pmid: "35845599"
title: "Análise Computacional Abrangente dos Alvos do Honokiol para Inibição do Ciclo Celular e Imunoterapia em Células-Tronco do Câncer de Mama Metastático."
authors: "Skolastika S, Hanif N, Ikawati M, Hermawan A"
journal: "Evidence-based complementary and alternative medicine : eCAM"
pubdate: "2022"
doi: "10.1155/2022/4172531"
source: "PMC Full Text"

Análise Computacional Abrangente dos Alvos do Honokiol para Inibição do Ciclo Celular e Imunoterapia em Células-Tronco do Câncer de Mama Metastático.

Autores

Skolastika S, Hanif N, Ikawati M, Hermawan A

Periodico

Evidence-based complementary and alternative medicine : eCAM (2022)

Conteudo

Análise Computacional Abrangente dos Alvos do Honokiol para Inibição do Ciclo Celular e Imunoterapia em Células-Tronco de Câncer de Mama Metastático

As células-tronco do câncer de mama (CTCMs) desempenham um papel crítico na quimiorresistência, metástase e mau prognóstico do câncer de mama. As CTCMs são em sua maioria dormentes e, portanto, ativá-las e modular o ciclo celular são importantes para uma terapia bem-sucedida contra as CTCMs. O microambiente tumoral (MAT) promove a sobrevivência das CTCMs e a progressão do câncer, e direcionar o MAT pode auxiliar na imunoterapia bem-sucedida. O honokiol (HNK), um polifenol bioativo isolado da casca e das vagens de sementes de Magnolia spp., é conhecido por exercer efeitos anticancerígenos, como induzir a parada do ciclo celular, inibir a metástase e superar a resistência à imunoterapia em células de câncer de mama. No entanto, os mecanismos moleculares de ação do HNK nas CTCMs, bem como seus efeitos sobre o ciclo celular, permanecem obscuros. Este estudo teve como objetivo explorar os potenciais alvos e mecanismos moleculares do HNK na parada do ciclo celular de CTCMs metastáticas (CTCMm) e o impacto do MAT. Usando análises de bioinformática, previmos os alvos proteicos do HNK a partir de vários bancos de dados e recuperamos os genes diferencialmente expressos em CTCMm do banco de dados GEO. A interseção entre os genes diferencialmente expressos (GDEs) e os alvos do HNK foi determinada usando um diagrama de Venn, e os resultados foram analisados usando uma rede de interação proteína-proteína, seleção de genes centrais, análises de enriquecimento de ontologia genética e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto, análise de alteração genética, taxa de sobrevida e níveis de infiltração de células imunes. Finalmente, a interação entre o HNK e dois alvos do HNK que regulam o ciclo celular foi analisada usando análise de docking molecular. Os potenciais alvos terapêuticos identificados do HNK (PTTH) incluíram CCND1, SIRT2, AURKB, VEGFA, HDAC1, CASP9, HSP90AA1 e HSP90AB1, que podem potencialmente inibir o ciclo celular das CTCMm. Além disso, nossos resultados mostraram que o PTTH pode modular as vias PI3K/Akt/mTOR e HIF1/NFkB. No geral, esses achados destacam o potencial do HNK como um agente imunoterapêutico para CTCMm ao modular o ambiente imune tumoral.

1. Introdução

O câncer de mama foi o câncer mais prevalente em 2020 (em termos de novos casos) e a principal causa de mortes relacionadas ao câncer entre as mulheres. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, o câncer de mama tem a maior taxa de incidência na Indonésia, com uma taxa de mortalidade de 22.692 casos por ano. Até 2040, a incidência está prevista para atingir 89.512 casos. A quimioterapia, juntamente com cirurgia, radioterapia e mastectomia, é o tratamento mais comum. A quimiorresistência, ou a insensibilidade das células cancerígenas à terapia medicamentosa, é um fator importante no fracasso da quimioterapia contra o câncer de mama.
As células-tronco do câncer de mama (BCSCs) são um dos principais fatores que impulsionam a quimiorresistência, contribuindo assim para um prognóstico ruim e resultados clínicos desfavoráveis. As BCSCs podem se desenvolver em muitos tipos celulares e repovoar tumores heterogêneos após quimioterapia ou radioterapia convencionais. As BCSCs são em sua maioria quiescentes e, portanto, ativar células quiescentes e modular o ciclo celular é importante para alcançar uma terapia bem-sucedida das BCSCs. Tumores recorrentes são altamente agressivos, potencialmente com resistência cruzada a drogas, altamente metastáticos e apresentam prognóstico ruim. Um estudo anterior demonstrou que células imunes, como linfócitos CD8+, induzem a transição epitelial-mesenquimal das BCSCs Além disso, o microambiente tumoral (TME) promove a sobrevivência das BCSCs e a progressão do câncer e, portanto, pode impedir o sucesso da imunoterapia O uso de terapia combinada, na qual tanto quimioterapia quanto compostos naturais são usados para atingir BCSCs metastáticas (mBCSCs), poderia ser uma abordagem bem-sucedida para superar a quimiorresistência e alcançar o sucesso clínico no tratamento do câncer de mama.

Honokiol (HNK; 3,5-di-(2-propenil)-1,1′-bifenil-2,2′-diol, Figura 1(a)) é um polifenol bioativo isolado da casca e das vagens das sementes de Magnolia spp., amplamente utilizado na medicina tradicional asiática. O HNK controla várias vias de sinalização intracelular envolvidas no câncer, incluindo aquelas relacionadas ao fator nuclear kappa B (NF-κB), transdutores de sinal e ativadores da transcrição 3 (STAT3), receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e alvos mamíferos da rapamicina (mTOR). A parada do ciclo celular mediada pelo HNK é alcançada através da regulação negativa da ciclina D1, inibição da ciclina E1, quinase dependente de ciclina 2, quinase dependente de ciclina 4, cMYC e RB, sinalização CSK/EGFR, e da regulação positiva de p27 e p21. O HNK demonstrou inibir as metaloproteinases da matriz, reduzindo assim a migração, invasão e metástase celular, enquanto também regula a sinalização do VEGFR, exercendo um efeito antiangiogênico. Além disso, o HNK tem sido relatado como inibidor dos fatores de pluripotência POU5F1, Nanog e SOX2, e por abolir o fenótipo semelhante a BCSC (p11). Ademais, o HNK diminui a resistência a medicamentos ao inibir a regulação da P-gp e ao aumentar a apoptose. Além disso, o HNK também inibe a via PI3K/mTOR, contribuindo para contornar a resistência imunoterapêutica em células de glioma e câncer de mama. Embora pesquisas crescentes tenham avaliado os efeitos do HNK no ciclo celular, nas BCSCs e na metástase, os mecanismos moleculares subjacentes aos seus efeitos no eixo do ciclo celular das BCSCs metastáticas e na imunoterapia ainda não foram elucidados.

Este estudo teve como objetivo explorar os mecanismos moleculares subjacentes à parada do ciclo celular de mBCSCs mediada pelo HNK, bem como avaliar o impacto deste composto no ambiente imune usando estudos de bioinformática.

2. Materiais e Métodos
   2.1. Coleta de Dados e Identificação de Genes Expressos Diferencialmente (DEGs)
   Proteínas que interagem com HNK foram pesquisadas usando STITCH (https://stitch.embl.de),. Swisstargetprediction (https://www.swisstargetprediction.ch), canSAR Black (https://cansarblack.icr.ac.uk/) e SEA (https://sea.bkslab.org/). As proteínas recuperadas foram consideradas como proteínas mediadas por HNK (HMPs) e foram incluídas nas análises subsequentes. Os dados de microarranjo de células-tronco do câncer de mama metastático foram coletados do banco de dados GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) usando palavras-chave como células-tronco do câncer de mama metastático e Homo sapiens. Os critérios de inclusão foram: uso de amostras de pacientes ou xenoenxertos derivados de pacientes; foco em câncer de mama metastático; caracterização de células-tronco do câncer de mama; e descrição clara da identidade das amostras nos conjuntos de dados GSE. Os critérios de exclusão incluíram: uso de linhagens celulares de câncer de mama; sem ênfase em câncer de mama metastático; sem caracterização de células-tronco do câncer de mama; e ambiguidade em relação à identidade das amostras nos conjuntos de dados GSE. Um conjunto de dados GSE (GSE151191) foi selecionado entre os 62 conjuntos de dados para este estudo (Figura Suplementar 1). O GEO2R, um programa interativo baseado na web (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r) que compara dois grupos de amostras sob as mesmas condições, foi usado para identificar os DEGs entre tumores primários e metastáticos, com base nos seguintes critérios de significância: P < 0,05 e log |Fold Change| > 1. Usando, as proteínas sobrepostas entre as HMP e aquelas codificadas pelos DEGs foram identificadas e posteriormente analisadas usando uma rede de interação proteína-proteína (PPI).
   2.2. Construção da Rede PPI
   A PPI foi construída e exibida usando STRING-DB v11.0 e o software Cytoscape, respectivamente. As proteínas incluídas no top 10 do ranking de acordo com a pontuação de Centralidade de Clique Máxima (MCC) determinada pelo plugin Cyto-Hubba foram consideradas genes hub.
   Os genes hub foram submetidos a análises de enriquecimento GO e KEGG usando as ferramentas e WebGestalt. A significância estatística foi definida como P < 0,05.
   2.3. Análise de Alterações Genéticas
   As proteínas indicadas pelas análises de enriquecimento GO e KEGG e um estudo aprofundado da literatura sobre os genes hub foram usados para determinar os potenciais alvos terapêuticos do HNK (PTTH). Neste estudo, genes que codificam PTTH como CCND1, SIRT2, AURKB, VEGFA, HDAC1, CASP9, HSP90AA1 e HSP90AB1 foram triados quanto a alterações genéticas em todos os estudos de câncer de mama disponíveis no banco de dados cBio-portal ((https://www.cbioportal.org). Os estudos com o maior número de alterações genéticas foram selecionados para análise adicional de conectividade.
   2.4. Taxa de Sobrevida e Nível de Infiltração de Células Imunes
   O banco de dados online Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA, https://gepia.cancer-pku.cn) foi utilizado para analisar a contribuição do PTTH para a sobrevida global (OS). O Tumor Immune Estimation Resource (TIMER) (https://cistrome.shinyapps.io/timer/) foi usado para analisar a correlação entre os níveis de expressão do PTTH e o nível de infiltração de células imunes.
   2.5. Validação dos Níveis de Expressão de mRNA e Proteína do PTTH
   Os níveis de expressão de mRNA e proteína do PTTH foram determinados usando TNMPlot e Human Protein Atlas (HPA). Genes diferencialmente expressos e níveis de mRNA em tecidos tumorais, normais e metastáticos foram analisados usando TNMplot (https://www.tnmplot.com/), no qual o banco de dados utilizou dados do GEO ou bibliotecas de RNA-seq do The Cancer Genome Atlas (TCGA), Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments (TARGET) e The Genotype-Tissue Expression (GTEx). Os níveis de expressão proteica foram analisados usando o Human Protein Atlas (HPA) (https://www.proteinatlas.org/), um banco de dados online que contém uma ampla gama de dados transcriptômicos e proteômicos de vários tecidos e células.
   2.6. Docking Molecular
   Para prever as propriedades de ligação do HNK ao AURKB e ao RAC-1 através de docking molecular, a predição computacional foi conduzida em um sistema operacional Windows 10, Intel Core (TM) i5-10ª Geração com 8 GB de RAM. O MOE 2010 (licenciado da Faculdade de Farmácia UGM) foi usado para simulação de docking, cálculo do escore RMSD-docking e interação de visualização. Os IDs PDB das proteínas AURKB e RAC-1 (3ZCW e 3TH5, respectivamente) foram pesquisados em https://rcsb.org. A estrutura do HNK foi obtida do PubChem, submetida a uma busca conformacional e minimizada no MOE usando o Menu Energy Minimize. Para a configuração da simulação de docking, London dG foi usado tanto para Rescoring 1 quanto para Rescoring 2. Triangle Matcher foi usado para função de escore e configuração de posicionamento, e Forcefield foi usado para refinar os resultados do docking a partir de 30 configurações retidas. Os resultados deste método determinarão qual conformação possui a mais baixa interação de ligação entre o ligante e seu receptor.
3. Resultados
   3.1. Identificação de DEGs e HMPs
   Os DEGs são considerados os drivers moleculares e/ou biomarcadores moleculares de vários fenótipos. A identificação de DEGs foi realizada para determinar os genes que atuam como marcadores biomoleculares de células-tronco do câncer de mama metastático (mBCSCs). No total, 6.970 DEGs no conjunto de dados GSE 151191 foram considerados regulados positiva/negativamente em células-tronco do câncer de mama metastático, de acordo com o valor de P ajustado <0,05 e |logFC| ≥ 1,0 (Tabela Suplementar 1). Subsequentemente, proteínas que interagem direta e/ou indiretamente com o HNK, referidas como HMPs, foram identificadas. Um total de 128 HMPs foram recuperadas do Swisstargetprediction, STITCH, canSAR Black e SEA (Tabela Suplementar 2). Finalmente, 30 genes sobrepostos (OGs), incluindo 18 genes regulados positivamente e 12 genes regulados negativamente, foram identificados como sendo tanto HMPs quanto DEGs (Figura 1(b); Tabela 1).
   3.2. Rede PPI
   Para aprofundar nossa compreensão das interações entre os 30 OGs, construímos uma rede PPI. A rede continha 40 nós e 134 arestas, com um grau médio do nó de 6,7, um coeficiente médio de agrupamento local de 0,618 e um valor de enriquecimento PPI < 1,0e-16 (Figura 1(c)). Análises adicionais identificaram genes hub dentro da rede PPI (Figura 1(d)), que incluíram sirtuína 2 desacetilase dependente de NAD (SIRT2), ciclina D1 (CCND1), quinase de proteína serina/treonina Aurora-B (AURKB), fator de crescimento endotelial vascular A (VEGFA), histona desacetilase 1 (HDAC1), caspase 9 (CASP9), proteína de choque térmico HSP 90-alfa (HSP90AA1) e proteína de choque térmico HSP 90-beta (HSP90AB1) (Tabela 2).
   3.3. Análise de Enriquecimento de Vias GO e KEGG
   As funções dos OGs foram investigadas adicionalmente usando análises de enriquecimento de vias GO e KEGG. Os processos biológicos nos quais esses OGs estavam implicados estão resumidos na Figura 2(a). Entre os processos biológicos identificados, comunicação celular, processo metabólico, organização do componente celular, processo multicelular do organismo, processo de desenvolvimento, resposta a estímulo e regulação biológica estão fortemente ligados à progressão do câncer. De acordo com a análise de enriquecimento dos componentes celulares, os OGs eram abundantes no núcleo, citosol, lúmen envolto por membrana e complexo contendo proteína (Figura 2(a)). Finalmente, os OGs foram enriquecidos na função molecular de ligação a proteínas (Figura 2(a)). A análise de enriquecimento de vias KEGG demonstrou que os OGs estavam particularmente enriquecidos na via de sinalização PI3K-Akt, vias associadas ao câncer e regulação do ciclo celular (Tabela Suplementar 3).
   3.4. Análise de Alterações Genéticas
   Oito genes (SIRT2, CCND1, AURKB, VEGFA, HDAC1, CASP9, HSP90AA1 e HSP90AB1) que desempenham um papel essencial no crescimento e desenvolvimento de mBCSC foram selecionados a partir de genes centrais e referidos como potenciais alvos terapêuticos do honokiol (PTTH). A variação genética dentro desses genes foi analisada usando o cBioportal. O estudo de câncer de mama com o maior número de alterações genéticas foi selecionado para análise posterior (Figura 2(b)). O Oncoprint foi utilizado para determinar a porcentagem de alterações nos genes PTTH em pacientes com mBC. As alterações genéticas nos PTTH variaram de 1,1% a 35% nas 180 amostras de pacientes analisadas (Figura 2(c)), sendo a amplificação a alteração genética mais comum. Os genes mais frequentemente mutados foram CCND1 (35%), HSP90AB1 (11%) e VEGFA (8%). A análise de exclusividade mútua mostrou que as mutações em VEGFA coocorreram significativamente com mutações em HSP90AB1 (Tabela 3). As alterações no número de cópias (CNAs) são particularmente comuns no câncer e desempenham um papel significativo no seu desenvolvimento e progressão. O status do CNA pode ser deleção homozigótica (deleção superficial), deleção heterozigótica (deleção profunda), diploide, ganho (evento de amplificação com relativamente poucas cópias) ou amplificação (evento de amplificação com muitas cópias). A análise de CNAs revelou que a expressão do mRNA de SIRT2 foi menor em casos de deleção superficial e maior em casos de amplificação do que em diploides (normal/sem alteração) (Figura 2(d)). A expressão do mRNA de HDAC1 e HSP90AB1 foi menor em casos com deleções superficiais e maior em casos com ganho. A expressão do mRNA de HSP90AA1 foi menor em pacientes com ganho do que naqueles com ganho diploide. A expressão do mRNA de CASP9 foi menor no ganho do que em casos de deleção superficial, mas não significativamente diferente daquela em casos diploides. Todas as CNAs além das mencionadas não foram expressas de forma diferente. Finalmente, a análise de vias do cBioportal mostrou que a via do ciclo celular é a principal via que é perturbada por alterações genéticas no PTTH. Entre os genes envolvidos na regulação da via celular, CCND1, que codifica a ciclina D1, foi identificado como PTTH (Figura 2(e)).
   3.5. Taxa de Sobrevivência e Nível de Infiltração de Células Imunes
   Para avaliar o valor clínico dos níveis de expressão dos genes PTTH, examinamos se eles estão associados à sobrevida global (OS) ou ao prognóstico de pacientes com câncer de mama. Baixos níveis de expressão de CASP9 e HSP90AB1 foram significativamente associados a uma OS ruim (P < 0,05) (Figura 3(a)). Para compreender o papel do microambiente imunológico no desenvolvimento e prognóstico de pacientes com mutações em BRCA, analisamos a correlação entre os níveis de expressão de PTTH e a infiltração de imunócitos. O nível de expressão de PTTH estava positiva ou negativamente relacionado ao nível de infiltração de diferentes células imunes, indicando que o PTTH modulava o microambiente imunológico ao influenciar a infiltração de células imunes. Os níveis de expressão de CCND1, VEGFA, AURKB, HDAC1, HSP90AA1 e HSP90AB1 foram positivamente correlacionados com os níveis de infiltração de células imunes, enquanto os níveis de expressão de SIRT2 e CASP9 foram negativamente correlacionados com a pureza tumoral de BRCA (Figura 3(b)). Além disso, o nível de infiltração de linfócitos B foi positivamente correlacionado com os níveis de expressão de HSP90AB1 e AURKB, e negativamente correlacionado com o nível de expressão de CCND1. Além disso, observamos uma correlação positiva entre os níveis de infiltração de linfócitos T CD8+ e os níveis de expressão de SIRT2, HDAC1, CASP9 e HSP90AA1, e entre os níveis de infiltração de linfócitos T CD4+ e os níveis de expressão de SIRT2, HDAC1 e CASP9. No entanto, os níveis de infiltração de linfócitos T CD4+ foram negativamente correlacionados com os níveis de expressão de HSP90AA1. Os níveis de infiltração de macrófagos foram positivamente correlacionados com os níveis de expressão de CCND1, SIRT2, CASP9 e HSP90AA1, enquanto foram negativamente correlacionados com os níveis de expressão de AURKB. Os níveis de infiltração de neutrófilos foram positivamente correlacionados com SIRT2, AURKB, VEGFA, HDAC1, CASP9, HSP90AA1 e HSP90AB1. Os níveis de infiltração de células dendríticas foram negativamente correlacionados com os níveis de expressão de CCND1 e positivamente correlacionados com os níveis de expressão de SIRT2, AURKB e HDAC1. Os demais dados não mencionados não são estatisticamente significativos.
   3.6. Validação do Nível de Expressão de mRNA e do Nível de Expressão Proteica do PTTH
   Os níveis de expressão de CCND1, AURKB, HDAC1, VEGFA, HSP90AA1 e HSP90AB1 estavam aumentados no tecido de câncer de mama (BC) e ainda mais elevados no câncer de mama metastático (mBC) (Figura 4(a)). Os níveis de expressão de CASP9 não apresentaram diferenças significativas entre os tecidos de mama normal, tumoral e metastático. Curiosamente, a expressão de SIRT2 foi reduzida nos tecidos de câncer de mama, mas aumentada nos tecidos metastáticos em comparação com os tecidos normais. Esses resultados foram corroborados por dados imuno-histoquímicos do HPA, que mostraram que CCND1, AURKB e HDAC1 estavam superexpressos no núcleo, enquanto SIRT2, VEGFA, HSP90AA1 e HSP90AB1 estavam superexpressos na região citoplasmática/membranosa (Figura 4(b)). Por fim, CASP9 não foi diferencialmente expresso entre o tecido normal e o tecido tumoral.
   3.7. Docking Molecular
   A análise de docking molecular revelou que AURKB e RAC-1 poderiam se ligar aos seus respectivos ligantes nativos e ao HNK (Figura 5). A afinidade da interação entre essas proteínas e o HNK foi semelhante à de seus ligantes naturais. A interação entre AURKB e seu ligante nativo ADP foi mais forte do que entre AURKB e HNK, de acordo com o escore de docking (−12,89 e −8,68, respectivamente, Tabela 4). Além disso, o ADP interagiu com vários aminoácidos da AURKB, como Gly108, Gly110, Lys111 e Thr112, enquanto o HNK interagiu com apenas um aminoácido (Pro27). Da mesma forma, a interação de ligação entre Rac-1 e seu ligante nativo (éster de ácido fosfoaminofosfônico-guaniilato/GNP; escore de docking −21,38) foi mais forte do que entre Rac-1 e HNK (escore de docking −18,17). Isso foi resultado do número de aminoácidos com os quais os compostos interagiram e da distância entre os aminoácidos em interação e o composto. Por exemplo, a distância entre Thr17 e GNP foi muito menor (1,82 Å) do que com HNK (3,35). No entanto, apesar da menor afinidade da interação, o HNK poderia potencialmente competir com os ligantes nativos para inibir a função dessas proteínas.
4. Discussão
   Este estudo identificou oito PTTHs, incluindo CCND1, SIRT2, AURKB, VEGFA, HDAC1, CASP9, HSP90AA1 e HSP90AB1. Os níveis de expressão desses genes foram fortemente associados aos níveis de infiltração imune. O microambiente tumoral influencia a angiogênese e a resposta imune, e há muito é reconhecido como um determinante primário da progressão tumoral a longo prazo. Além disso, pode impactar grandemente a eficácia da imunoterapia, destacando a necessidade de sua melhor compreensão.
   A ciclina D1, codificada pelo CCND1, é considerada um oncogene que promove proliferação celular, crescimento, angiogênese e resistência à quimioterapia e radioterapia. Neste estudo, revelamos que a expressão de CCND1 foi positivamente correlacionada com a pureza do BRCA e os níveis de infiltração de macrófagos, e negativamente correlacionada com os níveis de infiltração de células B e células dendríticas. Muitos estudos mostraram que os macrófagos associados a tumores desempenham um papel importante na proliferação, invasão, angiogênese e metástase do carcinoma mamário humano, e que o aumento da infiltração de macrófagos no tumor confere potencial metastático e está associado a um prognóstico ruim no câncer de mama. Nossos achados estão alinhados com os de Pestell et al., que demonstraram que a expressão de ciclina D1 estava aumentada no estroma do câncer humano e promovia inflamação tumoral, angiogênese e expansão de células-tronco no câncer de mama avançado. Curiosamente, um estudo anterior relatou que o HNK poderia inibir a expressão de ciclina D1.
   SIRT2, uma histona desacetilase dependente de NAD, tem sido sugerida como um alvo terapêutico promissor no tratamento do câncer. Acredita-se que a SIRT2 afete a carcinogênese de maneira dependente do contexto, afetando vias epigenéticas implicadas na iniciação, desenvolvimento e progressão do câncer. O nível de expressão de SIRT2 foi correlacionado negativamente com a pureza do BRCA, mas positivamente com os níveis de infiltração de células T CD8+, células T CD4+, macrófagos, neutrófilos e células dendríticas. Esses resultados confirmam os de estudos anteriores, nos quais o nível de expressão de SIRT2 e o nível de infiltração de células T CD8+ foram correlacionados positivamente em pacientes com câncer de mama. Além disso, a SIRT2 sistêmica tem sido sugerida para promover o desenvolvimento tumoral ao suprimir células NK. Curiosamente, a expressão de SIRT2 foi significativamente menor no câncer de mama do que no tecido mamário normal, sugerindo que a SIRT2 pode atuar como um supressor tumoral durante a iniciação da tumorigênese. Além disso, um estudo anterior relatou que a alta expressão de SIRT2 em tecidos tumorais avançados está associada a um prognóstico ruim, sugerindo que a SIRT2 pode funcionar como um oncogene.

VEGFA é uma citocina que promove o desenvolvimento vascular e a formação de novos vasos sanguíneos a partir de redes vasculares pré-existentes durante a embriogênese. Além disso, o VEGFA também pode ser liberado por células cancerígenas e estromais. Em vários modelos murinos e humanos de câncer, foi demonstrado que o VEGFA estimula a transição epitélio-mesenquimal iniciadora de tumor e a metástase, e que os níveis de expressão de VEGFA estão positivamente correlacionados com a pureza do BRAC e os níveis de infiltração de neutrófilos. Em linha com esses resultados, outro estudo relatou que pacientes com mBC apresentavam níveis mais elevados de VEGFA circulante do que pacientes sem metástases. O VEGF pode estimular a migração de neutrófilos através da ativação do VEGFR1 e pode impedir a maturação das células dendríticas, resultando na inativação das células T citotóxicas. Tregs, macrófagos associados a tumores e células supressoras derivadas de mieloides são altamente induzidos pelo VEGF, resultando em um TME imunossupressor. Além disso, o VEGF aumenta a expressão de PD-1 em CTLs CD8+ e Tregs de maneira dependente de VEGFR2, bem como a expressão do ligante Fas, interleucina (IL)-10 e prostaglandina E3, levando à depleção de células T citotóxicas. Portanto, o VEGF-A pode ser usado como um biomarcador para terapia de direcionamento imunológico em pacientes com câncer de mama.
A histona desacetilase 1 (HDAC1) é superexpressa em células de câncer de mama e tecidos humanos de câncer de mama, podendo desencadear a proliferação e migração dessas células por meio da ativação dos sinais Snail/IL-8. Foi relatado que a supressão da HDAC1 reduz a invasão de células de câncer de mama ao inibir a metaloproteinase-9 da matriz, e reduz a expressão de PD-L1 e HLA-DR e a frequência de Treg no câncer de mama triplo-negativo. Em nosso estudo, houve uma correlação positiva entre os níveis de expressão de HDAC1 e a pureza tumoral, e os níveis de infiltração de células T CD8+, células T CD4+, neutrófilos e células dendríticas.
A HSP90α, codificada pelo gene HSP90AA1, é a isoforma da HSP90 induzível por estresse. Estudos anteriores mostraram que altos níveis de expressão de HSP90 (HSP90α e HSP90β) aumentam a probabilidade de recorrência e metástases à distância no câncer de mama triplo-negativo e ER+/HER2-, e estão associados a maior mortalidade. A superexpressão de HSP90 em células humanas de câncer de mama foi associada ao aumento da proliferação celular e metástase, bem como à sobrevida global curta e características clinicopatológicas agressivas, como alto estágio clínico, tumores grandes e envolvimento de linfonodos. Lin et al. relataram que a expressão elevada de HSP90AB1 estava ligada a uma melhor sobrevida global de pacientes com câncer de mama ER- e do tipo basal. No entanto, descobrimos que a alta expressão de HSP90AB1 estava associada a um prognóstico ruim em pacientes com BRCA. Além disso, a expressão de HSP90AA1 e HSP90AB1 foi positivamente correlacionada com a pureza tumoral; e a expressão de HSP90AA1 foi positivamente relacionada a células T CD8+, macrófagos e neutrófilos, mas negativamente correlacionada com células T CD4+. Mais estudos para explorar a infiltração de CD8+, macrófagos, neutrófilos, CD4+ e os efeitos do HNK sobre HSP90AA1 e HSP90AB1 são necessários.
O CASP9 codifica a caspase-9, uma iniciadora da via intrínseca da apoptose. Quando o apoptossomo, um complexo multimolecular que compreende o citocromo c e o fator 1 ativador de peptidase apoptótica (Apaf-1), é formado, ele cliva a pró-caspase-9, formando a caspase-9, desencadeando a cascata de ativação das caspases ao ativar caspases executoras, incluindo a caspase 3 e a caspase 7, para clivar outros alvos celulares.
A família das quinases aurora inclui a quinase aurora B (AURKB), uma proteína quinase serina/treonina mitótica, e a quinase aurora A (AURKA), que é um membro do Complexo Cromossômico Passageiro (CPC). O CPC desempenha um papel na progressão do ciclo celular e é um marcador prognóstico do câncer de mama decorrente da mutação BRCA2. A desregulação da AURKB é observada em vários tumores, e sua superexpressão é frequentemente ligada à invasão de células tumorais, metástase e resistência a medicamentos. Portanto, a AURKB emergiu como um alvo farmacológico atraente para o desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas.
RAC1 e AURKB foram selecionados para análise aprofundada de docking molecular por estarem conectados ao eixo PTTH-mBCSCs-ciclo celular. A família Rho-GTPase, incluindo Rho, Rac1 e Cdc42, regula o citoesqueleto e, assim, modula a motilidade, migração e invasão celular. A ativação de Rac-1/Cdc42 pode induzir o crescimento celular ao ativar a via PAK1/ciclina D1, ou a morte celular ao ativar a via PAK1/Akt/BAD. Rho tem sido sugerido como um potencial alvo terapêutico, uma vez que a interação entre Rho e VEGFA leva à progressão e metástase do câncer.

Este estudo revelou os potenciais alvos e mecanismos moleculares do HNK no ciclo celular de mBCSCs (Figura 6). Sabe-se que o HNK exerce efeitos anticancerígenos ao suprimir a angiogênese, migração, invasão e proliferação em diversas linhagens de células cancerígenas e modelos tumorais. O HNK inibe o ciclo celular via a via PI3K/Akt/mTOR ao regular positivamente PTEN e P21, e suprimir p-Akt, ciclina D/CDK4, c-Myc, Rac1 e AURKB. A angiogênese é inibida através da via HIF1/NFkB, que é ativada em condições hipóxicas e bloqueia a liberação de VEGF. A análise de infiltração imune mostrou que o HNK está correlacionado com a inibição de VEGFA, sugerindo que o HNK pode bloquear efetivamente o VEGFR2. O HNK também foi encontrado para reduzir a ativação de VEGFR/VEGF induzida por HIF e inibir a atividade de metaloproteinases da matriz e a migração celular. Além disso, o HNK pode induzir a apoptose através da regulação positiva de BAD, caspase-9, caspase-3 e caspase-8. No microambiente tumoral, condutores oncogênicos como β-catenina, STAT3, PI3K/PTEN/AKT/mTOR, p53, NF-kB e RAS/RAF/MAPK são ativados para suprimir a produção de quimiocinas, reduzir o recrutamento de células dendríticas, macrófagos, células T e células NK para os sítios tumorais, e suprimir o sistema imunológico desses imunócitos. Além disso, a sinalização intrínseca do tumor pode fazer com que as células tumorais expressem PD-L1, resultando em disfunção das células T no microambiente tumoral. Este estudo destaca o potencial do HNK como um agente imunoterapêutico para mBCSCs ao modular o ambiente imunológico do tumor. No entanto, os resultados deste estudo foram obtidos através de estudos de bioinformática; portanto, são necessários estudos adicionais in vitro, in vivo e ensaios clínicos para validar as descobertas.

5. Conclusões

Este estudo identificou oito PTTHs consistindo em CCND1, SIRT2, AURKB, VEGFA, HDAC1, CASP9, HSP90AA1 e HSP90AB1, que podem inibir o eixo mBCSC-ciclo celular. Além disso, os PTTHs podem regular as vias PI3K/Akt/mTOR e HIF1/NFkB. Este estudo está acelerando o desenvolvimento do HNK como agente anti-mBCSCs ao direcionar certos genes. No entanto, este estudo tem várias limitações; por exemplo, os alvos do HNK são previstos a partir de banco de dados. Outros algoritmos adicionais de aprendizado de máquina fornecerão candidatos mais validados de alvos do HNK. Outra limitação deste estudo é que utilizamos uma abordagem de bioinformática; portanto, é necessário explorar mais a fundo para validação e esclarecimento em estudos experimentais.
Disponibilidade de Dados
Os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos no artigo e em seus arquivos suplementares.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram que não possuem conflitos de interesse.
Materiais Suplementares
Câncer hoje. número estimado de casos incidentes na Indonésia, mulheres, todas as idades
Estatísticas de tratamento e sobrevivência do câncer, 2019
Impacto clínico das células-tronco do câncer de mama em pacientes com câncer de mama metastático
Células-tronco do câncer e quimiorresistência: o mais inteligente sobrevive ao ataque
Editorial: o papel das células-tronco do câncer de mama nos desfechos clínicos
Doença residual mínima em tumores sólidos malignos: uma revisão
Células-tronco do câncer de mama como impulsionadoras da quimiorresistência tumoral, dormência e recidiva: novos desafios e oportunidades terapêuticas
Transição epitélio-mesenquimal induzida pelo sistema imunológico in vivo gera células-tronco do câncer de mama
Células-tronco no câncer: células-tronco, células-tronco do câncer e seu microambiente
Direcionamento do microambiente tumoral: removendo obstruções às respostas imunes anticancerígenas e à imunoterapia
Magnolol e honokiol isolados de Magnolia officinalis protegem as mitocôndrias do coração de rato contra a peroxidação lipídica
Honokiol: um novo agente natural para prevenção e terapia do câncer
Honokiol, um bifenil natural, inibe o crescimento in vitro e in vivo do câncer de mama através da indução de apoptose e parada do ciclo celular
A regulação negativa da ativação da sinalização mediada por c-Src/EGFR está envolvida na parada do ciclo celular e apoptose induzidas por honokiol em células de câncer de mama humano MDA-MB-231
Honokiol induz apoptose e suprime a migração e invasão de células de carcinoma ovariano através da via de sinalização AMPK/mTOR
Efeitos antipsoriáticos do Honokiol através da inibição de NF-κB e VEGFR-2 em modelo animal de camundongo transgênico K14-VEGF
A ativação do supressor tumoral LKB1 pelo honokiol abole o fenótipo semelhante a células-tronco do câncer no câncer de mama através da inibição do Stat3 oncogênico
Honokiol abole a progressão tumoral induzida por leptina ao inibir o eixo de sinalização Wnt1-MTA1-β-catenina de maneira dependente do microRNA-34a
Honokiol ativa o eixo LKB1-miR-34a e antagoniza as ações oncogênicas da leptina no câncer de mama
Indução de autofagia citoprotetora dependente de STK11 em células de câncer de mama após tratamento com honokiol
Honokiol potencializa quimioterápicos em células de câncer de mama multirresistentes através de apoptose aumentada e morte necrótica programada adicional
Inibição da via PI3K/mTOR mediada por honokiol
STITCH: redes de interação de produtos químicos e proteínas
SwissTargetPrediction: um servidor web para predição de alvos de pequenas moléculas bioativas
CanSAR: um recurso integrado de pesquisa translacional pública em câncer e descoberta de fármacos
Prevendo novos alvos moleculares para fármacos conhecidos
InteractiVenn: uma ferramenta baseada na web para análise de conjuntos através de diagramas de Venn
STRING v10: redes de interação proteína-proteína, integradas sobre a árvore da vida
Cytoscape: um ambiente de software para modelos integrados de redes de interação biomolecular
CytoHubba: identificando objetos centrais e sub-redes a partir de interatomas complexos
Ferramentas de enriquecimento em bioinformática: caminhos para a análise funcional abrangente de grandes listas de genes
WebGestalt 2017: um kit de ferramentas de análise de enriquecimento de conjuntos de genes mais abrangente, poderoso, flexível e interativo
O portal de genômica do câncer cBio: uma plataforma aberta para explorar dados genômicos multidimensionais do câncer: figura 1
GEPIA: um servidor web para perfil de expressão gênica e análises interativas em câncer e tecidos normais
TIMER2.0 para análise de células imunes infiltrantes de tumor
TNMplot.com: uma ferramenta web para comparação da expressão gênica em tecidos normais, tumorais e metastáticos
HPAanalyze: um pacote R que facilita a recuperação e análise dos dados do Atlas de Proteínas Humanas
Quantos genes diferencialmente expressos: uma perspectiva a partir da comparação de distâncias genotípicas e fenotípicas
Células T CD4+ regulam a metástase pulmonar de carcinomas mamários ao potencializar propriedades pró-tumorais de macrófagos
Compreendendo o microambiente imune tumoral (TIME) para uma terapia eficaz
O sistema FGF/FGFR no câncer de mama: características oncogênicas e perspectivas terapêuticas
SIRT2 promove a progressão do melanoma murino através da inibição de células natural killer
Ciclar ou não ciclar: uma decisão crítica no câncer
Ciclina D como alvo terapêutico no câncer
Ciclina D1 no câncer: uma conexão molecular para controle do ciclo celular, adesão e invasão no tumor e estroma
Ciclina D1 estromal promove sinalização imune heterotípica e crescimento do câncer de mama
SIRT2 contribui para a resistência de células de melanoma ao inibidor multiquinase dasatinibe
Ação dupla de sirtuínas como supressoras e promotoras de tumor na determinação do fenótipo maligno
O papel duplo das sirtuínas no câncer
O significado clínico de SIRT2 em malignidades: um supressor tumoral ou um oncogene?
A desacetilase dependente de NAD SIRT2 regula a diferenciação de células T envolvida na resposta imune tumoral
Sinalização do receptor de VEGF ? no controle da função vascular
O fator de crescimento endotelial vascular é um mitógeno angiogênico secretado
Fator de crescimento endotelial vascular: um novo membro da família do fator de crescimento derivado de plaquetas
Papel da via do fator de crescimento endotelial vascular no crescimento tumoral e angiogênese
Um nicho vascular e um loop VEGF-Nrp1 regulam a iniciação e a capacidade de células-tronco de tumores de pele
VEGF impulsiona células-tronco iniciadoras de câncer através da sinalização VEGFR-2/Stat3 para regular positivamente Myc e Sox2
GLI1 regula uma nova via autócrina baseada em neuropilina‐2/α6β1 integrina que contribui para a iniciação do câncer de mama
Células semelhantes a células-tronco do glioma promovem angiogênese tumoral através do fator de crescimento endotelial vascular
A sinalização autócrina VEGF-VEGFR2-neuropilina-1 promove a viabilidade de células semelhantes a células-tronco do glioma e o crescimento tumoral
O fator de crescimento endotelial vascular promove a invasão do carcinoma de mama de forma autócrina ao regular o receptor de quimiocina CXCR4
VEGF induz transição epitélio-mesenquimal (EMT) em células semelhantes à neoplasia intraepitelial prostática (PIN) por meio de um loop autócrino
A expressão do fator de crescimento endotelial vascular promove o crescimento de metástases cerebrais de câncer de mama em camundongos nus
Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) no câncer de mama: comparação de VEGF no plasma, soro e tecido e densidade microvascular, e efeitos do tamoxifeno
Níveis de citocinas correlacionam-se com infiltração de células imunes após terapia anti-VEGF em modelos pré-clínicos de camundongos com câncer de mama
A produção do fator de crescimento endotelial vascular por tumores humanos inibe a maturação funcional de células dendríticas
A rede imunossupressora tumoral: células supressoras derivadas de mieloides, células T reguladoras e células T natural killer
VEGF-A modula a expressão de pontos de verificação inibitórios em células T CD8+ em tumores
O endotélio tumoral fasL estabelece uma barreira imune seletiva que promove tolerância em tumores
VEGF-A está associado ao grau de TILs e à expressão de PD-L1 em câncer de mama primário
HDAC1 desencadeia a proliferação e migração de células de câncer de mama via regulação positiva da interleucina-8
As histona desacetilases 1, 6 e 8 são críticas para a invasão no câncer de mama
A inibição de HDAC potencializa a imunoterapia no câncer de mama triplo-negativo
A amplificação e a alta expressão da proteína de choque térmico 90 marcam fenótipos agressivos do câncer de mama negativo para o receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano
Expressão de hsp90 e ciclina D1 em câncer de mama humano
O HSP90AA1 plasmático prediz o risco de início do câncer de mama e metástase à distância
As proteínas de choque térmico criam uma assinatura para prever o desfecho clínico no câncer de mama
As isoformas da família da proteína de choque térmico 90 como biomarcadores prognósticos e suas correlações com infiltração imune no câncer de mama
Efeito antitumoral do honokiol isolado e em combinação com outros agentes anticancerígenos no câncer de mama
Honokiol inibe a transição epitélio-mesenquimal em células de câncer de mama ao direcionar o eixo transducer de sinal e ativador de transcrição 3/Zeb1/E-caderina
Quinases Aurora: novos alvos terapêuticos em cânceres
AURKB como alvo no câncer de pulmão de células não pequenas com resistência adquirida à terapia anti-EGFR
Quinase Aurora B: um potencial alvo farmacológico para terapia do câncer
A pequena proteína de ligação a GTP rac regula o ruffling da membrana induzido por fatores de crescimento
Efeito da inibição de PAK na mecânica celular depende de Rac1
Um inibidor de molécula pequena específico para GTPase rac1/cdc42 suprime o crescimento de xenoenxertos primários de câncer de próstata humano e prolonga a sobrevida em camundongos
O papel das GTPases Rho na sinalização de VEGF em células cancerígenas
Honokiol: uma revisão de seu potencial anticancerígeno e mecanismos
Direcionamento das vias de apoptose no câncer com magnolol e honokiol, constituintes bioativos da casca de Magnolia officinalis
Sinalização C-KIT no tratamento do câncer
(a) Estrutura do honokiol. (b) Diagrama de Venn dos potenciais alvos terapêuticos do honokiol (PTTH) em células-tronco do câncer de mama (BCSCs). (c) Rede de interação proteína-proteína (PPI) do honokiol e das proteínas interagentes. (d) Top-10 genes hub determinados de acordo com a pontuação de Centralidade de Clique Máxima (MCC).

(a) Análise de Ontologia Gênica (GO) dos potenciais alvos terapêuticos do honokiol (PTTH) utilizando o WebGestalt. (b) Visão geral das alterações genéticas em CCND1, SIRT2, AURKB, VEGFA, HDAC1, CASP9, HSP90AA1 e HSP90AB1 com base em amostras de vários estudos de câncer de mama. (c) Análise Oncoprint de CCND1, SIRT2, AURKB, VEGFA, HDAC1, CASP9, HSP90AA1 e HSP90AB1 no conjunto de dados do The Metastatic Breast Cancer Project (Provisório, fevereiro de 2020). (d) Níveis de expressão de mRNA de CCND1, SIRT2, AURKB, VEGFA, HDAC1, CASP9, HSP90AA1 e HSP90AB1 no The Metastatic Breast Cancer Project (Provisório, fevereiro de 2020) conforme analisado usando o cBioportal. 1: deleção profunda, 2: deleção superficial, 3: diploide; 4: ganho; 5: amplificação. As análises estatísticas foram realizadas por ANOVA de uma via usando o teste de comparação múltipla de Tukey. O símbolo ∗ou∗∗ou∗∗∗ou∗∗∗∗ simboliza P < 0,05 ou P < 0,01 ou P < 0,001 ou P < 0,001, respectivamente. (e) Vias relacionadas às alterações genéticas previstas pelo cBioportal. Os resultados mostraram que as alterações genéticas do PTTH interromperam as vias que regulam o ciclo celular.

(a) Associação entre os níveis de expressão de CCND1, SIRT2, AURKB, VEGFA, HDAC1, CASP9, HSP90AA1 e HSP90AB1 e a sobrevida global nas amostras de câncer de mama do The Cancer Genome Atlas. (b) Análise de correlação entre os níveis de expressão de CCND1, SIRT2, AURKB, VEGFA, HDAC1, CASP9, HSP90AA1 e HSP90AB1 e os níveis de infiltração de células B, células T CD8+, células T CD4+, macrófagos, neutrófilos e células dendríticas.

Níveis de expressão de mRNA e proteína de CCND1, SIRT2, AURKB, VEGFA, HDAC1, CASP9, HSP90AA1 e HSP90AB1. (a) Níveis de expressão de mRNA no The Cancer Genome Atlas (TCGA). (b) Níveis de expressão de proteína em tecidos mamários normais e tumorais obtidos do Human Protein Atlas (HPA).

Visualização da docagem molecular do honokiol (HNK) em direção à AURKB e RAC-1.

Mecanismo proposto do honokiol (HNK) em mBCSCs (criado com https://BioRender.com).

Potenciais alvos terapêuticos do honokiol (PTTH) em células-tronco do câncer de mama metastático (mBCSCs).
No. Símbolo da proteína Nome da proteína Banco de dados 1 CASP9 Caspase 9 STITCH 2 IL4 Interleucina 4 STITCH 3 PDK1 Isoforma 1 da piruvato desidrogenase quinase Swisstargetprediction 4 CCND1 Ciclina D1 STITCH 5 CSF1R Receptor do fator estimulador de colônias de macrófagos Swisstargetprediction 6 TRAP1 Proteína de choque térmico de 75 kDa, mitocondrial Swisstargetprediction 7 VEGFA Fator de crescimento endotelial vascular A STITCH 8 HDAC8 Histona desacetilase 8 Swisstargetprediction 9 CAPN1 Calpaína 1 STITCH 10 PARP1 Poli(ADP-ribose) polimerase-1 Swisstargetprediction 11 MGLL Lipase monoglicerídica Swisstargetprediction 12 NQO2 Quinona redutase 2 Swisstargetprediction 13 RXRA Receptor X do retinoide alfa canSAR Black 14 CNR1 Receptor canabinoide 1 Swisstargetprediction 15 HSP90AB1 Proteína de choque térmico HSP 90-beta Swisstargetprediction 16 AURKB Serina/treonina-proteína quinase Aurora-B Swisstargetprediction 17 PTGER4 Receptor EP4 de prostanoides Swisstargetprediction 18 HSP90AA1 Proteína de choque térmico HSP 90-alfa Swisstargetprediction 19 DYRK1A Quinase 1A regulada por fosforilação de tirosina de dupla especificidade Swisstargetprediction 20 GSK3A Glicogênio sintase quinase-3 alfa Swisstargetprediction 21 ACHE Acetilcolinesterase Swisstargetprediction 22 PAK1 Serina/treonina-proteína quinase PAK 1 Swisstargetprediction 23 FAAH Amidoidrolase de anandamida Swisstargetprediction 24 CAPN2 Calpaína 2 STITCH 25 CAPN3 Calpaína 3 STITCH 26 HDAC1 Histona desacetilase 1 Swisstargetprediction 27 EPHX2 Epóxido hidratase Swisstargetprediction 28 CDC25B Fosfatase de dupla especificidade Cdc25B Swisstargetprediction 29 HDAC6 Histona desacetilase 6 Swisstargetprediction 30 SIRT2 Desacetilase sirtuína 2 dependente de NAD Swisstargetprediction
Os 10 principais genes hub pelo escore de Centralidade de Clique Máxima (MCC), conforme analisado pelo CytoHubba.
Classificação Símbolo do gene Escore MCC 1 HSP90AA1 132 2 PARP1 102 3 CCND1 98 4 HDAC1 67 5 HSP90AB1 62 6 VEGFA 53 7 CASP9 28 8 AURKB 26 9 HDAC6 24 10 SIRT2 18
Resultados da análise de exclusividade mútua dos potenciais alvos terapêuticos do honokiol (PTTH).
A B Razão de chances log2 Valor P Tendência HSP90AB1 VEGFA >3 <0,001 Coocorrência
Resultados da docagem molecular do honokiol (HNK) em relação a AURKB e RAC-1.
Proteína, ID PDB Ligante nativo Honokiol S RMSD (Å) LA AA BT D S RMSD (Å) LA AA BT D AURKB, ID PDB : 3ZCW −12,89 1,39 OOOO Gly108Gly110Lys111Thr112 ScDScDScDScD 1,951,912,112,24 −8,68 1,10 C Pro27 ArH 2,75 RAC-1, ID PDB : 3TH5 −21,38 0,48 OOOOOOOOHH Ala13Gly15Lys16Lys16Thr17Cys18Thr35Gly60Asp118Asp118 ScDScDScDScDScDScDScDScDScDScD 2,202,491,731,951,901,791,822,372,092,13 −18,17 1,86 COCCOC Gly12Gly15Thr17Pro34Thr35Thr35 ArHScDArHArHScAArH 4,011,833,353,962,142,70
S: escore de docagem, RMSD: desvio quadrático médio da raiz, LA: átomo do ligante, AA: aminoácido, BT: tipo de ligação, D: distância, ScD: doador da cadeia lateral, ScA: aceptor da cadeia lateral, ArH: areno H, e BbD: doador do esqueleto.