pmid: "36903330"
title: "Saponinas de Castanha-da-Índia - Escinas, Isoescinas, Transescinas e Desacilescinas"
authors: "Savarino P, Colson E, André J, Gerbaux P"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2023 Feb 23"
doi: "10.3390/molecules28052087"
source: "PMC Full Text"
Saponinas de Castanha-da-Índia - Escinas, Isoescinas, Transescinas e Desacilescinas
Autores
Savarino P, Colson E, André J, Gerbaux P
Periodico
Molecules (Basel, Switzerland) (2023 Feb 23)
Conteudo
Saponinas de Castanha-da-Índia – Escinas, Isoescinas, Transescinas e Desacilescinas
As escinas constituem uma família abundante de saponinas (saponosídeos) e são os componentes mais ativos nas sementes de Aesculum hippocastanum (castanha-da-índia – CI). Elas possuem grande interesse farmacêutico como tratamento de curto prazo para insuficiência venosa. Numerosos congêneres de escina (com composições ligeiramente diferentes), bem como numerosos regio- e estereoisômeros, são extraíveis das sementes de CI, tornando obrigatórios os ensaios de controle de qualidade, especialmente porque a relação estrutura-atividade (REA) das moléculas de escina permanece pouco descrita. No presente estudo, espectrometria de massas, ativação por micro-ondas e ensaios de atividade hemolítica foram utilizados para caracterizar extratos de escina (incluindo uma descrição quantitativa completa dos congêneres e isômeros de escina), modificar as saponinas naturais (hidrólise e transesterificação) e medir sua citotoxicidade (escinas naturais vs. modificadas). Os grupos éster do aglicona que caracterizam os isômeros de escina foram alvo. Uma análise quantitativa completa, isômero por isômero, do teor ponderal nos extratos de saponina, bem como no pó seco da semente, é relatada pela primeira vez. Impressionantes 13% em peso de escinas nas sementes secas foram medidos, confirmando que as escinas de CI devem ser absolutamente consideradas para aplicações de alto valor agregado, desde que sua REA seja estabelecida. Um dos objetivos deste estudo foi contribuir para este desenvolvimento, demonstrando que as funções éster do aglicona são obrigatórias para a toxicidade do derivado de escina, e que a citotoxicidade também depende da posição relativa das funções éster no aglicona.
- Introdução
Por décadas, empresas farmacêuticas e laboratórios acadêmicos têm se engajado em inúmeros esforços para a preparação de moléculas originais com propriedades específicas. Enfrentando enormes desafios para a produção de baixo custo de medicamentos seguros, os cientistas têm demonstrado interesse crescente em moléculas de origem natural, que apresentam estruturas altamente específicas, como fármacos ou pró-fármacos. Em particular, as saponinas monopolizam uma parte crescente da pesquisa atual.
As saponinas são metabólitos especializados que têm sido usados há centenas de anos na medicina tradicional chinesa. Embora essas moléculas tenham sido descobertas em diversos invertebrados marinhos (por exemplo, esponjas, estrelas-do-mar e pepinos-do-mar), elas estão presentes principalmente no reino vegetal. Um estudo realizado com mais de 1700 variedades de plantas e vegetais asiáticos atesta sua presença em cerca de 75% deles. Esta família de moléculas, embora caracterizada por uma enorme diversidade estrutural, baseia-se em um padrão comum, originado da condensação de uma aglicona apolar esteroidal ou triterpenoide e pelo menos um glicano polar composto por uma cadeia linear ou ramificada de açúcar. As saponinas monodesmosídicas são caracterizadas pela condensação de um único oligossacarídeo na aglicona, enquanto estruturas polidesmosídicas aparecem quando várias cadeias de oligossacarídeos estão ligadas à aglicona. Além disso, várias funções químicas específicas, como sulfato (seja no glicano ou na aglicona), ácido carboxílico livre e muitas outras, são frequentemente detectadas e, sem dúvida, modulam as propriedades biológicas das saponinas.
Em plantas e animais, propõe-se que as saponinas estejam envolvidas em processos defensivos, na comunicação inter e intraespécies, e também acredita-se que participem dos processos de reprodução. Seu caráter anfifílico confere a elas propriedades biológicas interessantes e diversas (por exemplo, hemolítica, antibacteriana, antifúngica, antiviral, etc.), resultando diretamente de suas interações específicas com as membranas celulares. Já foi proposto que a citotoxicidade das saponinas deriva de sua capacidade de serem incorporadas nas membranas celulares. É claro que sua interação com uma membrana específica é altamente dependente de suas estruturas químicas, destacando que a grande diversidade estrutural das saponinas deve estar relacionada de alguma forma a atividades específicas em relação aos diversos organismos vivos ao redor. Estabelecer a relação estrutura/atividade (REA) das saponinas representa, portanto, uma tarefa complicada, mas essencial para decifrar o papel biológico das saponinas, mas também para considerá-las como moléculas de origem biológica para aplicações de alto valor agregado em farmácia, medicina, agricultura, etc.
Um procedimento elegante para atingir um objetivo tão ambicioso é utilizar procedimentos de química orgânica que modifiquem especificamente a estrutura das saponinas e avaliem o impacto das modificações em suas propriedades. Como exemplos típicos, demonstramos recentemente que a dessulfatação das saponinas contidas nas vísceras do pepino-do-mar malgaxe Holothuria scabra anula sua atividade hemolítica (AH) e que a hidrólise parcial das saponinas bidesmosídicas contidas na casca da pseudocereal chilena Chenopodium quinoa modula significativamente sua AH. Outros estudos foram reportados recentemente e envolvem a funcionalização do grupo amino dos diosgenil β-D-glicosaminosídeos, a N-acilação das saponinas de Quillaja saponaria ou a oximação de saponinas triterpenoides.
O presente estudo foca em saponinas extraídas dos frutos do castanheiro-da-índia europeu, Aesculus hippocastanum L.. Esta árvore é amplamente plantada ao longo de rodovias ou em parques e jardins públicos, mas devido à sua toxicidade intrínseca, as sementes (também chamadas de conkers) não são adequadas para consumo humano. O fruto, composto pela casca espinhosa verde – a ouriço – e a semente, representa, portanto, uma biomassa descartada que contém produtos químicos potencialmente valiosos, como um alto teor de saponinas. Essas moléculas – denominadas escinas – foram identificadas em 1952 por Ratschow M. e Bodecker H.. Todas as escinas são saponinas monodesmosídicas e consistem em uma aglicona triterpênica e um glicano ramificado ancorado em C3 composto por três unidades de monossacarídeos (glicose—Glc, xilose—Xyl, galactose—Gal, ou ácido glucurônico—GlcA). Elas diferem entre si pela presença de funções específicas localizadas nos carbonos C21 (tigloíla—Tig, angloíla—Ang, isobutirila—iBu, ou grupo 2-metilbutirila—mBu), C22 ou C28 (grupo acetila—Ac), conforme apresentado na Figura 1. As escinas isoméricas são principalmente distinguidas em escinas (Tig/Ang em C21; Ac em C22) e isoescinas (Tig/Ang em C21; Ac em C28). A literatura sobre escinas é bastante complicada de acompanhar porque vários nomes surgiram ao longo dos anos, e ambiguidades estão frequentemente presentes ao tentar correlacionar os diferentes estudos. Por exemplo, cripto-, α- e β-escinas apareceram na literatura nos anos 60′s e se referiam a misturas de componentes. Wagner et al. afirmaram que a criptoescina contém saponinas C-28-O-acetiladas – ou seja, isoescinas, e a β-escina contém saponinas C22-O-acetiladas, ou seja, escinas, enquanto a α-escina é uma mistura de cripto- e β-escina. Na literatura recente, α-escinas e β-escinas têm sido associadas principalmente a uma mistura natural de saponinas, com α-escinas e β-escinas sendo compostas principalmente por Isoescina Ia (a é para tigloíla) e Ib (b é para angloíla), e Escina Ia e Ib, respectivamente. Preparações comerciais disponíveis em diferentes países contêm tanto α- quanto β-escinas, sendo as β-escinas muito mais ativas em comparação com as α-escinas. Uma das razões intrínsecas para tal confusão, além da presença de formas isoméricas nas plantas, decorre do fato de que as α-escinas são formadas por meio de uma migração acílica envolvendo os grupos hidroxila nas posições C21, C22 e C28 simplesmente pelo aquecimento de soluções aquosas de β-escinas.
No presente estudo, os grupos éster presentes em C21, em C22 e/ou em C28, veja a Figura 1, das saponinas contidas na castanha da Índia (HC) dos frutos, serão especificamente modificados usando métodos de química orgânica para preparar especificamente derivados de saponina com propriedades biológicas potencialmente modificadas. Quando comparadas às ligações glicosídicas, as funções éster alvo são de fato propensas à hidrólise em pH básico e, portanto, podem ser especificamente eliminadas em condições de química verde, ou seja, ativação assistida por micro-ondas. O impacto da natureza, presença e posição das funções éster na citotoxicidade é, portanto, avaliado medindo-se sua HA. Todas as amostras são caracterizadas qualitativa e quantitativamente por espectrometria de massas, conforme abundantemente descrito na literatura. Ao longo deste manuscrito, o nome de uma molécula bem definida será sempre escrito com letra maiúscula (ou seja, Escin Ia e Isoescin IIb), enquanto famílias de moléculas serão escritas com letras minúsculas (tipicamente, escin I e isoescin).
- Resultados e Discussão
2.1. Extração e Identificação de Saponinas no Extrato Natural (NE)–Purificação, Caracterização e Quantificação das Escins I, II e III no Extrato Enriquecido (EE)
Extratos naturais de saponinas (NE) são obtidos por extração sólido-líquido com metanol a partir das sementes secas moídas, seguida por várias extrações líquido/líquido, veja Materiais e Métodos, com um rendimento de extração de 3,557 g por 25 g de semente seca moída, ou seja, 142 mg·g−1. Usando o protocolo de EM desenvolvido em nosso laboratório, consistindo em uma compilação de dados analíticos obtidos por análise de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI), experimentos de espectrometria de massas em tandem (dissociação induzida por colisão—CID), medições de massa exata (alta resolução—HRMS) e separação por cromatografia líquida (LC-MS/MS), nove composições elementares diferentes para um total de vinte e quatro isômeros de saponina são detectadas e reunidas na Tabela 1. O espectro de massas MALDI-ToF do NE é apresentado na Figura 2 e revela a presença de nove sinais em m/z 1083, 1097, 1111, 1113, 1123, 1137, 1141, 1153 e 1155 que são prontamente atribuídos a composições elementares de saponinas como íons [M + Na]+ com base em medições de massa exata, veja a Tabela 1.
Análises de LC-MS/MS foram realizadas para (i) confirmar que os íons detectados eram íons de saponinas, (ii) destacar a presença de isômeros para cada composição de saponina, (iii) confirmar a sequência de glicanos e a natureza dos grupos éster no aglicona usando dissociações induzidas por colisão (CID), e (iv) quantificar o teor de saponinas dentro do NE. Experimentos de LC-MS e LC-MS/MS revelam claramente que todas as escinas detectadas estão presentes como diferentes isômeros, veja a Tabela 1, com o caso típico das escinas I, II e II presentes como quatro isômeros diferentes. Com base em dados da literatura e, em particular, em nossa recente investigação de espectrometria de massas por mobilidade iônica, as escinas I detectadas em m/z 1153 como íons [M + Na]+ na Figura 3a são prontamente identificadas como Escina Ia (TR 7,96 min), Escina Ib (TR 8,25 min), Isoescina Ia (TR 8,59 min) e Isoescina Ib (TR 8,88 min). Combinando os dados de LC-MS e LC-MS/MS, atribuímos os diferentes tempos de retenção (TR) às diferentes moléculas de escina. Todos os espectros de massas CID ([M + H]+) são apresentados nos Materiais Suplementares. Observe que todas essas moléculas já foram descritas na literatura, assegurando nossa atribuição.
As proporções molares de saponinas são estimadas com base nas abundâncias relativas de íons de sinal, ou seja, por integração de sinal LC. Como um exemplo típico, na Figura 3a, o cromatograma de corrente iônica extraída (EIC) (íons m/z 1153) nos permite estimar – considerando todos os íons de saponina detectados na Tabela 1 – que os quatro isômeros de escina I, ou seja, Escina Ia, Escina Ib, Isoescina Ia e Isoescina Ib, estão presentes com proporções molares de 22, 18, 11 e 9%, respectivamente (Tabela 1). Usando uma saponina comercialmente disponível (Hederacoside C) como padrão interno, o percentual em peso de cada composição de escina também pode ser determinado, veja a Tabela 1, e a composição de escina I é confirmada como sendo de longe a composição mais abundante, com 55,85% em peso do extrato, ou seja, 55,85 mg de escinas I por 100 mg de extrato seco, para uma quantidade global de 91,82 mg de escinas por 100 mg de extrato seco (~92% de pureza). Quando combinado adicionalmente com o rendimento de extração gravimétrico, ou seja, 142 mg·g−1, podemos estimar que o teor de escinas nas sementes de HC atinge ~130 mg·g−1 de pó de semente seco, o que está em boa concordância com os teores de escinas relatados de ~12,5% em sementes de HC.
Utilizamos cromatografia flash (FC) para tentar isolar os isômeros de escina I, e a eluição da FC foi monitorada por MALDI-MS. Conforme mostrado na Figura 2b, os isômeros de escina I (m/z 1153), escina II (m/z 1123) e escina III (m/z 1137) foram separados com sucesso das escinas IV-IX, mas são muito semelhantes para serem separados entre si. De fato, as escinas I, II e III diferem apenas, isômero por isômero, pela natureza de um resíduo monossacarídico (R6 na Figura 1), que é glicose, xilose e galactose, respectivamente. Em outras palavras, os grupos éster alvo em C21, C22 ou C28 são semelhantes. Decidimos, portanto, utilizar um extrato concentrado denominado EE (extrato enriquecido) para nossas investigações.
Utilizando LC-MS com Hederacosídeo C como padrão interno, analisamos qualitativa e quantitativamente este extrato, composto pelos quatro isômeros de escina I (27,21%, 21,99%, 19,61% e 15,99% em peso para Escina Ia, Escina Ib, Isoescina Ia e Isoescina Ib, respectivamente), pelos quatro isômeros de escina II (2,75%, 2,48%, 1,18% e 0,82% em peso para Escina IIa, Escina IIb, Isoescina IIa e Isoescina IIb, respectivamente) e pelos quatro isômeros de escina III (2,69%, 2,36%, 1,15% e 0,66% em peso para Escina IIIa, Escina IIIb, Isoescina IIIa e Isoescina IIIb, respectivamente), conforme Tabela 2. Globalmente, o extrato EE contém 98,89 mg de saponinas por 100 mg, com 59,48 mg e 39,41 mg de escinas e isoescinas por 100 mg, respectivamente.
2.2. Hidrólise Específica Assistida por Micro-ondas de Saponinas de Sementes de Castanha-da-Índia
Um dos objetivos deste estudo foi avaliar se os grupos éster estavam participando da citotoxicidade das saponinas. A estratégia experimental baseia-se na hidrólise específica dessas funções éster sem degradar o esqueleto glicano-aglicona da escina. Um dispositivo de ativação térmica por micro-ondas é bem demonstrado como um método de aquecimento homogêneo e rápido, cancelando ou limitando a formação de subprodutos. Além disso, o uso de aquecimento por micro-ondas permite a modulação de vários parâmetros da reação, como a concentração dos reagentes (aqui fixada em 1 mg·mL⁻¹), a natureza do solvente (aqui apenas soluções aquosas), o pH, a temperatura de aquecimento e o tempo de aquecimento/reagente. O EE foi então dissolvido em tampões aquosos variando de pH 7 a pH 14 (para evitar a hidrólise ácida da ligação glicosídica) e submetido a tempos de aquecimento de 1 s a 15 min e temperaturas de aquecimento de 100 a 160 °C. Usando MALDI-MS para monitorar o grau de hidrólise, as condições ótimas de hidrólise foram identificadas como pH 14 por 5 min a 150 °C. O espectro de MALDI-MS registrado para essas condições é mostrado na Figura 2c. As escinas I, II e III do EE são hidrolisadas quantitativamente em Desacilescina I, Desacilescina II e Desacilescina III e detectadas em m/z 1029, m/z 999 e m/z 1015 na Figura 2c. A composição elementar dos íons, bem como a conservação dos grupos glicano, foram confirmadas por MALDI-HRMS e LC-MS/MS (ver Tabela 3). O processo de hidrólise ocorreu através de um mecanismo de adição/eliminação, típico da hidrólise básica da ligação éster, conforme apresentado na Figura 4.
Também pode ser notado que os regioisômeros e estereoisômeros presentes em cada família de escina, ou seja, escina a, escina b, isoesina a e isoesina b, colapsam em uma única estrutura, denominada desacilescina, devido à eliminação dos grupos éster determinantes de isomerismo. Os dados mostrados na Tabela 3, obtidos por análises qualitativas e quantitativas, demonstram a especificidade da dupla hidrólise de éster, uma vez que foram obtidos tempos de retenção únicos. Além disso, as proporções relativas entre as desacilescinas I, II e III (84, ~8 e ~8%) reproduzem as proporções relativas entre as escinas I, II e III (85, 7,5 e ~7%), determinadas antes da hidrólise, conforme Tabela 2 e Tabela 3, respectivamente.55,85% em peso) com 59,5% de escinas a/b (β-escinas) e 39,5% de isoescinas a/b (α-escinas). Eliminar as funções éster do aglicona por hidrólise básica claramente anula a citotoxicidade das saponinas, pelo menos contra glóbulos vermelhos, já que a HA não é mais detectada, independentemente da concentração do extrato: veja a curva vermelha na Figura 6. É provável que tal modificação das propriedades esteja relacionada à perda de anfifilicidade das saponinas naturais pela liberação de grupos álcool livres na aglicona. Finalmente, ao estimar a HA do TE, observamos uma perda de atividade após a migração do grupo acetil. Determinamos anteriormente que o TE era enriquecido em isoescinas (
2.3. Transesterificação Assistida por Micro-ondas de Saponinas de Sementes de Castanha-da-Índia
Além das escins (a/b) e isoescins (a/b), isômeros de escina (para escins I, II e III) foram detectados na análise por LC-MS em condições de micro-ondas mais suaves, tipicamente com pH neutro e temperatura mais baixa, como mostrado na Figura 3b para pH 7–120 °C–5 min. A mistura de saponinas correspondente é aqui denominada extrato de transesterificação (TE). Com base em MALDI-HRMS, as composições elementares dos íons [M + Na]+ foram confirmadas como correspondendo aos isômeros de escina I, II e III; vide Tabela 4. As escins são bem conhecidas por se converterem em isoescins por uma migração intramolecular de acetila – ou seja, um processo de transesterificação – de C22 para C28; vide também Figura 5. A comparação entre a análise por LC-MS dos extratos EE e TE na Figura 3 revela que a proporção escin-para-isoescin é modificada, com as isoescins se tornando mais abundantes após o aquecimento. Curiosamente, não é possível aumentar ainda mais a conversão escin-para-isoescin e, em vez disso, dois sinais adicionais de LC aparecem em tempos de retenção menores. De um ponto de vista mais quantitativo, no EE, as escins (a + b) e isoescins (a + b) são caracterizadas pelos %-Pesos de ~59,5 e ~39,5 mg por 100 mg; vide também Tabela 2. Após ativação térmica por micro-ondas, esses % de pesos tornam-se, respectivamente, ~41,5 e ~36,5 mg por 100 mg. Os isômeros adicionais de escina são então produzidos em direção a um %-Peso de ~19,5 mg por 100 mg; vide Tabela 4. Globalmente, o teor de saponinas neste TE totaliza 97,34 mg por 100 mg; vide Tabela 4.
Conforme mostrado nos Materiais Suplementares, os espectros de massa CID dos novos íons isômeros de escina foram medidos como marginalmente distintos dos espectros de massa CID de escina e isoescin, o que atesta uma grande similaridade estrutural. Esses isômeros adicionais de escina podem, portanto, corresponder às saponinas C-16-O-acetiladas. Em sua contribuição de 1970, Wagner et al. conseguiram cristalizar a 16-acetil-21-angeloilprotoascigenina, cujas contrapartes de escina nunca foram relatadas, até onde sabemos. Propomos aqui que essas Transescins Ia e Ib são produzidas por uma migração de acetila de C28 para C16 que ocorre através de um estado de transição de 6 membros similar à migração de acetila de C22 para C28, conforme esboçado na Figura 5. Tal migração de acetila entre C28 e C16 foi descrita para derivados de oleanano.
2.4. Avaliação da Atividade Hemolítica (AH)
A citotoxicidade dos diferentes extratos, ou seja, extrato enriquecido (EE), extrato de hidrólise (EH) e extrato de transesterificação (TE), foi comparada pela determinação de sua atividade hemolítica (AH). A AH foi comparada a uma solução de referência (500 µg·mL−1 de saponinas de vísceras de Holothuria scabra) e expressa como uma porcentagem da atividade da solução de referência, ver Materiais e Métodos.
Conforme mostrado na Figura 6, a HA foi significativamente impactada pelas modificações estruturais feitas nas saponinas de HC. Para o EE, a HA atingiu 100% já a 20 µg·mL⁻¹, significando que as saponinas do EE tiveram a mesma citotoxicidade que a solução padrão de saponina acima de 20 µg·mL⁻¹, tornando as saponinas do EE as mais ativas em nosso estudo. Como lembrete, este extrato contém principalmente os quatro isômeros de escina I (36% vs. ~39,5% no EE) e transescinas (19,5% vs. 0% no EE) e empobrecido em escinas (~41,5% vs. ~59,5% no EE) quando comparado ao EE. Essas concentrações exigiram que atingíssemos 100% de HA para os extratos EE e TE, que são, respectivamente, determinados a ~20 µg·mL⁻¹ e ~60 µg·mL⁻¹, veja a Figura 6. Ao associar essas concentrações com as proporções de isômeros de escina, obtivemos que 100% de HA foi alcançado com soluções de EE e TE contendo ~10 (escina), ~8 (isoescina) e 0 (transescina) µg·mL⁻¹ e ~25 (escina), ~21 (isoescina) e ~11 (transescina) µg·mL⁻¹, respectivamente. Está bem documentado que as escinas (β-escinas) são mais ativas que as isoescinas (α-escinas). A partir de nossos dados, também devemos considerar que efeitos competitivos entre isômeros de escina devem ser considerados, uma vez que, na presença de maiores proporções de isoescinas e/ou transescinas, a concentração de escinas deve ser mais que duplicada para atingir a mesma atividade hemolítica.
Na literatura recente, é amplamente relatado que a capacidade das saponinas de induzir poros transmembrana depende principalmente das estruturas das saponinas e das composições lipídicas da membrana. O colesterol é frequentemente proposto como o principal alvo das saponinas nas membranas, e a formação de complexos fortes de saponina/colesterol é a força motriz da atividade formadora de poros das saponinas. Portanto, mesmo que a natureza da parte glicânica seja obrigatória, ou seja, as sapogeninas são em sua maioria inativas, a estrutura da parte lipofílica define a força dos complexos saponina/colesterol. Nosso estudo se correlaciona bem com o conhecimento atual da RSA das saponinas, uma vez que a hidrofobicidade da parte aglicona (experimentos de hidrólise) e a estrutura da aglicona (experimentos de transesterificação) modificam claramente as interações saponina/membrana. Investigações in silico e sistemas de membranas modelo são, atualmente, cada vez mais utilizados para investigar as interações entre saponinas e membranas lipídicas. Seria de extrema importância considerar os presentes resultados experimentais em tais investigações. De fato, acreditamos que as reduções na HA medidas após hidrólise e transesterificação podem ter sua origem, por um lado, na reduzida propensão de penetração das saponinas hidrolisadas na membrana e, por outro lado, em uma interação saponina/colesterol mais fraca após a transesterificação.
3. Materiais e Métodos
3.1. Produtos Químicos
Metanol de grau técnico, n-hexano, clorofórmio, diclorometano, isobutanol para CLAE, ácido fórmico para CLAE e acetonitrila para CLAE foram fornecidos por CHEM-LAB NV (Somme-Leuze, Bélgica). Ácido 2,5-di-hidroxibenzoico (DHB), N,N-dimetilanilina (DMA) e Hederacosídeo C foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Diegem, Bélgica). Citrato de sódio, cloreto de sódio, fosfato dissódico di-hidratado, cloreto de potássio, fosfato monopotássico, hidróxido de potássio, ácido clorídrico e bórax foram fornecidos pela VWR Chemicals (Leuven, Bélgica). Água Milli-Q foi produzida purificando água de torneira com um sistema PURELAB flex 2 (ELGA LabWater, Lane End, High Wycombe, Reino Unido).
3.2. Extração e Cromatografia Flash
Frutos maduros foram coletados em Mons (Bélgica) durante o outono de 2022. As sementes foram então separadas da ouriça, secas em estufa (50 °C durante a noite) e moídas separadamente (IKA A 11 Mills, IKA, Staufen, Alemanha). O pó da amostra foi então colocado sob agitação em metanol (temperatura ambiente durante a noite). A solução foi centrifugada por dez minutos (4500× g, Sigma 2-16P, Sigma, Osterode am Harz, Alemanha). O sobrenadante foi coletado e diluído com água para obter uma proporção volumétrica de 70/30 (metanol/água). O extrato metanólico foi então particionado (v/v) com n-hexano, clorofórmio e diclorometano para remover compostos apolares. A terceira fase metanólica foi recuperada e evaporada a vácuo com um evaporador rotativo (80 rpm, IKA RV 10, IKA, Staufen, Alemanha) em banho-maria (50 °C). O resíduo foi levado a um volume de 25 mL (água), e uma quarta extração líquido-líquido (v/v) foi realizada com isobutanol para recuperar as saponinas na fase orgânica. A fase orgânica foi então lavada duas vezes com água para remover os sais residuais e impurezas. Finalmente, a fase orgânica foi evaporada a vácuo para obter um pó purificado. Este extrato é denominado extrato natural neste estudo (NE).
Para separar as escinas I, II e III de outras escinas, o pó do extrato natural (100 mg) foi dissolvido em uma mistura de água/acetonitrila (3 mL, 60/40). A solução foi submetida a cromatografia flash (Biotage SP1 Flash Chromatography, Biotage Sweden, Uppsala, Suécia) em uma coluna não polar (Büchi Cartouche FlashPure ID C-18-WP Flash, BUCHI Labortechnik GmbH, Hendrick-Ido-Ambracht, Países Baixos) usando um eluente cuja composição em água e acetonitrila variou durante a separação (fração 1 a 15; 80/20, fração 16 a 23; 70/30, fração 24 a 32; 65/35, fração 33 a 40; 60/40, fração 41 a 44; 50/50, fração 45 a 50; de 50/50 a 5/95, e fração 51 a 63; de 5/95 a 80/20). Cada fração consistiu em 18 mL, com um fluxo de 15 mL·min−1. As frações de interesse (36 a 39, confirmadas por MALDI-MS) foram coletadas e evaporadas a vácuo. O resíduo obtido foi levado a um volume de 25 mL (água) para realizar uma extração líquido-líquido (v/v) com isobutanol. A fase orgânica foi lavada duas vezes com água e finalmente evaporada a vácuo para obter o pó purificado. Este extrato é denominado extrato enriquecido neste estudo (EE).
3.3. Hidrólise e Transesterificação Assistidas por Micro-ondas
Os protocolos de hidrólise e transesterificação foram adaptados de Bedini et al. e de nossos estudos anteriores. O EE de A. hippocastanum (3 mg) foi solubilizado em 3 mL de diferentes soluções tampão cobrindo uma faixa de pH de 7 a 14. pH 7: 50 mL de KH2PO4 0,1 mol·L−1 foram adicionados a 29,1 mL de NaOH 0,1 mol·L−1 e completados para 100 mL com água Milli-Q. pH 8: 50 mL de KH2PO4 0,1 mol·L−1 foram adicionados a 46,7 mL de NaOH 0,1 mol·L−1 e completados para 100 mL com água Milli-Q. pH 9: 50 mL de bórax 0,025 mol·L−1 foram adicionados a 4,6 mL de HCl 0,1 mol·L−1 e completados para 100 mL com água Milli-Q. pH 10: 50 mL de bórax 0,025 mol·L−1 foram adicionados a 18,3 mL de NaOH 0,1 mol·L−1 e completados para 100 mL com água Milli-Q. pH 11: 50 mL de Na2HPO4 0,05 mol·L−1 foram adicionados a 4,1 mL de NaOH 0,1 mol·L−1 e completados para 100 mL com água Milli-Q. pH 12: 50 mL de Na2HPO4 0,05 mol·L−1 foram adicionados a 26,9 mL de NaOH 0,1 mol·L−1 e completados para 100 mL com água Milli-Q. pH 13: 4 mg de NaOH foram dissolvidos em 100 mL de água Milli-Q. pH 14: 4 g de NaOH foram dissolvidos em 100 mL de água Milli-Q.
As diferentes amostras foram submetidas a diferentes tempos de aquecimento (1 s a 15 min) a várias temperaturas (de 100 °C a 160 °C) utilizando um dispositivo de micro-ondas (Biotage Initiator Classic, Biotage Sweden, Uppsala, Suécia). Após resfriamento à temperatura ambiente, as soluções foram ajustadas para pH 7 usando HCl (0,1 mol·L−1), e a extração foi realizada contra isobutanol (v/v). A fase orgânica foi lavada duas vezes com água e finalmente evaporada a vácuo para produzir um pó seco. Esses extratos são denominados extrato hidrolisado (EH) e extrato de transesterificação (ET) neste estudo, ver texto.
3.4. Análises por Espectrometria de Massas (EM)
Análises preliminares de EM foram realizadas utilizando um espectrômetro de massas com dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) e um Waters QToF Premier (Waters, Manchester, Reino Unido) no modo de ionização positiva. A matriz foi composta por uma mistura de DHB (25 mg) e DMA (6 µL, 99%) em 250 µL de água Milli-Q/acetonitrila (v/v). Uma gota da matriz (1 µL) foi colocada em uma placa de aço inoxidável e seca ao ar. Uma gota da solução da amostra (1 mg de amostra dissolvida em 1 mL de água Milli-Q/acetonitrila (v/v)) (1 µL) foi depositada sobre o cristal da matriz e seca ao ar antes de introduzir a placa na fonte do espectrômetro de massas. A fonte MALDI foi composta por um laser Nd-YAG com energia máxima de 104,1 µJ, transferida para a amostra em um pulso de 2,2 ns (200 Hz). O quadrupolo foi configurado no modo somente rf para permitir a passagem dos íons entre m/z 250 e 2000. Todos os íons foram analisados por massa utilizando o analisador ToF (modo refletron, resolução em torno de 10.000) com 1 s de tempo de integração. Medidas precisas de massa (HRMS) foram realizadas usando PEG 600-1500 como padrão externo (massa de bloqueio). Para os experimentos de MALDI-EM/EM, os íons precursores foram selecionados por massa pelo quadrupolo e colididos contra argônio na célula de colisão, com a energia cinética do referencial de laboratório selecionada para produzir sinais de íons produto suficientemente intensos. Os íons fragmento foram medidos por massa com o analisador ToF (1 s de tempo de integração).
As análises de cromatografia líquida MS (LC-MS) foram realizadas com um sistema Waters Acquity UPLC H-Class (Waters, Manchester, Reino Unido) composto por um degaseificador a vácuo, uma bomba quaternária e um amostrador automático, acoplado a um espectrômetro de massas Waters Synapt G2-Si (Waters, Manchester, Reino Unido), com uma coluna não polar (Acquity UPLC BEH C18; 2,1 × 50 mm; 1,7 µm; Waters, Manchester, Reino Unido) utilizada a 40 °C. Amostras (0,1 mg) foram dissolvidas (1 mL) em uma solução de água Milli-Q/acetonitrila (85/15), e um volume de 5 µL (compartimento de amostras a 10 °C) foi injetado na coluna. O gradiente otimizado para as saponinas seguiu uma vazão de 250 µL·mL−1 de água Milli-Q (com 0,1% de ácido fórmico, eluente A) e acetonitrila (eluente B). A eluição iniciou com 85% de eluente A e 15% de eluente B, atingiu 60% de eluente A e 40% de eluente B em 6 min e foi mantida por 3 min. A proporção foi modificada para atingir 5% de eluente A e 95% de eluente B em 2 min, mantida por 1 min, retornada a 85% de eluente A e 15% de eluente B em 1 min, e finalmente mantida por 2 min, até o final da corrida cromatográfica (15 min no total). A ionização por eletrospray (ESI, modo positivo) foi utilizada para a produção de íons de saponinas com as seguintes condições: voltagem do capilar 3,1 kV, voltagem do cone 40 V; deslocamento da fonte 80 V, temperatura da fonte 100 °C, temperatura de dessolvatação 300 °C (vazão de nitrogênio seco 500 L·h−1), e faixa de massa entre m/z 50 e 2000 (quadrupolo em modo apenas RF, resolução em torno de 22.000) com 1 s de tempo de integração. Para as análises de LC-MSMS, os íons precursores foram selecionados por massa pelo quadrupolo e colididos contra argônio na célula Trap do dispositivo Tri-Wave, com a energia cinética do referencial de laboratório selecionada para produzir sinais de produto suficientemente intensos. Os íons fragmento foram medidos por massa com o analisador ToF (1 s de tempo de integração).
A quantificação de NE e EE foi obtida pela adição de uma quantidade conhecida (0,1 mg·mL−1) de Hederacosídeo C comercialmente disponível (Sigma-Aldrich, Produto n° 97151, M-ClarityTM Program MQ100), uma saponina pura extraída de Hedera helix, como padrão interno em cada extrato. As amostras fortificadas foram analisadas por LC-MS utilizando as condições experimentais descritas acima. Para cada saponina, incluindo o Hederacosídeo C, os sinais de íons de LC-MS correspondentes foram integrados usando o algoritmo de integração disponível no software MassLynxTM 4.1, incluindo todas as composições isotópicas. As contagens globais de íons foram usadas para estimar a concentração de cada saponina comparativamente à integração do sinal do Hederacosídeo C. Os %-Pesos em NE e EE (ver Tabela 1 e Tabela 2, respectivamente) corresponderam às porcentagens em massa de saponinas com uma dada composição elementar dentro do extrato (observe que as somas dos %-Peso não atingem 100%, permitindo estimar o teor de saponinas nos extratos em 91,82% e 98,89% para NE e EE, respectivamente). As frações mássicas na semente expressas em mg·g−1 foram posteriormente calculadas usando o rendimento global de extração determinado em 142 mg de extrato por g de semente moída (NE).
3.5. Medidas de Atividade Hemolítica (HA)
Para medir a HA, que reflete a atividade membranolítica, sangue bovino (armazenado com citrato de sódio 0,11 M) foi coletado imediatamente após a morte do animal no “Abattoirs de Ath” (22 Chemins des Peupliers, 7800 Ath, Bélgica) em 4 de fevereiro de 2022. O sangue bovino foi lavado usando uma solução salina tamponada com fosfato (PBS), que foi preparada dissolvendo 8 g de NaCl, 1,45 g de Na2HPO4·2H2O, 0,2 g de KCl e 0,2 g de KH2PO4 em 800 mL de água Milli-Q, ajustando o pH da solução para 7,4 e completando a solução até um volume de 1 L, usando água Milli-Q. Em um Falcon de 50 mL, 10 mL de sangue bovino citratado foram adicionados a 40 mL da solução de PBS. O Falcon foi centrifugado (15 min, 10.000× g), e o pellet foi preservado e lavado novamente com solução de PBS até que um sobrenadante claro e incolor fosse obtido. O sobrenadante final foi descartado, e 2 mL do pellet foram diluídos com 98 mL de solução de PBS, resultando em uma suspensão de eritrócitos a 2% (v/v). Várias soluções contendo extratos de saponinas em diferentes concentrações foram preparadas. Essas soluções foram colocadas na presença da suspensão de hemácias a 2% em triplicata e incubadas por 60 min a 20 °C, sob agitação contínua (500 rpm), antes de serem centrifugadas (10 min, 10.000× g). O sobrenadante de cada amostra foi coletado para medir a absorbância da solução a 540 nm. Nestes experimentos, utilizamos uma solução de 500 µg·mL−1 de saponinas extraídas das vísceras de Holothuria scabra como solução de referência, que é extremamente membranolítica. As HAs dos extratos foram calculadas usando a seguinte equação: onde Abssample, Absblank e Absref correspondem à absorbância (540 nm) das soluções testadas de eritrócitos/saponinas, da solução de eritrócitos e da solução de eritrócitos/saponina de referência, respectivamente.
- Conclusões
As escinas e isoescinas do fruto de Aesculus hippocastanum são bem conhecidas por participar da toxicidade das sementes. No presente estudo, estudamos a influência da natureza, bem como da posição dos grupos éster do aglicona na citotoxicidade das escinas. Utilizamos espectrometria de massas, aquecimento por micro-ondas e atividade hemolítica em saponinas extraídas para, respectivamente, caracterizar os extratos de saponinas, modificar quimicamente as saponinas e investigar sua citotoxicidade.
Caracterizamos completamente o extrato natural de saponinas, fornecendo, pela primeira vez, para todos os isômeros detectados, suas porcentagens em peso nas sementes (e no extrato) com uma impressionante biodisponibilidade de 13% em peso para as saponinas no pó de semente seco. Preparamos com sucesso um extrato que constituiu 99% em peso das escinas I, II e III usando cromatografia flash, com uma descrição qualitativa e quantitativa completa do conteúdo de regio- e estereoisômeros. Usando aquecimento por micro-ondas a pH 14 por 5 min, hidrolisamos com sucesso os grupos éster de glicano, resultando em uma mistura totalmente caracterizada de desacilescinas I, II e III. Também demonstramos que, sob aquecimento por micro-ondas a pH 7, a hidrólise da escina foi substituída por processos sucessivos de transesterificação correspondentes às transferências dos resíduos de ácido acético de C22 (escinas) para C28 (isoesciras) e de C28 para C16 (transesciras). Essas transesciras poderiam corresponder, pelo menos em parte, às crioesciras descritas nos anos 70. A partir do extrato de escina (99% em escinas; ~60% em escinas; ~40% em isoesciras), foi produzida uma mistura de saponinas rica em isoesciras e transesciras (97% em escinas; ~40% em escinas; ~35% em isoesciras; ~20% em transesciras).
As atividades hemolíticas (AH) desses três extratos (extrato enriquecido—EE; extrato hidrolisado—EH; extrato de transesterificação—ET) mostraram ser drasticamente impactadas pelas modificações estruturais. O EE foi medido como a mistura de saponinas mais hemolítica, enquanto a hidrólise completa dos grupos éster do aglicona mostrou anular a AH. A AH do ET sofreu uma redução de três vezes em comparação com o extrato enriquecido em escina (I-II-III), ou seja, 100% de AH foi alcançada com soluções de EE e ET contendo ~10 (escina), ~8 (isoescina) e 0 (transescina) µg·mL−1 e ~25 (escina), ~21 (isoescina) e ~11 (transescina) µg·mL−1, respectivamente. Com base na literatura, sabe-se que as escinas são mais citotóxicas do que seus isômeros isoescina. No entanto, como a concentração das escinas mais ativas aumentou drasticamente, de 10 para 25 µg·mL−1, acreditamos que efeitos competitivos entre os isômeros da escina devem ser considerados, pois, na presença de maiores proporções de isoescinas e/ou transesciras, a concentração de escinas deve ser mais que duplicada para atingir a mesma atividade hemolítica. Experimentos adicionais são obviamente esperados para confirmar essa hipótese e passarão absolutamente pela separação dos três regioisômeros. Essa tarefa promete ser particularmente delicada em vista das grandes semelhanças estruturais.
No entanto, este estudo revela claramente o impacto da natureza, presença e posição das funções éster do aglicona na atividade biológica dos isômeros da escina.
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Materiais Suplementares
As informações de suporte a seguir podem ser baixadas em: . Figura S1: Análise por LC-MSMS(+) do extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1131 [M + H]+ no tempo de retenção de 7,96 min (Escina Ia); Figura S2: Análise por LC-MSMS(+) do extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1131 [M + H]+ no tempo de retenção de 8,25 min (Escina Ib); Figura S3: Análise por LC-MSMS(+) do extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1131 [M + H]+ no tempo de retenção de 8,59 min (Isoescina Ia); Figura S4: Análise por LC-MSMS(+) do extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1131 [M + H]+ no tempo de retenção de 8,88 min (Isoescina Ib); Figura S5: Análise por LC-MSMS(+) do extrato de transesterificação (TE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1131 [M + H]+ no tempo de retenção de 6,59 min (Transescina Ia); Figura S6: Análise por LC-MSMS(+) do extrato de transesterificação (TE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1131 [M + H]+ no tempo de retenção de 6,86 min (Transescina Ib); Figura S7: Análise por LC-MSMS(+) do extrato de hidrólise (HE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1007 [M + H]+ no tempo de retenção de 5,38 min (Desacilescina I); Figura S8: Análise por LC-MSMS(+) do extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1101 [M + H]+ no tempo de retenção de 7,98 min (Escina IIa); Figura S9: Análise por LC-MSMS(+) do extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1101 [M + H]+ no tempo de retenção de 8,28 min (Escina IIb); Figura S10: Análise por LC-MSMS(+) do extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1101 [M + H]+ no tempo de retenção de 8,66 min (Isoescina IIa); Figura S11: Análise por LC-MSMS(+) do extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1101 [M + H]+ no tempo de retenção de 8,94 min (Isoescina IIb); Figura S12: Análise por LC-MSMS(+) do extrato de transesterificação (TE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1101 [M + H]+ no tempo de retenção de 6,58 min (Transescina IIa); Figura S13: Análise por LC-MSMS(+) do extrato de transesterificação (TE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1101 [M + H]+ no tempo de retenção de 6,85 min (Transescina IIb);
Figura S14: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato de Hidrólise (HE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 977 [M + H]+ no tempo de retenção de 5,36 min (Desacilescina II); Figura S15: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1115 [M + H]+ no tempo de retenção de 8,45 min (Escina IIIa); Figura S16: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1115 [M + H]+ no tempo de retenção de 8,84 min (Escina IIIb); Figura S17: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1115 [M + H]+ no tempo de retenção de 9,18 min (Isoescina IIIa); Figura S18: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1115 [M + H]+ no tempo de retenção de 9,54 min (Isoescina IIIb); Figura S19: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato de Transesterificação (TE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1115 [M + H]+ no tempo de retenção de 7,00 min (Transescina IIIa); Figura S20: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato de Transesterificação (TE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1115 [M + H]+ no tempo de retenção de 7,27 min (Transescina IIIb); Figura S21: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato de Hidrólise (HE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 991 [M + H]+ no tempo de retenção de 5,39 min (Desacilescina III); Figura S22: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato Natural (NE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1091 [M + H]+ no tempo de retenção de 6,10 min (Escina IV); Figura S23: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato Natural (NE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1091 [M + H]+ no tempo de retenção de 6,56 min (Isoescina IV); Figura S24: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato Natural (NE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1119 [M + H]+ no tempo de retenção de 7,71 min (Escina V); Figura S25: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato Natural (NE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1119 [M + H]+ no tempo de retenção de 8,20 min (Isoescina V); Figura S26: Análise por LC-MSMS(+) do Extrato Natural (NE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1133 [M + H]+ no tempo de retenção de 8,62 min (Escina VI);
Figura S27: Análise por LC-MSMS(+) do extrato natural (NE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1133 [M + H]+ em tempo de retenção de 9.47 min (Isoescin VI); Figura S28: Análise por LC-MSMS(+) do extrato natural (NE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1061 [M + H]+ em tempo de retenção de 6.12 min (Escin VII); Figura S29: Análise por LC-MSMS(+) do extrato natural (NE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1061 [M + H]+ em tempo de retenção de 6.59 min (Isoescin VII); Figura S30: Análise por LC-MSMS(+) do extrato natural (NE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1089 [M + H]+ em tempo de retenção de 7.42 min (Escin VIII); Figura S31: Análise por LC-MSMS(+) do extrato natural (NE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1089 [M + H]+ em tempo de retenção de 7.64 min (Isoescin VIII); Figura S32: Análise por LC-MSMS(+) do extrato natural (NE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1075 [M + H]+ em tempo de retenção de 6.44 min (Escin IX); Figura S33: Análise por LC-MSMS(+) do extrato natural (NE): espectro CID (15 eV) registrado para os íons precursores m/z 1075 [M + H]+ em tempo de retenção de 6.83 min (Isoescin IX).
Contribuições dos Autores
Conceituação, P.S. e P.G.; investigação, P.S., E.C. e J.A.; supervisão, P.G.; recursos, P.G.; redação—preparação do rascunho original, P.S. e P.G.; redação—revisão, P.S., E.C., J.A. e P.G. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Comitê de Ética em Pesquisa
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados apresentados neste estudo estão disponíveis mediante solicitação ao autor correspondente.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses. O financiador não teve papel no delineamento do estudo; na coleta, análise ou interpretação dos dados; na redação do manuscrito, ou na decisão de publicar os resultados.
Disponibilidade de Amostras
Amostras dos compostos estão disponíveis pelos autores mediante solicitação.
Referências
Saponinas como agentes citotóxicos: Uma revisão
A natureza anfifílica das saponinas e seus efeitos em membranas artificiais e biológicas e potenciais consequências para glóbulos vermelhos e células cancerígenas
Saponinas de medicamentos chineses como agentes anticancerígenos
Alguns derivados terpenoides e esteroides de equinodermos e esponjas
Diversidade molecular e distribuição corporal de saponinas na estrela-do-mar Asterias rubens por espectrometria de massa
Dessulfatação assistida por micro-ondas das saponinas hemolíticas extraídas das vísceras de Holothuria scabra
Estudo de saponinas em extrato metanólico das folhas de Acacia etbaica subespécie etbaica
Síntese química de saponinas
Saponinas, classificação e ocorrência no reino vegetal
Preservação das saponinas bioativas de Holothuria scabra através do processamento de trepang
Saponinas de Glycine Max Merrill (Soja)
Perspectiva biológica e taxonômica dos glicosídeos triterpenoides de pepinos-do-mar da família Holothuriidae (echinodermata, holothuroidea)
Caracterização química das saponinas contidas na parede corporal e nos túbulos cuvierianos do pepino-do-mar Holothuria (Platyperona) sanctori (Delle Chiaje, 1823)
Quimioatração do peixe-pérola Encheliophis vermicularis pelo pepino-do-mar Holothuria leucospilota
Quando um repelente se torna um atrativo: Saponinas nocivas são cairomônios que atraem o caranguejo arlequim simbionte
Saponina: Propriedades, métodos de avaliação e aplicações
Metabólitos secundários
Citotoxicidade, Toxicidade Hemolítica e Mecanismo de Ação da Saponina D de Pulsatilla e Seus Derivados Sintéticos
Avaliação dos efeitos antibacterianos, antifúngicos e citotóxicos de Holothuria scabra da costa norte do golfo pérsico
Avaliação da atividade antifúngica do creme dental de aloe vera contra Candida albicans
Mecanismo da atividade antiviral das saponinas triterpenoides
saponinas esteroidais antiprotozoárias da esponja marinha Pandaros acanthifolium
Investigação mecanística das interações entre a saponina esteroidal digitonina e modelos de membrana celular
Indução de estruturas altamente curvadas em relação à permeabilização e brotamento da membrana pelas saponinas triterpenoides, α- e δ-hederina
Formação de domínios e permeabilização induzidos pela saponina α-hederina e sua aglicona hederagenina em uma bicamada contendo colesterol
A influência das saponinas no colesterol da membrana celular
Relações estrutura-atividade de alguns diglicosídeos de hederagenina: Hemólise, citotoxicidade e indução de apoptose
Impacto da hidrólise e metanólise de saponinas bidesmosídicas de Chenopodium quinoa na sua atividade hemolítica
Síntese, modificação e atividade biológica de diosgenil β-d-glicosaminosídeos: Uma visão geral
Efeitos da N-acilação na adjuvanticidade imune de análogos do derivado de saponinas de quillaja GPI-0100
Novos glicosídeos triterpênicos sintéticos derivados de oxima como potentes adjuvantes vacinais de saponina
Determinação de quatro saponinas principais na casca e endosperma de sementes de castanha-da-índia (Aesculus hippocastanum L.) usando cromatografia líquida de alta eficiência com confirmação positiva por cromatografia em camada delgada
Envenenamento devido ao consumo de semente de castanha-da-índia
Terapia parenteral com venostasin
Escins-Ia, Ib, IIa, IIb e IIIa, oligoglicosídeos triterpênicos bioativos das sementes de Aesculus hippocastanum L.: Seus efeitos inibidores na absorção de etanol e atividade hipoglicêmica no teste de tolerância à glicose
Efeitos das Escins Ia, Ib, IIa e IIb da castanha-da-índia, sementes de Aesculus hippocastanum L., na inflamação aguda em animais
Saponinas e glicosídeos bioativos. III. Castanha-da-índia. (1): As estruturas, efeitos inibidores na absorção de etanol e atividade hipoglicêmica das Escins Ia, Ib, IIa, IIb e IIIa das sementes de Aesculus hippocastanum L.
Propriedades anti-inflamatórias e anticancerígenas da β-Escina, uma saponina triterpênica
Discriminação de saponinas regioisoméricas e estereoisoméricas de sementes de Aesculus hippocastanum por espectrometria de massa com mobilidade iônica
Die acylaglyka des kryptoäscins und a-Ascins
Aescina: Farmacologia, farmacocinética e perfil terapêutico
Novo método de CLAE para controle de qualidade da β-Escina em extrato hidroalcoólico de Aesculus hippocastanum L.
Farmacocinética e biodisponibilidade comparativas da Escina Ia e Isoescina Ia após administração de Escina e de Escina Ia e Isoescina Ia puras em ratos
CLAE preparativa para purificação de quatro saponinas bioativas isoméricas das sementes de Aesculus Chinensis
Análise de saponinas por espectrometria de massa
Composição fito-nutricional e mineral de sementes de castanha-da-índia indiana (Aesculus indica)
Castanha-da-índia indiana (Aesculus indica): Uma fruta silvestre
Hidrólise ácida de extratos ricos em saponinas de quinoa, lentilha, feno-grego e soja para obter extratos ricos em sapogeninas e outros compostos bioativos
Síntese de ésteres, ésteres ativados e lactonas
Über Triterpene XXIII—Über struktur und chemie der priverogenine
Atividades hemolíticas de glicosídeos triterpênicos da ordem de holotúrias dendrochirotida: Algumas tendências na evolução deste grupo de toxinas
Melhoria eficiente da atividade superficial da saponina de chá através de modificação tipo gemini por esterificação direta
Estrutura e relações de atividade hemolítica de saponinas e sapogeninas triterpênicas
Relações estrutura-atividade de saponinas hemolíticas
Relações estrutura-atividade da saponina α-hederina
Reações de esquiva de um molusco Buccinum undatum a substâncias surfactantes semelhantes a saponinas em extratos das estrelas-do-mar Asterias rubens e Marthasterias glacialis
Aumento da atividade membranolítica de saponinas de Chenopodium quinoa por hidrólise rápida em micro-ondas
Propriedades elétricas da membrana de eritrócitos e investigação imuno-hematológica
Interações de saponinas com sistemas de membrana modelo—estudos de monocamadas de Langmuir, hemólise e formação de ISCOMs
A matriz lipídica da membrana é um alvo chave para a ação de saponinas vegetais farmacologicamente ativas?
Como diferentes esteróis contribuem para membranas plasmáticas tolerantes a saponinas em pepinos-do-mar
Uma revisão de métodos químicos para a sulfatação e dessulfatação seletivas de polissacarídeos
Teores de saponinas qualitativos e quantitativos em cinco pepinos-do-mar do oceano Índico
Estrutura geral das escinas extraídas do fruto de Aesculus hippocastanum. Tig, Ang, iBu, mBu, Ac, Glc, Xil, Gal e GlcA representam, respectivamente, tigloíla, angloíla, isobutirila, 2-metilbutirila, acetila, glicose, xilose, galactose e ácido glucurônico.
Espectros de massa MALDI (modo de ionização positiva) de três diferentes extratos de saponinas: (a) Extrato natural (NE); (b) Extrato enriquecido em Escinas I, II e III (EE) obtido por cromatografia flash (coluna apolar–gradiente de acetonitrila); (c) Extrato de reação de hidrólise alcalina assistida por micro-ondas (pH 14–150 °C–5 min) (HE). As estruturas moleculares são esquematizadas destacando as funções alvo: nas saponinas EE, os ésteres estão localizados em C21 (Tig ou Ang) e C22 ou C28 (Ac); nas saponinas HE, os produtos de hidrólise possuem grupos álcool em C21, C22 e C28.
Análise por espectrometria de massa LC dos derivados de escina I presentes nos três diferentes extratos de saponinas: (a) O extrato natural (NE), m/z 1153 EIC (Cromatograma de Íon Extraído); (b) O extrato de reação de transesterificação assistida por micro-ondas (pH 7–120 °C–5 min) (TE), m/z 1153 EIC; (c) O extrato de reação de hidrólise alcalina assistida por micro-ondas (pH 14–150 °C–5 min) (HE), m/z 1029 EIC.
Proposta mecanística para as reações de hidrólise sucessivas sofridas pelas escinas I, II e III extraídas das sementes de castanha-da-índia. A hidrólise corresponde a perdas consecutivas de ácido acético e ácido angélico (tiglóico) seguindo mecanismos de adição/eliminação. Note que, nas condições de hidrólise utilizadas, não foi possível definir a sequência de hidrólise, se houver, uma vez que não foram detectados produtos de hidrólise de um único éster (perdas de ácido acético ou ácido angélico (tiglóico)).
Proposta mecanística para as sucessivas reações de transesterificação sofridas pelas escinas I, II e III extraídas da semente de castanha-da-índia: a primeira etapa consiste no deslocamento do grupo acetil do carbono C22 para o carbono C28 (escina para isoescina), e a segunda etapa envolve a migração do grupo acetil do carbono C28 para o C16 (isoescina para transescina).
Atividade hemolítica dos quatro extratos de saponinas: extrato enriquecido (EE—linha preta), extrato de hidrolisação (HE) e extrato de transesterificação (TE). Os experimentos foram realizados utilizando uma suspensão de 2% de eritrócitos de sangue bovino, em triplicata. As HAs são expressas como a % da atividade de referência, uma 500 µg·mL−1 de saponinas de vísceras de Holothuria scabra.
Extrato de semente de Aesculus hippocastanum: dados coletados por experimentos baseados em MS. As composições e medições de erro de massa (Δ) foram determinadas por MALDI-HRMS. As %-Pesos nos extratos e frações de massa (mg·g−1 de pó de semente de Aesculus hippocastanum) de cada composição de saponina foram determinadas com base nas proporções de intensidade do sinal iônico por LC, usando Hederacosídeo C como padrão interno, e usando o rendimento de extração gravimétrico (142 mg·g−1). As proporções molares de saponina (%) foram determinadas com base na integração relativa do sinal iônico por LC. Consulte Materiais e Métodos para detalhes de todas as análises quantitativas.
Saponinas Composições Elementares (M) m/z (Δ ppm) [M + Na]+ R1 R2 R3 R4 R5 R6 % em Peso no Extrato (%) Frações de Massa na Semente (mg·g−1) Tempo de Retenção (min) Proporções Molares (%) Escin Ia C55H86O24 1153.5427(1.7) Tig Ac H H OH Glc 55.85 ± 0.03 79.46 7.96 21.72 ± 0.09 Escin Ib Ang Ac H H OH Glc 8.25 18.40 ± 0.08 Isoescin Ia Tig H Ac H OH Glc 8.59 10.77 ± 0.08 Isoescin Ib Ang H Ac H OH Glc 8.88 9.32 ± 0.14 Escin IIa C54H84O23 1123.5342(3.6) Tig Ac H H OH Xyl 4.18 ± 0.11 5.95 7.98 1.48 ± 0.09 Escin IIb Ang Ac H H OH Xyl 8.28 1.26 ± 0.07 Isoescin IIa Tig H Ac H OH Xyl 8.66 0.93 ± 0.12 Isoescin IIb Ang H Ac H OH Xyl 8.94 0.99 ± 0.09 Escin IIIa C55H86O23 1137.5453(0.4) Tig Ac H H H Gal 4.74 ± 0.08 6.75 8.45 1.96 ± 0.08 Escin IIIb Ang Ac H H H Gal 8.84 1.66 ± 0.06 Isoescin IIIa Tig H Ac H H Gal 9.18 0.82 ± 0.03 Isoescin IIIb Ang H Ac H H Gal 9.54 0.75 ± 0.04 Escin IV C52H82O24 1113.5134(3.6) Ac Ac H H OH Glc 15.22 ± 0.16 21.66 6.10 9.16 ± 0.26 Isoescin IV Ac H Ac H OH Glc 6.56 7.84 ± 0.17 Escin V C54H86O24 1141.5435(2.6) iBu Ac H H OH Glc 7.27 ± 0.21 10.34 7.71 6.81 ± 0.15 Isoescin V iBu H Ac H OH Glc 8.20 1.11 ± 0.24 Escin VI C55H88O24 1155.5537(2.3) mBu Ac H H OH Glc 2.47 ± 0.17 3.52 8.62 2.18 ± 0.01 Isoescin VI mBu H Ac H OH Glc 9.47 0.48 ± 0.05 Escin VII C51H80O23 1083.5001(1.2) Ac Ac H H OH Xyl 0.56 ± 0.10 0.79 6.12 0.31 ± 0.09 Isoescin VII Ac H Ac H OH Xyl 6.59 0.33 ± 0.06 Escin VIII C53H84O23 1111.5316(1.3) iBu Ac H H OH Xyl 0.78 ± 0.13 1.11 7.42 0.54 ± 0.03 Isoescin VIII iBu H Ac H OH Xyl 7.64 0.33 ± 0.04 Escin IX C52H82O23 1097.5182(3.4) Ac Ac H H H Glc 0.75 ± 0.17 1.07 6.44 0.46 ± 0.05 Isoescin IX Ac H Ac H H Glc 6.83 0.39 ± 0.07
Separação por cromatografia flash (coluna não polar–solvente acetonitrila) do extrato de saponinas da semente de Aesculus hippocastanum resultou no extrato enriquecido em escinas I, II e III: as composições elementares dos íons foram determinadas por MALDI-HRMS, a proporção molar (%) de cada composição de escina, o % em Peso no EE (%), o tempo de retenção (min), e a proporção molar (%) dos isômeros foram estimadas com base na integração dos sinais obtidos por LC-MS, e usando Hederacoside C como padrão interno.
Composições Elementares (M) m/z (Δ ppm) [M + Na]+ Isômero Tempo de Retenção (min) Proporção Molar (%) %-Pesos no Extrato (%) Proporções Molares dos Isômeros (%) Escina IC55H86O24 1153,5427(1,7) Escina Ia 7,96 85,20 ± 0,09 27,21 ± 0,05 32,06 ± 0,04 Escina Ib 8,25 21,99 ± 0,09 25,92 ± 0,07 Isoescina Ia 8,59 19,61 ± 0,07 23,13 ± 0,06 Isoescina Ib 8,88 15,99 ± 0,11 18,89 ± 0,09 Escina IIC54H84O23 1123,5342(3,6) Escina IIa 7,98 7,53 ± 0,12 2,75 ± 0,09 37,89 ± 0,08 Escina IIb 8,28 2,48 ± 0,06 34,26 ± 0,04 Isoescina IIa 8,66 1,18 ± 0,07 16,94 ± 0,05 Isoescina IIb 8,94 0,82 ± 0,04 10,91 ± 0,03 Escina IIIC55H86O23 1137,5453(0,4) Escina IIIa 8,45 7,26 ± 0,09 2,69 ± 0,06 38,43 ± 0,05 Escina IIIb 8,84 2,36 ± 0,09 33,92 ± 0,04 Isoescina IIIa 9,18 1,15 ± 0,05 17,20 ± 0,03 Isoescina IIIb 9,54 0,66 ± 0,02 10,45 ± 0,02
Hidrólise alcalina assistida por micro-ondas (pH 14–150 °C–5 min) do extrato enriquecido com escinas I, II e III de sementes de Aesculus hippocastanum: as composições elementares dos íons foram determinadas por MALDI-HRMS, e as proporções molares (%) e tempos de retenção (min) foram obtidos por LC-MS.
Composições Elementares (M) m/z (Δ ppm)[M + Na]+ R1 R2 R3 R4 R5 R6 Tempo de Retenção (min) Proporção Molar(%) Desacilescina IC48H78O22 1029,4876(0,7) H H H H OH Glc 5,38 83,71 ± 0,48 Desacilescina IIC47H76O21 999,4745(3,2) H H H H OH Xyl 5,36 8,15 ± 0,06 Desacilescina IIIC48H78O21 1013,4953(2,0) H H H H H Gal 5,39 8,14 ± 0,51
Transesterificação alcalina assistida por micro-ondas (pH 7–120 °C–5 min) do extrato enriquecido de sementes de Aesculus hippocastanum: as composições elementares dos íons foram determinadas por MALDI-HRMS, e a proporção molar (%) foi obtida com base na integração do sinal de LC-MS.
Saponins Elemental Compositions (M) m/z (Δ ppm) [M + Na]+ R1 R2 R3 R4 R5 R6 Retention Time (min) Composition Molar Proportions (%) %-Weights in Extract (%) Isomer Molar Proportions (%) Escin Ia C55H86O24 1153.5427(1.7) Tig Ac H H OH Glc 7.96 84.44 ± 0.18 19.91 ± 0.09 23.93 ± 0.17 Escin Ib Ang Ac H H OH Glc 8.25 15.80 ± 0.10 18.99 ± 0.23 Isoescin Ia Tig H Ac H OH Glc 8.59 16.53 ± 0.08 19.89 ± 0.15 Isoescin Ib Ang H Ac H OH Glc 8.88 14.63 ± 0.06 17.59 ± 0.21 Transescin Ia Tig H H Ac OH Glc 6.59 9.22 ± 0.03 11.08 ± 0.13 Transescin Ib Ang H H Ac OH Glc 6.86 7.10 ± 0.09 8.53 ± 0.21 Escin IIa C54H84O23 1123.5342(3.6) Tig Ac H H OH Xyl 7.98 8.72 ± 0.23 1.68 ± 0.08 21.28 ± 0.26 Escin IIb Ang Ac H H OH Xyl 8.28 1.48 ± 0.07 18.72 ± 0.50 Isoescin IIa Tig H Ac H OH Xyl 8.66 1.58 ± 0.08 19.98 ± 0.45 Isoescin IIb Ang H Ac H OH Xyl 8.94 1.57 ± 0.07 19.83 ± 0.68 Transescin IIa Tig H H Ac OH Xyl 6.58 1.01 ± 0.01 12.84 ± 0.24 Transescin IIb Ang H H Ac OH Xyl 6.85 0.69 ± 0.06 8.79 ± 0.27 Escin IIa C55H86O23 1137.5453(0.4) Tig Ac H H H Gal 8.45 6.84 ± 0.42 1.38 ± 0.08 22.53 ± 0.26 Escin IIb Ang Ac H H H Gal 8.84 1.13 ± 0.03 18.43 ± 0.73 Isoescin IIa Tig H Ac H H Gal 9.18 1.21 ± 0.07 19.69 ± 0.69 Isoescin IIb Ang H Ac H H Gal 9.54 1.10 ± 0.08 17.91 ± 0.20 Transescin IIa Tig H H Ac H Gal 7.00 0.72 ± 0.02 11.73 ± 0.28 Transescin IIb Ang H H Ac H Gal 7.27 0.60 ± 0.03 9.71 ± 0.37