pmid: "38019914"
title: "KDM6B impulsiona a reprogramação epigenética associada ao comprometimento inicial da célula estromal linfoide e às propriedades imunes."
authors: "Sylvestre M, Barbier N, Sibut V, Nayar S, Monvoisin C, Leonard S, Saint-Vanne J, Martin A, Guirriec M, Latour M, Jouan F, Baulande S, Bohec M, Verdière L, Mechta-Grigoriou F, Mourcin F, Bertheuil N, Barone F, Tarte K, Roulois D"
journal: "Science advances"
pubdate: "2023 Dec"
doi: "10.1126/sciadv.adh2708"
source: "PMC Full Text"

KDM6B impulsiona a reprogramação epigenética associada ao comprometimento inicial da célula estromal linfoide e às propriedades imunes.

Autores

Sylvestre M, Barbier N, Sibut V, Nayar S, Monvoisin C, Leonard S, Saint-Vanne J, Martin A, Guirriec M, Latour M, Jouan F, Baulande S, Bohec M, Verdière L, Mechta-Grigoriou F, Mourcin F, Bertheuil N, Barone F, Tarte K, Roulois D

Periodico

Science advances (2023 Dec)

Conteudo

KDM6B impulsiona a reprogramação epigenética associada ao comprometimento inicial e às propriedades imunológicas das células estromais linfoides

As células estromais linfoides maduras (LSCs) são organizadoras-chave das respostas imunes dentro dos órgãos linfoides secundários. Da mesma forma, as estruturas linfoides terciárias impulsionadas pela inflamação dependem de imunofibroblastos que produzem citocinas e quimiocinas linfoides. Estudos recentes exploraram a origem e a heterogeneidade dos LSCs/imunofibroblastos, mas os mecanismos moleculares e epigenéticos envolvidos em seu comprometimento ainda são desconhecidos. Este estudo explorou a reprogramação transcriptômica e epigenética subjacente ao comprometimento de LSCs/imunofibroblastos. Identificamos a indução da lisina desmetilase 6B (KDM6B) como o principal impulsionador epigenético da diferenciação inicial de imunofibroblastos. Além disso, observamos um enriquecimento da assinatura gênica de KDM6B em fibroblastos inflamatórios murinos e no estroma patogênico de pacientes com doenças autoimunes. Por fim, KDM6B foi necessária para a aquisição de propriedades funcionais de LSCs/imunofibroblastos, incluindo a regulação positiva de CCL2 e o consequente recrutamento de monócitos. Em conjunto, nossos resultados revelam mecanismos epigenéticos que participam do comprometimento inicial e das propriedades imunes dos imunofibroblastos e apoiam o uso de modificadores epigenéticos como estratégias direcionadas a fibroblastos na inflamação crônica.

A histona desmetilase KDM6B desencadeia a programação epigenética inicial de imunofibroblastos normais e patogênicos em camundongos e humanos.

INTRODUÇÃO

As células estromais linfoides (LSCs) referem-se a um compartimento celular heterogêneo dentro dos órgãos linfoides secundários, consistindo em duas principais redes celulares especializadas que expressam gp38/podoplanina (PDPN): células reticulares fibroblásticas extrafoliculares PDPN+CCL19+CCL21+ (FRCs), e células dendríticas foliculares PDPN+CD21+CD35+ (FDCs) que povoam os folículos de células B. Estudos de sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e de imagem destacam níveis adicionais de heterogeneidade em LSCs murinos e humanos, delineando numerosos subconjuntos de FRCs ligados a várias localizações e funções, bem como dois subconjuntos de FDCs, refletindo sua sublocalização dentro do centro germinativo. Durante a embriogênese, as LSCs originam-se de organizadores mesenquimais de tecido linfoide (mLTo) sob o controle da via do fator nuclear κB (NF-κB). Em particular, os indutores de tecido linfoide produzem linfotoxina α1β2 (LT), ativando assim os mLTo que expressam LTβR. Em adultos, as LSCs derivam de precursores mesenquimais residentes locais, incluindo células perivasculares e precursores de adipócitos, e requerem tanto o fator de necrose tumoral–α (TNF) quanto a LT, produzidos por células imunológicas, para sua maturação e manutenção como células imunologicamente competentes. Embora abordagens elegantes de mapeamento de destino celular e reconstruções de trajetórias celulares baseadas em análises de scRNAseq tenham sugerido vias de especificação celular para subconjuntos de LSCs, os mecanismos moleculares subjacentes permanecem em grande parte inexplorados.
Condições inflamatórias crônicas, como infecções, doenças autoimunes e cânceres, estão associadas ao desenvolvimento de estruturas linfoides terciárias (TLSs) patogênicas ectópicas em tecidos periféricos. As TLSs são compostas por células imunes, incluindo linfócitos e células mieloides, células endoteliais e células estromais PDPN+ com características semelhantes a LSC, chamadas imunofibroblastos. Os imunofibroblastos sustentam o recrutamento, a organização e a manutenção das células imunes das TLSs, que por sua vez contribuem para sua plasticidade dinâmica. A ativação precoce de progenitores locais de imunofibroblastos depende de fatores inflamatórios liberados por células residentes e macrófagos derivados de monócitos recrutados, enquanto a expansão adicional da rede de fibroblastos e a organização das TLSs envolvem a comunicação cruzada com células T e B. Em humanos, as células estromais derivadas de tecido adiposo (ASCs) são especificamente propensas a interagir com células imunes em comparação com suas contrapartes da medula óssea. Além disso, as ASCs podem ser eficientemente comprometidas em direção a células semelhantes a LSC/imunofibroblastos in vitro, tornando-as um modelo celular atraente para capturar os mecanismos condutores do comprometimento de LSC/imunofibroblastos.

Modificações epigenéticas, como metilação do DNA e modificações de histonas, afetam a estrutura da cromatina, alterando sua acessibilidade a fatores de transcrição (TFs) e outros reguladores gênicos. EZH2 é um componente do complexo repressivo polycomb 2 responsável pela trimetilação de H3K27. Isso favorece o potencial de diferenciação adipogênico e inibe o osteogênico das células estromais mesenquimais da medula óssea (BM-MSCs). Por outro lado, as desmetilases de H3K27me3, lisina desmetilase 6A (KDM6A) (também conhecida como UTX) e lisina desmetilase 6B (KDM6B) (JMJD3) inibem a adipogênese e promovem a osteogênese, sugerindo um papel fundamental para a comutação epigenética centrada em H3K27 na especificação do destino das células estromais. KDM6B é amplamente conhecida por seu papel durante a resposta inflamatória e abriga sítios de ligação de NF-κB em seu promotor. KDM6B é regulada positivamente durante a infecção pelo vírus sincicial respiratório, e sua inibição resulta em uma produção diminuída das quimiocinas CCL2 e CCL5. KDM6B também contribui para a ativação de fibroblastos cutâneos dependente do fator de crescimento transformador β na esclerose sistêmica através da remoção da marca repressiva H3K27me3 no promotor de FRA2. Por fim, a inibição de KDM6B em sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLSs) da artrite reumatoide (AR) impede sua proliferação, através da repressão de PCNA. Em linha com esse resultado, a expressão sustentada de genes inflamatórios em FLSs de AR foi recentemente relacionada a modificações epigenéticas prolongadas induzidas por TNF, incluindo o depósito persistente da marca ativadora H3K27ac. Juntos, esses dados destacam o papel crucial das modificações de H3K27 na diferenciação e ativação de células estromais e levantam a questão sobre seu impacto no comprometimento precoce e na função de LSC/imunofibroblastos.
O presente estudo combinou um modelo in vitro de comprometimento de ASC humanas em células semelhantes a LSC/imunofibroblastos e um modelo in vivo de indução de TLS murino. Em ambos os casos, a diferenciação de LSC/imunofibroblastos foi associada a uma indução específica e precoce de KDM6B dependente de NF-κB, que poderia se ligar diretamente a genes de LSC. Em seguida, definimos uma assinatura gênica específica de KDM6 que se mostrou enriquecida em fibroblastos inflamatórios murinos e em imunofibroblastos patogênicos humanos de pacientes com doença autoimune. Além disso, demonstramos, usando um inibidor de KDM6, que a KDM6B era necessária para a aquisição do fenótipo e das funções de LSC/imunofibroblastos, incluindo a regulação positiva da produção de CCL2 e o recrutamento resultante de monócitos. Em conjunto, nossos resultados esclarecem os mecanismos epigenéticos envolvidos no comprometimento e na função das LSC.
RESULTADOS
TNF/LT desencadeia a diferenciação in vitro de precursores estromais em imunofibroblastos
Para dissecar os mecanismos moleculares da diferenciação de imunofibroblastos, desenvolvemos anteriormente um modelo in vitro de comprometimento de ASC humano para imunofibroblasto sob uma combinação de TNF e LT (Fig. 1A). Primeiramente, investigamos a composição molecular inicial de imunofibroblastos induzidos in vitro analisando seu perfil de expressão gênica (GEP) após 6 horas (H6) de estimulação com TNF/LT (n = 4). A análise de sequenciamento de RNA (RNA-seq) identificou 256 genes regulados positivamente e 97 genes regulados negativamente em H6 (P ajustado < 0,01, fold change >2, análise DESeq 2) em comparação com ASC não estimulados (Fig. 1B e tabela S1). Os genes regulados positivamente pertenciam a quimiocinas e citocinas imunomoduladoras (CCL2, CCL5, CXCL10, IL1B e IL8) e moléculas de adesão (PDPN, ICAM1, TNFRSF9 e VCAM1), classicamente associadas ao fenótipo de imunofibroblasto (Fig. 1C). Em seguida, definimos a assinatura de imunofibroblasto analisando o GEP de ASC estimulados por 3 dias (D3) com TNF/LT, destacando 966 genes regulados positivamente e 899 genes regulados negativamente (P ajustado < 0,01, fold change >2, análise DESeq 2; Fig. 1D e tabela S2). Utilizamos assinaturas gênicas recentemente estabelecidas de precursores universais de fibroblastos Pi16+ e Ccl19+ FRC para confirmar que o tratamento de ASC com TNF/LT por D3 in vitro mimetizou o comprometimento de precursores estromais em LSC/imunofibroblastos in vivo (Fig. 1E). A maioria dos 256 genes que estavam regulados positivamente em H6 permaneceu regulada positivamente em D3 (P = 1,38 × 10⁻⁷, teste hipergeométrico) (fig. S1A). A análise de enriquecimento de vias dos genes regulados positivamente tanto em H6 quanto em D3 revelou um enriquecimento nas vias de sinalização de NF-κB e de citocinas/quimiocinas (fig. S1, B e C). Isso foi confirmado adicionalmente usando a análise de enriquecimento de conjuntos de genes, mostrando um enriquecimento tanto na resposta inflamatória quanto na sinalização de TNF através da via de NF-κB em H6 e D3 (fig. S1D). Em contraste, a análise dos genes regulados negativamente tanto em H6 quanto em D3 revelou uma diminuição de genes associados ao comprometimento com outras linhagens estromais, como diferenciação de células de gordura branca e diferenciação de crista neural (fig. S1, E e F). Para validar ainda mais que ASCs comprometidos in vitro em imunofibroblastos exibiam características de LSC, avaliamos a relação entre as assinaturas de imunofibroblasto em H6 e D3 e o GEP publicado de LSCs maduros purificados humanos (FRCs e FDCs). ASCs diferenciados in vitro em adipócitos precoces (D1) e maduros (D21) foram utilizados como controles. Observamos uma correlação positiva entre imunofibroblastos in vitro e LSCs maduros e uma correlação negativa entre imunofibroblastos in vitro e adipócitos D1 (correlação de Pearson, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001) (Fig. 1F). Em conjunto, esses dados destacam que o tratamento com TNF/LT induz o comprometimento de ASCs em direção a imunofibroblastos com características semelhantes a LSC.
Análise transcriptômica cinética de imunofibroblastos comprometidos in vitro.
(A) Representação do modelo in vitro de comprometimento de célula estromal derivada de tecido adiposo (ASC) para imunofibroblasto. (B) Análise de sequenciamento de RNA (RNA-seq) de ASC tratadas com fator de necrose tumoral α (TNF)/linfotoxina α1β2 (LT) durante 6 horas (H6) (imunofibroblastos precoces). Genes expressos diferencialmente foram representados por meio de um gráfico de vulcão com genes regulados positivamente (P ajustado < 0,05, fold change > 2) em azul, e genes regulados negativamente (P ajustado < 0,05, fold change < −2) em vermelho, conforme identificado pela análise DESeq 2 (n = 4). (C) Heatmap mostrando as contagens normalizadas de citocinas imunomoduladoras, quimiocinas, receptores, moléculas de adesão e reguladores da matriz extracelular (MEC) selecionados após tratamento de ASC com TNF/LT por H6 em comparação com células não tratadas (CTR). O valor médio de quatro experimentos diferentes foi visualizado com escore z por meio de um código de cores. (D) Análise de RNA-seq de ASC tratadas com TNF/LT durante 3 dias (D3) (imunofibroblastos). Genes expressos diferencialmente foram representados por meio de um gráfico de vulcão com genes regulados positivamente (P ajustado < 0,05, fold change > 2) em azul, e genes regulados negativamente (P ajustado < 0,05, fold change < −2) em vermelho, conforme identificado pela análise DESeq 2 (n = 3). (E) Análise de enriquecimento de escore Seurat das assinaturas gênicas de fibroblasto Pi16+ (esquerda) e célula reticular fibroblástica Ccl19+ (FRC) (direita) em imunofibroblastos precoces e imunofibroblastos no dia 3 (n = 4 e n = 3, respectivamente). (F) Matriz de correlação de Pearson foi realizada usando genes regulados positivamente de imunofibroblastos H6 e D3, assinaturas de células estromais linfoides nativas (LSC) [FRC e célula dendrítica folicular (FDC)], e assinaturas de adipócitos diferenciados de ASC (D1 e D21). O tamanho dos pontos representa o valor absoluto da correlação, e o código de cores está associado à correlação positiva (vermelho) ou negativa (azul). (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.)
A indução e ligação precoce de KDM6B está associada ao comprometimento com imunofibroblasto.
Considerando o envolvimento previamente descrito da KDM6B na diferenciação e ativação de células estromais, estudamos a regulação das KDMs durante a resposta das células estromais ao TNF/LT. Das 17 KDMs detectáveis, apenas a KDM6B apresentou aumento de expressão, com pico em H2 após estimulação de ASCs humanas com TNF/LT (Fig. 2A). A regulação positiva da KDM6B foi restrita ao TNF/LT e não foi observada com outros sinais inflamatórios estromais clássicos, como ativação de receptores Toll-like por lipopolissacarídeo (LPS) ou Poly I:C, ou interferon-γ (IFN-γ), bem como estimulação com interleucina-17 (IL-17) (Fig. 2B). O silenciamento eficiente de RELA ou RELB, ambos regulados positivamente após tratamento com TNF/LT, prejudicou a indução de KDM6B sem afetar a expressão de KDM6A, subjacente à relação entre a ativação de NF-κB e a indução de KDM6B em resposta ao tratamento com TNF/LT (fig. S2, A e B). Validamos então que a KDM6B poderia se ligar efetivamente a genes do estroma linfoide realizando análise CUT&RUN de KDM6B em ASCs e imunofibroblastos iniciais (H6 após tratamento com TNF/LT). Após a chamada de picos, identificamos regiões diferencialmente ligadas entre células tratadas e não tratadas (ganho de 2676 e perda de 856 regiões, P ajustado < 0,05, fold change >2 ou < −2, análise DESeq 2; Fig. 2C). A maioria dessas regiões diferencialmente ligadas foi associada a um aumento da ligação de KDM6B após TNF/LT (75,8% versus 24,2%, P < 0,0001; fig. S2C). A análise de vias do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) dos genes enriquecidos por KDM6B destacou a via de NF-κB e vias mediadas por citocinas/quimiocinas (Fig. 2D). Além disso, a avaliação do enriquecimento de motivos de FT usando HOMER e genes-alvo de FT usando o banco de dados TRRUST e EnrichR nos picos enriquecidos por KDM6B em H6 identificou membros da família NF-κB como alvos-chave da KDM6B durante o comprometimento com LSC (Fig. 2E e fig. S2D). Por fim, os genes regulados positivamente em H6 após tratamento com TNF/LT foram enriquecidos para ligação de KDM6B (P = 5,5 × 10−39, teste hipergeométrico), incluindo CCL2, CCL5, PDPN, ICAM1, CXCL10 e IL1B (Fig. 2, F e G, e fig. S2, E a G). Em conjunto, esses dados demonstram que a combinação TNF/LT desencadeia a reprogramação molecular de ASCs em imunofibroblastos em associação com a indução precoce dependente de NF-κB da KDM6B.
A indução e ligação precoce da KDM6B está associada ao comprometimento com imunofibroblasto.
(A) Mapa de calor mostrando a expressão média (n = 3) das 17 KDM detectadas em células estromais derivadas de tecido adiposo (ASCs) tratadas com fator de necrose tumoral α (TNF)/linfotoxina α1β2 (LT) por 1 hora (H1) a 10 dias (D10). Os dados de expressão (n = 3) são normalizados com a expressão em H0 como controle, e o valor médio da mudança de expressão (fold change) é representado de acordo com a escala de código de cores. (B) Mapa de calor mostrando a expressão média (n = 3) das 17 KDM detectadas em ASCs tratadas com TNF/LT, lipopolissacarídeo (LPS), Poly I:C, interferon-γ (IFN-γ) ou interleucina-17 (IL-17) de H1 a 3 dias (D3) (n = 3). Os dados de expressão são normalizados com a expressão em H0 como controle, e o valor médio da mudança de expressão (fold change) é representado de acordo com a escala de código de cores. (C) Visualização dos picos de ligação de KDM6B em CTR (cinza) ou em imunofibroblastos precoces (verde). A repartição diferencial foi avaliada por um teste qui-quadrado com repartição igual definida como hipótese nula (P < 0,0001). (D) Os genes enriquecidos para ligação de KDM6B em ASC tratadas por TNF/LT em H6 foram analisados pelo EnrichR usando a análise de vias da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG). O −LOG10(valor P ajustado) das 20 principais vias KEGG enriquecidas foram visualizados por meio de histogramas. (E) Análise de enriquecimento de motivos nos picos enriquecidos para KDM6B em imunofibroblastos precoces (H6), conforme definido usando HOMER. Apenas os motivos com P < 1 × 10−4 foram mostrados. (F) Sobreposições de densidade de KDM6B e mapas de calor de densidade de tags das regiões de ligação de KDM6B associadas a genes induzidos em imunofibroblastos precoces (H6) foram comparados entre ASCs (CTR) e imunofibroblastos precoces (H6) (janelas de −/+ 2 kb). (G) ASCs foram tratadas com TNF/LT durante 6 horas (H6) e os genes diferencialmente expressos foram representados por meio de um gráfico de vulcão (volcano plot). Genes com enriquecimento significativo de KDM6B em H6 após o tratamento foram destacados em verde (P ajustado < 0,05, mudança de expressão > 2, análise DESeq 2).
O tratamento com GSK-J4 prejudica parcialmente o comprometimento com imunofibroblastos in vitro.
Para avaliar melhor o papel da KDM6B durante o comprometimento imunofibroblástico inicial, estimulamos ASCs com TNF/LT na presença ou ausência do inibidor específico de KDM6 GSK-J4 e analisamos seu GEP por RNA-seq em H6. Dentre os genes regulados positivamente no imunofibroblasto inicial, 72 foram afetados negativamente pelo tratamento com GSK-J4 (P ajustado < 0,05, fold change >2, análise DESeq2), incluindo CXCL10, VCAM1, TNFRSF9, PDPN, IL1B, CCL2 e CCL5, e foram definidos como a assinatura específica de KDM6 (Fig. 3, A a C). Por outro lado, outros genes induzidos por TNF/LT não foram afetados, incluindo IL8. Consequentemente, o tratamento com GSK-J4 levou à regulação negativa da expressão de PDPN na superfície celular em D3, conforme medido por citometria de fluxo (P < 0,001) (Fig. 3D), mas não afetou a produção de IL-8 quantificada em sobrenadantes celulares por Luminex (Fig. 3E). O tratamento com GSK-J4 também afetou o GEP de imunofibroblastos em D3 após o tratamento com TNF/LT, com uma regulação negativa de um conjunto de genes de estroma linfoide, incluindo CXCL10, VCAM1, TNFRSF9, PDPN, IL1B, CCL19, CCL2 e CCL5, ao contrário de IL8 (Fig. 3F, P ajustado < 0,05). Em concordância, a assinatura específica de KDM6 foi encontrada enriquecida para vias associadas à ativação de NF-κB e sinalização de TNF (fig. S3, A e B). Em conjunto, esses dados apoiam a hipótese de que KDM6B regula parcialmente o comprometimento imunofibroblástico.

A inibição de KDM6B prejudica parcialmente o comprometimento imunofibroblástico in vitro.

(A) Visualização em heatmap dos valores de expressão de genes regulados positivamente por 6 horas (H6) de tratamento com fator de necrose tumoral α (TNF)/linfotoxina α1β2 (LT) (n = 4, P ajustado < 0,05, fold change >2, análise DESeq2) na presença do inibidor de KDM6 GSK-J4 ou dimetilsulfóxido (DMSO) como controle. O escore Z é visualizado por meio de um código de cores. (B) Tabela dos 72 genes específicos de KDM6 reprimidos na presença de GSK-J4. (C) Heatmap de uma seleção da expressão gênica de células estromais linfoides (LSC)/imunofibroblastos conforme definido pela análise de RNA sequencing (RNA-seq) em H6 após tratamento com TNF/LT na presença do inibidor de KDM6 GSK-J4 ou DMSO como controle (n = 4). O escore Z é visualizado por meio de um código de cores. (D) Expressão da proteína de superfície celular gp38/podoplanina (PDPN) quantificada por citometria de fluxo em células estromais derivadas de tecido adiposo (ASCs) tratadas ou não com TNF/LT por 3 dias (D3), na presença ou ausência do inibidor de KDM6 GSK-J4 (n = 9). (Os valores são médias ± DP, ****P < 0,0001). (E) A concentração de IL-8 foi avaliada por Luminex nos sobrenadantes de ASCs tratadas ou não com TNF/LT por D3, na presença ou ausência do inibidor de KDM6 GSK-J4 (n = 6). Valores são médias ± DP, P = ns). (F) Expressão de genes LSC/imunofibroblastos em ASCs tratadas ou não com TNF/LT por D3, na presença ou ausência do inibidor de KDM6 GSK-J4 (n = 5 para IL1B, CCL5 e TNFRSF9, e n = 9 para os demais, valores são média, P ajustado por FDR *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001). (D a F) As análises estatísticas foram realizadas utilizando testes de Mann-Whitney.

KDM6B suporta o comprometimento imunofibroblástico in vivo
Para validar o papel da KDM6B na diferenciação de LSC/imunofibroblastos in vivo, primeiro usamos um atlas unicelular de fibroblastos de camundongo purificados de tecidos saudáveis e destacamos um enriquecimento específico da assinatura específica de KDM6 em FRC Ccl19+ (Fig. 4A e fig. S4A). Em seguida, usamos um modelo de formação de TLS para avaliar ainda mais a cinética do comprometimento inicial dos imunofibroblastos. Nesse modelo, a infecção da glândula salivar por um AdV5 defeituoso resulta na expansão e ativação de uma população de progenitores de imunofibroblastos Pdpn+, levando à regulação positiva dos marcadores de LSC. Classificamos células estromais de glândula salivar Cd45−Cd31−Epcam−Pdpn+ (fig. S4B) antes (H0) e em vários pontos de tempo após a injeção de AdV5 correspondentes ao início muito precoce (3 horas, H3), início [dia 1 (D1) e dia 2 (D2)], pico [dia 8 (D8)] e resolução [dia 23 (D23)] do TLS (n = 3). Usando RNA-seq, identificamos 4277 genes superexpressos em qualquer ponto de tempo durante a indução do TLS (P ajustado < 0,05, fold change >2, análise DESeq 2) (Fig. 4B). Entre eles, conforme observado para a resposta inicial de ASC humano a TNF/LT in vitro, uma superexpressão de quimiocinas e citocinas imunomoduladoras (incluindo Ccl2, Ccl5 e Cxcl10) e moléculas de adesão (incluindo Pdpn, Icam1 e Vcam1) foi detectada já em H3 após a indução (Fig. 4C e tabela S3). A assinatura do TLS em H3 incluiu 2642 genes superexpressos e foi enriquecida para as vias de sinalização de TNF e NF-κB (fig. S4C). A assinatura de imunofibroblasto inicial humano foi enriquecida no GEP de imunofibroblastos TLS Pdpn+ em H3, D1 e D2, ao contrário de D8 e D23, destacando as semelhanças entre o comprometimento de imunofibroblastos inicial murino e humano (fig. S4D). Em seguida, investigamos a expressão de KDM durante o comprometimento de imunofibroblastos murinos in vivo. Notavelmente, a expressão de Kdm6b demonstrou o aumento mais substancial, atingindo o pico em H3 após a indução do TLS (Fig. 4D). Além disso, a assinatura gênica específica de KDM6 humana foi enriquecida em imunofibroblastos TLS Pdpn+ murinos em H3 (Fig. 4E). Consistentemente, a assinatura gênica específica de KDM6 foi enriquecida em FLS de pacientes com AR em comparação com osteoartrite (OA) (P < 0,001) (Fig. 4F), reforçando assim a hipótese do envolvimento da KDM6B na aquisição de um perfil inflamatório em FLS de AR.
Além disso, a análise do atlas de células únicas obtido de órgãos de camundongos e humanos doentes revelou um enriquecimento específico (P < 0,0001) de genes específicos do KDM6 no aglomerado de fibroblastos humanos CCL19+, originários principalmente de pacientes com colite ulcerativa, e em fibroblastos Ccl19+ de camundongo purificados em contextos patológicos (Fig. 4G e fig. S4, E a G). Identificamos Ccl2 e Ccl5, duas quimiocinas envolvidas no recrutamento de monócitos, entre os genes específicos do KDM6 que foram os mais diferencialmente regulados positivamente em fibroblastos Ccl19+ obtidos de órgãos doentes em comparação com tecidos saudáveis (Fig. 4H). Além disso, dentro de subconjuntos de LSC de linfonodo murino, a assinatura gênica específica do KDM6 mostrou-se enriquecida em células reticulares T Cxcl9+, o subconjunto de FRC postulado para direcionar o movimento de células mieloides em tecidos linfoides inflamados (P < 0,001, teste t; fig. S4H e tabela S4). Coletivamente, nossos achados apoiam um papel para KDM6B no comprometimento de precursores de LSC/imunofibroblastos em células que atraem mieloides in vivo, o que poderia contribuir para a inflamação crônica patológica.
KDM6B suporta o comprometimento de imunofibroblastos in vivo.
(A) Enriquecimento de pontuação Seurat da assinatura específica de KDM6 (direita) em atlas de sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) de fibroblastos em estado estacionário (ss) de camundongo, reanalisado por Aproximação e Projeção de Variedade Uniforme (UMAP) (esquerda). (B) Análise de sequenciamento de RNA (RNA-seq) de fibroblastos Pdpn+ purificados de glândulas salivares murinas em diferentes pontos temporais antes (H0) ou após [3 horas (H3), 1 dia (D1), 3 dias (D3); 8 dias (D8) e 23 dias (D23)] indução de estrutura linfoide terciária (TLS) (n = 3). Genes diferencialmente expressos (P ajustado < 0,05, alteração de dobra >2 ou < −2, análise DESeq2) foram representados através de um heatmap, com escore z visualizado através de um código de cores. (C) Heatmap mostrando as contagens normalizadas de genes selecionados em fibroblastos Pdpn+ purificados de glândulas salivares murinas antes (H0) e 3 horas após (H3) indução de TLS (n = 3), com escore z visualizado através de um código de cores. (D) Expressão de histona lisina desmetilases em fibroblastos Pdpn+ purificados de TLS de camundongo nos mesmos pontos temporais que em (B). Dados de RNA-seq foram normalizados com a expressão de H0 como controle, e valores médios de alteração de dobra (n = 3) foram representados de acordo com a escala de código de cores. (E) Enriquecimento de pontuação Seurat da assinatura específica de KDM6 em fibroblastos Pdpn+ purificados de TLS salivar murino em H0, H3 e D2 (n = 3). (F) Enriquecimento de pontuação Seurat da assinatura específica de KDM6 em fibroblastos semelhantes a sinoviócitos de pacientes com osteoartrite (OA) (n = 10) ou artrite reumatoide (AR) (n = 10). Pontuações normalizadas sobre o valor médio de fibroblastos normais (n = 10) foram mostradas (valores são médias ± DP, ***P < 0,001, Mann-Whitney). (G) Enriquecimento de pontuação Seurat da assinatura específica de KDM6 (direita) em dados de scRNAseq de fibroblastos humanos obtidos de várias doenças, reanalisados por UMAP (esquerda). (H) Visualização de dot-blot da assinatura específica de KDM6 em atlas de scRNA-seq de fibroblastos de camundongo em estados perturbados versus estado estacionário. Cada gene foi representado como enriquecimento de alteração de dobra log2 da expressão média no agrupamento Ccl19+ em relação ao agrupamento Pi16+.
Ativação precoce de KDM6B afeta as propriedades imunes dos imunofibroblastos.
Imunofibroblastos e LSC são caracterizados por sua capacidade de interagir com células mieloides, que desempenham, por sua vez, um papel fundamental no início da formação de TLS. A indução de CCL2 e CCL5 durante o comprometimento de imunofibroblastos humanos in vitro foi associada a um recrutamento precoce de KDM6B e P300 nos enhancers de CCL2 e CCL5, conforme avaliado pelo perfil de ligação genômica global de KDM6B por CUT&RUN (fig. S2G) e confirmado por CUT&RUN quantitativo de reação em cadeia da polimerase (qPCR) (Fig. 5A e fig. S5A). No entanto, H3K27me3 não foi afetado nos enhancers de CCL2 e CCL5 após estimulação com TNF/LT nem sob tratamento com GSK-J4 (fig. S5B). KDM6B também demonstrou promover a desmetilação de H3K27me2 em H3K27me1. Em concordância, observamos uma diminuição significativa do nível de H3K27me2 em ambos os enhancers de CCL2 e em um enhancer de CCL5 após tratamento com TNF/LT (Fig. 5B). Esses dados sugerem um envolvimento direto de KDM6B na regulação da expressão de CCL2 e CCL5, por meio da desmetilação de H3K27me2 e acetilação de H3K27. Em concordância, o tratamento com GSK-J4 levou a uma diminuição específica de H3K27ac nos enhancers de CCL2 e CCL5 no D3 (Fig. 5C). A inibição de KDM6 tanto pelo tratamento com GSK-J4 quanto pelo shRNA direcionado a KDM6B subsequentemente diminuiu a expressão de CCL2 e CCL5, conforme visualizado por qPCR (Fig. 5D e fig. S5, C e D) e Luminex D3 (Fig. 5E). Por fim, estabelecemos um ensaio de migração Transwell no qual a migração de monócitos em resposta ao sobrenadante de ASC dependia de CCL2, conforme demonstrado pela forte redução do recrutamento de monócitos na presença de um antagonista de CCR2 (Fig. 5F). O tratamento com GSK-J4 reduziu fortemente a capacidade de ASC estimuladas por TNF/LT de promover a migração de monócitos (n = 7, P < 0,01). Em conjunto, esses dados confirmam um papel da regulação epigenética dependente de KDM6B no comprometimento de precursores de imunofibroblastos em células que atraem mieloides.
A ativação precoce de KDM6B afeta as propriedades imunes dos imunofibroblastos.
(A) Enriquecimento de KDM6B em elementos reguladores de CCL2 e CCL5 obtido por reação em cadeia da polimerase quantitativa CUT&RUN (qPCR) em células estromais derivadas de tecido adiposo (ASCs) tratadas ou não (CTR) com fator de necrose tumoral α (TNF)/linfotoxina α1β2 (LT) por 6 horas (H6) (n = 5). Imunoglobulina G (IgG) foi usada como controle negativo. (B) Enriquecimento de H3K27me2 em elementos reguladores de CCL2 e CCL5 obtido por CUT&RUN qPCR em ASCs tratadas ou não com TNF/LT por 3 dias (D3) (n = 5). O enriquecimento foi normalizado para uma região de controle positivo (MYT1). (C) Enriquecimento de H3K27ac em elementos reguladores de CCL2 e CCL5 obtido por CUT&RUN qPCR em ASCs tratadas ou não (CTR) com TNF/LT por D3, na presença ou não do inibidor de KDM6 GSK-J4 (n = 5). O enriquecimento foi normalizado para uma região de controle positivo (ACTB). (D) RT-qPCR de CCL2 (n = 9) e CCL5 (n = 5) em ASCs tratadas ou não (CTR) com TNF/LT por D3 na presença ou não do inibidor de KDM6 GSK-J4. (E) A concentração de CCL2 e CCL5 foi avaliada por Luminex em sobrenadantes de ASCs tratadas ou não (CTR) com TNF/LT por D3, na presença ou não do inibidor de KDM6 GSK-J4 (n = 6). (F) Migração de monócitos purificados do sangue periférico de doadores saudáveis em resposta a sobrenadantes coletados de ASCs tratadas ou não (CTR) com TNF/LT por D3, na presença ou não do inibidor de KDM6 GSK-J4. Quando indicado, um antagonista específico de CCR2 foi adicionado. O índice de migração celular é calculado como o número de monócitos viáveis DAPI−CD14+ que migram em resposta a sobrenadantes celulares dividido pelo seu número em resposta ao meio de migração (n = 7). (A) a (F) Análises estatísticas foram realizadas usando testes de Mann-Whitney ou testes de Wilcoxon para pares correspondentes de sinais classificados (valores são médias ± DP, *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001).
DISCUSSÃO
Nosso estudo explora como mecanismos epigenéticos, em particular a regulação dependente de KDM6B da marca de histona H3K27, contribuem para o comprometimento de precursores estromais humanos e murinos em LSC/imunofibroblastos imunocompetentes em contextos normais e inflamatórios. A via do LT regula a programação inicial das células estromais dos linfonodos mesentéricos e imprime seu perfil transcriptômico adulto e a imunidade mucosa resultante. Além disso, a remodelação da rede madura de LSC é influenciada pela exposição prévia a infecções. Esse treinamento inflamatório das LSC foi recentemente associado a níveis aumentados de H3K4me3 e à resposta metabólica a infecções secundárias. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes e o estágio inicial da diferenciação das LSC afetados por essas modificações não foram explorados. Até que ponto a KDM6B é o único impulsionador desse treinamento imune inato dependente de estroma no contexto da resposta imune normal ainda precisa ser estudado. Nesse sentido, descrevemos aqui os estágios iniciais dependentes de TNF/LT do comprometimento de imunofibroblastos in vitro e in vivo. No entanto, estímulos externos adicionais, produzidos por células imunes infiltrantes, e outros impulsionadores moleculares/epigenéticos seriam necessários para desencadear a diferenciação terminal e manter o fenótipo funcional do estroma imune. Além do perfil molecular do comprometimento de imunofibroblastos humanos e murinos normais, identificamos a assinatura gênica específica de KDM6B como enriquecida em contextos patológicos, incluindo em fibroblastos de AR e em fibroblastos CCL19+ relacionados a doenças identificados na colite autoimune. Fibroblastos CCL19+ também são comumente encontrados na síndrome de Sjögren, uma doença mimetizada pelo modelo in vivo de TLS salivar. O envolvimento da KDM6B ou de outros moduladores epigenéticos na iniciação, manutenção ou reativação do estroma patogênico semelhante a LSC durante a inflamação crônica ainda não está claro. Para esse fim, o uso da deleção de KDM6B em células precursoras Fap+ ou Ccl19+ seria útil para decifrar o destino celular de precursores de LSC/imunofibroblastos ativados aguda ou cronicamente na ausência de KDM6B.
Aqui, propusemos que a KDM6B se liga diretamente a elementos regulatórios, particularmente a potenciadores gênicos, relacionados ao fenótipo de imunofibroblasto, e que o tratamento com GSK-J4 poderia prevenir o comprometimento dos imunofibroblastos ao abolir a acetilação dos potenciadores gênicos dos imunofibroblastos. No entanto, como a KDM6B é especificamente direcionada à cromatina em resposta ao tratamento com TNF/LT precisa ser completamente elucidado. TNF e LT ativam sinergicamente as vias NF-κB canônica e não canônica, ambas necessárias para a diferenciação de LSC. A análise dos motivos dos sítios de ligação da KDM6B destacou uma forte associação com motivos NF-κB, sugerindo que a KDM6B poderia ser direcionada para genes LSC/imunofibroblásticos através de membros do NF-κB. Foi demonstrado anteriormente que a KDM6B interage com RELA para induzir a transcrição de genes inflamatórios em resposta ao TNF em queratinócitos através da atividade de desmetilação de histonas. Embora a KDM6B tenha sido inicialmente descrita como uma desmetilase de H3K27me3, não observamos modificação nos níveis de H3K27me3 durante o comprometimento dos imunofibroblastos nos potenciadores de CCL2 e CCL5. No entanto, a KDM6B também regula o nível de H3K27me2 em células epiteliais infectadas, e notamos que os níveis de H3K27me2 diminuíram após a estimulação com TNF/LT, concomitantemente com um ganho de acetilação de H3K27. Juntos, nossos dados apoiam a importância da KDM6B para a regulação de CCL2 e CCL5. No entanto, a interação molecular entre KDM6B, membros do NF-κB e C/EBPβ/P300, para a regulação das modificações de H3K27, necessita de investigação adicional.
Por fim, observamos que a KDM6B estava envolvida no controle epigenético da CCL2 em imunofibroblastos em diferenciação, levando ao recrutamento precoce de monócitos. Os fibroblastos da polpa vermelha do baço participam da manutenção da rede de macrófagos da polpa vermelha por meio da expressão de CCL2 e CCL7. Além disso, o recrutamento de monócitos mediado por CCL2 pelas LSC está envolvido na prevenção de uma resposta imune excessiva, um mecanismo que pode estar desregulado em doenças autoimunes. Na lesão intestinal, as MSCs apoiam a polarização de macrófagos liberadores de IL-10 por meio da produção de heterodímeros de CCL2 e CXCL12. O CXCL12 derivado de FLS também está envolvido no recrutamento de monócitos no sinóvio da AR. Acredita-se que a KDM6B regule o CXCL12 em células de glioblastoma, sugerindo que ela pode afetar tanto a produção de CCL2 quanto de CXCL12. Essas descobertas, juntamente com a identificação de um enriquecimento da assinatura gênica específica da KDM6B em FLS de AR, sugerem que a KDM6B pode ser um alvo relevante em doenças autoimunes, como proposto recentemente em um modelo de mastite induzida por inflamação. Além disso, a superexpressão de CCL2 em precursores mesenquimais tem sido associada ao fenótipo de fibroblastos associados ao câncer. Células estromais infiltrantes do tumor superexpressam CCL2 em um modelo de linfoma em camundongos, levando ao recrutamento de macrófagos por meio do eixo CCR2. Da mesma forma, as células B do linfoma folicular desencadeiam a expressão de CCL2 em células estromais humanas e induzem o recrutamento de monócitos, organizando assim os nichos de células do linfoma folicular em linfonodos invadidos e medula óssea. Mais recentemente, no mieloma múltiplo, um subconjunto de células estromais da medula óssea inflamadas ativadas por TNF e IL-1β demonstrou expressar CCL2 e interagir com células mieloides. Se a KDM6B está envolvida nesse processo ainda não foi explorado. A inibição da KDM6B já é uma opção terapêutica promissora no linfoma de células B devido ao seu efeito direto nas células B tumorais. A KDM6B promove a sobrevivência de células B malignas do linfoma difuso de grandes células B agressivo, e sua inibição sensibiliza o linfoma difuso de grandes células B aos agentes quimioterápicos. Compreender os mecanismos epigenéticos e moleculares que impulsionam o comprometimento e as propriedades imunes dos imunofibroblastos LSC/imunofibroblastos seria um pré-requisito para impulsionar as respostas vacinais ou reprogramar essas células em contextos patológicos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Amostras de tecido e células humanas
Os pacientes foram recrutados sob aprovação do conselho de revisão institucional após o processo de consentimento informado de acordo com a Declaração de Helsinque e as recomendações do comitê de ética do Instituto Nacional do Câncer da França. As lipoaspirações foram realizadas em adultos submetidos à dermolipectomia abdominal. As ASCs foram obtidas da fração vascular estromal do tecido adiposo de doadores magros essencialmente conforme descrito e foram amplificadas em um meio Eagle modificado Mínimo Essencial (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS) (Biosera) e fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) (1 ng/ml; Cellgenix). As ASCs foram então utilizadas entre as passagens 1 e 3 para todos os experimentos que foram realizados no mesmo meio sem suplementação de bFGF. Monócitos do sangue periférico de doadores saudáveis foram purificados usando o kit de isolamento de monócitos II (Miltenyi Biotech) e foram usados diretamente para ensaio de migração.
Cultura de células estromais
As ASCs foram tratadas com TNF (5 ng/ml)/linfotoxina α1β2 (LT) (50 ng/ml) (R&D Systems) e coletadas em diferentes pontos de tempo. Quando indicado, o inibidor de KDM6 GSK-J4 (20 μM) (Tocris) ou dimetilsulfóxido como controle foram adicionados a cada dia. As ASCs também foram tratadas com um painel de outros fatores pró/anti-inflamatórios incluindo IFN-γ (100 UI/ml), LPS (10 ng/ml), Poly I:C (1 μg/ml) e IL-17 (10 ng/ml, R&D Systems).
Camundongos e indução de TLS
C57BL/6 foram criados e mantidos sob condições específicas livres de patógenos na Unidade de Serviços Biomédicos da Universidade de Birmingham, de acordo com as regulamentações do Home Office e do comitê de ética local. As glândulas submandibulares de camundongos (de 8 a 12 semanas de idade) foram canuladas intraductalmente com 10⁸ a 10⁹ unidades formadoras de placas de adenovírus defectivo para replicação (AdV5), conforme descrito anteriormente, para induzir a formação de TLS ectópicos. A digestão tecidual foi realizada em meio RPMI 1640 contendo dispase (0,8 mg/ml), colagenase P (0,2 mg/ml) e desoxirribonuclease I (DNase I) (0,1 mg/ml) e 2% (v/v) de soro fetal bovino (FCS) por 20 min a 37°C com agitação suave. Após 20 min, os fragmentos de tecido foram pipetados muito suavemente para romper ainda mais o tecido e liberar a maioria das células. Os tubos foram colocados no banho-maria para permitir que os fragmentos grandes sedimentassem por 30 s, então o sobrenadante foi removido e colocado em um tubo Falcon de 50 ml preenchido com 10 ml de tampão de lavagem gelado [0,5% (p/v) de albumina sérica bovina e 2 mM de EDTA em solução salina tamponada com fosfato] e com um filtro de 7 μm. Uma nova mistura enzimática [2 ml; meio RPMI 1640 contendo dispase (0,8 mg/ml), colagenase P (0,2 mg/ml) e DNase I (0,1 mg/ml)] e 2% (v/v) de FCS foi adicionada aos tubos de digestão, e o conteúdo foi suavemente misturado e incubado por 10 min. O tecido foi vigorosamente pipetado no meio de digestão usando uma pipeta de 1 ml para digerir completamente os fragmentos de tecido. A suspensão celular foi transferida para o tubo Falcon de 50 ml da etapa anterior. Cada tubo de 50 ml agora continha todo o conteúdo celular do tecido digerido. Os tubos de coleta foram centrifugados a 1800 rpm por 10 min a 4°C. As células foram coradas com o corante de viabilidade eFluor 780 (eBiosciences) de acordo com as instruções do fabricante, seguidas pela coloração de anticorpos para CD45 (30-F11, RRID:AB_893344), CD326/Epcam (G8.8, RRID:AB_1134102), CD31 (390, RRID:AB_2910329) e Pdpn (gp38; 8.1.1, RRID:AB_2161928), todos da BioLegend. As células coradas foram classificadas usando BD FACSAria. A pureza das células estromais classificadas como Pdpn⁺Cd31⁻Epcam⁻Cd45⁻ rotineiramente excedeu 96%.
qPCR em tempo real
O RNA foi extraído de ASC humano usando o kit NucleoSpin RNA Plus (Macherey-Nagel). O cDNA foi sintetizado usando transcriptase reversa Superscript II e primers Oligo-dT (Life Technologies). O q-PCR foi então realizado usando SYBR Green Master Mix (Life Technologies) e primers específicos para os genes (Eurogentec) listados na tabela S5. A expressão gênica foi medida usando StepOnePlus (Life Technologies). Para cada amostra, a expressão dos genes de interesse foi determinada a partir de uma curva padrão de um pool de amostras de RNA e normalizada para o valor médio do gene de referência RPLP0.
Quando indicada, a expressão gênica foi avaliada utilizando o sistema Fluidigm BioMark HD. Neste caso, os cDNAs foram obtidos utilizando o Fluidigm reverse transcription Master Mix e, em seguida, pré-amplificados por 12 ciclos na presença de Pre-Amp Master Mix e uma mistura de primers combinados. A expressão gênica foi então medida com o EvaGreen Master Mix em uma matriz dinâmica 96.96 IFC. Após a verificação do controle de qualidade, a expressão gênica foi calculada com o método de cálculo ΔCt, utilizando RPLP0 como gene de referência.

Citometria de fluxo
Células viáveis foram analisadas após a exclusão de células DAPI+ (Life Technologies) utilizando os seguintes anticorpos monoclonais: anti-PDPN conjugado com ficoeritrina (clone NZ-1.3, RRID:AB_1582262, Ebiosciences) para coloração de ASC e imunofibroblastos, e anti-CD14 conjugado com ficoeritrina (clone M5E2, RRID:AB_396848, BD Pharmingen) para coloração de monócitos. Anticorpos monoclonais isotípicos apropriados foram utilizados para obter as razões de intensidade de fluorescência média, e as contagens celulares foram realizadas com fluorosferas de contagem de fluxo (Beckman Coulter) para determinar um índice de migração de monócitos. As análises foram realizadas utilizando citômetros de fluxo CytoFLEX ou Gallios (Beckman Coulter).

Sequenciamento de RNA
Dois experimentos de estimulação de células estromais foram realizados. Primeiro, três lotes independentes de ASC foram tratados ou não com tratamento TNF/LT por D3. Em seguida, quatro lotes independentes de ASC foram tratados ou não com TNF/LT na presença ou ausência do inibidor de KDM6 GSK-J4 por H6. A extração de RNA foi realizada com o kit NucleoSpin RNA Plus (Macherey-Nagel), e a pureza e integridade do RNA foram verificadas com o Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Todas as bibliotecas e sequenciamentos foram realizados pelo Institut Curie (Paris, França). Resumidamente, as bibliotecas de RNA-seq foram sequenciadas com leituras pareadas de 2 × 100 pb no sequenciador Illumina Hiseq 2500, gerando mais de 45 milhões de leituras por amostra, com >80% das sequências atingindo pontuações de qualidade Phred > Q30. Os dados brutos de leitura de sequenciamento foram verificados e visualizados quanto à qualidade usando FastQC (v0.11.5). As leituras de sequenciamento de RNA em massa de próxima geração foram alinhadas ao genoma de referência GRCh37 release 87 usando STAR (v2.5.2). A sumarização de leituras, contagens de genes e transcritos foi realizada usando featureCounts (versão 1.5.0). A expressão gênica diferencial foi analisada usando o algoritmo DESeq2 (v1.22.2). Genes significativos foram definidos como P < 0,01 após ajuste para falsa descoberta pela correção de Bonferroni. Para ASC nativas classificadas, essas células foram alinhadas com subconjuntos de LSC humanos de GSE148656 ao genoma de referência GRCh38 release 90 usando STAR (v2.5.2).
Para o estudo em camundongos, após a separação das células estromais Pdpn+ em diferentes pontos temporais pós-indução de TLS, a extração de RNA foi realizada com o kit NucleoSpin RNA Plus mini (Macherey-Nagel), e a pureza e integridade do RNA foram verificadas com o Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Os dados brutos de leitura de sequenciamento foram verificados e visualizados quanto à qualidade usando FastQC (v0.11.5). As leituras de sequenciamento de nova geração de RNA em massa foram alinhadas ao genoma de referência GRCm38 release 100 usando STAR (v2.5.2). A sumarização das leituras, bem como a contagem de genes e transcritos, foi realizada usando o featureCounts (versão 1.5.0). A expressão gênica diferencial foi analisada usando o algoritmo DESeq2 (v1.22.2). Genes significativos foram definidos como P < 0,05 após ajuste para falsa descoberta pela correção de Benjamini-Hochberg.
CUT&RUN
O protocolo CUT&RUN foi utilizado com pequenas modificações. Resumidamente, ASCs foram comprometidas em imunofibroblastos (precoces ou tardios) e, quando especificado, o inibidor de KDM6 GSK-J4 foi adicionado. Resumidamente, as células (1.103) foram ligadas a beads de Concanavalina A (Polysciences) e incubadas com 2 μl de anticorpo anti-H3K27ac (Cell Signaling Technology, D5E4, RRID:AB_10949503), 2 μl de anticorpo anti-H3K27me3 (Cell Signaling Technology, C36B1, RRID:AB_2616029) ou 2 μl de anticorpo anti-H3K27me2 (Diagenode, C15410046, policlonal) por 1 hora à temperatura ambiente, ou com 1 μl de anticorpo anti-KDM6B (Abcam, ab38113, RRID:AB_943898) ou 2 μl de anticorpo p300 (Diagenode, C15200211), durante a noite a 4°C. Para cada experimento, um anticorpo de coelho de imunoglobulina G (IgG) negativo foi usado como controle (DA1E, Cell Signaling Technology, RRID:AB_1550038). pA/G-MNase (0,89 ng/μl) foi ligada aos anticorpos e ativada com CaCl2 para digerir a cromatina durante 30 min a 0°C. A reação enzimática foi interrompida e os fragmentos de cromatina foram liberados por uma incubação de 10 min a 37°C. A sonicação da cromatina foi realizada com o EpiShear Probe Sonicator (Active Motif). O DNA foi purificado com o MinElute PCR Purification Kit (Qiagen). Todos os iniciadores usados neste estudo estão listados na tabela S6. Para experimentos de CUT&RUN de KDM6B, os fragmentos de DNA eluídos foram submetidos a sequenciamento de nova geração (NGS), as bibliotecas foram preparadas pela INTEGRAGEN, usando o NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit, contendo preparação de extremidades, cauda A e etapa de ligação de adaptadores indexados Illumina. Após a medição da concentração por qPCR, as bibliotecas são sequenciadas em um Illumina NovaSeq como leituras pareadas de 100 pb.
Análise de dados de CUT&RUN-seq
FASTQC (v 0.11.5) foi utilizado para verificar a qualidade das reads, e reads de baixa qualidade foram descartadas. As reads de CUT&RUN-seq foram então alinhadas ao genoma humano (hg19) usando a ferramenta Bowtie2, e os picos foram identificados com MACS2, usando o input como background, sendo mantidos apenas os picos com um FDR mínimo < 10⁻⁵. O pacote R ChIPseeker (v4.1) com a função annotatePeak() foi então utilizado para anotar os picos com suas localizações genômicas e associá-los ao gene mais próximo. A análise diferencial de ligação dos picos foi então realizada com o algoritmo DESeq2 (v1.22.2). Picos significativos foram definidos como P < 0,05 após ajuste para falsa descoberta pela correção de Benjamini-Hochberg. O DeepTools 3.5.0 foi então utilizado com a função computeMatrix para calcular o enriquecimento de KDM6B ao redor de regiões específicas do genoma (−2 kb/+2 Kb), e os escores foram então visualizados com as funções plotHeatmap e plotProfiles. O perfil de ligação de KDM6B como arquivo bigwig também foi visualizado em genes específicos usando o Integrative Genomics Viewer (https://igv.org/app/). Primers foram desenhados nessas regiões e utilizados para experimentos de CUT&RUN-qPCR.
Análise de microarranjos
Os dados brutos de microarranjos correspondentes a ASC e adipócitos (GSE 77532), bem como fibroblastos saudáveis, FLS de OA e AR (GSE 55235), foram baixados do banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) do National Center for Biotechnology Information. Os arranjos foram normalizados de acordo com o procedimento de normalização GC-RMA. A matriz normalizada subsequente foi então utilizada para a análise de enriquecimento Seurat. Para cada gene, o conjunto de sondas com a maior expressão foi retido. Os dados normalizados foram então utilizados para a análise de enriquecimento subsequente. Para o GSE 77523, a análise diferencial dos níveis de expressão gênica foi então realizada com o pacote Limma no software R. Valores de P ajustados por Benjamini e Hochberg < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Visualização e representação dos dados
A visualização dos genes diferencialmente expressos foi feita usando os pacotes pheatmap e ggplot do R. Diagramas de Venn foram obtidos com o InteractiVenn (www.interactivenn.net/). O enriquecimento da assinatura gênica específica de KDM6 foi calculado com o pacote Seurat do R (V4.0). Resumidamente, os dados transcriptômicos em massa foram convertidos em um objeto Seurat e os escores de assinatura foram calculados com a função AddModuleScore do pacote Seurat do R. Esta função calcula para cada amostra individual a expressão média de cada assinatura gênica, subtraída pela expressão agregada de conjuntos de genes controle. Todos os genes analisados foram agrupados em 25 bins com base em sua expressão média, e para cada gene da assinatura gênica, 100 genes controle foram selecionados aleatoriamente do mesmo bin que o gene. Quando necessário, os nomes dos genes foram convertidos para seus equivalentes murinos com um script R caseiro e o pacote homologene. Os escores das amostras foram então visualizados através do GraphPad.
Enriquecimento de fatores de transcrição
O enriquecimento para motivos de TF foi avaliado com HOMER usando o comando findMotifs.pl com parâmetro padrão e a adição do parâmetro -bg para correção de fundo com a lista de al identify peak. O enriquecimento para alvos de TF a partir de dados transcriptômicos foi realizado com Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/) consultando o banco de dados TRRUST Transfection Factor 2019.

Quantificação de quimiocinas
IL-8, CCL2 e CCL5 foram quantificados por ensaio imunoenzimático multiplex (Luminex, Millipore) nos sobrenadantes de ASC estimuladas ou não com TNF/LT na presença ou não do inibidor de KDM6 GSK-J4 durante D3.

Ensaio de migração
Monócitos do sangue periférico recém-purificados (105 células/100 μl) foram adicionados em RPMI–1% FCS (meio de migração de monócitos) ao compartimento superior de câmaras Transwell com filtros de poros de 5 μm. Os compartimentos inferiores continham sobrenadantes de células estromais primadas por D3 com TNF/LT com ou sem inibição de KDM6 por GSK-J4 em RPMI-1% FCS. O receptor CCR2 em monócitos foi bloqueado ou não por um pré-tratamento (10 min) com um antagonista específico de CCR2 (Sigma-Aldrich, sc-202525) a 10 nM. O número absoluto de monócitos viáveis DAPI− CD14+ no compartimento inferior da câmara Transwell foi quantificado por citometria de fluxo usando beads FlowCount após 2 horas de migração. O índice de migração celular foi calculado como o número de células viáveis DAPI−CD14+ que migraram em resposta aos sobrenadantes celulares dividido pelo seu número em resposta ao meio de migração.

Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism 6.0 usando o teste não paramétrico de Wilcoxon para pares correspondentes ou o teste U não paramétrico de Mann-Whitney, conforme apropriado.

Materiais Suplementares
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REFERÊNCIAS E NOTAS
Interações entre células estromais e células imunes
Sequenciamento de RNA de célula única de células estromais de linfonodos revela heterogeneidade associada ao nicho
Identificação de um novo subconjunto de células estromais de linfonodos envolvidas na regulação da homeostase de células plasmáticas
Propriedades fenotípicas e morfológicas de células reticulares da zona escura do centro germinativo que expressam Cxcl12
Desenvolvimento e função imunológica das células estromais dos linfonodos
A remodelação das células dendríticas foliculares das zonas clara e escura regula as respostas do centro germinativo
Um atlas de célula única de células não hematopoiéticas em linfonodos humanos e linfoma revela um panorama de remodelação estromal
Ontogenia das células organizadoras estromais durante o desenvolvimento dos linfonodos
A sinalização do receptor de linfotoxina-β pela via NF-κB2-RelB reprograma precursores de adipócitos como células estromais de linfonodos
Formação induzida por inflamação de aglomerados linfoides associados à gordura
Estruturas linfoides terciárias: Diversidade em seu desenvolvimento, composição e papel
Imunofibroblastos são impulsionadores fundamentais da formação de estruturas linfoides terciárias e da patologia local
Fibroblastos como reguladores imunes em infecção, inflamação e câncer
Análise de célula única de lesões da doença de Crohn identifica um módulo celular patogênico associado à resistência à terapia anti-TNF
A inflamação recapitula a ontogenia das células estromais linfoides
Mecanismos imunológicos orquestram estruturas linfoides terciárias em tumores através de fibroblastos associados ao câncer
Estudo integrado transcriptômico, fenotípico e funcional revela propriedades imunológicas específicas de tecido de células estromais mesenquimais
O loop IL-4/CXCL12 é um regulador chave da função do estroma linfoide no linfoma folicular
Reprogramação celular direta: Abordagens, mecanismos e progresso
Regulação da cromatina no desenvolvimento: Compreensão atual e abordagens
A desmetilase de histona Jmjd3 regula a diferenciação de osteoblastos através dos fatores de transcrição Runx2 e osterix
JMJD3 promove proliferação e hipertrofia de condrócitos durante a formação óssea endocondral em camundongos
As desmetilases de histona KDM4B e KDM6B promovem a diferenciação osteogênica de MSCs humanas
O eixo regulatório ERα/KDM6B modula a diferenciação osteogênica em células-tronco mesenquimais humanas
A desmetilase de histona H3 lisina-27 Jmjd3 liga a inflamação à inibição do silenciamento gênico mediado por polycomb
A ativação dependente de JMJD3 e NF-κB do gene Notch1 é necessária para a migração de queratinócitos durante a cicatrização de feridas cutâneas
A regulação positiva da desmetilase H3K27 KDM6 durante a infecção pelo vírus sincicial respiratório aumenta as respostas pró-inflamatórias e a imunopatologia
A desmetilase de histona proteína 3 contendo domínio Jumonji (JMJD3) regula a ativação de fibroblastos na esclerose sistêmica
A desmetilase de histona JMJD3 regula a proliferação mediada por sinoviócitos semelhantes a fibroblastos e a destruição articular na artrite reumatoide
Genes inflamatórios induzidos por TNF escapam da repressão em sinoviócitos semelhantes a fibroblastos: Análise transcriptômica e epigenômica
Desenvolvendo um sistema de cultura 3D de linfoma de células B para modelar terapia com anticorpos
Organização entre tecidos da linhagem de fibroblastos
O linfoma folicular desencadeia remodelação fenotípica e funcional do panorama das células estromais linfoides humanas
Análise genômica ampla da expressão gênica durante a adipogênese em células estromais derivadas de tecido adiposo humano revela novos padrões de expressão gênica durante a diferenciação de adipócitos
Papel dos receptores toll-like em células estromais derivadas de tecido adiposo humano
O treinamento de células reticulares fibroblásticas dependente de IL-17 potencializa a imunidade mucosal protetora de tecido através de células B produtoras de IL-10
Perfil genômico amplo direcionado in situ com alta eficiência para baixo número de células
Estruturas linfoides terciárias induzíveis, autoimunidade e disfunção exócrina em um novo modelo de inflamação da glândula salivar em camundongos C57BL/6
Identificação de pacientes com artrite reumatoide e osteoartrite por geração de conjunto de regras baseado em transcriptoma
Interações recíprocas entre fibroblastos e macrófagos na saúde, fibrose e câncer
A desmetilase de histona KDM6B ajusta finamente a resposta do hospedeiro ao Streptococcus pneumoniae
Programação no início da vida da identidade das células estromais dos linfonodos mesentéricos pela via da linfotoxina regula a imunidade mucosal adulta
Infecção programa respostas sustentadas de células estromais linfoides e molda a remodelação dos linfonodos após desafio secundário
Atlas estromal de célula única entre tecidos identifica fenótipos patológicos compartilhados de fibroblastos em quatro doenças inflamatórias crônicas
Células organizadoras de tecido linfoide FAP+ embrionárias geram a rede reticular dos linfonodos adultos
A maturação das células reticulares fibroblásticas dos linfonodos a partir de precursores miofibroblásticos é crítica para a imunidade antiviral
Diferenciação e ativação das células reticulares fibroblásticas
Fibroblastos reticulares que expressam o fator de transcrição WT1 definem um nicho estromal que mantém e reabastece os macrófagos da polpa vermelha esplênica
CCL2 estromal dos linfonodos limita as respostas de anticorpos
CCL2 e CXCL12 derivados de células estromais mesenquimais polarizam cooperativamente macrófagos teciduais IL-10+ para mitigar lesão intestinal
A hipóxia induz a regulação positiva do fator 1 derivado de células estromais em sinoviócitos semelhantes a fibroblastos, contribuindo para a migração de monócitos para o tecido sinovial na artrite reumatoide
JMJD3 promove a transição epitélio-mesenquimal e a migração de células de glioma via eixo CXCL12/CXCR4
O inibidor da histona desmetilase JMJD3, GSK-J1, melhora a inflamação induzida por lipopolissacarídeo em um modelo de mastite
Células estromais mesenquimais residentes no tumor conferem propriedades promotoras de tumor a células estromais ingênuas
Células estromais mesenquimais orquestram o nicho de células de linfoma folicular por meio do recrutamento e polarização dependentes de CCL2 de monócitos
O microambiente do mieloma múltiplo é definido por uma paisagem de células estromais inflamatórias
JMJD3 promove a sobrevivência de subtipos de linfoma difuso de grandes células B por meio de mecanismos distintos
A inibição da desmetilase KDM6B sensibiliza o linfoma difuso de grandes células B a drogas quimioterápicas
A hipóxia modula diferencialmente a estabilidade genômica de ADSCs e BM-MSCs de grau clínico em cultura de longo prazo
ChIPseeker: Um pacote R/Bioconductor para anotação, comparação e visualização de picos de ChIP
Combinações simples de fatores de transcrição determinantes de linhagem preparam elementos cis-regulatórios necessários para as identidades de macrófagos e células B
TRRUST v2: Um banco de dados de referência expandido de interações regulatórias transcricionais humanas e de camundongos