pmid: "19483651"
title: "Inibição mediada por honokiol da via PI3K/mTOR: uma estratégia potencial para superar a imunorresistência em glioma, carcinoma de mama e de próstata sem impactar a função das células T."
authors: "Crane C, Panner A, Pieper RO, Arbiser J, Parsa AT"
journal: "Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md. : 1997)"
pubdate: "2009"
doi: "10.1097/CJI.0b013e3181a8efe6"
source: "PMC Full Text"

Inibição mediada por honokiol da via PI3K/mTOR: uma estratégia potencial para superar a imunorresistência em glioma, carcinoma de mama e de próstata sem impactar a função das células T.

Autores

Crane C, Panner A, Pieper RO, Arbiser J, Parsa AT

Periodico

Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md. : 1997) (2009)

Conteudo

Inibição mediada por Honokiol da via PI3K/mTOR: uma estratégia potencial para superar a imuno-resistência em glioma, carcinoma de mama e próstata sem impactar a função das células T
A inibição da via PI3K/mTOR é um método atraente para diminuir a imuno-resistência e aumentar a imunoterapia mediada por células T. Um grande obstáculo para essa estratégia é o impacto dos inibidores convencionais da via PI3K/mTOR na função das células T. Em particular, a Rapamicina, um imunossupressor bem conhecido, pode diminuir a atividade da via PI3K/mTOR em células tumorais, mas também tem um efeito inibitório profundo sobre as células T. Aqui mostramos que o Honokiol, um produto dietético natural isolado de um extrato dos cones de sementes de Magnolia grandiflora, pode diminuir a imuno-resistência mediada pela via PI3K/mTOR de linhagens celulares de glioma, câncer de mama e próstata, sem afetar funções críticas pró-inflamatórias das células T. Especificamente, mostramos que, em doses suficientes para reduzir os níveis de fosfo-S6 e do regulador imune negativo B7-H1 em células tumorais, o Honokiol não prejudica significativamente a proliferação de células T ou a produção de citocinas pró-inflamatórias.
Em contraste com inibidores clássicos, incluindo LY294002, Wortmannin, inibidor de AKT III e Rapamicina, o Honokiol diminui especificamente a atividade da via PI3K/mTOR em células tumorais, mas não em células T recém-estimuladas. Coletivamente, nossos dados definem uma aplicação única para o Honokiol e fornecem o impulso para elucidar mais completamente o mecanismo pelo qual as células T são resistentes aos efeitos desse inibidor específico. O Honokiol está disponível clinicamente para testes em humanos e pode servir para aumentar a imunoterapia do câncer mediada por células T.
A terapia do câncer é baseada na especificidade sem toxicidade. As terapias mais eficazes têm sido capazes de explorar um atributo único da célula cancerosa com impacto mínimo no tecido normal. Nesse aspecto, a imunoterapia é muito atraente como uma abordagem para atingir antígenos tumorais únicos associados ao tumor que não são expressos por células saudáveis. A imunoterapia mediada por células T bem-sucedida requer a expansão de linfócitos específicos do tumor CD4 e CD8 positivos, seguida pela lise do alvo, e posterior desenvolvimento de uma população de células T de memória que pode servir para atingir a recorrência do câncer. Como resultado, vários ensaios clínicos recentes empregaram estratégias de vacinação antitumoral na tentativa de ativar e expandir células imunes específicas do tumor. Muitas técnicas de vacinação anticâncer foram descritas para evocar imunidade mediada por células T ex vivo, com respostas imunes periféricas documentadas que são específicas do tumor. Essas vacinas incluem peptídeos específicos do tumor, abordagens de células dendríticas e proteínas de choque térmico derivadas do tumor. No entanto, na maioria dos ensaios clínicos, não houve correlação clara entre respostas imunes sistêmicas e eficácia clínica. As células T na periferia podem ser geradas em resposta à vacina, mas não matam consistentemente seu alvo tumoral, sugerindo um defeito intrínseco nas respostas das células T no ambiente tumoral.
A discordância entre a resposta imune periférica e a eficácia clínica destaca a imunorresistência ao câncer como um problema emergente na imunoterapia, o papel da imunorresistência das células tumorais. Muitos tipos de malignidades sólidas, incluindo tumores de mama, próstata e cérebro, possuem mecanismos bem caracterizados de imunossupressão. A inibição local e sistêmica da atividade das células T pode ser devida, em parte, a fatores secretados no microambiente local ou à expressão superficial de proteínas que impedem a ativação ou induzem apoptose das células efetoras. Em alguns casos, a imunorresistência está correlacionada com a ativação de vias oncogênicas. Recentemente, descobrimos uma ligação entre a via PI3K/mTOR e a expressão da proteína imunorresistente B7-H1 em células de glioma, carcinoma de mama e próstata. Outros mecanismos de imunorresistência ao câncer mediada pela via PI3K/mTOR foram descritos, sugerindo que a inibição de PI3K/mTOR pode servir como um meio de aumentar a imunoterapia mediada por células T. No entanto, um grande impedimento para essa estratégia é o impacto dos inibidores convencionais da via PI3K/mTOR na função das células T. Por exemplo, a rapamicina, um imunossupressor bem conhecido, pode diminuir a atividade da via PI3K/mTOR nas células tumorais, mas também tem um efeito profundo nas células T. O composto ideal inibiria a via PI3K/mTOR nos alvos tumorais sem interromper a função ou proliferação das células T.
Aqui mostramos que o Honokiol, um produto natural isolado de um extrato dos cones de sementes de Magnolia grandiflora, pode diminuir a imuno-resistência mediada por PI3K/mTOR em células de glioma, câncer de mama e próstata através da inibição da via PI3K/mTOR, sem afetar significativamente a função das células T pró-inflamatórias. Primeiramente caracterizado por sua atividade antimicrobiana, o Honokiol também demonstrou possuir propriedades anti-angiogênicas. Propriedades antitumorais específicas incluem a indução de apoptose dependente de caspase em células de leucemia linfocítica crônica B e a inibição do crescimento metastático ósseo de células de câncer de próstata humano. Mais recentemente, trabalhos em células de câncer de mama mostraram que o Honokiol pode atenuar a sinalização PI3K/Akt/mTOR por meio da regulação negativa da fosforilação de Akt e regulação positiva da expressão de PTEN. Neste relatório, mostramos que o Honokiol é eficaz na prevenção da via de sinalização PI3K/mTOR em células tumorais de glioma, mama e próstata, incluindo a expressão reduzida de B7-H1. Dado o papel do B7-H1 na indução da apoptose de células T, nossos achados indicam que a inibição de PI3K/mTOR pelo Honokiol pode aumentar as respostas tumorais específicas de células T tanto por meio do aumento da sobrevivência das células T quanto pela manutenção das funções pró-inflamatórias das células T. Juntos, esses dados apoiam o estudo clínico do Honokiol como um meio de aumentar a imunoterapia mediada por células T.

Métodos
Western Blot
A concentração de proteína dos extratos celulares foi medida usando o reagente Protein Assay (Bio-Rad) em relação aos padrões de albumina de soro bovino. A proteína (30 µg) foi submetida a SDS-PAGE e eletrotransferida para membrana Immobilon-P (Millipore). A membrana foi bloqueada a 4 °C durante a noite e incubada com anticorpo monoclonal de camundongo para α-tubulina, p70 S6K1 ou fosfo-S6K1 (Thr-389); anticorpo monoclonal de coelho para fosfo-AKT (S473) (Abcam, Cambridge, MA); ou anticorpo policlonal de cabra para B7-H1 (Santa Cruz Biotechnology) seguido de incubação com anticorpos secundários específicos de isotipo (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). A proteína ligada foi visualizada usando reagentes de detecção de quimioluminescência para western blot (Amersham, Piscataway, NJ). Medidas densitométricas foram adquiridas e α-tubulina foi usada para verificar carregamento igual.

Tratamento com Inibidores
1×106 células tumorais ou T foram incubadas por 48 horas com os seguintes inibidores: LY294002 (100µM) (Ly294), Wortmannin (100µM) (WORT), inibidor de AKTIII (50µM) (AKTIII), Honokiol (20µM) (HNK) ou Rapamicina (100µM) (Rapa). O Honokiol foi um presente do Dr. Jack Arbiser da Universidade Emory, todos os outros inibidores foram obtidos da Calbiochem, San Diego, CA). Todos os inibidores foram reconstituídos em DMSO (veículo). Onde indicado, o tratamento com veículo refere-se a células tratadas apenas com DMSO pelo mesmo período.
Linfócitos primários do sangue (PBL) foram isolados de sangue total por centrifugação com Ficoll de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Pesquisa em Humanos da UCSF # H47634-01655-34. O consentimento informado foi obtido para a coleta de PBL de pacientes com tumores não malignos. Os PBL foram enriquecidos para células T CD3+ usando seleção magnética celular negativa conforme as instruções do fabricante (StemCell Technologies, British Columbia). As células CD3+ foram estimuladas por 24 horas com 5µg/ml de anti-CD3 humano ligado à placa (OKT3) e 2µg/ml de anti-CD28 humano solúvel (CD28.2) antes da cocultura. 5×104 células tumorais foram plaqueadas em uma placa de 96 poços de fundo redondo e deixadas para aderir durante a noite; em seguida, 5×104 células CD3+ enriquecidas e estimuladas foram adicionadas em um volume final de 200µl.
Ensaio de apoptose
As células foram cocultivadas conforme descrito acima por 4 horas e subsequentemente coradas na superfície no gelo com CD45 APC (BD Pharmingen, San Diego, CA) em PBS/ 2% de BSA por 20 minutos e lavadas três vezes. As células foram então coradas com Anexina V FITC e 7-AAD (BD Pharmingen) por 10 minutos e fixadas em 1% de formaldeído contendo 5µg/ml de 7-AAD e analisadas por citometria de fluxo. Células tratadas com 1 µM de estaurosporina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) serviram como controle positivo para apoptose.
Medida da proliferação de células T
As células CD3+ foram enriquecidas conforme descrito acima e coradas com 10µM de éster succinimidil carboxifluoresceína (CFSE) por 10 minutos a 37°C. As células foram neutralizadas com 100% de SBF e lavadas três vezes em meio de crescimento contendo soro (RPMI 1640). As células foram então estimuladas com CD3/CD28 por 72 horas, coradas com CD45 APC, fixadas em 2% de paraformaldeído e analisadas por citometria de fluxo.
Marcação de citocinas intracelulares
Após a estimulação com CD3/CD28 na presença de Brefeldina A (Sigma-Aldrich), as células CD3+ foram coradas na superfície com CD8 FITC, CD4 PerCP (BD Pharmingen) e/ou CD25 APC (eBioscience, San Diego, CA) no gelo por 20 minutos e lavadas três vezes. As células foram então fixadas em 2% de paraformaldeído por 1 hora. As células CD3+ foram então coradas usando IFNγ APC ou IL-17 PE para a detecção de citocinas intracelulares (eBioscience) em tampão contendo saponina (PermWash, BD Pharmingen). As células foram subsequentemente analisadas por citometria de fluxo.
Significância estatística
Os dados de todas as figuras foram coletados de múltiplos experimentos independentes realizados em triplicata. Dados experimentais representativos são mostrados. A significância estatística foi determinada usando o teste t de Student bicaudal com p < 0,01. As barras de erro representam +/− desvio padrão.
Resultados
Primeiramente, nosso objetivo foi demonstrar que o Honokiol poderia inibir a ativação da via PI(3)K/mTOR em linhagens celulares de glioma deficientes em PTEN. Descobrimos que, nas linhagens celulares de glioma U87 e U251, o tratamento com Honokiol inibiu a ativação da PI(3) quinase, conforme demonstrado pela diminuição das proteínas fosfo AKT, fosfo S6 quinase e fosfo S6 (Figura 1A). Como esperado, a inibição dessa via foi associada a uma diminuição na expressão da proteína B7-H1. A inibição dessa via após o tratamento com Honokiol foi semelhante à observada após o tratamento com outros inibidores bem caracterizados da via PI3K/mTOR, LY294002, Wortmannin, inibidor de AKT III e Rapamicina. Demonstramos anteriormente que uma diminuição na expressão da proteína B7-H1 em células tumorais promove a sobrevivência de células T ativadas por meio da inibição da apoptose mediada por B7-H1. Para determinar se o tratamento com Honokiol medeia um efeito semelhante, comparamos a sobrevivência de células T após cocultura com linhagens celulares U87 e U251 tratadas antes e depois da exposição ao Honokiol (Figura 1B). Encontramos uma diminuição significativa (p<0,01) na porcentagem de células T em apoptose quando comparadas às células cocultivadas tratadas apenas com veículo. A porcentagem de células T em apoptose após cocultura com U87 ou U251 foi reduzida a níveis comparáveis aos observados após o tratamento com qualquer outro inibidor da via PI3K/mTOR testado (média = 6,59% e 10,7%, respectivamente), sugerindo que a diminuição na ativação da via PI3K/mTOR observada por western blot na Figura 1A tem consequências funcionais na indução da apoptose de células T mediada por células tumorais.
Para determinar se essa observação era um fenômeno restrito a células de glioma deficientes em PTEN, examinamos em seguida o efeito do tratamento com Honokiol em linhagens celulares de mama (Figura 2A) e de próstata (Figura 2B) deficientes em PTEN. Conforme observado nas linhagens celulares de glioma, o tratamento com Honokiol das linhagens BT549 e PC-3 reduziu significativamente os componentes fosforilados a jusante da via PI3K/mTOR a níveis semelhantes aos observados com o tratamento de outros inibidores de PI3K bem caracterizados. Após a cocultura com células T estimuladas, as células tumorais tratadas com Honokiol também reduziram significativamente a indução de apoptose de células T, medida pela coloração com Anexina V, em um grau semelhante aos outros inibidores testados (Figura 2B). Curiosamente, a diminuição na apoptose de células T após cocultura com células BT549 tratadas com Honokiol foi significativamente menor (p<0,05) do que a observada após o tratamento com Ly294002, Wortmannin, inibidor de AKT III ou Rapamicina, sugerindo que o Honokiol promove a sobrevivência de células T ou inibe melhor a apoptose de células T mediada por células tumorais.
Uma possível explicação para a redução na apoptose de células T após cocultura com células tumorais tratadas com Honokiol é que o tratamento é tóxico para as células tumorais, reduzindo o número de células tumorais na cocultura. Para abordar essa possibilidade, tratamos células tumorais com doses de Honokiol, Ly294002, Wortmannina, Inibidor de AKT III ou Rapamicina em doses suficientes para inibir a sinalização PI3K/mTOR e avaliamos a quantidade de morte celular tumoral induzida antes da cocultura. Encontramos níveis semelhantes de Honokiol não sendo mais tóxico para as células tumorais do que os outros inibidores (Figura 3A), sugerindo que a morte preferencial de células tumorais pelo Honokiol não explica a redução na apoptose de células T observada na Figura 1. Quando as concentrações dos inibidores foram mantidas durante toda a cocultura de células T e tumorais (Figura 3B), descobrimos que a apoptose de células T foi diminuída nas células tumorais tratadas com Honokiol, enquanto na presença de Rapamicina, Wortmannina e Inibidor de AKT III, a morte de células T aumentou significativamente. Isso pode ser devido à indução de apoptose de células T como resultado da toxicidade do inibidor. O tratamento com Ly294002 também aumenta a apoptose de células T em menor grau, apesar de todos os inibidores reduzirem a sobrevivência das células tumorais e a expressão de B7-H1 nas células tumorais (Figura 1).
Tendo demonstrado que o Honokiol mediou efeitos semelhantes na sinalização de células tumorais e uma redução na apoptose de células T mediada por células tumorais, buscamos determinar os efeitos do Honokiol nas respostas de células T ativadas. Descobrimos que, em contraste com outros inibidores, o Honokiol suportou a proliferação de uma alta porcentagem de células T após a estimulação (Figura 4). A ligeira redução de células T em proliferação de 25.9% para 22.9 % em resposta ao tratamento com veículo (Figura 4B) não foi estatisticamente significativa (p=0.58), sugerindo um efeito mínimo do Honokiol na expansão das células T. Todos os outros inibidores de PI3K/mTOR testados reduziram significativamente os níveis de proliferação para abaixo do observado em células não estimuladas (8.83%), sugerindo que a proliferação basal em linfócitos de pacientes também é afetada por esses inibidores. A inclusão de inibidores durante a cocultura com células tumorais prejudicou a proliferação de células T (dados não mostrados), sugerindo que os efeitos observados são devidos às propriedades anti-inflamatórias das células tumorais e seus efeitos na proliferação de células T, e não à presença de Honokiol na cocultura. No entanto, foi relatado que o Honokiol tem propriedades anti-inflamatórias em células T, inibindo a proliferação da linhagem celular CTLL-2 responsiva a lipopolissacarídeos. Para determinar se poderíamos detectar uma inibição semelhante da proliferação em células T primárias, medimos a proliferação de células T após doses crescentes de tratamento com Honokiol. Em doses suficientes para inibir a sinalização de PI3K/mTOR em células tumorais (20µM), a proliferação de células T é relativamente não afetada. No entanto, em doses próximas a 80µM, a proliferação de células T pode ser inibida, sugerindo que o Honokiol tem o potencial de atuar como um agente anti-inflamatório em doses relativamente altas.

Após a estimulação das células T, vários marcadores de ativação são regulados positivamente na superfície celular, incluindo o receptor de IL-2, CD25. O CD25 é um marcador de ativação, mas também funcionalmente importante nas respostas imunes, pois a proliferação de células T ativadas depende da sinalização de IL-2 através do CD25. Para determinar se a diferença na proliferação de células T observada após o tratamento com inibidores poderia ser atribuída à expressão diferencial de CD25, examinamos a expressão na superfície de células T CD4 negativas, CD8 positivas (Figura 5A). Embora o Honokiol diminua significativamente a porcentagem de células que expressam CD25 (p<0.01) em relação às células tratadas apenas com veículo, descobrimos que 55.5% das células T CD8 estimuladas expressam CD25, em comparação com apenas 9.9% após o tratamento com Wortmannina e 27.0% após o tratamento com inibidor de AKT III, o que poderia explicar as diferenças na proliferação de células T. Curiosamente, o tratamento com Ly294002 e o tratamento com Honokiol tiveram efeitos semelhantes na expressão de CD25 (51.5%), sugerindo um mecanismo independente de CD25 para a abolição da proliferação de células T observada em células T tratadas com Ly294002.
A imunoterapia bem-sucedida depende de respostas de células T CD8 pró-inflamatórias caracterizadas pela produção de IFNγ ou IL-17. Para determinar se o tratamento com Honokiol preveniu a produção de citocinas pró-inflamatórias em resposta à estimulação, medimos em seguida o efeito na produção de citocinas por células T CD8. Descobrimos que o tratamento com Honokiol não prejudicou significativamente a capacidade das células T CD8 de produzir IFNγ (Figura 5B) e IL-17 (Figura 5C) quando comparado às células T tratadas apenas com veículo. Em contraste, todos os outros inibidores testados reduziram significativamente a porcentagem de células produtoras de citocinas pró-inflamatórias. Importante, a quantidade de citocina produzida por célula foi semelhante à observada em células não tratadas após a estimulação (Figura 5B e 5C). As respostas de citocinas das células T durante a cocultura com células tumorais foram ainda mais diminuídas na presença do inibidor (dados não mostrados), indicando que células tumorais com PI3K/mTOR reduzido têm uma capacidade intrínseca de prejudicar as respostas pró-inflamatórias das células T. Isso sugere que o tratamento com Honokiol funcionaria melhor em conjunto com outros tratamentos destinados a neutralizar o microambiente tumoral anti-inflamatório. Em conjunto, esses dados indicam que o tratamento com Honokiol em concentrações suficientes para reduzir a sinalização da via PI3K/mTOR e a expressão de B7-H1 tem um efeito mínimo na resposta pró-inflamatória das células efetoras da imunidade adaptativa.
Avaliamos os níveis de S6 fosforilado, um ponto final da sinalização de PI3K/mTOR em células T após o tratamento com Honokiol para determinar se a retenção da proliferação e da produção de citocinas pró-inflamatórias ocorre apesar da sinalização prejudicada de PI3K/mTOR/S6 nas células T. Enquanto o tratamento com inibidor de AKT III nas células T diminuiu os níveis de fosfo-S6 após a estimulação, o tratamento com Honokiol não o fez (Figura 6A). No entanto, o tratamento com Honokiol da linhagem celular de glioma deficiente em PTEN, U87, resultou em uma redução de 60% nos níveis de fosfo-S6 (Figura 6B). Como a ativação de S6 é importante para a tradução de proteínas e a função das células T ativadas, esses dados sugerem que as células T podem ter um mecanismo redundante para ativar S6 apesar da potente inibição da via PI3K/mTOR pelo Honokiol.
Discussão
A imunoterapia do câncer mediada por células T requer que um linfócito T CD8 específico do tumor possa identificar e alvejar efetivamente a célula cancerígena. A imunoressistência local e sistêmica é, portanto, um impedimento significativo para o sucesso da imunoterapia. As células tumorais possuem diversos mecanismos que facilitam a imunoressistência e a imunossupressão, incluindo a secreção de TGFβ ou a expressão de CTLA-4. Anteriormente, associamos a expressão da proteína B7-H1 à ativação da via PI3K/mTOR, identificando esta via oncogênica como um potencial alvo para superar um mecanismo conhecido de imunoressistência em células de glioma, câncer de mama e próstata, resultando em apoptose de células T. Aqui, mostramos que inibidores convencionais (LY294002, Wortmannina, Rapamicina, AKTIII) podem reduzir a apoptose de células T em cocultura com linhagens celulares tumorais deficientes em PTEN, mas que esses inibidores têm um impacto significativo na função pró-inflamatória das células T. Especificamente, esses inibidores reduziram a proliferação de células T, diminuíram a porcentagem de células T CD8 positivas que expressam interferon gama e IL-17, bem como reduziram a porcentagem de células T que expressam o marcador de ativação CD25. Consequentemente, a estratégia de potencializar a imunoterapia mediada por células T ao inibir a via PI3K/mTOR usando esses agentes convencionais provavelmente terá eficácia mínima devido aos efeitos colaterais na função das células T.
Primeiramente, consideramos o Honokiol como um possível candidato, com base em sua capacidade comprovada de inibir a via PI3K/mTOR em outros cânceres, bem como seu amplo uso como fitoterápico, sugerindo que seria bem tolerado como agente clínico e com baixa probabilidade de impactar negativamente o sistema imunológico. Aqui, mostramos que o Honokiol pode inibir a expressão de B7-H1 em três tipos de células tumorais deficientes em PTEN tão efetivamente quanto outros inibidores convencionais. Ao fazer isso, o Honokiol também pode reduzir a expressão de outras proteínas imunoressoras que são produto da perda de PTEN nessas células, ao reduzir a tradução mediada por S6 celular. Em contraste com outros inibidores convencionais, o Honokiol tem um efeito mínimo na proliferação de células T, na expressão de marcadores de ativação ou na produção de citocinas pró-inflamatórias. Os resultados desses experimentos fornecem o ímpeto para explorar mais completamente a utilidade clínica do Honokiol como adjuvante à imunoterapia ativa. Juntamente com trabalhos publicados anteriormente mostrando a inibição in vitro e in vivo tanto da proliferação de células tumorais quanto da angiogênese, nossos dados demonstram uma aplicação promissora para este inibidor natural de PI3K/mTOR que não havia sido descrita anteriormente. Os dados aqui apresentados também são consistentes com estudos publicados recentemente usando modelos de tumor xenoenxerto, sugerindo uma potencial aplicação de base ampla em pacientes com câncer.
Outros relatos publicados indicaram que o Honokiol possui efeitos anti-inflamatórios, inibindo a produção de citocinas inflamatórias e eliminando radicais livres produzidos durante uma resposta imune em andamento, em aparente contraste com nossos achados. No entanto, as citocinas e respostas avaliadas nesses estudos são aquelas produzidas durante uma resposta imune inata, como óxido nítrico, IL-6 e TNFα, em vez daquelas produzidas durante respostas imunes adaptativas. Um estudo recente sugere que o Honokiol atua, em vez disso, como um agente anti-inflamatório em células T. Possíveis explicações para essa discrepância estão relacionadas ao tipo de células e estímulos utilizados nos experimentos. Aqui, descrevemos os efeitos de doses baixas de Honokiol em células T primárias estimuladas com anti-CD3/CD28, enquanto o trabalho anterior utilizou a linhagem celular CTLL-2 após estimulação com lipopolissacarídeo ou Concanavalina A. Após o tratamento de células T com doses crescentes de Honokiol, também descobrimos que este inibidor pode bloquear a proliferação de células T (Figura 4), sugerindo que, em algumas condições, o Honokiol pode ser útil como um agente anti-inflamatório. Em conjunto com os dados aqui apresentados, o Honokiol pode ter o potencial de inibir o dano tecidual inespecífico que citocinas inatas e radicais livres podem causar e manter a função das células T e a especificidade da terapia imune adaptativa em doses suficientes para prevenir a sinalização de PI3K/mTOR.

O mecanismo pelo qual as células T são aparentemente resistentes aos efeitos do Honokiol ainda precisa ser elucidado. Nossos dados sugerem que a via PI3K/mTOR não é afetada em células T estimuladas expostas ao Honokiol, em contraste com células tumorais expostas à mesma dose no mesmo período de tempo. A resistência pode estar relacionada à redundância nas vias de sinalização em células T, ao vício oncogênico em células transformadas, a propriedades bioquímicas que distinguem a permeabilidade das células T das células tumorais, ou a uma combinação de múltiplos fatores. Independentemente do mecanismo específico responsável pela discordância entre glioma e linfócitos, os dados bioquímicos e funcionais deste relatório fornecem novos insights sobre a utilidade clínica potencial do Honokiol, no contexto da imunoterapia para pacientes com tumores deficientes em PTEN.
Estudos adicionais são necessários para estender esses resultados para o âmbito clínico, incluindo o uso de modelos animais pré-clínicos. Estudos atuais estão em andamento em nosso laboratório para avaliar a eficácia do tratamento com Honokiol no crescimento de células de glioma in vivo. Estudos longitudinais desses animais revelarão a capacidade das células T de eliminar células tumorais tratadas com Honokiol, prolongar a sobrevida dos animais e reduzir a carga tumoral. Nesses estudos, a análise ex vivo das células T também determinará as doses e os regimes de tratamento ideais que promovem a função pró-inflamatória das células T, evitando a ativação de PI3K/mTOR nas células tumorais. Antecipamos que doses mais altas serão necessárias para alcançar os resultados obtidos in vitro devido à complexidade do microambiente tumoral. No entanto, o uso dietético generalizado de Honokiol sugere que este agente será bem tolerado em altas doses. Também foi demonstrado que uma dosagem entre 35 e 65 mg/kg três vezes por semana é bem tolerada em modelos animais e pode induzir apoptose de células tumorais in vivo, fornecendo uma faixa testável mediana para a função das células T e toxicidade em animais portadores de tumor.

Em conclusão, identificamos uma característica anteriormente desconhecida do Honokiol que pode oferecer uma vantagem terapêutica para pacientes em tratamento com protocolos de imunoterapia baseados em células T. In vivo, o tratamento com Honokiol pode diminuir a sobrevida das células tumorais e a imunorresistência mediada por PI3K/mTOR às respostas imunes adaptativas. Considerando o interesse atual em terapias imunes mediadas por células T para pacientes com muitos tipos de câncer, nossos dados indicam que o Honokiol pode ser melhor considerado em combinação com outras terapias para manter a função das células imunológicas durante o tratamento.

Divulgação Financeira: JA depositou pedidos de direitos de patente internacional para o Honokiol. A Universidade Emory depositou pedidos de direitos nos EUA. Todos os outros autores declararam não haver conflitos de interesse em relação a este trabalho.

Referências
Abordagens imunoterapêuticas baseadas em células e peptídeos para glioma
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B7-H1 associado a tumor promove apoptose de células T: um mecanismo potencial de evasão imune
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A perda da função do supressor tumoral PTEN aumenta a expressão de B7-H1 e a imuno-resistência em glioma
A quinase PI(3) está associada a um mecanismo de imuno-resistência no câncer de mama e próstata
O direcionamento da sinalização de AKT sensibiliza o câncer para imunoterapia celular
CXCR6 induz a progressão do câncer de próstata pela via de sinalização AKT/alvo mamífero da rapamicina
A expressão reduzida de PTEN em células de câncer de mama confere suscetibilidade a inibidores da via PI3 quinase/Akt
A ativação compensatória de PI3-quinase/Akt/mTor regula o desenvolvimento de resistência ao imatinibe
A inibição da fosfatidilinositol 3-quinase sensibiliza amplamente as células de glioblastoma à apoptose induzida por receptores de morte e por drogas
Indução de apoptose e modulação da ativação e função efetora em células T por drogas imunossupressoras
Atividade antimicrobiana de constituintes fenólicos de Magnolia grandiflora L
Honokiol, um produto natural de baixo peso molecular, inibe a angiogênese in vitro e o crescimento tumoral in vivo
O produto natural honokiol induz apoptose dependente de caspase em células de leucemia linfocítica crônica de células B (B-CLL)
Honokiol, um produto natural de planta, inibe o crescimento metastático ósseo de células de câncer de próstata humano
O efeito anti-inflamatório do honokiol é mediado pela supressão da via PI3K/Akt
Na vanguarda: Controle de células T CD4+ sobre a reatividade de células T CD8+ a um antígeno tumoral modelo
Células polarizadas Th17 específicas do tumor erradicam melanomas grandes estabelecidos
Fator de crescimento transformador beta-2 derivado de células de glioblastoma humano: evidência de secreção de formas biologicamente ativas de alto e baixo peso molecular
Um ensaio piloto de bloqueio de CTLA-4 com anti-CTLA-4 humano em pacientes com câncer de próstata refratário a hormônios
Honokiol, um constituinte da erva medicinal oriental magnolia officinalis, inibe o crescimento de xenoenxertos PC-3 in vivo em associação com indução de apoptose
Honokiol, um produto natural de planta, inibe sinais inflamatórios e alivia artrite inflamatória
Honokiol é um potente sequestrador de radicais superóxido e peroxila
Honokiol inibe a ativação da via PI3K/mTOR, a expressão da proteína B7-H1 e a apoptose de células T em células de glioma deficientes em PTEN
(a) As linhagens celulares de glioblastoma com deficiência de PTEN, U87 e U251, foram tratadas por 72 horas com os inibidores de PI3K LY294002 (100 µM) (Ly294), Wortmannin (100 µM) (WORT), inibidor de AKTIII (50 µM) (AKTIII), Honokiol (20 µM) (HNK) ou Rapamicina (100 µM) (Rapa), e os lisados celulares totais foram analisados por western blot conforme descrito em Materiais e Métodos. (b) Linfócitos CD3+ (células T) foram estimulados com anti-CD3/anti-CD28 (3/28) ou deixados não estimulados (NS) e cocultivados com as linhagens U87 ou U251 tratadas com inibidores por 4 horas. As coculturas foram analisadas quanto à apoptose de células T utilizando marcação com CD45/AnnexinV/7-AAD. As barras representam a média de amostras triplicatas de um experimento representativo. As barras de erro representam +/− DP.
O Honokiol inibe a ativação da via PI(3) quinase/mTOR, a expressão da proteína B7-H1 e a apoptose de células T em células de mama e próstata com deficiência de PTEN
(a) As linhagens celulares tumorais com deficiência de PTEN, BT549 (câncer de mama) ou PC-3 (câncer de próstata), foram tratadas por 72 horas com os inibidores de PI3K descritos na Figura 1, e os lisados celulares totais foram analisados por western blot conforme descrito em Materiais e Métodos. (b) Células T foram estimuladas com anti-CD3/anti-CD28 (3/28) ou deixadas não estimuladas (NS) e cocultivadas com as linhagens BT549 ou PC-3 tratadas com inibidores por 4 horas. As coculturas foram analisadas quanto à apoptose de células T utilizando marcação com CD45/AnnexinV/7-AAD. As barras representam a média de amostras triplicatas de um experimento representativo. As barras de erro representam +/− DP.
O tratamento com Honokiol não reduz a apoptose de células T por aumento da toxicidade para as células tumorais
As linhagens celulares tumorais com deficiência de PTEN, U87 e U251, foram tratadas com os seguintes inibidores por 72 horas: LY294002 (100 µM) (Ly294), Wortmannin (100 µM) (WORT), inibidor de AKTIII (50 µM) (AKTIII), Honokiol (20 µM) (HNK) ou Rapamicina (100 µM) (Rapa). As células tumorais foram subsequentemente analisadas quanto à apoptose por citometria de fluxo utilizando marcação com Anexina/7-AAD. As barras representam a média de amostras triplicatas de um experimento representativo. As barras de erro representam +/− DP.
Células T tratadas com Honokiol proliferam em resposta à estimulação
(a) Citometria de fluxo representativa de células T marcadas com éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) e estimuladas com CD3/CD28 na presença de inibidores. Após 72 horas, as células foram analisadas quanto à diluição do CFSE. (b) Porcentagem média de células T em proliferação após 72 horas de estimulação com CD3/CD28. As porcentagens foram determinadas usando os gates desenhados nos dados brutos mostrados em (a). As barras representam a média de amostras triplicatas de um experimento representativo. As barras de erro representam +/− DP. (c) Diluição do CFSE por células T CD3+ 72 horas após estimulação com CD3/CD28 na presença de doses crescentes de Honokiol.
Células T CD8+ tratadas com Honokiol produzem citocinas pró-inflamatórias em resposta à estimulação
(a) Porcentagem média de células T CD8+ expressando CD25 na superfície celular. As células T foram estimuladas por 72 horas conforme descrito em Materiais e Métodos e analisadas quanto à expressão de superfície de CD4 (eixo x) e CD25 (eixo y) por citometria de fluxo (b–c) As células T foram estimuladas por 72 horas e analisadas quanto à expressão de CD8 (eixo x) e ao acúmulo intracelular de (b) IFNγ (eixo y) ou (c) IL-17 (eixo y). Os gráficos de barras são representativos da expressão média de amostras em triplicata. As porcentagens foram determinadas utilizando as gates definidas nos dados brutos de citometria de fluxo.
O tratamento com Honokiol, mas não o tratamento com inibidor de AKT III, permite a ativação da via PI3K/TOR em células T
(a) Células T ou (b) células de glioma U87 foram estimuladas por 72 horas na presença de Honokiol (20µM) ou inibidor de AKT III (50µM) e analisadas quanto à fosforilação de S6 por western blot. A alfa-tubulina foi usada como controle de carga. Os dados de densitometria forneceram uma medida quantitativa dos níveis de expressão proteica.