pmid: "41406225"
title: "O lncRNA LINC-PINT controla a função linfática e o perfil inflamatório no linfedema."
authors: "Laugero N, Peghaire C, Verdu L, Balzan E, Draia-Nicolau T, Sylvestre R, Malloizel-Delaunay J, Bura-Rivière A, Morfoisse F, Prats AC, Lacazette E, Garmy-Susini B"
journal: "Science advances"
pubdate: "2025 Dec 19"
doi: "10.1126/sciadv.aea2960"
source: "PMC Full Text"
O lncRNA LINC-PINT controla a função linfática e o perfil inflamatório no linfedema.
Autores
Laugero N, Peghaire C, Verdu L, Balzan E, Draia-Nicolau T, Sylvestre R, Malloizel-Delaunay J, Bura-Rivière A, Morfoisse F, Prats AC, Lacazette E, Garmy-Susini B
Periodico
Science advances (2025 Dec 19)
Conteudo
lncRNA LINC-PINT controla a função linfática e o perfil inflamatório no linfedema
O linfedema é uma disfunção linfática que leva ao acúmulo de líquido e gordura no braço ou na perna. Aqui, realizamos o perfil de RNA não codificante do linfedema secundário induzido por câncer de mama humano. Identificamos o RNA longo intergênico não codificador de proteína, transcrito induzido por P53 (LINC-PINT), como essencial para o desenvolvimento do linfedema. LINC-PINT é o lncRNA mais expresso em células endoteliais linfáticas humanas (LECs) sob condição de estresse. A eliminação de LINC-PINT em LECs promove a expressão de genes relacionados à inflamação. Mecanicamente, o ATAC-seq revelou que LINC-PINT induz a transcrição de genes envolvidos na linfangiogênese e adesão de células imunológicas ao aumentar a acessibilidade da cromatina. Notavelmente, a deficiência de LINC-PINT prejudica a proliferação, migração e brotamento das LECs. A deleção condicional de Lnc-Pint no endotélio linfático de camundongos (Lnc-Pintlecko) leva a uma redução na densidade da rede linfática dérmica. Camundongos Lnc-Pintlecko apresentam diminuição do linfedema, redução do refluxo dérmico, fibrose e inflamação. Nossas descobertas revelam um papel molecular crucial de LINC-PINT na função linfática e têm implicações clínicas substanciais para o lncRNA como biomarcador do linfedema.
O RNA longo não codificador LINC-PINT controla a disfunção linfática e a inflamação no linfedema secundário associado ao câncer de mama.
INTRODUÇÃO
O linfedema é uma incapacidade crônica causada por lesão linfática, levando à estase linfática seguida de acúmulo de gordura no braço ou na perna. É caracterizado por deposição substancial de colágeno nos tecidos dérmico e adiposo, resultando em um estágio irreversível da doença. Nos países ocidentais, o linfedema secundário, que é a forma clinicamente prevalente do linfedema, surge após a ruptura iatrogênica dos vasos linfáticos, mais frequentemente devido a tratamentos contra o câncer, como ressecção de linfonodos, quimioterapia ou radioterapia.
Fisiopatologicamente, o linfedema secundário é caracterizado por inflamação crônica, infiltração de células imunes e remodelamento tecidual progressivo que culmina em fibrose. Notavelmente, a ativação de células T CD4+ após lesão linfática orquestra a liberação de citocinas profibróticas [por exemplo, interleucina-4 (IL-4), IL-13 e fator de crescimento transformador β1], prejudicando a função linfática e resultando na degradação dos vasos linfáticos, que são compostos principalmente por células endoteliais linfáticas (LECs). Todas essas alterações levam a mudanças na expressão gênica no membro linfedematoso. Assim, as LECs respondem a esses insultos com expressão gênica alterada, embora os reguladores moleculares que orquestram tais respostas permaneçam incompletamente definidos. Os controles epigenéticos e transcricionais são claramente fundamentais, mas modelos de regulação linfática historicamente subestimaram os RNAs longos não codificantes, que são atores-chave na regulação da expressão gênica. RNAs longos não codificantes (lncRNAs), transcritos com extensão superior a ~200 nucleotídeos, têm potencial limitado ou nulo de codificação de proteínas. Eles podem exibir notável especificidade tecidual e de tipo celular, frequentemente superando a dos mRNAs em contextos de desenvolvimento e fisiológicos. Funcionalmente, os lncRNAs atuam intracelularmente por meio de diversos mecanismos em suas próprias células: suporte nuclear de complexos epigenéticos, recrutamento de fatores de transcrição (TF), remodelamento da cromatina, "sequestro" de miRNAs e regulação pós-transcricional, como estabilidade do mRNA e modulação da tradução. Embora a maioria dos lncRNAs desempenhe funções regulatórias dentro da célula que os produz, alguns podem ser exportados para o ambiente extracelular via exossomos ou microvesículas e, então, modular a expressão gênica em células receptoras.
No entanto, os lncRNAs estão fortemente envolvidos em doenças vasculares. Por exemplo, o lncRNA PSMB8-AS1 controla a inflamação vascular e agrava a aterosclerose, enquanto o lncRNA PSR regula o remodelamento vascular. Recentemente, o lncRNA 1 regulador transcricional endotelial linfático (LETR1) foi identificado como o primeiro lncRNA específico de LEC. O LETR1 atua como suporte nuclear para complexos epigenéticos. O LETR1 fornece a primeira evidência da importância dos lncRNAs na regulação de funções celulares endoteliais específicas de linhagem. Outros lncRNAs, como VESTAR e NEAT1, podem afetar indiretamente a função linfática ao induzir a expressão de fatores de crescimento linfangiogênicos. No entanto, as funções dos lncRNAs na doença vascular linfática, em particular no linfedema, permanecem não abordadas.
Neste estudo, examinamos o repertório da expressão de genes não codificantes no linfedema. Sequenciamos RNAs não codificantes de biópsias de tecido de pacientes que desenvolveram linfedema após tratamento para câncer de mama e comparamos esses RNAs não codificantes com aqueles de tecido normal e não lesionado dos mesmos pacientes. Identificamos o transcrito induzido por P53 de RNA longo intergênico não–codificador de proteína (LINC-PINT) como o principal lncRNA que controla a função linfática no linfedema. LINC-PINT é um lncRNA amplamente expresso. Sua expressão é regulada transcricionalmente pelo supressor tumoral p53, bem como por estímulos externos, incluindo fator de necrose tumoral (TNF) e tratamentos com d-glicose.
LINC-PINT atua como um RNA regulador do complexo repressivo polycomb 2 (PRC2), que é um complexo proteico que modifica a estrutura da cromatina e regula a expressão gênica. LINC-PINT guia o PRC2 para regiões genômicas específicas, reprimindo a expressão gênica. Por meio de sua associação com o PRC2, LINC-PINT influencia a expressão de genes envolvidos na regulação do ciclo celular, diferenciação e desenvolvimento, participando assim da manutenção da homeostase celular e prevenindo o desenvolvimento tumoral ao controlar a expressão de genes críticos.
A superexpressão de LINC-PINT foi observada no diabetes tipo 2 e no infarto agudo do miocárdio, sugerindo que LINC-PINT pode inibir a progressão dessas doenças. Por outro lado, LINC-PINT é regulado negativamente em muitos cânceres e considerado um marcador de gravidade da doença. Em linhagens celulares de carcinoma colorretal e de pulmão, LINC-PINT inibe proliferação, migração e invasão, enquanto promove viabilidade e proliferação celular em linhagens de células epiteliais do pigmento retiniano, linhagens de cardiomiócitos e linhagens de células β pancreáticas. LINC-PINT só recentemente foi investigado em biologia vascular, e foi demonstrado que ele atenua a angiopatia amiloide cerebral na doença de Alzheimer.
Descobrimos que LINC-PINT é significativamente regulado positivamente no linfedema e é o lncRNA mais altamente expresso em LECs. LINC-PINT controla a acessibilidade da cromatina em LECs, o que leva à expressão de genes inflamatórios. O knockdown de LINC-PINT reduziu o linfedema, normalizou os vasos coletores linfáticos e fez com que os macrófagos se diferenciassem no fenótipo anti-inflamatório M2. Nossos achados fornecem insights sobre os mecanismos do linfedema e identificam um potencial biomarcador para uma necessidade médica não atendida.
RESULTADOS
Identificação do lncRNA LINC-PINT como um potencial regulador do linfedema secundário associado ao câncer de mama
Evidências crescentes sugerem um papel importante dos lncRNAs na biologia vascular e em doenças, principalmente no contexto dos vasos sanguíneos. Um estudo recente identificou elegantemente lncRNAs específicos de linhagem que são expressos especificamente em LECs e demonstrou que o lncRNA LETR1 regula funções-chave dos vasos linfáticos in vitro. No entanto, o papel potencial dos lncRNAs na linfangiogênese e em doenças associadas à disfunção dos vasos linfáticos não foi investigado a fundo in vivo.
Para identificar a lista de lncRNAs que poderiam estar envolvidos no desenvolvimento do linfedema associado ao câncer de mama, realizamos sequenciamento de RNA em massa de dermolipectomias de quatro pacientes, seguido por uma análise de expressão diferencial (DEseq2) e perfil de RNA não codificante (Fig. 1, A e B, e fig. S1, A e B).
Identificação do lncRNA LINC-PINT como um potencial regulador do linfedema secundário associado ao câncer de mama.
(A) O RNA foi isolado de dermolipectomias de pacientes. O sequenciamento de RNA em massa foi realizado no braço controle (CTL) versus linfedema (LD) do mesmo paciente. (B e C) Vinte e cinco lncRNAs foram identificados em LD em comparação com CTL. Mapas de calor (B) e gráfico de vulcão (C) dos lncRNAs significativamente (Padj < 0,05) up- (log2FC > 0,5) ou down-regulados (log2FC < -0,5) em LD versus CTL. (D) Os níveis de RNA são plotados como contagens normalizadas em log10 (n = 4 amostras por grupo). Os lncRNAs foram classificados em 2 grupos: grupo 1 para alta expressão (contagem normalizada em log10 > 2,8) e grupo 2 para baixa expressão (contagem normalizada em log10 < 2,8). Os aliases dos lncRNAs do LNCipedia, os valores de log2 da mudança de expressão (FC) entre o braço LD e CTL para cada lncRNA e a significância do FC são mostrados na tabela à esquerda (Padj < 0,05, log2FC > 0,5 ou < -0,5: 24 genes). Marrom significa menor expressão; azul significa maior expressão. (E) Diagrama de Venn entre dermolipectomias e HDLEC de controle. Os perfis de expressão dos lncRNAs no RNA-seq realizado em HDLEC de controle mostraram que 11 dos 24 genes (Padj < 0,05, log2FC > 0,5 ou < -0,5) identificados em (D) (roxo azulado) foram expressos em HDLEC in vitro com uma contagem normalizada em log10 > 1. (F) Mapa de calor dos lncRNAs regulados em LD versus braço CTL que também são expressos em HDLEC in vitro. Os níveis de expressão são plotados como contagens normalizadas em log10 para cada amostra CTL e como uma média (n = 3 amostras CTL). Azul escuro: menor expressão; branco: maior expressão. (G) Hibridização in situ por fluorescência (FISH) de LINC-PINT (roxo) e coloração de Lyve-1 (verde) em amostra de CTL (biópsia de tecido do braço normal) e LD (biópsia de tecido do braço com linfedema) (escala: 25 μm). (H) Quantificação da coloração de LINC-PINT (pixels roxos) por célula. n = 4, teste t pareado.
Conforme relatado em estudos anteriores de RNA-seq em massa, pacientes com linfedema apresentaram um aumento nos perfis de expressão gênica inflamatória. A análise dos dados identificou 24 lncRNAs que foram significativamente regulados positivamente (22 genes) ou negativamente (2 genes) no braço com linfedema em comparação com o braço controle (Fig. 1C). Com base em seus níveis de expressão no braço controle dos pacientes, os 24 lncRNAs foram agrupados em dois grupos. Seis lncRNAs, incluindo LINC-PINT (RNA longo intergênico não codificador de proteína, transcrito induzido por P53), exibiram maior expressão (grupo 2, log10 contagem > 2,8), enquanto 18 lncRNAs mostraram menor expressão (grupo 1, log10 contagem < 2,8) (Fig. 1D). Os seis lncRNAs AC067817.1, AL034397.3, KLF7-ITAC016831.1, AC016831.1, AL356488.2 e LINC-PINT foram os genes mais significativamente regulados positivamente [log2FC ≥ 0,5 e valor de P ajustado (Padj) < 0,001] (Fig. 1C). Os dados também revelaram regulação de outros RNAs não codificadores, como micro-RNAs, no braço com linfedema em comparação com o controle (fig. S1C). Em contraste, LETR1, o lncRNA específico de LEC, não foi modulado no linfedema (fig. S1D).
Sobrepondo esses resultados com dados de sequenciamento de RNA (RNA-seq) de células endoteliais linfáticas dérmicas humanas (HDLEC) de controle mostrou que, entre os 24 genes, apenas 11 lncRNAs (LINC-PINT, LINC00513, Lnc-MEST-7, MIR17HG, ADAMTSL4-AS1, Lnc-ENOSF1-3, Lnc-ARGLU1-2, Lnc-RPRML-4, KLF7-IT1, Lnc-PLEKHA2-1 e Lnc-ZADH2-5) foram expressos em HDLEC sob condições basais (Fig. 1, E e F). Notavelmente, LINC-PINT exibiu os níveis de expressão mais altos em HDLEC de controle (Fig. 1F), sugerindo um papel potencial nos vasos linfáticos. A análise de hibridização in situ por fluorescência (FISH) combinada com imuno-coloração para Lyve-1 confirmou a expressão de LINC-PINT nos vasos linfáticos (Fig. 1G), e o aumento da expressão de LINC-PINT foi observado na pele com linfedema (Fig. 1, D a H). Dado que LINC-PINT demonstrou atuar como supressor tumoral e regulador fino das funções celulares em células não endoteliais, selecionamos este candidato para estudo posterior de sua expressão e papel potencial em LECs.
LINC-PINT é expresso em LECs e sua expressão é induzida por condições de estresse in vitro
Inicialmente, utilizamos bancos de dados transcriptômicos publicamente disponíveis para investigar a expressão de LINC-PINT e sua possível especificidade tecidual. A análise dos níveis de LINC-PINT revelou expressão ubíqua em vários tecidos de camundongo, incluindo cérebro, rim, fígado e pulmão, bem como em células endoteliais isoladas desses órgãos (fig. S2A). A análise bioinformática de dados de sequenciamento de imunoprecipitação da cromatina (ChIP-seq) para marcadores de promotores/amplificadores em células endoteliais da veia umbilical humana [marcas de histonas H3K4Me3/H3K4Me1/H3K27Ac, disponíveis do Consórcio ENCODE] no locus do gene humano LINC-PINT indicou uma região promotora conservada aberta e ativa em células endoteliais, indicativa de transcrição e expressão ativas (fig. S2B).
Descoberta de motivos para FTs selecionados envolvidos na homeostase vascular [gene relacionado a ETS (ERG)], especificação/maturação linfática (PROX1, SOX18 e NR2F2) e formação de válvulas linfáticas (GATA2, KLF4 e FOXC2/P2) em duas regiões promotoras (A1 e A2) do locus LINC-PINT revelou sítios de ligação putativos, sugerindo um possível papel desses FTs homeostáticos na regulação de LINC-PINT (fig. S2C). Foi demonstrado que P53 regula transcricionalmente a expressão de LINC-PINT em células não endoteliais; em concordância com esses dados, “as regiões promotoras de LINC-PINT mostraram a presença de motivos para FT relacionado a TP53 (fig. S2C). A triagem de motivos do promotor de LINC-PINT para FTs ativados em condições de estresse, como hipóxia (HIF1α) e inflamação [fator nuclear κB (NFκB) e FOS::JUN], indicou que a expressão de LINC-PINT poderia ser finamente modulada por múltiplas condições patológicas em células endoteliais (fig. S2C).
A validação da expressão de LINC-PINT em HDLEC foi realizada in vitro por FISH (Fig. 2A). Notavelmente, LINC-PINT está localizado principalmente no núcleo com um padrão perinuclear em LECs em repouso (Fig. 2A, esquerda). Observamos um forte aumento nos níveis de mRNA de LINC-PINT sob estresse hipóxico (Fig. 2, A, direita, e B). A análise de reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) confirmou a superexpressão de LINC-PINT sob hipóxia (Fig. 2C). Além disso, níveis elevados de RNA de LINC-PINT foram observados sob várias condições de estresse, incluindo estresse do retículo endoplasmático induzido por tunicamicina (Fig. 2D), estresse genotóxico induzido por doxorrubicina (Fig. 2E) e estresses inflamatórios induzidos por forbol 12-miristato 13-acetato (Fig. 2F), TNFα (Fig. 2G) e interferon-β (IFN-β; Fig. 2H).
LINC-PINT endotelial linfático é induzido por estresse.
(A) Imagens representativas da expressão de LINC-PINT (vermelho) usando hibridização in situ fluorescente (RNA de molécula única) (smRNA-FISH) em HDLEC; núcleos identificados por DAPI (azul). Barras de escala, 10 μm. (B) Quantificação subcelular de RNA de LINC-PINT em HDLEC sob normóxia e hipóxia. (C) Análise de triagem por RT-qPCR do nível de RNA de LINC-PINT em HDLEC submetidas a estresse hipóxico por 72 horas (1% O2). Os dados são apresentados como média ± EPM; teste t pareado; n = 3. (D) Análise de triagem por RT-qPCR do nível de mRNA de LINC-PINT em HDLEC tratadas com tunicamicina (2 μg/ml) para induzir estresse do retículo endoplasmático (RE). Os dados são apresentados como média ± EPM; teste t pareado; n = 3. (E) HDLEC tratadas com doxorrubicina (10 μM) por 24 horas para induzir estresse genotóxico. Os dados são apresentados como média ± EPM; teste t pareado; n = 3. [(F) a (H)] HDLEC tratadas com (F) forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (10 ng/ml), (G) TNFα (100 ng/ml) ou (H) interferon-β (IFN-β) (100 ng/ml) por 24 horas para induzir inflamação. Os dados são apresentados como média ± EPM; teste t pareado; n = 3.
Identificação das vias de sinalização reguladas por LINC-PINT em LECs indica funções potenciais na adesão celular e resposta à inflamação
Para elucidar os mecanismos moleculares e as vias de sinalização controladas pelo LINC-PINT, analisamos o perfil global do transcriptoma de HDLEC deficientes em LINC-PINT usando um GapmeR de ácido nucleico travado (LNA) direcionado ao éxon 2 do LINC-PINT. A eficiência do knockdown (KD) do LINC-PINT usando LNA GapmeR em HDLEC foi avaliada por FISH (fig. S3A e S3B) e por RT-qPCR 72 horas após a transfecção (fig. S3C). A avaliação da qualidade e similaridade das amostras de RNA-seq é apresentada (fig. S3, D a F). Em seguida, realizamos uma análise de expressão diferencial (DE), definindo genes DE significativos por um Padj < 0,05 e um log2 da mudança de expressão (log2FC) > 0,5 ou < −0,5. O KD do LINC-PINT teve um alto impacto no transcriptoma global de HDLEC, resultando em 1007 genes regulados positivamente e 768 genes regulados negativamente (Fig. 3, A a C, e tabelas S1 e S2).
Vias de sinalização molecular reguladas pelo LINC-PINT em HDLECs.
(A e B) Análise de RNA-seq realizada em HDLEC em quadruplicatas. Mapas de calor de genes selecionados significativamente regulados positivamente (A) e negativamente (B) associados ao knockdown de LINC-PINT. (C) Gráfico de vulcão mostrando valores de log2FC (mudança de expressão) calculados entre o LNA GapmeR antisense contra LINC-PINT e o controle negativo no ponto de tempo de 72 horas. Pontos vermelhos e azuis: genes significativamente (Padj < 0,05) regulados positivamente (log2FC > 0,5) e negativamente (log2FC < −0,5), respectivamente. (D) Principais termos de ontologia génica (GO) significativamente enriquecidos (FDR < 0,05) para processo biológico de genes significativamente regulados negativamente após KD do LINC-PINT no ponto de tempo de 72 horas. (E) Diagrama de Venn mostrando o número de genes únicos e compartilhados identificados em quatro estudos: genes que são regulados positiva e negativamente no linfedema versus genes que são regulados positiva e negativamente em HDLEC com knockdown de LINC-PINT com uma contagem normalizada log10 > 1. (F) Comparação dos dados de RNA-seq de dermolipectomias e HDLEC mostrou que 27 genes foram regulados negativamente em HDLEC com KD de LINC-PINT e regulados positivamente no linfedema. (G) Análise de GO para processos biológicos revelou que genes regulados negativamente foram enriquecidos (FDR < 0,05) para termos relacionados ao tráfego de leucócitos.
A análise de ontologia génica (GO) para processos biológicos revelou que genes regulados negativamente foram enriquecidos [taxa de falsa descoberta (FDR) < 0,01; razão génica > 0,02] para termos relacionados à transcrição, sistema imunológico e metabolismo de células endoteliais (Fig. 3D). Para comparar a expressão génica entre RNA-seq humano (superexpressão de LINC-PINT) e RNA-seq in vitro de HDLEC (KD de LINC-PINT), geramos um diagrama de Venn (Fig. 3E). Descobrimos que 27 genes são regulados positivamente no linfedema e regulados negativamente in vitro após KD de LINC-PINT (Fig. 3, E e F, e fig. S3, G a I). Entre eles, identificamos uma maioria de genes envolvidos na inflamação, como SELE, NEDD9, SPRY1, ICAM1, SELP e GNA14 (Fig. 3, F e G, e fig. S3, G a I). A adrenomedulina, uma molécula que predispõe ao linfedema secundário, também foi regulada positivamente (Fig. 3F).
Em contraste, apenas 12 genes (1%) foram encontrados como regulados negativamente no linfedema e regulados positivamente no KD de HDLEC para LINC PINT (Fig. 3E e fig. S3, J a L). A análise GO para processos biológicos revelou que os genes regulados negativamente foram enriquecidos (FDR < 0,05) para termos relacionados à citocinese e localização de proteínas na cromatina (fig. S3M).
LINC-PINT controla a acessibilidade da cromatina em LECs
Para entender se LINC-PINT poderia controlar a expressão gênica em HDLEC, realizamos um ensaio de cromatina acessível por transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq). Esta técnica identifica regiões de cromatina aberta, ou seja, regiões onde o DNA é acessível a TFs, reguladores epigenéticos e outras proteínas reguladoras (fig. S4A). Essas regiões frequentemente estão associadas a regiões reguladoras importantes. Para investigar o possível envolvimento de LINC-PINT na regulação da expressão gênica, comparamos HDLEC expressando LINC-PINT com células KD para LINC-PINT. Os resultados da análise diferencial de ATAC-seq entre as duas condições mostram uma remodelação significativa da paisagem da cromatina em HDLEC. A Figura 4A mostra que 63,68% dessas modificações afetam regiões promotoras de genes. Esses resultados foram confirmados pela análise da densidade de regiões abertas nas proximidades do sítio de início da transcrição (Fig. 4B). Como resultado, podemos observar a presença de um deslocamento na densidade de regiões abertas próximo ao TSS após o KD de LINC-PINT. Isso pode indicar o envolvimento de elementos reguladores controlados por LINC-PINT que podem levar a modulações na expressão gênica ao fornecer acesso a TFs. O heatmap apresentado na Fig. 4C mostra 12 genes para os quais os perfis de acessibilidade da cromatina variam significativamente entre as condições de controle e KD de LINC-PINT, de acordo com os resultados observados no RNA-seq. Para esses 12 genes, a acessibilidade da cromatina entre as duas condições é modulada de forma variável. A análise detalhada dos picos (Fig. 4D e fig. S4B) indica que, para todos esses genes, há uma diminuição na acessibilidade da cromatina na condição de KD de LINC-PINT. Esses resultados se correlacionam com os dados de RNA-seq obtidos para esses genes na Fig. 3 (ou seja, nível de RNA diminuído no KD de LINC-PINT em comparação com a condição de controle). Juntos, esses resultados confirmam a capacidade do lncRNA LINC-PINT de modular a expressão gênica de genes-alvo específicos relacionados à resposta inflamatória endotelial no nível transcricional.
LINC-PINT controla a acessibilidade da cromatina em LECs.
(A) Gráfico de pizza de picos de características genômicas anotadas mostra que mais de 63,68% dessas modificações afetam regiões promotoras de genes (FDR < 0,05). HDLECs controle n = 3 e HDLECs com knockdown de LINC-PINT n = 3. (B) Gráfico de frequência de contagem de picos representativo no TSS ± 3 kb para HDLECs controle e HDLECs com knockdown de LINC-PINT. (C) Mapa de calor de genes selecionados significativamente regulados derivados dos 27 genes da análise cruzada entre os pacientes e o RNA-seq de HDLECs (FDR < 0,05). (D) Rastros representativos do navegador do genoma dos dados de ATAC-seq mostrando regiões de acessibilidade reduzida em HDLECs com knockdown de LINC-PINT na proximidade dos genes ADAMTS18, ENG, KCNIP1, LINC-PINT, NEDD9, NNMT, OR7E14P, PLEKHA7, RAPGEF4, SLC25A25, SPRY1 e UGCG. Os dados mostrados representam uma visão ampliada e são representativos dos perfis de todo o genoma apresentados na fig. S4B. (E) Análise de motivos de DNA conhecidos enriquecidos em picos de ATAC-seq ganhos ou perdidos. (F) Escores representativos associados a regiões genômicas centradas no motivo indicado e picos de ATAC-seq nas condições controle e com knockdown de LINC-PINT.
Para investigar mais a fundo os mecanismos regulatórios potenciais associados à remodelação da cromatina mediada por LINC-PINT, buscamos motivos enriquecidos em regiões diferencialmente acessíveis (DARs) para identificar potenciais fatores de transcrição (FTs) que possam estar envolvidos na modulação da expressão gênica (Fig. 4E). A análise de motivos revelou um forte enriquecimento significativo de sítios de ligação de SP2/SP1 e FOXJ3 dentro dessas regiões (Fig. 4E). Notavelmente, a curva deprimida na condição de knockdown de LINC-PINT indica uma forte diminuição na acessibilidade da cromatina para os FTs SP2/SP1 (Fig. 4F e fig. S4C), sugerindo que LINC-PINT parece ser necessário para manter a acessibilidade dos sítios de ligação de SP2/SP1. Assim, o knockdown de LINC-PINT poderia resultar em compactação local da cromatina, reduzindo a possibilidade de ligação desses fatores e, portanto, potencialmente afetando a transcrição de seus genes alvo. Em contraste, os motivos FOXJ3 mostram acessibilidade aumentada na condição de knockdown de LINC-PINT. O knockdown de LINC-PINT aumenta a acessibilidade dos sítios FOXJ3, sugerindo que LINC-PINT desempenha um papel repressivo sobre essas regiões. É possível que FOXJ3 regule genes que se tornam mais acessíveis e, portanto, mais expressos na ausência de LINC-PINT. Identificamos sítios potenciais de ligação de SP2/SP1 e FOXJ3 em 11 dos 12 genes onde a acessibilidade da cromatina foi significativamente alterada na condição de knockdown de LINC-PINT (fig. S4D). Assim, sugerimos que LINC-PINT poderia influenciar o recrutamento de cofatores de remodelação da cromatina ou interagir com complexos que regulam esses FTs. No entanto, se essas alterações são uma consequência direta da perda de LINC-PINT ou resultam de cascatas regulatórias secundárias ainda precisa ser totalmente elucidado.
O knockdown de LINC-PINT reduz a proliferação, migração e brotamento de LECs in vitro.
Em seguida, investigamos os potenciais efeitos funcionais do LINC-PINT nas principais funções das LECs. A contagem de células (Fig. 5A) e o ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) (Fig. 5B) revelaram uma redução significativa na proliferação e no crescimento celular em HDLEC deficientes em LINC-PINT em comparação com células controle após 48 e 72 horas de tratamento. Para avaliar a migração das HDLEC, realizamos então ensaios de fechamento de ferida (ensaios de risco) após KD de LINC-PINT em HDLEC; observamos uma redução significativa da migração em HDLEC deficientes em LINC-PINT em comparação com células controle (Fig. 5, C e D).
LINC-PINT regula funções-chave das HDLEC in vitro.
(A) Contagem de células de HDLEC tratadas com controle ou um Antisense LNA GapmeR contra LINC-PINT foi realizada nos pontos de tempo de 24, 48 e 72 horas (n = 3 experimentos). Os dados são normalizados para as células controle em 24 horas. (B) O ensaio de MTT foi realizado nos pontos de tempo indicados em HDLEC controle versus HDLEC deficientes em LINC-PINT. Os dados são normalizados para as células controle no ponto de tempo de 24 horas (n = 3 experimentos). [(A) e (B)] Efeito do LINC-PINT na proliferação de HDLEC. Dados gráficos: média ± EPM, teste t de Student. (C) Ensaio de fechamento de ferida após 8 horas: controle versus HDLEC deficientes em LINC-PINT. Linhas tracejadas brancas destacam as áreas da ferida. Barras de escala, 200 μm. (D) Quantificação do fechamento da ferida após 8 horas. Os dados são normalizados para as células controle no ponto de tempo de 0 hora e expressos como porcentagem de fechamento da ferida em comparação com a condição controle (n = 3 experimentos em duplicatas). Dados gráficos: média ± EPM, teste t de Student. (E) Brotamento de HDLEC controle versus HDLEC deficientes em LINC-PINT nos pontos de tempo de 72, 96 e 120 horas. Pontas de seta brancas destacam os brotos e as linhas pontilhadas brancas destacam os brotos. Barras de escala, 100 μm. (F) Brotamento (controle versus HDLEC deficientes em LINC-PINT) no ponto de tempo de 144 horas; núcleos (azul) e células (F-actina, verde). Barras de escala, 100 μm. (G) Quantificação do número de contas com ou sem broto. Os dados são expressos como porcentagem do total de contas. Os números de contas quantificadas para cada condição são especificados. (H) Quantificação do número de brotos por conta. Os dados são expressos como número médio de brotos por conta. Os números de contas quantificadas são especificados. As linhas nos boxes mostram as médias. (I) Quantificação do comprimento dos brotos. Os dados são expressos como comprimento médio do broto por conta. Os números de brotos quantificados para cada condição são especificados. O gráfico de dispersão mostra média ± EPM NS, não significativo, teste t de Student. [(E) a (I)] Ensaio de contas de fibrina. [(G) a (I)] Quantificação do brotamento em HDLEC controle versus HDLEC deficientes em LINC-PINT nos pontos de tempo de 72, 96 e 120 horas.
Por fim, o papel do LINC-PINT na linfangiogênese foi investigado em um ensaio de brotamento in vitro (ensaio de esferas de fibrina) (Fig. 5, E a I). O knockdown (KD) de LINC-PINT em HDLEC levou à redução do brotamento ao longo do tempo (Fig. 5, E a I), com uma diminuição na porcentagem de esferas com brotamento (Fig. 5G), uma redução significativa no número de brotos por esfera (Fig. 5H) e no comprimento dos brotos (Fig. 5I). Em conjunto, esses dados forneceram fortes evidências de que o LINC-PINT é um importante regulador e modulador de funções essenciais das CELs em condições basais e de repouso.
O LINC-PINT linfático é essencial para a rede linfática in vivo
Para avaliar o papel do LINC-PINT (referido como lnc-pint no genoma do camundongo) na rede linfática in vivo, geramos o camundongo knockout condicional Prox1CreERT2; Lnc-Pintfl/fl, no qual o Lnc-Pint é seletivamente invalidado nos vasos linfáticos após indução com tamoxifeno (Lnc-PintLECKO) (fig. S5, A e B). Notavelmente, o éxon 1, que contém o sítio de ligação do PRC2, foi flanqueado por sítios LoxP (fig. S5A). Confirmamos o knockout de Lnc-Pint isolando CELs do pulmão (fig. S5C) e realizamos RT-qPCR (fig. S5D).
Em seguida, investigamos o efeito do KD de Lnc-Pint na pele (Fig. 6A-C). Observamos uma diminuição significativa na densidade linfática na ausência de lnc-Pint (Fig. 6C), que foi atribuída a uma diminuição no diâmetro dos vasos linfáticos (Fig. 6, A a C). Também observamos uma diminuição no número de vasos linfáticos (Fig. 6D), uma diminuição no número de pontos de ramificação entre os vasos linfáticos e também uma diminuição no número de vasos de extremidade cega em camundongos Lnc-PintLECKO. Esses resultados estão alinhados com nossos dados in vitro, mostrando que o lnc-Pint controla funções-chave das CELs e, assim, contribui para o desenvolvimento e/ou estabilidade dos vasos linfáticos in vivo.
O KD de LINC-PINT no sistema linfático diminui a densidade dos vasos linfáticos.
(A) Imunodetecção do sistema linfático em derme total de camundongos Lnc-PintLECKO e controles da mesma ninhada (Cre-) (barras de escala, 200 μm). (B) Foco em alta ampliação em capilar linfático dérmico em camundongos Lnc-PintLECKO e controles da mesma ninhada Lnc-Pintfl/fl (Cre−) (barras de escala, 50 μm). (C) Quantificação do diâmetro dos vasos linfáticos dérmicos. (D) Quantificação da superfície dos vasos linfáticos. (E) Quantificação do número de pontos de ramificação. (F) Quantificação de vasos linfáticos cegos. Os dados são apresentados como média ± EPM; teste t de Student; Lnc-Pintfl/fl n = 3; Lnc-PintLEC KO n = 6.
Camundongos com deleção de Lnc-Pint especificamente nos vasos linfáticos são menos suscetíveis ao desenvolvimento de linfedema secundário in vivo
Para confirmar o papel do Lnc-Pint no linfedema, realizamos um modelo de linfedema em camundongos (Fig. 7A). Em concordância com a superexpressão observada em biópsias de tecido humano, a análise por qPCR em tecidos da pele de membros controle versus membros em desenvolvimento de linfedema secundário mostrou uma superexpressão de Lnc-Pint (fig. S6A) em camundongos controle Lnc-Pintfl/fl. A RT-qPCR em CLEs isoladas da pele de camundongos controle Lnc-Pintfl/fl confirmou que Lnc-Pint está efetivamente superexpresso nessas células na condição de linfedema (Fig. 7B). Assim, o aumento observado na quantidade de RNA de Lnc-Pint nos tecidos da pele do linfedema secundário resulta mais das CLEs do que das células estromais, onde seu nível permaneceu inalterado (Fig. 7B e fig. S6, A e B). O desenvolvimento do linfedema não foi inibido em camundongos Lnc-PintLECKO em comparação com camundongos controle Lnc-Pintfl/fl ou camundongos sem depleção de Lnc-Pint induzida por tamoxifeno (Fig. 7C e fig. S6, C a E). Em ninhadas controle, o linfedema está associado a uma proliferação de vasos linfáticos, um processo fisiopatológico chamado redirecionamento linfático (Fig. 7, D e E, painel superior, e fig. S6F). Além disso, o refluxo linfático dérmico observado no linfedema não foi observado em camundongos Lnc-PintLECKO (Fig. 7E). Em contraste, camundongos Lnc-PintLECKO exibem uma ausência de novos vasos linfáticos formados no membro com linfedema (Fig. 7, D e E, e fig. S6F). Isso foi confirmado por imunodetecção dupla da densidade de vasos linfáticos em criosseções de pele com linfedema (Fig. 7, F e G). Outro destaque do linfedema resulta em um aumento da espessura da derme devido à inflamação crônica induzida pela estase linfática (Fig. 7, H e I). Aqui, em concordância com a ausência de linfedema, nenhuma diferença na espessura da derme foi observada em camundongos Lnc-PintLECKO (Fig. 7I). Essas descobertas estão de acordo com a diminuição na expressão de genes inflamatórios observada em HDLEC com KD de LINC-PINT, conforme mostrado na Fig. 3. Consistente com a superexpressão observada em biópsias de tecido humano, a análise por RT-qPCR de CLEs do tecido da pele de membros controle versus linfedema mostrou uma superexpressão de NEDD9 e endoglina (ENG; fig. S6, G e H). No entanto, essa superexpressão não foi observada quando LINC-PINT foi silenciado, como visto em modelos in vitro de HDLEC.
O KD de LINC-PINT reduz o linfedema e o refluxo dérmico.
(A) Representação esquemática do procedimento cirúrgico indutor de linfedema em camundongos. (B) Análise por RT-qPCR do nível de RNA de Lnc-pint em CLEs isoladas da pele do membro controle e com linfedema de camundongos Lnc-PintLECKO e ninhadas controle Lnc-Pintfl/fl. Os dados são apresentados como média ± EPM; ANOVA de duas vias; Lnc-Pintfl/fl n = 4; Lnc-PintLEC KO n = 3. (C) Quantificação do diâmetro do membro em controle e LD de camundongos Lnc-PintLECKO e ninhadas controle Lnc-Pintfl/fl. Os dados são apresentados como média ± EPM; ANOVA de duas vias; Lnc-Pintfl/fl n = 6; Lnc-PintLEC KO
n = 9. (D) Linfografia do membro controle e do membro com linfedema de camundongos Lnc-PintLECKO (barra = 2 mm). (E) Quantificação do refluxo dérmico linfático (pixels verdes) no membro com LD de camundongos Lnc-PintLECKO. Os dados são apresentados como média ± EPM; ANOVA de duas vias; Lnc-Pintfl/fl
n = 6; Lnc-PintLEC KO
n = 9. (F) Imunodetecção de vasos linfáticos positivos para Lyve-1 e podoplanina na pele de camundongos Lnc-PintLECKO e seus irmãos controle Lnc-Pintfl/fl; barras de escala, 25 μm (G) Quantificação de vasos linfáticos positivos para Lyve-1 na pele de camundongos Lnc-PintLECKO e seus irmãos controle. Os dados são apresentados como média ± EPM; ANOVA de duas vias; Lnc-Pintfl/fl
n = 6; Lnc-PintLEC KO
n = 9. (H) Coloração tricrômica de Masson da pele linfedematosa; barras de escala, 70 μm. (I) Quantificação da espessura da derme no membro com linfedema de camundongos Lnc-PintLECKO e seus irmãos controle Lnc-Pintfl/fl. Os dados são apresentados como média ± EPM; ANOVA de duas vias; Lnc-Pintfl/fl
n = 6; Lnc-PintLEC KO
n = 9.
Camundongos com deleção de Lnc-Pint especificamente em vasos linfáticos exibem um perfil anti-inflamatório
Para investigar o efeito da depleção de Lnc-Pint na inflamação tecidual, as populações de células imunes foram analisadas na pele linfedematosa por classificação celular ativada por fluorescência (FACS; Fig. 8, A a F). Conforme demonstrado anteriormente, nenhum efeito da população de células T CD8+ foi encontrado no linfedema, enquanto as células T CD4+ tenderam a aumentar (Fig. 8, A a C). No entanto, a depleção de Lnc-Pint no sistema linfático não teve efeito sobre as populações gerais de células T (Fig. 8, A a C). Em seguida, estudamos as populações de macrófagos (Fig. 8, D a F). No modelo de linfedema em camundongos, a cirurgia não afetou as populações de macrófagos. No entanto, foi observada uma redução significativa de macrófagos M1 pró-inflamatórios no membro com linfedema de camundongos Lnc-PintLECKO (Fig. 8, D e E). Isso foi associado a um aumento significativo de macrófagos M2 anti-inflamatórios (Fig. 8, D e F). Essas observações estão alinhadas com uma melhora na homeostase tecidual observada no modelo de linfedema. A imunodetecção de macrófagos em criosseções da pele com linfedema revela uma redução significativa de macrófagos no membro linfedematoso de camundongos Lnc-PintLECKO (Fig. 8, G e H), provavelmente devido a uma diminuição nos macrófagos M1, que são mais abundantes que os macrófagos M2.
A redução de LINC-PINT diminui a inflamação.
(A) Gráficos representativos de FACS de linfócitos T CD8+ e CD4+ no LD da pele CTL e LD de camundongos Lnc-PintLECKO e seus irmãos controle. (B) Quantificação mostrando a proporção da população de células CD8+. Os dados são apresentados como média ± EPM; ANOVA de duas vias; Lnc-Pintfl/fl
n = 2; Lnc-PintLEC KO
n = 4. (C) Quantificação mostrando a proporção da população de células CD4+. Os dados são apresentados como média ± EPM; ANOVA de duas vias; Lnc-Pintfl/fl
n = 2; Lnc-PintLEC KO
n = 4. (D) Gráficos de FACS representativos de macrófagos M1 e M2 do LD e CTL. Método de gate para identificação de macrófagos: CD45+CD11b+F4-80+. (E) e macrófagos M2 (CD45+CD11b+F4-80+CD206+) (F) na pele Ctrl e LD de camundongos Lnc-PintLECKO e de seus companheiros de ninhada controles Lnc-Pintfl/fl. Os dados são apresentados como média ± EPM; ANOVA de duas vias; Lnc-Pintfl/fl
n = 2; Lnc-PintLEC KO
n = 4. [(E) e (F)] Quantificação mostrando a proporção de macrófagos M1 (CD45+CD11b+F4-80+CD206−) (G) Imunodetecção de macrófagos positivos para F4/80 na pele de camundongos Lnc-PintLECKO e de seus companheiros de ninhada controles Lnc-Pintfl/fl (barras de escala, 200 μm). (H) Quantificação de macrófagos positivos para F4/80 na pele de camundongos Lnc-PintLECKO e de seus companheiros de ninhada controles Lnc-Pintfl/fl. Os dados são apresentados como média ± EPM; ANOVA de duas vias; Lnc-Pintfl/fl
n = 6; Lnc-PintLEC KO
n = 6.
DISCUSSÃO
Aqui, relatamos o perfil de expressão e o papel potencial do lncRNA em biópsias de tecido do braço de pacientes com linfedema. Identificamos um lncRNA abundante em LEC, denominado LINC-PINT, como uma molécula chave na reprogramação do endotélio linfático sob condição de estresse.
Estudos recentes revelaram evidências de que os LEC expressam uma assinatura precisa de lncRNA para controlar seus programas regulatórios específicos da linhagem. Eles identificaram o lncRNA LETR1 como um gatekeeper crítico do transcriptoma global dos LEC. Em adultos, apesar de uma forte expressão de LETR1 na pele humana, não observamos qualquer diferença de expressão no braço com linfedema em comparação ao braço normal, sugerindo um envolvimento menor na patologia em comparação ao desenvolvimento.
No geral, observamos uma tendência ao aumento no número de lncRNAs em dermolipectomias do braço afetado quando comparado ao braço normal no mesmo paciente. Identificamos 24 lncRNAs significativamente regulados positivamente no linfedema. Entre eles, o LINC-PINT foi o mais expresso no linfedema. O LINC-PINT é um transcrito longo intergênico não codificante induzido por p53 que desempenha um papel crucial em muitas doenças, principalmente no câncer. Ao comparar os perfis de longos não codificantes do linfedema com os dos LEC, identificamos apenas 11 lncRNAs comuns, incluindo o LINC-PINT, levantando evidências de seu papel na patologia.
De acordo com a literatura, as regiões promotoras do LINC-PINT mostraram a presença de motivos para TFs relacionados a TP53. A triagem do promotor do LINC mostrou motivos para TFs ativados em condições de estresse, incluindo hipóxia (HIF1α) e inflamação (NF-κB e FOS::JUN). Isso foi validado in vitro em HDLEC estimulados por estresses hipóxico (1% O2) ou inflamatório (TNFα e IFN-γ).
Em contraste, o KD do LINC-PINT em HDLEC resultou em uma diminuição significativa em genes envolvidos na inflamação, incluindo genes que codificam para selectina E e P (SELE e SELP), NEDD3, ADAMTS18, ICAM e ENG. Esses resultados estão diretamente de acordo com a patologia do linfedema, que, devido à estase linfática, leva à inflamação crônica associada a fibrose significativa da pele e do tecido adiposo subcutâneo.
A determinação da identidade celular é modulada pela acessibilidade da cromatina. Recentemente, foi demonstrado que os lncRNAs, por meio da modificação da cromatina, desempenham papéis significativos em diversas redes regulatórias gênicas. Grande parte do DNA na cromatina eucariótica está enterrada dentro dos nucleossomos, e as estruturas de cromatina de ordem superior e as histonas impedem estericamente a capacidade dos TFs de alcançar suas regiões-alvo. Neste estudo, estabelecemos a localização nuclear de LINC-PINT em HDLECs. Isso era esperado, uma vez que LINC-PINT é conhecido por interagir com complexos de remodelação da cromatina, como o PRC2, em células cancerígenas, onde induz a metilação da histona H3K27me3, resultando na compactação da cromatina. A análise de ATAC-seq mostra remodelação da cromatina quando LINC-PINT é KD. Isso sugere que LINC-PINT tem a capacidade de interagir com complexos de remodelação da cromatina ativadores em LEC. Sabe-se que vários lncRNAs têm a capacidade de interagir com diferentes complexos. Este é o caso do lncRNA XIST, por exemplo, que pode interagir com PRC2, o mediador de silenciamento para receptor de retinoides e hormônio tireoidiano/corepressor de receptor nuclear (SMRT/NCoR), o complexo de remodelação de nucleossomo e desacetilase e os complexos homólogos de chromobox. Embora esses últimos complexos sejam repressores da expressão gênica, também existem numerosos exemplos de lncRNAs que interagem com complexos que ativam a expressão gênica. O RNA ativado por danos ao DNA antissenso do promotor de CDKN1A interage com PRC2 e com o complexo LSD1/CoREST, levando à liberação desses complexos do promotor de CDKN1A.
Esses resultados destacam um papel fundamental do LINC-PINT na regulação da acessibilidade da cromatina. A análise de ATAC-seq revelou mudanças significativas na acessibilidade de motivos potenciais de ligação de SP2/SP1 e FOXJ3 após o KD de LINC-PINT, sugerindo que esse lncRNA desempenha um papel crucial na modulação da ocupação de fatores de transcrição. Especificamente, observamos uma diminuição na acessibilidade em locais potenciais de ligação de SP2/SP1, indicando que o LINC-PINT é necessário para manter um estado de cromatina aberto nesses loci. Isso sugere que o LINC-PINT pode facilitar a ligação de SP2/SP1, influenciando assim a transcrição de seus genes-alvo. Em contraste, motivos potenciais de ligação de FOXJ3 exibiram um aumento acentuado na acessibilidade, implicando que o LINC-PINT normalmente atua como um repressor nessas regiões. Essa regulação diferencial da acessibilidade da cromatina apoia a hipótese de que o LINC-PINT funciona como um modulador dinâmico da estrutura da cromatina, possivelmente por meio de interações com complexos de remodelação da cromatina. Essas descobertas fornecem insights sobre os mecanismos reguladores que governam a identidade das LECs e sugerem que a remodelação da cromatina mediada pelo LINC-PINT pode ser um fator importante em doenças relacionadas ao sistema linfático. Estudos adicionais, incluindo análise de ChIP-seq de SP2/SP1 e FOXJ3, bem como experimentos funcionais, serão necessários para delinear os mecanismos precisos pelos quais o LINC-PINT orquestra a regulação transcricional e confirmar o recrutamento desses fatores para a cromatina.
Além disso, estudos recentes relataram o importante papel dos mecanismos epigenéticos no desenvolvimento linfático. Essas descobertas levantaram o conceito de uma regulação epigenética do endotélio linfático adulto em condições patológicas, incluindo o linfedema. Aqui, identificamos o LINC-PINT como um regulador chave da acessibilidade da cromatina em LECs, levando à identificação de estratégias terapêuticas para doenças relacionadas às LECs.
Para determinar o papel fisiológico do LINC-PINT nas funcionalidades dos vasos linfáticos, realizamos ensaios in vitro. Inesperadamente, o KD de LINC-PINT foi associado a uma melhora na proliferação, migração e brotamento das LECs. Isso pode ser atribuído à linfangiogênese aberrante observada no linfedema, que geralmente ocorre após a ruptura da função e estrutura normais dos vasos linfáticos. Quando os vasos linfáticos são danificados ou comprometidos, como é o caso no linfedema, o corpo tenta compensar iniciando o crescimento de novos vasos linfáticos. No entanto, esse processo é frequentemente desorganizado e ineficiente, resultando na formação de vasos linfáticos anormais que são incapazes de drenar eficazmente o fluido linfático da área afetada. Isso leva a um maior acúmulo de fluido linfático, exacerbando os sintomas do linfedema.
Confirmamos o papel crucial do LINC-PINT na fisiopatologia do endotélio linfático ao gerar um knockout genético do Linc-Pint no endotélio de camundongos (Prox1Cre; Linc-Pintfl/fl). Nossa estratégia foi deletar o éxon 1, que contém o domínio de ligação do PCR2. Os camundongos knockout foram férteis e não apresentaram edema ou refluxo dérmico linfático. No entanto, observamos uma redução significativa da densidade capilar da derme linfática, atribuída a uma diminuição no diâmetro linfático, na superfície dos vasos linfáticos, no número de pontos de ramificação e nos capilares de extremidade cega. Isso é tipicamente observado quando há um bloqueio ou comprometimento da função linfática. No entanto, os camundongos Lnc PintLECKO exibem densidade semelhante de vasos coletores (Fig. 7G) associada a um aumento da permeabilidade linfática com forte refluxo dérmico. Isso pode ocorrer em diversas condições, como o linfedema. Essa constrição impede o fluxo da linfa e agrava o inchaço e os sintomas associados à condição.
Considerando que o LINC-PINT foi identificado como induzido durante o linfedema e necessário para a mudança de fenótipo das CELs, investigamos se o LINC-PINT poderia servir como um alvo terapêutico em um modelo pré-clínico de linfedema. O KD específico do Linc-Pint no endotélio linfático aboliu o inchaço do membro induzido por cirurgia e o refluxo dérmico linfático. Isso foi associado a uma redução na fibrose da derme, o último estágio de degradação tecidual observado durante o linfedema devido à persistência da inflamação crônica. Em consonância com a regulação de genes inflamatórios induzida pelo LINC-PINT, observamos uma diminuição de macrófagos pró-inflamatórios do tipo M1 e um aumento de macrófagos anti-inflamatórios do tipo M2 nos camundongos Linc-PintLECKO. Nossas observações indicam que a função do lnc-pint pode ser dependente do contexto, com seus efeitos se tornando detectáveis predominantemente sob condições de estresse, como o linfedema após o knockout, enquanto em condições fisiológicas sua contribuição para a homeostase dos macrófagos parece mínima.
Em conjunto, nosso estudo mostrou que o LINC-PINT é um ator fundamental na disfunção linfática associada ao linfedema. Destacamos, por meio da caracterização molecular e funcional do LINC-PINT, a importância dos lncRNAs nas doenças linfáticas em adultos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Amostra de tecido humano
As amostras foram selecionadas como espécimes codificados sob um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do INSERM (DC-2008-452) e pelo Departamento de Pesquisa do Estado (Ministère de la recherche, ARS, CPP2, autorização AC-2008-452). Todos os doadores forneceram consentimento informado por escrito. Quando possível, algumas amostras de tecido do braço controle foram coletadas para fins estéticos. No total, foram coletados 16 espécimes de lipodermectomia. As amostras foram obtidas de blocos de parafina de arquivo de linfedema de pacientes tratados no Hospital Rangueil, Toulouse, França, entre 2015 e 2016. Pacientes com histórico de linfedema de 1 a 12 anos apresentavam linfedema estágio 2 de acordo com a classificação da Sociedade Internacional de Linfologia. Os pacientes elegíveis tinham histórico de câncer de mama unilateral não metastático sem recorrência por mais de 5 anos. Os principais parâmetros clínicos utilizados para diagnosticar um linfedema significativo incluíam edema clínico do membro superior com uma diferença de volume entre o membro superior afetado e o outro membro superior de 10% ou 200 ml.
Cultura celular e tratamentos
HDLEC (um único doador masculino, prepúcio juvenil, Promocell, C-12216, >99% das células são CD31 positivas e >96% podoplanina positivas) foram cultivadas em meio de células endoteliais MV2 (EGM-MV2, Promocell, C-22121). Fibroblastos da pele humana foram cultivados em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich, D6429) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Gibco, 10270-06) e 1% de penicilina-estreptomicina. As células endoteliais foram utilizadas nas passagens 3 a 5 (confluência máxima de 70 a 80%) e os fibroblastos humanos foram utilizados nas passagens 4 a 7. As células foram cultivadas a 37°C em uma incubadora com 5% de CO2. Para alguns experimentos, as HDLEC foram cultivadas a 37°C em condições hipóxicas (1% O2) em uma incubadora de ar com CO2 (Binder, 9040-0116) por 48 horas.
RNA-seq em massa de amostras de dermolipectomia
O RNA total de dermolipectomias foi extraído e isolado usando o kit RNeasy mini (Qiagen, 74104). A digestão de DNA foi realizada usando o conjunto RNase-Free DNase (Qiagen, 79254). O RNA total foi então depletado de RNA ribossômico de acordo com o pipeline de genômica da Eurofins. O RNA-seq foi então realizado pela Eurofins genomics usando sequenciamento paired-end 2 × 150 pb em Illumina HiSeq. A qualidade das sequências foi avaliada com FastQC (versão Galaxy 0.52) e depois aparadas com Trimmgalore versão 0.3.8.1 com a interface Galaxy. As leituras aparadas foram então mapeadas para o genoma de referência Homo sapiens GRCh38.91 disponível no ENSEMBL usando o alinhador STAR versão 2.5.2b. As contagens de hits foram resumidas e relatadas usando o recurso gene_id no arquivo de anotação. A distribuição das contagens de leitura nas bibliotecas foi examinada antes e depois da normalização. As contagens de leitura originais foram normalizadas para ajustar vários fatores, como variações no rendimento do sequenciamento entre as amostras. Essas contagens de leitura normalizadas foram usadas para determinar com precisão os genes expressos diferencialmente. Após a extração das contagens de hits de genes, a tabela de contagens de hits de genes foi usada para análises posteriores de expressão diferencial. Usando DESeq2 (versão Galaxy 0.99.2), foi realizada uma comparação da expressão gênica entre o braço controle e o braço de linfedema. O teste de Wald foi usado para gerar valores de P e log2 das mudanças de dobra. Genes com log2FC > 0,5 ou log2FC < −0,5 e um Padj < 0,05 foram definidos como genes expressos diferencialmente e usados para análises posteriores. A mudança transcricional global entre os dois grupos comparados foi visualizada por um gráfico de vulcão. Cada ponto de dados no gráfico de vulcão representa um gene. O log2 da mudança de dobra de cada gene é representado no eixo x e o log10 de seu valor de Padj está no eixo y. Genes com valor de Padj menor que 0,05 e log2 da mudança de dobra maior que 0,5 são indicados por pontos vermelhos. Estes representam genes regulados positivamente. Genes com valor de Padj menor que 0,05 e log2 da mudança de dobra menor que 0,5 são indicados por pontos azuis. Estes representam genes regulados negativamente.
Isolamento de RNA e reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR)
O RNA total de tecidos de camundongos ou células humanas foi isolado usando o kit RNeasy (Qiagen, 74104) e transcrito reversamente em cDNA usando o High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, 4368813) contendo a Transcriptase Reversa Multi Scribe. A PCR quantitativa em tempo real foi realizada usando ONEGreen FAST qPCR Premix (Ozyme, OZYA008) em um sistema Quantstudio 5 (Thermo Fisher Scientific, A34322). Os valores de expressão gênica foram normalizados para a expressão de 18S, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) ou hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase, conforme indicado nas legendas das figuras.
As sequências de primers foram as seguintes (as sequências são fornecidas de 5′ a 3′): GAPDH humano (CAAGGTCATCCATGACAACTTTG; GGGCCATCCACAGTCTTCTG), 18S humano/camundongo (CAACTAAGAACGGCCATGCA; AGCCTGCGGCTTAATTTGAC), ICAM1 humano (CCCTGATGGGCAGTCAACAG; AGCGTAGGGTAAGGTTCTTGC), LINC-PINT humano (GGAACGAGGCAAGGAGCTAA; GAGCTCAGATCAGCAAGGCA), LINC-PINT de camundongo (GCATTGGGATACCAGGGCTT; CTGCAGTTGCTCGTTTGCAT), Lyve1 de camundongo (CAGCACACTAGCCTGGTGTTA; CGCCCATGATTCTGCATGAG), SELE humano (GTTCCTTCCTGCCAA-GTGGT; CCTTCAGGACAGGCGAACTT), NEDD9 humano (ACCACTCAAGGGGTATACGA; CCCTTTTGTAGGCGGGATGT), ADAMTS18 humano (TCGTGGAGCGAGTGTTCT; CCTTCTCGCTGCACTTCATCT), SELP humano (CCAACCTGCAAAGGCATAGC; GCGTTGCAGCCAAAGTAACA), PLEKHA7 humano (GACCAGAACAGTGTGGCTGA; GTCACTGCCTGGGCTGC) e ENG humano (CTGCCACTGGACACAGGATAAG; GACTGTTTCTGCAAGACTTGTG).
Silenciamento de LINC-PINT
As LECs foram transfectadas com Antisense LNA GapmeRs em Meio de Células Endoteliais MV2 (EGM-MV2, Promocell C-22121) usando Interferin (Polyplus Transfection, 409-10). As células foram transfectadas com um Antisense LNA GapmeR B contra o éxon 2 de LINC-PINT (NR_109853_1, a uma concentração final de 30 nM, sequência: 5′-TGATGCGCACGTAGAT-3′) (Qiagen) e denominadas como LINC-PINT GapmeR no texto, seguindo as instruções do fabricante. Um Antisense LNA GapmeR Controle Negativo A (Qiagen, LG00000002) foi utilizado, denominado como Ctl GapmeR.
Sequenciamento de RNA em LECs primárias humanas
O RNA total de amostras de HDLEC (passagem 4, 80% de confluência no momento da coleta, derivadas de um único doador) que foram tratadas individualmente com GapmeR direcionado a LINC-PINT ou GapmeR Controle (30 nM) foi coletado 72 horas após a transfecção e isolado usando o método TRIzol/clorofórmio. O RNA total foi então submetido ao protocolo de RNA-seq com depleção de RNA ribossômico, realizado pela empresa Genewiz usando Illumina HiSeq, configuração PE 2x150. As leituras de sequência foram aparadas para remover possíveis sequências adaptadoras e nucleotídeos de baixa qualidade usando Trimmomatic versão 0.36. As leituras aparadas foram mapeadas para o genoma de referência H. sapiens GRCh38 disponível no ENSEMBL usando o alinhador STAR versão 2.5.2b. O alinhador STAR é um alinhador de splicing que detecta junções de splicing e as incorpora para ajudar a alinhar todas as sequências de leitura. Arquivos BAM foram gerados como resultado desta etapa. As contagens de genes únicos foram calculadas usando feature Counts do pacote Subread versão 1.5.2. As contagens foram resumidas e relatadas usando o recurso gene_id no arquivo de anotação. Apenas leituras únicas que caíram dentro de regiões de éxons foram contadas.
ATAC Seq
HDLEC transfectadas com GapmeR direcionado ao LINC-PINT ou GapmeR controle (30 nM) foram coletadas 72 horas após o tratamento e criopreservadas após tratamento com DNase I. Extração de ácidos nucleicos, transposição e preparação de bibliotecas foram realizadas pela Genewiz. As amostras foram então submetidas ao protocolo de sequenciamento realizado pela Genewiz utilizando Illumina HiSeq, configuração PE 2x150. Adaptadores de sequenciamento e bases de baixa qualidade foram removidos usando Trimmomatic 0.38. As leituras limpas foram então alinhadas ao genoma de referência hg38 usando bowtie2. As leituras alinhadas foram filtradas usando SAMtools 1.9 para manter alinhamentos que (i) tenham qualidade mínima de mapeamento de 30, (ii) estejam alinhados de forma concordante e (iii) sejam os alinhamentos primários chamados. Duplicatas de PCR ou ópticas foram marcadas usando Picard 2.18.26 e removidas. Antes da chamada de picos, leituras mapeadas para mitocôndrias foram chamadas e filtradas, e leituras mapeadas para contigs não posicionados foram removidas. MACS2 2.1.2 foi usado para chamada de picos a fim de identificar regiões de cromatina abertas. Para cada comparação pareada, picos da condição A e da condição B foram mesclados e picos encontrados em qualquer condição foram mantidos para análises posteriores. Leituras sobrepostas aos picos foram contadas em todas as amostras, e essas contagens foram usadas para análises diferenciais de picos utilizando o pacote R Diffbind.
Análise de motivos e visualização
Para identificar motivos de ligação de FT dentro das DARs obtidas da análise de ATAC-seq, empregamos o conjunto Multiple Em for Motif Elicitation (MEME), acessível através da plataforma Galaxy Europe (https://usegalaxy.eu/). A ferramenta MEME-ChIP (versão 5.4.1) foi usada para realizar descoberta de motivos de novo, analisando sequências correspondentes às DARs para revelar motivos super-representados indicativos de possíveis sítios de ligação de FT.
Análise GO
Uma análise GO foi realizada separadamente nos conjuntos estatisticamente significativos de genes regulados positivamente e negativamente, utilizando o software PANTHER (versão 18.0). A lista de referência de H. sapiens foi usada para agrupar o conjunto de genes significativamente diferencialmente expressos com base em seus processos biológicos ou vias, e a super-representação dos termos GO foi testada usando o teste exato de Fisher.
Hibridização in situ por fluorescência
Tecido de pele humana
O tecido de pele humana embebido foi desparafinizado e reidratado. A recuperação de epítopo induzida por calor úmido foi realizada usando tampão citrato (citrato de sódio–ácido cítrico) a pH 6,0 para recuperação de epítopo. Os tecidos foram permeabilizados por 5 min em PBS 1×–Triton X-100 1% à temperatura ambiente, em seguida os tecidos foram incubados por 45 min à temperatura ambiente com formamida 15% (Sigma-Aldrich, 47671) diluída em tampão SSC-1X (Sigma-Aldrich, S6639). Três sondas FISH direcionadas ao LINC-PINT foram misturadas em tampão TE a uma concentração final de 20 ng/μl. Mix1 contendo as sondas LINC-PINT [2 μl da mistura de sondas, 5 μl de tampão SSC-20×, 1,7 μl de RNA total de Escherichia coli (20 μg/μl; Roche, 10109541001), 15 μl de formamida 100% e 26,3 μl de H2O] foi aquecido a 100°C em um termociclador (Bio Rad, T100) por 1 min e então adicionado ao mix2 [1 μl de albumina de soro bovino (BSA) livre de RNase (Roche, 10711454001), 1 μl de complexos de ribonucleosídeo vanadil (VRC) (Sigma-Aldrich, 94740) e 26,5 μl de sulfato de dextrana 40% (MP Biomedical, 160111)]. Cinquenta microlitros de mix1 + mix2 foram adicionados a cada amostra de pele e incubados durante a noite a 37°C. Os tecidos foram lavados uma vez por 20 min a 37°C com formamida 15% diluída em tampão SSC-1×, lavados uma vez em PBS. Os tecidos foram incubados durante a noite com anticorpo anti-humano Lyve-1 (Fitzgerald, 70R-LR005) e, em seguida, incubados por 2 horas em Donkey Anti-rabbit 488 (Jackson Immuno Research, 711-545-152), diluição 1/500 em PBS–BSA 2%. Os tecidos foram lavados três vezes em PBS-1× e, em seguida, incubados com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1 μg/ml em PBS) por 5 min. As lâminas foram então montadas com meio de montagem para fluorescência (Dako, S302380-2). Imagens das células foram obtidas usando um microscópio invertido de fluorescência (Leica, DMi8).
Células
As células foram incubadas por 15 min à temperatura ambiente com 15% de formamida (Sigma-Aldrich, 47671) diluída em tampão SSC-1× (Sigma-Aldrich, S6639). Três sondas FISH direcionadas ao LINC-PINT foram misturadas em tampão TE a uma concentração final de 20 ng/μl. A mistura1 contendo as sondas LINC-PINT [1,5 μl da mistura de sondas, 5 μl de tampão SSC-20×, 1,7 μl de RNA total de E. coli (20 μg/μl Roche, 10109541001), 15 μl de formamida 100% e 26,8 μl de H2O] foi aquecida a 100°C em um termociclador (Bio Rad, T100) por 1 min e então adicionada à mistura2 [1 μl de BSA livre de RNase (Roche, 10711454001), 1 μl de VRC (Sigma-Aldrich, 94740) e 26,5 μl de sulfato de dextrano a 40% (MP Biomedical, 160111)]. Cinquenta microlitros da mistura1 + mistura2 foram adicionados a cada poço e as células foram incubadas durante a noite a 37°C. As células foram lavadas quatro vezes por 30 min a 37°C com 15% de formamida diluída em tampão SSC-1×, lavadas duas vezes em PBS e então incubadas com DAPI (diluição 1/5000 em PBS) por 1 min. As lâminas de câmara de oito poços Lab-Tek foram então montadas com meio de montagem para fluorescência (Dako, S3023). Imagens das células foram obtidas com aumento de 63× usando um microscópio invertido de fluorescência (Leica, DMi8). As sondas FISH oligonucleotídicas para LINC-PINT foram as seguintes (5′ para 3′): Sonda 1 (CCTCATTTTGTTCGCGTGCCCCTGGGCTGGGAAAGGAGTG), sonda 2 (CACAATGTTGTTTCATTATATCATGTCCATCATGTGAC) e sonda 3 (GTATCTGTATCATTCTTATGTGTTCCGTAAGTTATGCC).
Ensaio de proliferação celular
A proliferação celular foi estimada pelo ensaio de MTT. As células foram semeadas em placas de 96 poços em baixa densidade (4000 células por poço) e deixadas aderir durante a noite. No dia seguinte, as células foram transfectadas com Antisense LNA GapmeRs (30 nM) durante a noite, 20 μl de MTT (5 mg/ml) (Euromedex, 4022-B) diluídos em 80 μl de EGM-MV2 foram adicionados a cada poço 24, 48 ou 72 horas após a transfecção, e as células foram incubadas por mais 4 horas. A absorbância foi registrada a 570 nm com um leitor de microplacas (Biochrom Asys, UVM340) após adição de dimetilsulfóxido. A proliferação celular também foi avaliada em paralelo, 24, 48 e 72 horas após a transfecção, por contagem celular usando um contador de células (Luna, Logos, L20001).
Ensaio de migração/riscamento da monocamada
Para o ensaio de migração, 150.000 HDLECs foram semeadas em placas de seis poços. No dia seguinte, as HDLECs foram transfectadas com 30 nM de controle ou LNA GapmeR direcionado ao LINC-PINT, e 6 horas após a transfecção, as HDLECs foram desprendidas e 70.000 células foram semeadas em placas de 24 poços e cultivadas durante a noite. No dia seguinte, monocamadas confluentes de HDLECs foram riscadas manualmente usando uma ponteira de 10 μl e o meio completo EGM-V2 foi substituído. Imagens das áreas riscadas foram obtidas com aumento de 4× e nos tempos 0 e 8 horas usando um microscópio de campo claro (Nikon Eclipse, TS100). As imagens foram analisadas manualmente usando Fiji (versão 1.53-6).
Ensaio de esferas de fibrina - ensaio de brotamento
Para ensaios de brotamento, HDLEC em suspensão foram incubadas com microcarreadores revestidos com colágeno (Cytodex 3, Sigma-Aldrich, C3275) por 5 horas (400 células por microcarreador). Os microcarreadores revestidos com HDLEC foram então transferidos para uma placa de Petri e colocados em uma incubadora para transfecção. As HDLEC revestidas nos microcarreadores foram transfectadas com Antisense LNA GapmeRs (30 nM) durante a noite. As HDLEC aderidas à placa de Petri (e não aos microcarreadores) foram coletadas ao final dos experimentos para controlar a eficiência de knockdown de LINC-PINT ao longo do tempo (72 horas e 6 dias após a transfecção). No dia seguinte, números iguais de microcarreadores revestidos com HDLEC foram embebidos em géis de fibrina em placa de 24 poços ou lâmina de câmara de quatro poços Lab-Tek (180 microcarreadores por poço). O gel de fibrina foi preparado dissolvendo fibrinogênio bovino (2 mg ml−1) (Sigma-Aldrich, 341573) em PBS e a coagulação foi induzida pela adição de trombina bovina (2 U ml−1) (Sigma-Aldrich, T4648). Após 30 min, fibroblastos de pele humana foram plaqueados sobre o gel e foi adicionado meio de crescimento de células endoteliais-2 (Lonza, CC-3162) suplementado com VEGF-C humano (100 ng/ml, Peprotech, 100-20CD). A formação dos brotos foi imageada em aumento de 10× usando um microscópio de campo claro (Nikon Eclipse, TS100) para quantificação. A porcentagem de microcarreadores com ou sem broto, o número de brotos por microcarreador e o comprimento dos brotos foram quantificados e contados manualmente às 72, 96 e 120 horas após o plaqueamento usando Fiji (versão 1.53-6).
Para coloração por imunofluorescência, microcarreadores revestidos com HDLEC foram fixados 6 dias (144 horas) após o plaqueamento com paraformaldeído a 4% por 1 hora à temperatura ambiente, depois lavados três vezes com PBS, incubados à temperatura ambiente por 45 min com solução de permeabilização (Triton X-100 a 0,5% em PBS) e então com solução de bloqueio (BSA a 1% – SFB a 5% – Tween a 0,1% em PBS) durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as células foram coradas com Hoechst (Thermo Fisher Scientific, 33342) e faloidina Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A12379) diluídos 1:5000 e 1:500, respectivamente, em solução de coloração (BSA a 1% – SFB a 5% – Tween a 0,1% em PBS) por 24 horas a 4°C. Após cinco lavagens em Tween a 0,5% em PBS à temperatura ambiente sob agitação suave, as imagens foram obtidas em aumento de 10× usando um microscópio invertido de fluorescência (Leica, DMi8).
Modelos de camundongos.
Todos os estudos receberam aprovação do comitê de ética local e foram realizados de acordo com as diretrizes da Convenção Europeia para a Proteção dos Animais Vertebrados Utilizados para Experimentação e de acordo com as diretrizes do INSERM IACUC (França) para o manejo de animais de laboratório. Todos os experimentos com animais foram aprovados pela filial local Inserm Rangueil-Purpan do comitê de ética de Midi-Pyrénées, França, sob o número de referência APAFIS #52318-2024120517161785. Animais de diferentes gaiolas no mesmo grupo experimental foram selecionados para garantir a randomização. Os camundongos foram alojados em gaiolas individualmente ventiladas em uma sala com temperatura e luz controladas em uma instalação SPF e receberam comida e água ad libitum. Camundongos fêmeas C57BL/6J (6 semanas de idade) foram obtidos da Envigo, França.
Para gerar o knockout de lnc-pint, dois sítios lox foram inseridos nas posições Chr6:31,219,550 e Chr6:31,217,550 (GRCm38/mm10) para permitir a deleção da região promotora e do éxon 1 do gene lnc-pnt pela recombinase Cre. A inserção no genoma do camundongo foi realizada por recombinação em células ES para gerar camundongos fundadores F0 capazes de gerar transmissão germinativa pelo Instituto Clínico do Camundongo, Estrasburgo, França. A partir desses fundadores, a linhagem de camundongos Lnc-Pintfl/fl foi gerada. Camundongos Prox1CreERT2; Lnc-Pintfl/fl (=Linc-PintLEC KO) foram gerados pelo cruzamento de camundongos Prox1CreERT2 do laboratório do Dr. Makinen com LincPintfl/fl.
Modelo de linfedema em camundongos
O linfedema foi estabelecido nos membros superiores esquerdos de camundongos fêmeas C57Bl/6 com 6 semanas de idade. Tamoxifeno (1 mg por dia durante 5 dias por via oral) foi administrado 4 semanas antes da indução do linfedema. O procedimento cirúrgico do linfedema é realizado por mastectomia parcial da segunda glândula mamária associada a linfadenectomia axilar e braquial. O tamanho do membro foi medido usando um paquímetro conforme descrito anteriormente.
Sexo como variável biológica
Nosso estudo examinou exclusivamente camundongos fêmeas porque a doença modelada é relevante apenas em fêmeas.
Isolamento de LECs da pele do pulmão e do membro de camundongos
O pulmão e a pele dos membros de camundongos foram coletados, picados e digeridos enzimaticamente usando o Dissociador GentleMACS (Miltenyi Biotec, 130-093-235) com o Kit de Dissociação de Múltiplos Tecidos 1 (Miltenyi Biotec, 130-110-201) de acordo com as instruções do fabricante. A digestão foi interrompida pela adição de DMEM/F12 contendo 10% de SBF, e suspensões de células únicas foram preparadas por filtração sequencial através de filtros de 100 e 40 μm, seguidas por etapas de centrifugação e lavagem em tampão MACS (PBS, 0,5% de BSA e 2 mM de EDTA). Para o enriquecimento de CELs, as suspensões de células únicas foram incubadas com anticorpo anti-LYVE1 (Fitzgerald, 70R-LR003) seguido por microesferas de imunoglobulina G (IgG) anti-coelho (Miltenyi Biotec, 130-048-602). A separação magnética foi realizada utilizando colunas LS (Miltenyi Biotec, 130-042-401) em um separador QuadroMACS de acordo com as instruções do fabricante. O fluxo não retido representou a fração Lyve1−, enquanto as células retidas magneticamente foram coletadas como a fração Lyve1+ (CELs). As CELs purificadas foram centrifugadas, ressuspensas em reagente TRIzol (Invitrogen, 15596026) e armazenadas a −80°C até a extração de RNA.
Imuno-histoquímica de montagem total
A pele da orelha foi dissecada da camada de cartilagem e fixada em formaldeído 4% em PBS por 1 hora no gelo. Após lavagem três vezes em PBS, as amostras foram permeabilizadas em PBS com TritonX-100 0,3% (PBST) e saturadas por 1 hora em PBS contendo TritonX-100 0,3% e leite 3% (PBSMT) à temperatura ambiente. Após lavagem três vezes em PBS, as amostras foram incubadas com anticorpos primários: anticorpo de cabra anti-Lyve-1 de camundongo (R&D, AF2125) 1:200 e anticorpo monoclonal de camundongo anti-podoplanina humana clone D2-40 em PBST 1:200 durante a noite a 4°C. Os anticorpos secundários Alexa Fluor 488 AffiniPure IgG de burro anti-cabra (Jackson ImmunoResearch; 705-545-003; 1:300) e Alexa 594 AffiniPure IgG de burro anti-camundongo (Jackson ImmunoResearch; 715-585-150; 1:300) foram incubados por 2 horas à temperatura ambiente. As amostras foram montadas em lâmina em Meio de Montagem Fluorescente (Dako, S302380-2). As imagens foram adquiridas em microscópio de campo amplo DMi8 (Leica) usando uma câmera Leica DFC9000GT. Para medições quantitativas, pelo menos três regiões na periferia e no centro de cada pele de orelha externa foram analisadas. O nível de limiar foi ajustado para minimizar o ruído de fundo, e então os valores de intensidade de pixel para a área corada positivamente foram medidos usando o software NIH ImageJ (NIH).
Microlinfangiografias
Camundongos foram anestesiados com uma injeção subcutânea de zoletil (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), e a integridade da vasculatura linfática da pele foi examinada por microlinfangiografia por fluorescência. Uma macromolécula marcada com fluorescência (dextrano conjugado com isotiocianato de fluoresceína-dextrano de 70.000 kDa, 2 mg/ml; Sigma-Aldrich, 46945-100MG-F) foi injetada no coxim plantar da pata edematosa e da pata controle. Devido ao seu grande tamanho, o traçador foi captado pelos linfáticos, mas foi excluído da vasculatura sanguínea. À medida que os vasos linfáticos transportavam o traçador fluorescente, ele era claramente visível dentro dos capilares linfáticos dérmicos e vasos coletores, proporcionando assim uma visualização clara da funcionalidade linfática. As imagens foram adquiridas usando um binóculo (Zeiss) e analisadas no Fiji.
Histologia
Para coloração em parafina, as peles foram fixadas em formalina 10% durante a noite antes da inclusão em parafina. Cortes de cinco micrômetros foram desparafinizados e reidratados antes da recuperação antigênica com citrato. Os tecidos foram bloqueados com BSA 5% por 30 min à temperatura ambiente. Todas as secções de tecido foram então incubadas a 4°C com os anticorpos primários apropriados durante a noite. As secções foram então incubadas com conjugados de anticorpos secundários marcados com fluorescência correspondentes por 2 horas à temperatura ambiente, seguidas por coloração com DAPI por 5 min antes da montagem com meio de montagem fluorescente (Dako, S302380-2). As secções foram imageadas com um microscópio invertido de fluorescência (Leica, DMi8). Os anticorpos primários utilizados foram anticorpo de cabra anti-Lyve-1 de camundongo (1:200, R&D, AF2125) e anticorpo de rato anti-F4/80 de camundongo (1:50, BioRad, MCA497G). Os anticorpos secundários utilizados foram Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (Jackson ImmunoResearch; 705-545-003) e Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Rat IgG (Jackson ImmunoResearch; 312-605-044).
Quantificação do tamanho da derme
Secções de tecido incluídas em parafina foram coradas usando um kit de tricrômico de Masson (Biognost, MST-100T) seguindo as instruções do fabricante. As imagens foram adquiridas em um microscópio Leica usando uma câmera Leica DFC450C. A espessura da pele foi avaliada por análise usando o Fiji.
Análise por citometria de fluxo
Peles de membros de camundongos foram coletadas e digeridas com o Multi Tissue Dissociation Kit (Miltenyi, 130-110-204) de acordo com as instruções do fabricante, seguindo o programa de tecido de pele de camundongo no gentle MACS Dissociator da Miltenyi. Os tecidos digeridos foram clarificados através de um filtro de células de 100 μm antes da lise de eritrócitos usando Red Blood Cell Lysis Solution (Miltenyi, 130-094-183) por 2 min à temperatura ambiente. Suspensões celulares foram obtidas após filtração através de um filtro de células de 40 μm e foram ressuspensas em tampão FACS (PBS, 2% FBS e 0,4% EDTA 2 mM) e então bloqueadas com 10% de reagente bloqueador de FcR de camundongo (Miltenyi, 130-092-575) e 2% de BSA por 10 min no gelo. A viabilidade celular foi determinada com Live/Dead fixable blue reagent (Invitrogen, L23105) em PBS por 20 min no gelo antes da coloração de anticorpos de superfície. As células foram coradas por 30 min no gelo com CD45-VF500 (Tonbo, 85-0451-U025), CD64-PE (Miltenyi, 130-118-684), CD11b-PE-vio770 (Miltenyi, 130-109-287), CD11c-BV605 (BioLegend, 117334), Ly-6G-VioBlue (Miltenyi, 130-119-986), Ly-6C-Vio Bright R720 (Miltenyi, 130-128-235), CD3-BUV805 (BD, 749276), CD8-BV570 (BioLegend, 100739), NK1.1-Brillant Violet 711 (eBioscience, 407-5941-82), F4/80-BUV395 (BD Biosciences, 565614), CD19-APC Fire 810 (BioLegend, 115577), CD206-PerCP/cy5.5 (BioLegend, 141715), CD4-APC Cy7 (BioLegend, BLE100526) e Brilliant Stain Buffer (Invitrogen, 00440942). Para coloração intracelular, as células foram fixadas e permeabilizadas com Transcription Factor Fixation/Permeabilization reagent (eBioscience, 00-5521-00) por 30 min no gelo e coradas com Arginase1-APC (eBioscience, 17-3697-82), FoxP3-PE (eBioscience, 12-5773-82) e iNOS-AF488 (eBioscience, 53-5920-82) por 30 min no gelo. As células foram analisadas pelo citômetro espectral Aurora (Cytek) e os dados foram obtidos com o software SpectroFlo (Cytek). As análises de citometria de fluxo foram realizadas na plataforma TRI-Genotoul (I2MC, Toulouse).
Estatística
Todos os resultados apresentados neste estudo são representativos de pelo menos três experimentos independentes. Os dados são apresentados como média ± EPM. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student bicaudal, teste U de Mann-Whitney bicaudal ou análise de variância (ANOVA) de uma via com teste post hoc de Tukey usando o Prism versão 6.0 (GraphPad). As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas com um valor de P < 0,05.
Materiais Suplementares
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REFERÊNCIAS
Linfangiogênese no desenvolvimento e na doença humana
Novos desenvolvimentos nos aspectos clínicos da doença linfática
Linfoedema secundário associado ao câncer
A obesidade aumenta a inflamação e prejudica a função linfática em um modelo de linfoedema em camundongos
Fisiopatologia molecular do linfoedema secundário
15-Lipoxigenase promove a resolução da inflamação no linfoedema controlando a função das células Treg via IFN-β
Além de PROX1: Regulação transcricional, epigenética e por RNAs não codificantes da identidade e função linfática
Evolução e funções dos RNAs longos não codificantes
Regulação epigenética por RNAs longos não codificantes
U1 snRNP regula a retenção de RNAs não codificantes na cromatina
A separação de fase do Pumilio induzida por NORAD é necessária para a estabilidade do genoma
Transferência de RNAs não codificantes mediada por vesículas extracelulares no câncer
RNAs não codificantes de vesículas extracelulares na angiogênese tumoral: Das funções biológicas ao significado clínico
O lncRNA GAPLINC regula a apoptose de células endoteliais vasculares na aterosclerose
O lncRNA PSMB8-AS1 instiga a inflamação vascular para agravar a aterosclerose
O lncRNA PSR regula o remodelamento vascular através da codificação de uma nova proteína, a arteridina
LETR1 é um lncRNA específico de endotélio linfático que governa a proliferação e migração celular através de KLF4 e SEMA3C
Os papéis emergentes dos RNAs longos não codificantes no desenvolvimento e doença vascular linfática
Sunitinibe estimula a expressão de VEGFC por células tumorais e promove linfangiogênese em carcinomas de células renais claras
Controle traducional por RNAs longos não codificantes
Múltiplos modelos de camundongos knockout revelam que lincRNAs são necessários para a vida e o desenvolvimento cerebral
O lincRNA Pint conecta a via p53 com o silenciamento epigenético pelo complexo repressivo Polycomb 2
Papel da regulação negativa do RNA longo não codificante (LncRNA) LINC-PINT na progressão da cardiomiopatia e retinopatia em pacientes com diabetes tipo 2
O lncRNA humano LINC-PINT inibe a invasão de células tumorais através de um elemento de sequência altamente conservado
LINC-PINT ativa a via da proteína quinase ativada por mitógeno para promover infarto agudo do miocárdio regulando miR-208a-3p
Linc-pint inibe o crescimento de adenocarcinoma ductal pancreático em estágio inicial através da ativação da via TGF-β
Caracterização multi-ômica do tecido adiposo induzido por linfedema resultante de cirurgia relacionada ao câncer de mama
Perspectivas sobre o ENCODE
A sinalização da adrenomedulina é necessária para o desenvolvimento vascular linfático murino
A vasculatura linfática requer sinalização do receptor de estrogênio-α para proteger contra linfedema
RNA longo não codificante LINC-PINT como um novo biomarcador prognóstico no câncer humano: Uma meta-análise e aprendizado de máquina
Implicações clínicas do lncRNA LINC-PINT no câncer
Lipoaspiração para inchaço em pacientes com linfedema
Um RNA longo não codificante, LncMyoD, modula a acessibilidade da cromatina para regular a progressão da linhagem miogênica de células-tronco musculares
A análise de acessibilidade da cromatina em célula única revela a base epigenética e fatores de transcrição característicos para os subtipos moleculares de cânceres colorretais
RNAs longos não codificantes e modificadores da cromatina: Seu lugar no código epigenético
PCGF3/5-PRC1 inicia o recrutamento de Polycomb na inativação do cromossomo X
Descoberta sistemática de proteínas de ligação ao RNA Xist
O lncRNA Xist interage diretamente com SHARP para silenciar a transcrição através de HDAC3
Transcrição extensa e coordenada de RNAs não codificantes dentro de promotores do ciclo celular
Desmetilação de histonas mediada pelo homólogo da amina oxidase nuclear LSD1
O sequenciamento de RNA de célula única revela heterogeneidade e diversidade funcional das células endoteliais linfáticas
Epigenética do desenvolvimento: Fenótipo e o epigenoma flexível
A epigenética do linfedema
A vasculatura linfática no século XXI: Novos papéis funcionais na homeostase e na doença
Administração de mRNA de Apelin-VEGF-C como terapia para o tratamento de linfedema secundário
Mudança do diâmetro linfático em diferentes posições corporais