de ouro em quatro temperaturas diferentes, conforme mencionado nas Seções 5.3 e 5.4.
Caracterização das AuNPs
Espectroscopia UV-Vis
A redução dos íons Au3+ foi monitorada medindo os espectros UV-vis das alíquotas das misturas reacionais em uma cubeta de quartzo em intervalos regulares em um espectrofotômetro UV-1650CP Shimadzu, em uma faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm. Para correção da linha de base, água deionizada foi utilizada como branco.
Difração de Raios X
A caracterização por DRX foi realizada para determinar a estrutura cristalina das AuNPs usando o D8 Advance, BRUKER, Diffratômetro, Alemanha. Quando um feixe de raios X incidente é direcionado à amostra em uma faixa diferente de ângulos, ele é difratado em diferentes direções devido à estrutura cristalina do material em investigação. A amostra em uma lâmina de vidro foi varrida em uma faixa de 2θ de 20–80° com tempo e um incremento de 0,02°/0,1 s de intervalo. Uma voltagem de 40 kV e corrente de 40 mA foram aplicadas com radiação Cu-Kα (λ = 1,54 Å) no instrumento. Um diâmetro médio de cristalito foi medido a partir das amostras varridas usando a equação de Debye–Scherrer:D (nm) é o tamanho, λ (nm) é o comprimento de onda da radiação Cu-Kα, β (radianos) é a largura total à meia altura (FWHM), e θ (radianos) é a metade do ângulo de Bragg.
Microscopia Eletrônica de Varredura
A morfologia das AuNPs biorreduzidas e seu tamanho foram estudados por MEV (VEGA3, TESCAN, República Tcheca) usando um feixe de elétrons focado nas amostras. As amostras foram sonicadas (EW-04711-35 Ultrasonicator, Cole Parmer, EUA) por 1 h a 37 °C para evitar a agregação das AuNPs. A voltagem de aceleração do microscópio foi ajustada em 20 kV e uma distância de trabalho de 15 mm para a amostra foi escolhida.
Espectroscopia de Energia Dispersiva
A composição elementar das AuNPs sintetizadas biologicamente foi determinada por EDX acoplado ao MEV entre a faixa de energia de 0–20 keV.
Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier
Os espectros de FTIR mostram um deslocamento no número de onda dos grupos funcionais dos extratos antes e após a formação das AuNPs na mistura. Um espectrômetro Perkin-Elmer Spectrum-100, EUA, foi usado para detectar a presença de diferentes tipos de grupos funcionais na superfície das Au-NPs presentes na mistura reacional. Alíquotas de amostra líquida foram misturadas com KBr, um produto químico higroscópico, para remover a umidade das amostras e foram secas em estufa a 200 °C por 30 min. O pó fino das amostras misturadas com KBr foi obtido por moagem manual em almofariz e pistilo. Uma faixa de comprimento de onda infravermelho de 4000–350 cm–1 e resolução de 4 cm–1 foi aplicada ao pó fixado no suporte de pastilha.
Determinação da Atividade Antioxidante
Ensaio de Sequestro do Radical Livre DPPH
A atividade antioxidante de AuNPs selecionadas de diferentes fontes, cada uma com diferentes concentrações e temperaturas de incubação, foi determinada pelo ensaio com DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) de acordo com um procedimento padrão. O princípio deste método colorimétrico é uma mudança de cor observada por espectrofotometria UV-vis a 517 nm como resultado da redução de doadores de hidrogênio ou antioxidantes presentes em uma amostra. Resumidamente, 1 mM de DPPH foi preparado em metanol. Alíquotas de 1,6 mL contendo concentrações variáveis de AuNPs (20–2000 μg/mL) em água destilada foram adicionadas a 0,4 mL de 0,1 mM de DPPH. A mistura reacional foi vortexada adequadamente e incubada a 37 °C no escuro por no máximo 30 min com agitação a 100 rpm. A seguinte fórmula (eq 2) foi utilizada para determinar o potencial de sequestro de radicais em porcentagem dos AuNPs de diferentes fontes.onde Acontrole é o valor de absorbância do controle e Amostra é o valor de absorbância da amostra teste. O ácido ascórbico foi utilizado como referência e os testes foram realizados em triplicata.

Conjugação de Fármacos com AuNPs

Seleção de Nanopartículas de Tamanho Similar via Centrifugação Diferencial

Os AuNPs sintetizados foram posteriormente utilizados para a conjugação de (Z)-4-hidroxitamoxifeno, Inibidor do Fator Induzível por Hipóxia-1 (Alfa) (HIF-1-alfa) e H-[1, 2 e 4] oxadiazol [4, 3, −a] quinoxalina-1 (ODQ). Para a separação de AuNPs de tamanho uniforme, a centrifugação diferencial foi realizada a 500, 1000 e 2000 r.c.f, o que resultou em diferentes pellets. Esses pellets foram ressuspendidos em 5 mL de água deionizada após a remoção do sobrenadante a cada etapa progressiva. Após completar a centrifugação em 3 velocidades diferentes, concluímos que a segunda rodada de centrifugação a 1000 r.c.f forneceu os melhores resultados na forma de pellets espessos visíveis e mensuráveis e cor clara do sobrenadante como uma indicação de que a maioria das NPs de tamanho idêntico foi sedimentada. Assim, esses pellets a 1000 r.c.f foram escolhidos para experimentações posteriores de conjugação de fármacos.
Soluções estoque de 50 μg/mL de todos os fármacos, Inibidor de HIF-1-alfa, ODQ e 4-hidroxi Tamoxifeno foram preparadas. Emulsões de AuNP preparadas a partir de três diferentes fontes biológicas foram centrifugadas a 500 rpm por 30 min a 4 °C. O sobrenadante foi transferido para outro tubo Falcon e novamente centrifugado a 1000 rpm a 4 °C por 30 min. A centrifugação resulta na separação de partículas de tamanho uniforme da emulsão heterogênea. O pellet de AuNPs obtido após a segunda centrifugação foi ressuspenso em 20 mL de água deionizada. Subsequentemente, 5 mL da solução de AuNPs foram transferidos para seis tubos Falcon rotulados com fármacos anticancerígenos. 60 μL de PEG foram adicionados a cada tubo de AuNPs, misturados completamente por 5 min em um vórtex a 250 rpm, e adicionados a uma cubeta para determinar a absorbância da solução de Au-NP-PEG via espectrofotômetro UV-vis. Em seguida, 5 mL de 50 μg/mL de cada fármaco foram adicionados aos seis tubos Falcon contendo a solução de AuNP-PEG; os tubos foram vortexados por 5 min e depois sonicados por 2 min. Essas soluções de AuNP-PEG-fármaco foram transferidas para uma cubeta para determinar a absorbância. Os tubos de amostra foram centrifugados a 6300 rpm por 30 min a 4 °C e o sobrenadante foi transferido para uma cubeta para determinar a absorbância do fármaco não ligado remanescente no sobrenadante via espectrofotômetro UV-vis, enquanto o fármaco ligado permaneceu no pellet. O pellet foi ressuspenso em 5 mL de água deionizada e armazenado em condições escuras a 4 °C.
Ensaio de Citotoxicidade
Células MCF7 (ATCC HTB-22) e MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram incubadas a 37 °C sob 95% de ar umidificado com 5% de CO2. Antes do experimento, as células foram tripsinizadas (0,25% de Tripsina e EDTA) e semeadas (1 × 10⁴ células/poço) em placas de 96 poços. As AuNPs, fármacos livres e conjugados foram medidos usando o ensaio de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H tetrazólio) a 5 mg/mL. As células foram tratadas com AuNPs, AuNPs carregadas com fármaco e apenas fármacos por 24 h. As células foram incubadas novamente por 48–72 h, seguidas pela adição de 10 μL da solução de MTT preparada em cada poço. A placa foi então incubada por mais três horas antes da adição de 100 μL de DMSO. A absorbância foi subsequentemente registrada em um leitor de microplacas a 570 nm. Os resultados do ensaio de MTT foram avaliados usando a seguinte fórmula (eq 3):
Análise Estatística
Os resultados dos experimentos realizados em triplicata foram expressos como média ± desvio padrão e uma análise de variância de dois fatores (ANOVA) foi usada para determinar a significância estatística das diferenças com o auxílio do software estatístico SPSS 17.0 e GraphPad Prism 7.0.
Informações de Suporte Disponíveis
Figuras adicionais conforme mencionado no texto (PDF)
As Informações de Suporte estão disponíveis gratuitamente em https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsomega.2c06491.
Material Suplementar
Endereço Atual do Autor
∥ Westmead Institute for Medical Research, Universidade de Sydney NSW, Sydney 2006, Nova Gales do Sul, Austrália
Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.
Referências

AuNPs são nanopartículas inorgânicas importantes aplicadas em sistemas de transporte de fármacos
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