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pmid: "22353783"
title: "Honokiol ativa a proteína quinase ativada por AMP em células de câncer de mama por meio de uma via dependente de LKB1 e inibe a carcinogênese mamária."
authors: "Nagalingam A, Arbiser JL, Bonner MY, Saxena NK, Sharma D"
journal: "Breast cancer research : BCR"
pubdate: "2012 Feb 21"
doi: ""
source: "PMC Full Text"

Honokiol ativa a proteína quinase ativada por AMP em células de câncer de mama por meio de uma via dependente de LKB1 e inibe a carcinogênese mamária.

Autores

Nagalingam A, Arbiser JL, Bonner MY, Saxena NK, Sharma D

Periodico

Breast cancer research : BCR (2012 Feb 21)

Conteudo

Honokiol ativa a proteína quinase ativada por AMP em células de câncer de mama através de uma via dependente de LKB1 e inibe a carcinogênese mamária
Introdução
Honokiol, um polifenol de pequena molécula isolado de espécies de magnólia, é amplamente conhecido por seu potencial terapêutico como agente anti-inflamatório, antitrombótico e antioxidante e, mais recentemente, por sua função protetora na patogênese da carcinogênese. No presente estudo, buscamos examinar a eficácia do honokiol em inibir a migração e invasão de células de câncer de mama e elucidar os mecanismos moleculares subjacentes.
Métodos
Foram utilizados ensaios de clonogenicidade e de formação de colônias tridimensionais para examinar o crescimento de células de câncer de mama com tratamento com honokiol. O efeito do honokiol na invasão e migração de células de câncer de mama foi avaliado usando ensaios de invasão em Matrigel, migração por risco, migração de esferoides e migração baseada em sensoriamento de impedância elétrica célula-substrato (ECIS). Análises de Western blot e imunofluorescência foram usadas para examinar a ativação do eixo quinase hepática B1 (LKB1)-proteína quinase ativada por AMP (AMPK). Pares isogênicos de linhagens celulares de câncer de mama com knockdown de LKB1 foram desenvolvidos. A importância funcional da ativação de AMPK e da superexpressão de LKB1 nos efeitos biológicos do honokiol foi examinada usando fibroblastos embrionários de camundongo imortalizados (MEFs) nulos para AMPK e tipo selvagem (WT) para AMPK, e pares isogênicos de linhagens celulares com knockdown de LKB1. Finalmente, foram utilizados xenoenxertos em camundongos, análises imuno-histoquímicas e de Western blot de tumores.
Resultados
A análise dos mecanismos moleculares subjacentes revelou que o tratamento com honokiol aumenta a fosforilação e a atividade da proteína quinase ativada por AMP (AMPK), evidenciado pelo aumento da fosforilação do alvo downstream da AMPK, a acetil-coenzima A carboxilase (ACC) e pela inibição da fosforilação da p70S6 quinase (pS6K) e da proteína de ligação ao fator de iniciação eucariótico 4E 1 (4EBP1). Usando MEFs nulos para AMPK e MEFs tipo selvagem (WT) para AMPK, descobrimos que a AMPK é necessária para a modulação mediada por honokiol de pACC-pS6K. Intrigantemente, descobrimos que o tratamento com honokiol aumentou a expressão e a translocação citoplasmática do supressor tumoral LKB1 em células de câncer de mama. O knockdown de LKB1 inibiu a ativação de AMPK mediada por honokiol e, mais importante, a inibição da migração e invasão de células de câncer de mama. Além disso, o tratamento com honokiol resultou na inibição da tumorigênese mamária in vivo. A análise dos tumores mostrou aumentos significativos nos níveis de LKB1 citoplasmático e fosfo-AMPK nos tumores tratados com honokiol.
Conclusões
Em conjunto, esses dados fornecem as primeiras evidências in vitro e in vivo do papel integral do eixo LKB1-AMPK na inibição mediada por honokiol da invasão e migração de células de câncer de mama. Em conclusão, o tratamento com honokiol poderia potencialmente ser uma estratégia terapêutica racional para o carcinoma de mama.
Introdução
O câncer de mama é um dos cânceres mais comuns e a segunda principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em mulheres. Cerca de 226.870 novos casos de câncer de mama invasivo e cerca de 63.300 novos casos de carcinoma in situ serão diagnosticados em 2012, de acordo com as estimativas mais recentes para o câncer de mama nos Estados Unidos pela American Cancer Society. Apesar dos grandes avanços nos programas de rastreamento e do desenvolvimento de diversas abordagens terapêuticas direcionadas, a mortalidade relacionada ao câncer de mama ainda permanece em um nível alarmantemente alto, com aproximadamente 1 em cada 35 mulheres morrendo de câncer de mama. As terapias disponíveis, incluindo radiação, terapia endócrina e quimioterapia convencional, são frequentemente limitadas por alta toxicidade, menor eficácia, resistência terapêutica e morbidade relacionada ao tratamento. Portanto, estratégias terapêuticas mais eficazes são claramente necessárias para combater o câncer de mama e reduzir a morbidade e mortalidade.

A importância de agentes constitutivos ativos em produtos naturais tem se tornado cada vez mais evidente, devido às suas propriedades potencialmente preventivas e terapêuticas contra o câncer. Na medicina tradicional asiática, a casca da raiz e do caule de espécies de Magnolia tem sido usada por séculos para tratar ansiedade, distúrbios nervosos, febre, sintomas gastrointestinais e acidente vascular cerebral. Os benefícios terapêuticos das espécies de Magnolia têm sido atribuídos ao honokiol, um composto fenólico natural isolado de um extrato das sementes de Magnolia grandiflora. O honokiol demonstrou efeitos antitrombóticos, antibacterianos, anti-inflamatórios, antioxidantes e ansiolíticos, e pode se mostrar benéfico contra hepatotoxicidade, neurotoxicidade, trombose e angiopatia. Dois estudos pioneiros que mostraram os notáveis efeitos inibidores do honokiol na promoção de tumores de pele em camundongos e demonstraram a eficácia do honokiol contra tumores estabelecidos em camundongos confirmaram o potencial anticancerígeno do honokiol. Estudos subsequentes mostraram as atividades anticancerígenas do honokiol em muitas linhagens de células cancerígenas e modelos tumorais.
Foi descoberto que o honokiol altera muitos processos celulares e modula alvos moleculares que se sabe afetarem a apoptose, o crescimento e a sobrevivência de células tumorais. Uma revisão de estudos anteriores sugere que o mecanismo pelo qual o honokiol causa parada do crescimento e morte celular pode ser específico para linhagem celular/tipo tumoral e envolver muitas vias de sinalização. Por exemplo, a regulação positiva de Bax foi observada em alguns sistemas celulares, mas não em outros. O honokiol diminui a fosforilação de ERK, Akt e c-Src para induzir apoptose de forma eficaz em células de angiosarcoma SVR, inibe a via de sinalização de ERK para exercer atividade antiangiogênese, mas ativa ERK em neurônios corticais para induzir crescimento de neuritos. Na leucemia linfocítica crônica (LLC), o honokiol causa apoptose através da ativação da caspase 8, seguida pela ativação das caspases 9 e 3. O aumento da clivagem de Mcl-1 mediado pelo honokiol e a diminuição da regulação de XIAP, bem como a regulação positiva de BAD, são observados no mieloma múltiplo, enquanto Bid, p-Bad, Bak, Bax, Bcl-2 e Bcl-xL permanecem inalterados. O honokiol também inibe a via de sinalização NF-κB, afetando assim a expressão de muitos genes a jusante em células endoteliais, monócitos humanos, linfoma, células embrionárias renais, leucemia promielocítica, mieloma múltiplo, câncer de mama, câncer cervical e câncer de cabeça e pescoço. Assim, o honokiol provoca várias respostas celulares e modula múltiplas facetas da transdução de sinal.
No presente estudo, investigamos especificamente o efeito do honokiol nas propriedades malignas das células de câncer de mama, incluindo migração e invasão, e também examinamos os mecanismos moleculares subjacentes. Curiosamente, descobrimos que o honokiol aumenta a expressão do supressor tumoral LKB1 para modular a via de sinalização envolvendo o eixo AMPK-pS6K. Testamos diretamente a necessidade de AMPK e LKB1 na inibição mediada por honokiol das propriedades malignas das células de câncer de mama. Nossos resultados mostraram que LKB1 e AMPK são moléculas integrantes necessárias para a modulação mediada por honokiol de 4EBP1-pS6K e inibição da migração e invasão de células de câncer de mama.
Materiais e métodos
As linhagens celulares de câncer de mama humano, MCF7 e MDA-MB-231, foram obtidas da American Type Culture Collection e mantidas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Gemini Bioproducts, Woodland, CA, EUA) e 2 μM de L-glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A autenticação da linhagem celular foi realizada por análise de marcadores genéticos conhecidos ou resposta (por exemplo, expressão do receptor de estrogênio e p53 e responsividade ao estrogênio). MEFs imortalizadas knockout para AMPK (AMPK-nulo) e AMPK-WT foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Keith R. Laderoute (SRI International, Menlo Park, CA, EUA). Honokiol é um produto natural extraído do cone de sementes de Magnolia grandiflora, conforme descrito anteriormente. Anticorpos para p-AMPK (fosfo-AMPK), AMPK, ACC, p-ACC (fosfo-ACC), pS6K, p-pS6K (fosfo-S6K), 4EBP1, p-4EBP1 (fosfo-4EBP1), p-Akt (fosfo-Akt), Akt e LKB1 (3047) foram adquiridos da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA).

Knockdown estável de LKB1 usando RNA de grampo curto lentiviral
Cinco construções pré-fabricadas de RNA de grampo curto (shRNA) lentiviral para LKB1 e uma construção de controle negativo criada no mesmo sistema vetorial (pLKO.1) foram adquiridas da Open Biosystems (Huntsville, AL, EUA). Células pareadas com knockdown estável de LKB1 (MCF7 e MDA-MB-231) foram geradas seguindo nosso protocolo publicado anteriormente.

Ensaio de viabilidade celular
O ensaio de viabilidade celular foi realizado estimando-se a redução de XTT (2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazólio-5-carboxianilida), utilizando um kit comercialmente disponível (Roche). As células de câncer de mama foram tratadas com honokiol conforme indicado.

Ensaio de clonogenicidade
Para o ensaio de formação de colônias, as células MCF7 e MDA-MB-231 foram tratadas com honokiol conforme indicado por 10 dias; colônias contendo > 50 células de aparência normal foram contadas.

Ensaio de crescimento independente de ancoragem em ágar mole
O crescimento independente de ancoragem das células MCF7 e MDA-MB-231 na presença de tratamento com honokiol foi determinado pela formação de colônias em ágar mole. As colônias foram contadas em cinco campos selecionados aleatoriamente com aumento de ×10, utilizando um microscópio invertido Olympus IX50.

Ensaio de migração por risco
O ensaio de migração foi realizado de acordo com nosso protocolo publicado. As células foram tratadas com honokiol conforme indicado. As placas foram fotografadas após 24 e 48 horas no mesmo local da imagem inicial.

Ensaio de cicatrização de ferida por detecção de impedância elétrica célula-substrato (ECIS)
O ensaio de cicatrização de ferida foi realizado utilizando a tecnologia ECIS (Applied BioPhysics, Troy, NY, EUA) e seguindo nosso protocolo previamente estabelecido.

Ensaio de migração de esferoide
Células MDA-MB-231 e MCF7 (1,5 × 104) foram semeadas em placas revestidas com ágar a 0,5% e cultivadas em um agitador orbital (100 rpm) por 48 horas em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 a 37°C. Esferoides tumorais intactos foram selecionados e transferidos para placas de seis poços. Os esferoides foram tratados com honokiol, conforme indicado. Após 48 horas de incubação, os esferoides foram fixados com formalina tamponada a 10% em PBS e corados com violeta cristal. A migração das células a partir dos esferoides foi observada sob microscópio óptico.
Ensaio de invasão
Para um sistema modelo in vitro de metástase, o ensaio de invasão em Matrigel foi realizado utilizando uma câmara de invasão Matrigel da BD Biocoat Cellware (San Jose, CA, EUA). As lâminas foram codificadas para evitar viés de contagem, e o número de células invadidas em seções representativas de cada membrana foi contado sob microscópio óptico. O número de células invadidas para cada amostra experimental representa a média de poços em triplicata.
Western blotting
O lisado celular total foi preparado raspando células MCF7 e MDA-MB-231 em 250 μl de tampão RIPA modificado gelado. Uma quantidade igual de proteína foi resolvida em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio, transferida para membrana de nitrocelulose, e a análise de Western blot foi realizada. A imunodetecção foi realizada usando quimioluminescência amplificada (sistema ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.
Ensaio de imunoprecipitação
A imunoprecipitação de LKB1 foi realizada seguindo o protocolo previamente publicado, utilizando anticorpo anti-LKB1 seguido de imunoblotting com anticorpo anti-STRAD.
Imunofluorescência e imagem confocal
Células de câncer de mama (5 × 105 células/poço) foram plaqueadas em lâminas de câmara de quatro poços (Nunc, Rochester, NY, EUA) seguidas de tratamento com honokiol e submetidas à análise de imunofluorescência conforme descrito. Células fixadas e coradas por imunofluorescência foram imageadas usando um sistema confocal de varredura a laser Zeiss LSM510 Meta (Zeiss) configurado em um microscópio vertical Zeiss Axioplan 2 com uma objetiva plan-apocromática 63XO (NA 1,4). Todos os experimentos foram realizados múltiplas vezes usando réplicas biológicas independentes.
Ensaio de tumorigênese mamária
MDA-MB-231 (5 × 106) células em 0,1 ml de HBSS foram injetadas subcutaneamente na região glútea direita de camundongos fêmeas atímicos nus de 4 a 6 semanas de idade. Duas semanas após o implante inicial, os animais foram divididos em dois grupos experimentais. Os camundongos foram tratados com injeções intraperitoneais de (a) controle (solução salina e Intralipid) ou (b) honokiol, a 3 mg/camundongo/dia em Intralipid a 20% (Baxter Healthcare, Deerfield, IL, EUA), 3 vezes por semana durante a duração do experimento. Os tumores foram medidos com paquímetros, e o volume tumoral foi calculado usando a fórmula (V = a/2 × b2), onde V é o volume tumoral em milímetros cúbicos, e a e b são os maiores e menores diâmetros em milímetros, respectivamente. Todos os animais foram sacrificados após 4 semanas de tratamento. Os tumores foram coletados, pesados, fixados em formalina tamponada neutra a 10% e submetidos a análises adicionais com imuno-histoquímica.
Análise imuno-histoquímica
Utilizamos seções tumorais para determinar o efeito do honokiol na expressão de p-AMPK, LKB1 e Ki-67 por imuno-histoquímica. A imuno-histoquímica foi realizada essencialmente como descrito anteriormente por nós para outras proteínas. Pelo menos quatro imagens representativas não sobrepostas de cada seção tumoral de cinco camundongos de cada grupo foram capturadas usando o software ImagePro para quantificação da expressão de p-AMPK, LKB1 e Ki-67. Lisados celulares totais foram preparados a partir de amostras tumorais e submetidos a análise de imunotransferência. Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do ACUC da Universidade.
Análise estatística
Todos os experimentos foram realizados três vezes em triplicata. A análise estatística foi realizada usando o software Microsoft Excel. As diferenças significativas foram analisadas usando o teste t de Student e distribuição bicaudal. Os dados foram considerados estatisticamente significativos se P < 0,05. Os dados foram expressos como média ± EPM entre experimentos em triplicata realizados três vezes.
Resultados
O tratamento com honokiol inibe a clonogenicidade, migração e invasão de células de câncer de mama
Propriedades de inibição do crescimento e indução de apoptose do honokiol foram relatadas em várias linhagens de células cancerígenas. No presente estudo, duas linhagens de células de câncer de mama, MCF7 e MDA-MB-231, foram tratadas com várias concentrações variando de 1 μM a 25 μM de honokiol e submetidas a ensaio de clonogenicidade (Figura 1a) e de crescimento independente de ancoragem (Figura 1b). Foi observada inibição dose-dependente e estatisticamente significativa da clonogenicidade e da formação de colônias em ágar mole na presença de honokiol. O tratamento com 5 μM de honokiol resultou em ~50% a 60% de inibição da clonogenicidade e da formação de colônias em ágar mole, enquanto concentrações mais altas (10 e 25 μM) foram mais inibitórias (Figura 1a, b). Examinamos ainda o efeito do honokiol no crescimento das células de câncer de mama HCC1806, que possuem uma mutação homozigótica do LKB1, utilizando ensaio de clonogenicidade e de formação de colônias em ágar mole. Nossos estudos mostram que o honokiol não inibe o crescimento das células HCC-1806 (Arquivo adicional 1). Esses resultados indicam que o LKB1 pode ser uma molécula integral para a inibição do crescimento mediada pelo honokiol.
Honokiol inibe a clonogenicidade e o crescimento independente de ancoragem de células de câncer de mama. (a) Células MCF7 e MDA-MB-231 foram tratadas com várias concentrações de honokiol (HNK) (conforme indicado) e submetidas a ensaio de clonogenicidade. U, células não tratadas. Colônias contendo > 50 células de aparência normal foram contadas. *P < 0,005, em comparação com os controles não tratados. (b) Células de câncer de mama foram submetidas a ensaio de formação de colônias em ágar mole na presença de várias concentrações de honokiol por 3 semanas. Os resultados são expressos como número médio de colônias contadas (em seis microcampos). *P < 0,001, em comparação com os controles não tratados.
A progressão do câncer é um processo de múltiplas etapas que envolve a invasão da membrana basal por células tumorais e a migração para pontos distantes de uma determinada massa tumoral primária, levando à metástase. Examinamos o efeito do honokiol na migração e invasão de células de câncer de mama utilizando ensaios de migração por "scratch", migração baseada em sensoriamento de impedância elétrica célula-substrato (ECIS), migração de esferoides e ensaio de invasão em Matrigel. O tratamento com honokiol resultou na inibição da migração das células de câncer de mama (Figura 2a) em comparação com células não tratadas. Para a determinação quantitativa da alteração no potencial de migração das células de câncer de mama após o tratamento com honokiol, realizamos um ensaio de impedância em tempo real quantitativo utilizando a técnica baseada em ECIS. Como esperado, células confluentes apresentaram altos valores de resistência. Células confluentes foram submetidas a um pulso de alta voltagem que resultou na diminuição da resistência, indicando morte e desprendimento das células presentes no pequeno eletrodo ativo. As células foram deixadas não tratadas ou tratadas com honokiol, e as alterações na resistência foram registradas por 24 horas. As células de controle não tratadas apresentaram um aumento na resistência, mostrando aumento da migração das células ao redor do pequeno eletrodo ativo que não foram submetidas ao pulso de alta voltagem para atingir os valores de resistência das células não lesionadas no início do experimento. As células tratadas com honokiol apresentaram uma diminuição na resistência, indicando diminuição da migração. Notavelmente, as células tratadas com honokiol nunca atingiram os valores das células não lesionadas, mostrando inibição significativa do potencial de migração (Arquivo adicional 2). Examinamos o efeito do tratamento com honokiol na capacidade migratória de esferoides das células MCF7 e MDA-MB-231. Observou-se migração significativa das células MCF7 e MDA-MB-231 a partir dos esferoides em condições não tratadas. O tratamento com honokiol resultou na inibição da migração das células a partir dos esferoides (Figura 2b). Em seguida, realizamos o ensaio de invasão em Matrigel para examinar o efeito do honokiol no potencial de invasão das células de carcinoma de mama. Como evidenciado na Figura 2c, o tratamento com honokiol diminuiu a invasão das células de câncer de mama através do Matrigel em comparação com células não tratadas. A ativação da FAK tem sido demonstrada como reguladora da migração e invasão de células cancerígenas por meio de vias distintas, promovendo a regulação dinâmica das adesões focais e das estruturas periféricas de actina e a degradação da matriz mediada por metaloproteinases da matriz (MMPs). Examinamos se o tratamento com honokiol afeta a ativação da FAK para inibir a migração e invasão das células de câncer de mama. O tratamento com honokiol inibiu a fosforilação da FAK em células de câncer de mama, indicando o envolvimento da ativação da FAK na inibição mediada pelo honokiol do potencial de migração e invasão das células de câncer de mama (Figura 2d). Coletivamente, esses resultados mostram que o tratamento com honokiol pode inibir efetivamente a clonogenicidade, a formação de colônias independente de ancoragem, a migração e a invasão das células de carcinoma de mama.
Honokiol inibe a migração e invasão de células de câncer de mama. (a) Células MCF7 e MDA-MB-231 foram submetidas ao ensaio de migração por risco. O meio de cultura foi substituído por meio contendo honokiol (2.5 μM) ou meio não tratado (U). O tratamento com fator de crescimento epidérmico (EGF) a 100-ng/ml foi usado como controle positivo. As placas foram fotografadas na mesma localização da imagem inicial (0 horas) às 24 horas. Os resultados mostrados são representativos de três experimentos independentes realizados em triplicata. O histograma mostra a mudança na migração (fold change). *P < 0.01, comparado com controles não tratados. (b) Células MCF7 e MDA-MB-231 foram submetidas ao ensaio de migração de esferoides. O meio de cultura foi substituído por meio contendo honokiol (2.5 μM) ou meio não tratado (U). Os esferoides foram fotografados 48 horas após o tratamento. Os resultados mostrados são representativos de três experimentos independentes realizados em triplicata. Os histogramas mostram a porcentagem de migração. *P < 0.01, comparado com controles não tratados. (c) Células MCF7 e MDA-MB-231 foram cultivadas em câmaras de invasão de Matrigel seguidas de tratamento com honokiol (HNK, 1.0, 2.5 μM) por 24 horas, conforme indicado. U, controles não tratados. O número de células que invadiram através do Matrigel foi contado em cinco regiões diferentes. As lâminas foram codificadas para remover viés de contagem. Os histogramas mostram a média de três experimentos independentes realizados em triplicata. *P < 0.005, comparado com controles não tratados. (d) Células de câncer de mama (MDA-MB-231) foram tratadas com honokiol (HNK, 2.5 μM) pelos intervalos de tempo indicados. U, células não tratadas. A proteína total foi isolada, e quantidades iguais de proteínas foram resolvidas com SDS-PAGE e submetidas à análise de immunoblot utilizando anticorpos específicos para FAK fosforilada. As membranas foram reblotadas utilizando anticorpos totais de FAK como controles. Os blots são representativos de múltiplos experimentos independentes.
A ativação da AMPK induzida por honokiol desempenha um papel integral na inibição mediada por honokiol da atividade do mTOR e do potencial de migração das células
Honokiol modula múltiplas vias (fator nuclear (NF)-κB, ERK, Akt e JNK) de maneira dependente do processo celular e do tecido-alvo. A proteína quinase ativada por AMP (AMPK) é uma serina/treonina proteína quinase que atua como um sensor mestre do equilíbrio energético celular em células de mamíferos, regulando o metabolismo da glicose e dos lipídios. Estudos recentes implicaram a AMPK como um fator importante no crescimento e migração de células cancerígenas. Assim, buscamos determinar o efeito do honokiol na fosforilação e ativação da AMPK. O tratamento com honokiol estimulou a fosforilação da AMPK na Thr-172 em células MCF7 e MDA-MB-231. O honokiol não teve efeito nos níveis de expressão total da proteína AMPK (Figura 3a). A fosforilação da AMPK na Thr-172 tem sido amplamente associada à sua ativação. Uma vez ativada, a AMPK fosforila e inativa diretamente várias enzimas metabólicas consumidoras de ATP, incluindo a acetil-coenzima A carboxilase (ACC). Examinamos a fosforilação da ACC para avaliar a atividade da AMPK com o tratamento com honokiol. Observou-se aumento da fosforilação da ACC em células MCF7 e MDA-MB-231 em resposta ao tratamento com honokiol, em comparação com células não tratadas, enquanto os níveis totais da proteína ACC permaneceram inalterados (Figura 3a). A ativação da AMPK leva à supressão da sinalização do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), e os mecanismos moleculares envolvem a fosforilação da proteína do complexo da esclerose tuberosa TSC2 na Thr-1227 e Ser-1345, que aumenta a atividade do complexo TSC1-TSC2 para inibir o mTOR. Dois efetores a jusante do mTOR muito bem caracterizados e amplamente estudados são a proteína quinase S6 ribossômica de 70 kDa (p70S6K1 ou pS6K) e a proteína de ligação ao fator de iniciação eucariótico 4E (elF4E) (4EBP1). A fosforilação de pS6K e 4EBP1 tem sido amplamente utilizada para avaliar alterações na atividade do mTOR em resposta a várias vias de fatores de crescimento. Em seguida, examinamos o efeito do honokiol na atividade do mTOR em células de câncer de mama. O honokiol diminuiu a fosforilação de pS6K e 4EBP1 em ambas as células MCF7 e MDA-MB-231, sem afetar os níveis totais das proteínas pS6K e 4EBP1 (Figura 3b). Estudos recentes mostraram que a pS6K regula o citoesqueleto de actina atuando como uma proteína de reticulação de filamentos de actina e como uma proteína ativadora de GTPase da família Rho. Foi demonstrado que a reorganização do citoesqueleto de actina é crítica para a migração celular, pois as células cancerígenas móveis devem montar e desmontar os filamentos de actina em suas bordas de avanço. A depleção ou inibição da atividade da pS6K resulta na inibição da reorganização do citoesqueleto de actina e na inibição da migração. Devido ao papel integral da pS6K na migração de células cancerígenas, é possível que a inibição da migração mediada pelo honokiol seja mediada através da inibição da pS6K.
O honokiol ativa a AMPK e inibe a fosforilação de pS6K e 4EBP1 em células de câncer de mama. (a) Células MCF7 e MDA-MB-231 foram tratadas com honokiol (HNK, 2,5 μM) pelos intervalos de tempo indicados. U, células não tratadas. A proteína total foi isolada, e quantidades iguais de proteínas foram resolvidas com SDS-PAGE e submetidas à análise de immunoblot usando anticorpos específicos para AMPK fosforilada (pAMPK-Thr 172) e ACC fosforilada (pACC). As membranas foram reblotadas usando anticorpos totais para AMPK e ACC como controles. Os blots são representativos de múltiplos experimentos independentes. O histograma é a média da análise densitométrica mostrando unidades de densidade relativa (RDUs) do sinal de Western blot para pAMPK e pACC normalizados para AMPK total ou ACC em três experimentos separados. *P < 0,005, em comparação com controles não tratados. (b) Células de câncer de mama foram tratadas com honokiol como em (a) e submetidas à análise de immunoblot usando anticorpos específicos para pS6K fosforilada (p-pS6K) e 4EBP1 fosforilada (p-4EBP1). As membranas foram reblotadas usando anticorpos totais para pS6K e p-4EBP1 como controles. Os blots são representativos de múltiplos experimentos independentes. O histograma é a média da análise densitométrica mostrando unidades de densidade relativa (RDUs) do sinal de Western blot para p-pS6K e p-4EBP1 normalizados para pS6K total ou 4EBP1 em três experimentos separados. *P < 0,001, em comparação com controles não tratados.
O mTOR, um regulador chave do crescimento e proliferação celular, existe em dois complexos multiproteicos estrutural e funcionalmente distintos, mTORC1 e mTORC2. Sabe-se que o mTORC1 ativa a síntese proteica e o crescimento celular através da regulação da atividade de pS6K e 4E-BP1, enquanto o mTORC2 fosforila Akt em Ser-473, ativando o crescimento, proliferação e sobrevivência celular. Descobrimos que o honokiol aumenta a ativação da AMPK e inibe a função do mTORC1, conforme evidenciado pela inibição da fosforilação de pS6K e 4E-BP1.
Em seguida, determinamos se o tratamento com honokiol modula a função do mTORC2. O mTORC2 fosforila Akt em Ser-473. Portanto, para determinar se o mTORC2 também é inibido pelo honokiol sob condições semelhantes, células de câncer de mama foram tratadas com honokiol, e a fosforilação de Akt foi determinada. O honokiol não alterou a fosforilação de Akt em Ser-473 em células de câncer de mama (arquivo adicional 3). Esses resultados fornecem evidências de que o honokiol inibe apenas o mTORC1 em células de câncer de mama. Achados contrastantes foram relatados anteriormente, mostrando redução na fosforilação de Akt em resposta ao tratamento com honokiol. Vale notar que, neste estudo, as células MDA-MB-231 foram tratadas com concentrações muito mais altas de honokiol (60, 80 e 100 μM). Portanto, a diminuição observada na fosforilação de Akt pode ser devida ao tratamento com concentrações mais altas de honokiol. O honokiol inibe o crescimento do câncer de mama de maneira dependente da concentração, com concentrações mais altas sendo muito mais inibitórias do que concentrações mais baixas (Figura 1).
Embora nossos achados tenham claramente demonstrado o envolvimento da ativação da AMPK na rede de sinalização do honokiol, levantamos a questão se a inibição do mTOR e da migração celular induzida pelo honokiol requer a proteína AMPK. Utilizamos MEFs derivadas de camundongos AMPK-WT (WT) e AMPK knockout (AMPK-nulo) para testar a possível necessidade dessa proteína na inibição da migração mediada pelo honokiol. A imunotransferência confirmou a ausência da proteína AMPK nas MEFs AMPK-nulas (Figura 4a). Em concordância com a ausência da proteína AMPK, as MEFs AMPK-nulas não apresentaram qualquer fosforilação da ACC, mesmo na presença de honokiol. As MEFs AMPK-WT, por outro lado, exibiram fosforilação da ACC estimulada pelo honokiol, indicando ativação da AMPK (Figura 4b). A exposição de MEFs derivadas de camundongos AMPK-WT ao honokiol resultou em inibição da fosforilação da pS6K, enquanto as MEFs derivadas de camundongos AMPK-nulos foram significativamente resistentes à inibição da fosforilação da pS6K mediada pelo honokiol (Figura 4d).

A depleção de AMPK abole o aumento da fosforilação da ACC mediado pelo honokiol, a inibição da fosforilação da S6K e a inibição da migração. (a) Imunotransferência para a proteína AMPK usando lisados de MEFs não tratadas derivadas de camundongos AMPK-WT (WT) e AMPK knockout (AMPK-nulo). O blot foi desnudado e reincubado com anticorpo anti-actina. (b) MEFs WT e AMPK-nulas foram tratadas com honokiol (HNK, 2,5 μM) pelos intervalos de tempo indicados. U, célula não tratada. A proteína total foi isolada, e quantidades iguais de proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e submetidas à análise por imunotransferência usando anticorpos específicos para ACC fosforilada (p-ACC). O anticorpo anti-actina foi usado como controle. (c) MEFs WT e AMPK-nulas foram submetidas ao ensaio de migração por risco na presença (HNK, 2,5 μM) ou ausência (U) de honokiol. As placas foram fotografadas no local idêntico da imagem inicial (0 horas) em 24 horas. O histograma mostra a mudança na migração vezes o controle. *P < 0,001, em comparação com os controles não tratados. Todos os experimentos foram realizados três vezes em triplicata. (d) MEFs WT e AMPK-nulas foram tratadas com honokiol (HNK, 2,5 μM) pelos intervalos de tempo indicados. U, célula não tratada. A proteína total foi isolada, e quantidades iguais de proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e submetidas à análise por imunotransferência usando anticorpos específicos para pS6K fosforilada (p-pS6K). As membranas foram reincubadas usando anticorpo total para pS6K e actina como controle. (e) MEFs WT e AMPK-nulas foram submetidas ao ensaio de XTT na presença (HNK) ou ausência (U) de honokiol, conforme indicado. Os resultados mostrados são representativos de três experimentos independentes realizados em triplicata. *P < 0,001, em comparação com os controles não tratados.
A seguir, investigamos se a AMPK está diretamente envolvida na inibição da migração mediada por honokiol. MEFs AMPK-WT apresentaram inibição da migração em resposta ao tratamento com honokiol tanto no ensaio de migração por "scratch" quanto no ensaio de migração baseado em ECIS. Curiosamente, o tratamento com honokiol não conseguiu inibir a migração de MEFs deficientes em AMPK (Figura 4c; Arquivo adicional 4). O knockdown de AMPK também inibiu o efeito antiproliferativo do honokiol (Figura 4e). Esses resultados mostraram que a AMPK é uma molécula integral na mediação dos efeitos negativos do honokiol sobre o eixo mTOR e o potencial de migração das células.
A inibição de LKB1 abole a modulação da AMPK mediada por honokiol e a inibição da migração e invasão celular.
O supressor tumoral LKB1 (também conhecido como Stk11) é uma proteína quinase serina/treonina evolutivamente conservada que possui uma ampla gama de funções celulares, incluindo supressão tumoral, polaridade celular, regulação do ciclo celular e promoção da apoptose. O LKB1 foi recentemente identificado como uma quinase upstream crítica para a AMPK, regulando sua atividade. De forma intrigante, descobrimos que o honokiol aumenta a expressão do supressor tumoral LKB1 nas células MCF7 e MDA-MB-231, com um aumento significativo em 1 hora de tratamento e expressão máxima em 24 horas nas células MCF7 e em 4 horas nas células MDA-MB-231 (Figura 5a). A expressão variável de LKB1 em células de câncer de mama MDA-MB-231 foi relatada. Recentemente, adquirimos células MDA-MB-231 de vários laboratórios de pesquisa estabelecidos em câncer de mama e analisamos a expressão e o estado funcional do LKB1. Nossos dados mostraram inequivocamente a presença de LKB1 funcional nas células MDA-MB-231. O LKB1 humano é tanto nuclear quanto citoplasmático, mas um mutante de LKB1 sem o sinal de localização nuclear ainda retém a capacidade de suprimir o crescimento celular, sugerindo que o pool citosólico de LKB1 desempenha um papel importante na mediação de suas propriedades supressoras de tumor. A proteína STRAD (adaptador relacionado a Ste20) demonstrou formar um complexo no qual a STRAD ativa o LKB1, resultando na translocação citoplasmática do LKB1. Investigamos o efeito do honokiol na formação do complexo LKB1-STRAD em células de câncer de mama. Para abordar essa questão, células de câncer de mama foram tratadas com honokiol, seguidas de imunoprecipitação com anticorpos contra LKB1. Os complexos proteicos imunoprecipitados foram analisados quanto à presença de STRAD usando análise de Western blot. Níveis mais elevados de STRAD imunoprecipitado com LKB1 na presença de honokiol indicaram aumento da formação do complexo LKB1-STRAD (Figura 5b). A imunocoloração de células MCF7 e MDA-MB-231 tratadas com honokiol revelou que o tratamento com honokiol aumenta o acúmulo citoplasmático de LKB1. O LKB1 estava localizado predominantemente no núcleo em células de câncer de mama não tratadas, embora a expressão citoplasmática de LKB1 também tenha sido detectada (Figura 5c). Experimentos de controle com anticorpo secundário (resultados não mostrados) produziram uma coloração de fundo extremamente fraca, distribuída uniformemente por toda a célula, independentemente do tratamento. Estudos sobre a localização subcelular do LKB1 indicaram uma ampla variedade de padrões de localização.
Camundongo LKB1 foi encontrado predominantemente nuclear, enquanto Caenorhabditis elegans PAR-4 e Xenopus XEEK1 foram detectados exclusivamente no citoplasma. LKB1 humano foi detectado tanto nuclear quanto citoplasmático em vários tipos celulares. Embora a expressão de LKB1 seja exclusivamente citoplasmática em câncer de pulmão e pâncreas, pólipos hamartomatosos gastrointestinais de pacientes com síndrome de Peutz-Jeghers, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, carcinoma lobular invasivo da mama e carcinoma ductal papilar sólido in situ da mama mostram expressão de LKB1 tanto citoplasmática quanto nuclear. Estudos em cardiomiócitos primários de ratos adultos e mioblastos C2C12 mostraram que LKB1 estava localizado predominantemente no núcleo e sofre localização citoplasmática sob várias estimulações. Estudos in vitro sugerem que LKB1 nuclear regula a progressão do ciclo celular e atua como fator de transcrição, enquanto LKB1 citoplasmático participa do controle do metabolismo energético e da polaridade celular. Não é completamente compreendido como a localização subcelular de LKB1 afeta sua função supressora de tumor e ativação de outras vias de sinalização in vivo.
Honokiol aumenta a expressão de LKB1, a interação LKB1:STRAD, a translocação citosólica, e a depleção de LKB1 abole a modulação mediada por honokiol da AMPK, a inibição da migração e invasão de células de câncer de mama. (a) Células MCF7 e MDA-MB-231 foram tratadas com 2,5 μM de honokiol pelos intervalos de tempo indicados. U, célula não tratada. A proteína total foi isolada, e quantidades iguais de proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e submetidas à análise de imunoblot usando anticorpos específicos para LKB1. As membranas foram reblotadas usando anticorpo de actina como controle. Os blots são representativos de múltiplos experimentos independentes. O histograma é a média da análise densitométrica mostrando unidades de densidade relativa (UDRs) dos sinais de Western blot para LKB1 normalizados para a actina em três experimentos independentes. *P < 0,005, em comparação com os controles não tratados. (b) Células MCF7 foram tratadas com 2,5 μM de honokiol ou não tratadas e submetidas ao ensaio de imunoprecipitação usando anticorpos IgG ou LKB1, conforme indicado. Os imunoprecipitados foram analisados usando anticorpos anti-STRAD. O histograma é a média da análise densitométrica mostrando unidades de densidade relativa (UDRs) dos sinais de Western blot para STRAD em três experimentos independentes. *P < 0,005, em comparação com os controles não tratados. (c) Células MCF7 e MDA-MB-231 foram tratadas com honokiol (HNK), e a proteína LKB1 foi analisada por imunofluorescência usando anticorpo LKB1; a coloração com 4',6-diamidino-2-fenilindol foi usada para determinar a localização nuclear. Esses resultados são representativos de múltiplos experimentos independentes. (d) LKB1 foi depletada em células MCF7 e MDA-MB-231 usando duas construções lentivirais diferentes de RNA de grampo curto para LKB1 (shRNA1 e shRNA2) e uma construção controle negativa criada no mesmo sistema vetorial (pLKO.1). Populações estáveis de células com LKB1 depletada (LKB1shRNA) e controle de vetor (pLKO.1) foram usadas para isolamento de proteína total, e quantidades iguais de proteínas foram submetidas à análise de imunoblot usando anticorpos específicos para LKB1. Actina foi usada como controle. (e) Células MDA-MB-231-LKB1shRNA (LKB1-sh1 e LKB1-sh2) e MDA-MB-231-pLKO.1 (pLKO.1) foram tratadas com honokiol (HNK, 2,5 μM), e a fosforilação de AMPK foi analisada por Western blot. Anticorpo total para AMPK foi usado como controle. (f) Células MDA-MB-231-LKB1shRNA (LKB1-sh1 e LKB1-sh2) e MDA-MB-231-pLKO.1 (pLKO.1) foram cultivadas até a confluência, riscadas com uma ponteira de pipeta e fotografadas imediatamente após o risco (0 horas).
O meio de cultura foi substituído por meio contendo honokiol (HNK, 2,5 μM) ou meio não tratado (U). As placas foram fotografadas no mesmo local da imagem inicial (0 horas) após 24 horas. Os resultados apresentados são representativos de três experimentos independentes realizados em triplicata. (g) Células MDA-MB-231-LKB1shRNA (LKB1-sh1 e LKB1-sh2) e MDA-MB-231-pLKO.1 (pLKO.1) foram cultivadas em câmaras de invasão Matrigel, seguidas de tratamento com honokiol (HNK, 2,5 μM) por 24 horas. O número de células que invadiram através do Matrigel foi contado em cinco regiões diferentes. As lâminas foram mascaradas para eliminar viés de contagem. O resultado mostra a média de três experimentos independentes realizados em triplicata. *P < 0,005, em comparação com os controles.
Levantamos a questão de saber se LKB1 desempenha um papel regulatório importante na modulação mediada por honokiol da AMPK e na inibição da migração e invasão de células de câncer de mama. Para abordar essas questões, utilizamos lentivírus LKB1shRNA e puromicina para selecionar pools estáveis de células MCF7 e MDA-MB-231 com depleção de LKB1. Analisamos os pools estáveis de células MCF7 e MDA-MB-231 pLKO.1 e LKB1shRNA quanto à expressão da proteína LKB1 por análise de imunoblot e descobrimos que a expressão da proteína LKB1 estava significativamente reduzida nas células LKB1shRNA (shRNA1 e shRNA2) em comparação com as células controle pLKO.1 (Figura 5d). As células pLKO.1 e LKB1shRNA foram tratadas com honokiol, e a fosforilação de AMPK foi determinada por análise de Western blot. Descobrimos que o honokiol aumentou a fosforilação de AMPK nas células pLKO.1. Curiosamente, demonstrando um papel crucial do LKB1, o tratamento com honokiol não alterou os níveis de fosforilação de AMPK nas células LKB1shRNA (Figura 5e). Invasão e migração são as principais características biológicas do comportamento maligno das células carcinoma. Além de examinar o efeito da depleção de LKB1 na modulação da AMPK induzida por honokiol, também examinamos a necessidade de LKB1 na inibição mediada por honokiol das propriedades metastáticas das células de câncer de mama. Como evidente na Figura 5f, o tratamento com honokiol inibiu eficientemente a migração das células pLKO.1, enquanto as células pLKO.1 não tratadas apresentaram aumento da migração. Nossos resultados mostraram que as células LKB1shRNA exibiram aumento da migração na ausência de tratamento com honokiol. Interessantemente, o tratamento com honokiol não inibiu a migração das células LKB1shRNA (Figura 5f). Em seguida, examinamos o efeito do honokiol no potencial de invasão das células pLKO.1 e LKB1shRNA e descobrimos que o honokiol inibiu a invasão das células pLKO.1, enquanto as células LKB1shRNA não foram afetadas pelo tratamento com honokiol (Figura 5g). Esses resultados mostram coletivamente que a superexpressão de LKB1 induzida por honokiol é, de fato, um componente crucial da maquinaria de sinalização usada pelo honokiol na modulação do eixo AMPK-S6K e na inibição das propriedades metastáticas das células de câncer de mama.
O tratamento com honokiol inibe a progressão do tumor mamário em camundongos atímicos nus
Investigamos a relevância fisiológica de nossas descobertas in vitro avaliando se o honokiol tem efeitos supressores no desenvolvimento de carcinoma de mama em modelos de camundongos nus e o envolvimento do eixo LKB1-AMPK. No grupo experimental tratado com honokiol, a taxa de crescimento tumoral foi significativamente inibida, e o tamanho e peso do tumor foram significativamente reduzidos em comparação com o grupo controle (Figura 6a, b). A avaliação imuno-histoquímica da proliferação tumoral mostrou maior Ki-67 no grupo controle em comparação com o grupo tratado com honokiol (Figura 6c). Em nossas análises in vitro, descobrimos o envolvimento e a necessidade do eixo LKB1-AMPK nas funções biológicas do honokiol. Examinamos a expressão de LKB1 e p-AMPK em tumores tratados com honokiol. Tumores tratados com honokiol apresentaram níveis mais elevados de AMPK e LKB1 fosforilados (Figura 6c). Além disso, examinamos os níveis de expressão de AMPK, ACC e S6K fosforilados e não fosforilados, em camundongos tratados com honokiol e veículo. Encontramos níveis mais elevados de AMPK e ACC fosforilados nos tumores tratados com honokiol em comparação com os controles tratados com veículo. Tumores tratados com honokiol apresentaram níveis mais baixos de S6K fosforilado, enquanto os controles tratados com veículo exibiram níveis elevados de S6K fosforilado (Figura 6d). Esses dados apresentaram evidências in vivo diretas do envolvimento da ativação de LKB1-AMPK e da subsequente inibição de pS6K na função do honokiol (Figura 6e).

O tratamento com honokiol inibiu o crescimento do tumor mamário em camundongos nus. Tumores derivados de células MDA-MB-231 foram desenvolvidos em camundongos nus e tratados com veículo ou honokiol (HNK). (a) O crescimento tumoral foi monitorado medindo-se o volume do tumor por 4 semanas (oito camundongos por grupo). (b) Ao final de 6 semanas, os tumores foram coletados, medidos, pesados e fotografados. O tratamento com honokiol inibiu o tamanho do tumor em comparação com o tratamento com veículo. O peso médio do tumor e imagens representativas dos tumores são mostrados aqui. (c) Amostras tumorais foram submetidas à análise imuno-histoquímica usando anticorpos para LKB1, p-AMPK e Ki67. O tratamento com honokiol (HNK) diminuiu a expressão de Ki-67 e aumentou a expressão de LKB1 e pAMPK, em comparação com o tratamento com veículo. Diagramas de barras mostram a quantificação da expressão proteica em tumores de camundongos tratados com veículo e honokiol. Colunas, média (n = 8); barras, DP. *Significativamente diferente (P < 0,005) em comparação com o controle. (d) Lisados tumorais (de dois tumores diferentes de cada conjunto) foram submetidos à análise por immunoblot usando anticorpos para fosfo-AMPK (p-AMPK), AMPK, fosfo-ACC (p-ACC), ACC, fosfo-pS6K, pS6K. O anticorpo actina foi usado como controle. (e) Um modelo de ativação de AMPK estimulada por honokiol (HNK) em células de câncer de mama. A estimulação com honokiol induz a translocação de LKB1 do núcleo para o citosol e fosforila a AMPK, levando ao aumento da fosforilação de ACC e à diminuição da fosforilação de pS6K e 4EBP1.
A atividade antitumoral do honokiol, um produto natural derivado da planta de magnólia e utilizado na medicina tradicional asiática, tem sido relatada em vários modelos pré-clínicos. No presente estudo, investigamos o potencial do honokiol na inibição da migração e invasão de células de câncer de mama e os mecanismos moleculares subjacentes. As seguintes descobertas inéditas são relatadas neste estudo: (i) o tratamento com honokiol inibe propriedades malignas como invasão e migração de células de câncer de mama; (ii) o honokiol estimula a fosforilação e atividade da AMPK enquanto reduz a atividade do mTOR, evidenciado pela redução da fosforilação de pS6K e 4EBP1; (iii) a proteína AMPK é necessária para a inibição mediada por honokiol de pS6K e 4EBP1; (iv) o honokiol aumenta a expressão e a localização citosólica do supressor tumoral LKB1, que é uma molécula efetora essencial para mediar o efeito do honokiol no eixo AMPK-pS6K e na inibição da invasão e migração de células de câncer de mama; e (v) o honokiol inibe o crescimento tumoral da mama e modula o eixo LKB1-AMPK-pS6K in vivo. Nossos resultados mostram que o tratamento com honokiol inibe significativamente as propriedades malignas das células de câncer de mama através da modulação do eixo LKB1-AMPK-pS6K; portanto, o uso de honokiol pode ser uma estratégia terapêutica adequada para o câncer de mama metastático.

Muitas moléculas bioativas e seus análogos sintéticos têm sido relatados como demonstrando atividade contra o câncer de mama. Embora a menor toxicidade associada às moléculas bioativas seja uma qualidade muito desejada, sua biodisponibilidade limitada dificulta o desenvolvimento adicional. O honokiol exibe um espectro desejável de biodisponibilidade, em contraste com muitos outros produtos naturais. O desenvolvimento de outros agentes polifenólicos tem sido obstruído pela má absorção e excreção rápida. O honokiol não possui essa desvantagem, pois níveis sistêmicos significativos de honokiol podem ser obtidos em modelos pré-clínicos, e ele pode atravessar a barreira hematoencefálica. Essas qualidades do honokiol o tornam um promissor agente anticancerígeno natural de baixo peso molecular. De fato, descobriu-se que o honokiol altera muitos alvos moleculares em vários modelos de câncer para inibir o crescimento e a sobrevivência das células tumorais. Uma das principais descobertas deste estudo é que a via LKB1-AMPK desempenha um papel importante na mediação do efeito do efeito do honokiol na migração e invasão de células de câncer de mama.
AMPK, um sensor mestre do equilíbrio energético celular em células de mamíferos, regula o metabolismo de glicose e lipídios. A regulação bioquímica da ativação da proteína quinase serina/treonina AMPK ocorre por meio de múltiplos mecanismos. A AMPK sofre uma mudança conformacional em resposta à ligação direta de AMP ao seu domínio de ligação a nucleotídeos, expondo o loop de ativação da subunidade quinase catalítica. LKB1 fosforila uma treonina crítica nesse loop de ativação para ativar a AMPK. A desfosforilação por proteínas fosfatases também desempenha um papel importante na regulação da atividade da AMPK. A depleção genética de LKB1 em fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) resulta na perda da ativação da AMPK após estresses energéticos que aumentam o AMP, mostrando a necessidade de LKB1 na ativação da AMPK. Descobrimos que o honokiol aumenta a ativação da AMPK, que pode ser inibida eficientemente pelo silenciamento de LKB1. A AMPK representa um ponto central na via mTOR, regulando uma vasta gama de atividades celulares, incluindo transcrição, tradução, tamanho celular, turnover de mRNA, estabilidade proteica, biogênese ribossomal e organização do citoesqueleto. Além de ser diretamente ativada pelo supressor tumoral LKB1, a própria AMPK regula a ativação de outros dois supressores tumorais, TSC1 e TSC2, que são reguladores críticos de Rheb e mTOR. Descobrimos que o knockdown de AMPK inibe a inibição de mTOR mediada por honokiol. A inibição de mTOR mediada por honokiol também sugere que o honokiol e seus derivados podem se mostrar excelentes candidatos como terapias-alvo para carcinomas caracterizados por atividade hiperativa de mTOR.
A quinase LKB1 é um supressor tumoral e um determinante-chave na síndrome de Peutz-Jeghers, uma suscetibilidade hereditária ao câncer gastrointestinal, pulmonar, pancreático e de mama. A inativação do gene LKB1 foi demonstrada em um subconjunto de câncer de pulmão e pâncreas esporádicos. Embora a perda da expressão de LKB1 não seja comumente observada no carcinoma mamário humano, ela certamente se correlaciona com DCIS de alto grau e carcinoma ductal invasivo de alto grau. É importante notar que a expressão de LKB1 não foi eliminada em casos de DCIS puro, mas apenas no DCIS associado à invasão, indicando que a perda de LKB1 poderia potencialmente promover a invasão. Apoiando essa noção, níveis baixos da proteína LKB1 foram relatados como correlacionados com mau prognóstico no carcinoma mamário. Nossos estudos mostram que o tratamento com honokiol aumenta a expressão e a localização citosólica de LKB1 em tumores xenoenxertados de mama e inibe o crescimento tumoral. A LKB1 está localizada predominantemente no núcleo, translocando-se para o citosol, seja formando um complexo heterotrimérico com STRAD (proteína adaptadora relacionada à ste20) e MO25 (proteína 25 de camundongo), seja associando-se à LIP1 (proteína que interage com LKB1), para exercer suas funções biológicas. O pool citoplasmático de LKB1 desempenha um papel importante na mediação de suas propriedades supressoras de tumor. A LKB1 do tipo selvagem, quando coexpressa com STRAD e MO25, exibe aumento da localização citoplasmática, enquanto a LKB1 mutante, incapaz de interagir com STRAD e MO25, permanece no núcleo. A promoção da translocação citosólica de LKB1 é um mecanismo comum para ativar funções a jusante da LKB1, pois a ativação da AMPK por metformina, peroxinitrito ou adiponectina também envolve a translocação citosólica da LKB1. O tratamento com honokiol aumenta a formação do complexo LKB1-STRAD, além da superexpressão de LKB1, aumentando assim o pool funcional de LKB1. Nosso estudo mostra, pela primeira vez, que o honokiol estimula a translocação citosólica de LKB1 em células de câncer de mama.
Conclusões
Descobrimos um novo mecanismo pelo qual o honokiol inibe a invasão e migração de células de câncer de mama, que envolve o aumento da expressão e localização citosólica de LKB1 e a ativação da AMPK. Também demonstramos a necessidade de LKB1 e AMPK na inibição mediada por honokiol da migração e invasão de células de câncer de mama. Nossos resultados, portanto, fornecem novos insights sobre os mecanismos pelos quais o honokiol, um agente anticancerígeno promissor, inibe a carcinogênese mamária.
Abreviaturas
4EBP1: proteína de ligação a 4E 1; ACC: acetil-coenzima A carboxilase; AMPK: proteína quinase ativada por AMP; ECIS: detecção de impedância elétrica célula-substrato; ERK: quinase regulada por sinal extracelular; LKB1: quinase hepática B1; MEFs: fibroblastos embrionários de camundongo; pS6K: quinase p70S6; WT: tipo selvagem.
Conflitos de interesse
AN, MYB, NKS e DS declaram não ter conflito de interesses. JLA é listado como inventor em patentes depositadas pela Emory University. A Emory licenciou suas tecnologias de honokiol para a Naturopathic Pharmacy. JLA recebeu ações da Naturopathic Pharmacy, que, até onde sabemos, não são negociadas publicamente.
Contribuições dos autores
AN realizou experimentos no Laboratório Sharma; JLA e MYB padronizaram e realizaram o isolamento do honokiol; NKS e DS desenharam a pesquisa e escreveram o artigo. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Material Suplementar
Agradecimentos
NKS, NIH K01DK076742 e R03DK089130; DS, NIH R01CA131294 e BCRF; JLA, Emory Skin Disease Research Core Center Grants NIH R01 AR47901 e NIH P30 AR42687, Veterans Administration Hospital Merit Award, fundos da Rabinowitch-Davis Foundation for Melanoma Research e da Betty Minsk Foundation for Melanoma Research.
Quimioprevenção do câncer com fitoquímicos dietéticos
Produtos naturais como fontes de novos medicamentos no período de 1981-2002
Honokiol, um agente antiangiogênico e antitumoral multifuncional
[Estudos sobre os componentes de Magnolia obovata Thunb. 3. Ocorrência de magnolol e honokiol em M. obovata e outras plantas aliadas]
Estudos sobre inibidores da promoção de tumores de pele, IX. Neolignanas de Magnolia officinalis
Arbiser: Honokiol, um produto natural de baixo peso molecular, inibe a angiogênese in vitro e o crescimento tumoral in vivo
O produto natural honokiol induz apoptose dependente de caspase em células de leucemia linfocítica crônica de células B (B-CLL)
Honokiol, um produto natural de planta, inibe o crescimento metastático ósseo de células de câncer de próstata humano
Honokiol suprime sinais de sobrevivência mediados pela atividade da fosfolipase D dependente de Ras em células cancerosas humanas
Envolvimento da via da proteína quinase ativada por mitógeno p38 na apoptose induzida por honokiol em uma linhagem celular de hepatoma humano (hepG2)
Honokiol, um candidato terapêutico natural, induz apoptose e inibe angiogênese de células tumorais ovarianas
Honokiol supera a resistência convencional a drogas no mieloma múltiplo humano por indução de apoptose dependente e independente de caspase
5-Formilhonokiol exerce atividade antiangiogênese via inativação da via de sinalização ERK
Efeito de crescimento de neuritos do 4-O-metilhonokiol por indução de fatores neurotróficos através da ativação de ERK
A promoção do crescimento de neuritos induzida por honokiol depende da ativação de quinases reguladas por sinal extracelular (ERK1/2)
A inibição da sinalização desencadeada por estresse oxidativo relacionada à NADPH oxidase pelo honokiol suprime a apoptose de células endoteliais humanas induzida por glicose elevada
Honokiol inibe a ativação de NF-kappaB estimulada por TNF-alfa e a expressão gênica regulada por NF-kappaB através da supressão da ativação de IKK
Os efeitos anti-inflamatórios do magnolol e do honokiol são mediados através da inibição da via downstream de MEKK-1 na sinalização de ativação de NF-kappaB
Honokiol potencializa a apoptose, suprime a osteoclastogênese e inibe a invasão por meio da modulação da via de ativação do fator nuclear-kappaB

O isotiocianato de benzila inibe as ações oncogênicas da leptina em células de câncer de mama humano ao suprimir a ativação do transdutor de sinal e ativador da transcrição 3

A proteína quinase ativada por 5'-AMP (AMPK) é induzida por condições de baixo oxigênio e privação de glicose encontradas em microambientes de tumores sólidos

LKB1 é necessária para a modulação mediada por adiponectina do eixo AMPK-S6K e inibição da migração e invasão de células de câncer de mama

A estimulação do crescimento de células de câncer de mama induzida por leptina envolve o recrutamento de histona acetiltransferases e do complexo mediador ao promotor de CYCLIN D1 via ativação de Stat3

A regulação positiva da survivina, dependente do eixo leptina-EGFR-Notch1, é essencial para a migração induzida por leptina de células de carcinoma mamário

A adiponectina antagoniza as ações oncogênicas da leptina na carcinogênese hepatocelular

A adiponectina modula a quinase N-terminal c-Jun e o alvo mamífero da rapamicina e inibe o carcinoma hepatocelular

A comunicação bidirecional entre a sinalização da leptina e do fator de crescimento semelhante à insulina-I promove a invasão e migração de células de câncer de mama via transativação do receptor do fator de crescimento epidérmico

A ativação concomitante das vias de sinalização JAK/STAT, PI3K/AKT e ERK está envolvida na promoção mediada por leptina da invasão e migração de células de carcinoma hepatocelular

Metástase: um alvo terapêutico para o câncer

Migração celular: um processo molecular fisicamente integrado

A biologia da locomoção celular dentro da matriz extracelular tridimensional

Controle dos fenótipos celulares móveis e invasivos pela quinase de adesão focal

As implicações sinalizadoras e biológicas da superexpressão de FAK no câncer

Detecção de energia e nutrientes pela proteína quinase ativada por AMP

Via de sinalização LKB1/AMPK/mTOR em neoplasias hematológicas: do metabolismo à biologia das células cancerígenas

Direcionamento da AMPK: uma nova oportunidade terapêutica no câncer de mama

A via da proteína quinase ativada por AMP: novos atores a montante e a jusante

AMPK e proliferação celular: AMPK como alvo terapêutico para aterosclerose e câncer

AMPK, síndrome metabólica e câncer

A rede de sinalização TOR em expansão

p70 S6 quinase no controle da dinâmica do citoesqueleto de actina e migração direcionada de células de câncer de ovário

Mecanismo da motilidade baseada em actina

Definindo o papel do mTOR no câncer

Fosforilação e regulação de Akt/PKB pelo complexo rictor-mTOR

A regulação negativa da ativação da sinalização mediada por c-Src/EGFR está envolvida na parada do ciclo celular e apoptose induzidas por honokiol em células de câncer de mama humano MDA-MB-231

Mecanismos moleculares da supressão tumoral por LKB1

Novos papéis para a via LKB1→AMPK

O gene supressor de tumor LKB1 está associado ao prognóstico no carcinoma mamário humano

A ativação terapêutica da metformina/AMPK promove o fenótipo angiogênico no modelo de câncer de mama ERalfa negativo MDA-MB-435
Parada do crescimento pelo supressor tumoral LKB1: indução de p21(WAF1/CIP1)
Vias de sinalização dependentes de LKB1
O gene Lkb1 da síndrome de Peutz-Jeghers em camundongos codifica uma proteína quinase nuclear
Clonagem e caracterização de uma nova proteína serina/treonina quinase expressa em embriões iniciais de Xenopus
O gene par-4 de C. elegans codifica uma putativa serina-treonina quinase necessária para estabelecer a assimetria embrionária
A supressão do crescimento por Lkb1 é mediada por uma parada do ciclo celular na fase G(1)
O produto do gene de Peutz-Jegher, LKB1, é um mediador da morte celular dependente de p53
Expressão da proteína LKB1 na evolução da neoplasia glandular do pulmão
Perda da expressão de Stk11/Lkb1 em neoplasias pancreáticas e biliares
Correlação da coloração para LKB1 e COX-2 em pólipos hamartomatosos e carcinomas de pacientes com síndrome de Peutz-Jeghers
Perda de LKB1 específica de localização na metástase de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço
Expressão da proteína LKB1 no câncer de mama humano
Um eixo de sinalização APPL1-AMPK medeia os efeitos metabólicos benéficos da adiponectina no coração
APPL1 medeia a localização citosólica de LKB1 induzida por adiponectina através da via de sinalização PP2A-PKCzeta
A adiponectina ativa a proteína quinase ativada por AMP em células musculares através de vias dependentes de APPL1/LKB1 e fosfolipase C/Ca2+/Ca2+/calmodulina-dependente proteína quinase quinase
LKB1 é recrutada para o promotor de p21/WAF1 por p53 para mediar a ativação transcricional
A atividade catalítica de LKB1 contribui para a sinalização do receptor de estrogênio alfa
Regulação da localização e função de LKB1/STRAD por E-caderina
A curcumina, a especiaria dourada do açafrão indiano, é um quimiossensibilizador e radiossensibilizador para tumores e um quimioprotetor e radioprotetor para órgãos normais
Papel da epigalocatequina galato (EGCG) no tratamento do câncer de mama e próstata
Base molecular para a quimioprevenção pelo sulforafano: uma revisão abrangente
Quimioprevenção por isotiocianatos: base molecular da indução de apoptose
Curcumina como agente anticancerígeno: revisão da lacuna entre aplicações básicas e clínicas
O Honokiol atravessa a BHE e a BCSFB, e inibe o crescimento de tumor cerebral no modelo de gliosarcoma intracerebral em rato 9L e no modelo de glioma xenoenxerto U251 humano
A síndrome de Peutz-Jeghers é causada por mutações em uma nova serina treonina quinase
MO25alpha/beta interagem com STRADalpha/beta aumentando sua capacidade de ligar, ativar e localizar LKB1 no citoplasma
LIP1, uma proteína citoplasmática funcionalmente ligada à quinase LKB1 da síndrome de Peutz-Jeghers
Ativação da quinase supressora tumoral LKB1 pela pseudoquinase STE20-like STRAD
A fosforilação de LKB1 na serina 428 pela proteína quinase C-zeta é necessária para a ativação aumentada por metformina da proteína quinase ativada por AMP em células endoteliais
A ativação da proteína quinase C zeta pelo peroxinitrito regula a proteína quinase ativada por AMP dependente de LKB1 em células endoteliais cultivadas
A fosforilação da serina 428 de LKB1 dependente de proteína quinase Czeta aumenta a exportação nuclear de LKB1 e a apoptose em células endoteliais