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pmid: "37833361"
title: "Caracterização do genoma do castanheiro-da-índia revela a evolução da biossíntese de escina e esculina."
authors: "Sun W, Yin Q, Wan H, Gao R, Xiong C, Xie C, Meng X, Mi Y, Wang X, Wang C, Chen W, Xie Z, Xue Z, Yao H, Sun P, Xie X, Hu Z, Nelson DR, Xu Z, Sun X, Chen S"
journal: "Nature communications"
pubdate: "2023 Oct 13"
doi: "10.1038/s41467-023-42253-y"
source: "PMC Full Text"

Caracterização do genoma do castanheiro-da-índia revela a evolução da biossíntese de escina e esculina.

Autores

Sun W, Yin Q, Wan H, Gao R, Xiong C, Xie C, Meng X, Mi Y, Wang X, Wang C, Chen W, Xie Z, Xue Z, Yao H, Sun P, Xie X, Hu Z, Nelson DR, Xu Z, Sun X, Chen S

Periodico

Nature communications (2023 Oct 13)

Conteudo

Caracterização do genoma do castanheiro-da-índia revela a evolução da biossíntese de aescina e aesculina
O castanheiro-da-índia (Aesculus chinensis) é uma árvore medicinal importante que contém diversos compostos bioativos, como aescina, saponinas triterpenoides do tipo barrigenol (BAT) e aesculina, uma cumarina glicosilada. Neste artigo, relatamos uma montagem do genoma de 470,02 Mb e caracterizamos um evento de duplicação do genoma inteiro específico de Aesculus, que leva à formação e duplicação de dois agrupamentos gênicos relacionados à biossíntese de triterpenoides (BGCs). Também mostramos que os genes AcOCS6, AcCYP716A278, AcCYP716A275 e AcCSL1 dentro desses dois BGCs, juntamente com o AcBAHD6 expresso especificamente na semente, são responsáveis pela formação de aescina. Além disso, identificamos sete genes biossintéticos de glicosídeos de cumarina originários de Aesculus e alcançamos a síntese de novo de aesculina em E. coli. A análise de colinearidade mostra que os segmentos colineares dos BGCs podem ser rastreados até angiospermas de divergência inicial, e os genes essenciais que codificam enzimas necessárias para a biossíntese de BAT são recrutados antes da separação de Aesculus, Acer e Xanthoceras. Essas descobertas fornecem insights sobre a evolução de agrupamentos gênicos associados a metabólitos de árvores medicinais.
O castanheiro-da-índia (Aesculus chinensis) é uma espécie arbórea que pode produzir compostos medicinais como aescina e aesculina. Aqui, os autores montam seu genoma, identificam genes-chave envolvidos na biossíntese desses dois grupos de compostos e alcançam a síntese de novo de aesculina em E. coli.
Introdução
As plantas sintetizam uma grande variedade de compostos medicinais estruturalmente diversos, como noscapina, casbenos, avenacinas, cucurbitacinas e taxadieno, que são exclusivos de linhagens ou espécies específicas. Curiosamente, a biossíntese de numerosos compostos resulta de um agrupamento gênico relacionado à biossíntese (BGC), caracterizado por genes fisicamente colocalizados envolvidos em uma via metabólica comum. Com o crescente corpo de informações de sequências genômicas disponíveis, múltiplas investigações foram concluídas para esclarecer a organização colinear dos BGCs dentro e entre espécies. Exemplos incluem os triterpenos tianóis em Arabidopsis thaliana e seus parentes próximos, alcaloides benzilisoquinolínicos em Papaver, glicoalcaloides esteroidais em Solanaceae, cucurbitacinas triterpênicas em Cucurbitaceae e momilactonas diterpenoides em gramíneas. Evidências de plantas herbáceas mostraram que eventos genéticos complexos, como duplicação do genoma inteiro (WGD), duplicação em tandem, realocação gênica, inversão cromossômica e transferência lateral de genes, impactam a montagem, manutenção e diversificação de genes que são fisicamente agrupados e não homólogos, mas funcionalmente coordenados durante o processo evolutivo. Em contraste, exemplos que demonstram mecanismos genômicos que levam à produção exclusiva de produtos farmacêuticos em árvores são limitados e incluem casca-de-sabão, teixo e árvore-da-felicidade.
Aesculus L., da família Sapindaceae, é nativo do hemisfério norte temperado. Esta planta acumula saponinas triterpenoides medicinais (escina Ia e escina Ib, coletivamente referidas como aescin) e o composto cumarínico aesculina, todos com propriedades medicinais. A escina Ia pertence às saponinas triterpenoides do tipo barrigenol (BAT), derivadas de um esqueleto de oleanano (β-amirina); este esqueleto sofre ainda oxigenação região-específica em C-16, C-21, C-22, C-24 e C-28 para se tornar protoaescigenina, a principal aglicona da aescin. A protoaescigenina é ainda modificada pela adição de uma porção glucuronila na posição C-3, bem como diglicosídeo e 2-metilcrotonilação na posição C-21 e acetilação na posição C-22 para formar a escina Ia. Preparações de aescin foram administradas por via oral, intravenosa (aescina de sódio contendo escina Ia e escina Ib) e tópica em ensaios clínicos para tratar insuficiência venosa crônica, edema e hemorroidas. A aesculina, que é 6,7-diidroxicumarina 6-O-glicosídeo, juntamente com a digitoxina, tem sido usada como uma solução popular para colírio para aliviar sintomas como astenopia, dor ocular e diplopia. Atualmente, a biossíntese de aescin e aesculina em castanheiras-da-índia, bem como o surgimento da via biossintética BAT nesta linhagem, permanecem não investigados.
Neste trabalho, para determinar a via de biossíntese desses compostos, montamos um genoma em escala cromossômica de A. chinensis. Revelamos uma duplicação genômica antiga que ocorreu há aproximadamente 30,8 milhões de anos (MYA) em Aesculus, que pode ter contribuído para a formação de BGCs relacionados a triterpenoides BAT. Além disso, realizamos a verificação funcional das enzimas-chave envolvidas na biossíntese da escina Ia, como AcOCS6, AcCYP716A278, AcCYP716A275, AcCSL1 e AcBAHD6, bem como das enzimas cruciais para a biossíntese da aesculina, a saber, Ac4CL1-3, AcF6’H1-2, AcUGT84A56 e AcUGT92G7. Adicionalmente, utilizamos uma abordagem baseada em genômica comparativa para esclarecer a organização e evolução dos BCGs BAT em angiospermas.
Resultados e discussão
Perfil de metabólitos de A. chinensis em diferentes tecidos e estruturas de cápsulas
Perfil de compostos relacionados à aescin e aesculina em diferentes órgãos de A. chinensis durante o desenvolvimento.
A Fenótipos de folha (F), flor (Fl), ramo (R), pericarpo (P) e semente (S). B A análise de LC–MS mostra a quantificação absoluta de protoaescigenina (1), escina Ia (2), escina Ib (3), esculetina (4) e aesculina (5) em folha, ramo, flor, pericarpo e semente de A. chinensis. Os dados são apresentados como valores médios ± d.p. (n = 3 amostras biologicamente independentes). Letras diferentes representam diferenças significativas (P < 0,05) entre as médias de acordo com a análise de variância (ANOVA) combinada com o teste de Duncan de múltiplas faixas. C Imagem de MALDI-MSI e micrografia ideal do corte transversal da cápsula, incluindo cotilédone, testa e pericarpo. A imagem iônica de 2 ou 3 (m/z 1169,5152) no cotilédone de A. chinensis é apresentada. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.

Para rastrear eficientemente genes candidatos que codificam enzimas envolvidas nas vias da aescin e aesculina, realizamos LC–QQQ–MS e exploramos os perfis metabólicos de protoaescigenina (1), escina Ia (2), escina Ib (3), esculetina (4) e aesculina (5) em ramos, flores, folhas, pericarpos e sementes (Fig. 1A). Os conteúdos de 5 foram significativamente maiores em folhas e flores do que em pericarpos e sementes (p < 0,05), e os conteúdos de 2 e 3 foram os mais altos nas sementes (p < 0,05) (Fig. 1B, Tabelas Suplementares 1 e 2). Em paralelo, foi realizada a imagem por espectrometria de massa com ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI)-MSI para determinar a distribuição espacial dos metabólitos candidatos nas cápsulas. Os resultados analíticos mostraram que 2 e seu isômero 3 (m/z 1169,5152 [C55H86O24 + K]+) acumularam-se massivamente nos cotilédones próximos às testas (Fig. 1C, Tabela Suplementar 3).

Montagem do genoma e anotação de genes de A. chinensis.
Análise evolutiva do genoma de A. chinensis.
A Montagem em nível cromossômico do genoma de A. chinensis. a Elementos transponíveis; b densidade gênica; c nível de expressão gênica entre semente e outros tecidos; d conteúdo de GC; e e blocos de sintenia de sequências parálogas do genoma de A. chinensis. B É mostrada uma árvore filogenética inferida a partir de ortólogos de famílias de genes únicos entre táxons de plantas selecionados. O intervalo de confiança de 95% para a maior densidade posterior é mostrado nos nós internos. Os círculos vermelhos no ramo de Aesculus destacam um evento de WGD específico de Aesculus (Aα). C Macrossintenia entre regiões genômicas de A. chinensis, C. clementina e X. sorbifolium. Os padrões de macrossintenia entre A. chinensis e C. clementina ou X. sorbifolium mostram que cada região de C. clementina ou X. sorbifolium alinha-se com duas regiões sintênicas em A. chinensis. D Comparação de cromossomos entre A. chinensis, X. sorbifolium e C. clementina. E As distribuições de substituições sinônimas por sítio sinônimo (KS) de genes ortólogos e parálogos entre A. chinensis, C. clementina e X. sorbifolium. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
O tamanho do genoma de A. chinensis foi previsto como 481,90 Mb usando citometria de fluxo (Figura Suplementar 1). Uma análise de genoma de A. chinensis baseada em frequências de 17 k-mers de leituras curtas Illumina mostrou que o genoma de A. chinensis tem 504,28 Mb, com um pequeno pico heterozigoto e um pico repetitivo óbvio, sugerindo que o genoma possui baixo nível de heterozigosidade (~0,37%) (Figura Suplementar 2). Além disso, o sequenciamento de leituras longas usando Oxford Nanopore Technologies (ONT) obteve 34 Gb de dados com ~68× de cobertura e um comprimento N50 de 11,74 kb (Tabela Suplementar 4). Após correção de erros, poda e montagem, as leituras ONT filtradas foram montadas em 656 contigs com um tamanho total de 470,02 Mb e um comprimento N50 de 2,05 Mb, cobrindo 97,50% do tamanho estimado do genoma nuclear (Tabela Suplementar 5). Os contigs montados continham muitos erros de sequenciamento devido à baixa precisão do sequenciamento ONT. Consequentemente, essa montagem em nível de contigs foi polida mais três vezes usando leituras curtas Illumina, e 97,4% (1573 de 1614) dos ortólogos de cópia única de plantas foram identificados usando a estimativa de Benchmarking de Ortólogos Universais de Cópia Única (BUSCOs), indicando um alto grau de completude no genoma polido de A. chinensis (Tabela Suplementar 6). Além disso, o sequenciamento de captura de conformação cromossômica Hi-C gerou 344.838.272 leituras pareadas brutas, das quais 58,05% (189.382.086) foram mapeadas na montagem de contigs como leituras pareadas únicas. Entre essas leituras únicas, 174.576.440 foram capturadas para guiar a montagem dos pseudocromossomos. Um total de 461,08 Mb (98,09%) do genoma montado foi ancorado em 20 pseudocromossomos (2n = 40) (Figura 2A, Figura Suplementar 3). A Tabela Suplementar 5 lista as características detalhadas do genoma de A. chinensis.
Aproximadamente 59,14% (276.695.955 pb) dos DNAs repetitivos no genoma de A. chinensis (Tabela Suplementar 5) foram anotados de acordo com o conteúdo de elementos transponíveis (TEs) de genomas relatados de Sapindaceae, a saber, Xanthoceras sorbifolium (56,39%) e Dimocarpus longan (52,87%). Destes elementos repetitivos, 24,37% (114.021.841 pb) dos TEs eram retrotransposons de repetição terminal longa (LTR), dos quais 98,1% pertenciam à superfamília Gypsy (32,7%) e à superfamília Copia (65,4%) (Tabela Suplementar 7). Além disso, 36.557 genes codificadores de proteínas foram identificados por meio da integração de predições gênicas ab initio, buscas por proteínas homólogas e os transcritos montados de novo a partir de leituras de RNA-seq. Adicionalmente, 35.790 (97,9%) genes puderam ser localizados nos 20 pseudocromossomos. Os ortólogos identificados cobriram 95,4% dos BUSCOs de Embryophyta, indicando que o genoma anotado é amplamente completo (Tabela Suplementar 8). Identificamos ainda grupos ortólogos de proteomas de A. chinensis e outras 13 espécies de Rosídeas, incluindo A. thaliana, Brassica rapa, Citrus clementina, Cucumis sativus, D. longan, Glycine max, Gossypium raimondii, Malus domestica, Populus trichocarpa, X. sorbifolium, Theobroma cacao e Vitis vinifera, e obtivemos um total de 21.299 grupos ortólogos abrangendo 497.631 genes. Em seguida, comparamos os genomas de espécies vegetais candidatas para obter famílias gênicas significativamente expandidas em A. chinensis ou exclusivas de A. chinensis (Figura Suplementar 4). A predição funcional mostrou que as famílias gênicas expandidas estão especialmente enriquecidas nas vias KEGG de metabólitos secundários, como biossíntese de terpenoides (KO00900: biossíntese do esqueleto de terpenoides, KO00909: biossíntese de sesquiterpenoides e triterpenoides) e biossíntese de fenilpropanoides (KO00940) (Figura Suplementar 5).

Análise de datação filogenômica e duplicação do genoma completo
Um total de 139 genes de cópia única de 13 espécies de Rosídeas foram selecionados para construir uma árvore filogenética de alta confiança. As árvores filogenéticas a partir de sequências de nucleotídeos e proteínas concatenadas de genes de cópia única apoiaram que A. chinensis está intimamente relacionada a outras espécies de Sapindaceae sequenciadas, X. sorbifolium e D. longan (Fig. 2B). Nessas análises, A. chinensis foi considerada uma linhagem irmã de X. sorbifolium, e ambas as espécies formaram ainda um grupo irmão de D. longan. A datação molecular das linhagens testadas usando as sequências de nucleotídeos de genes de cópia única e calibrações de idade fóssil revelou que a divergência das famílias Sapindaceae e Rutaceae de Sapindales ocorreu há aproximadamente 36,3 milhões de anos (MAA) com um intervalo de confiança (IC) de 95% variando de 21,8 MAA a 50,4 MAA. A separação entre A. chinensis e X. sorbifolium ocorreu há ~32,5 MAA com um IC de 95% de 17,5 MAA a 45,4 MAA (Fig. 2B).
Análise colinear intragenômica identificou pelo menos um evento de duplicação completa do genoma (WGD) no genoma de A. chinensis (Fig. 2C). Análises de colinearidade entre A. chinensis e X. sorbifolium e entre A. chinensis e C. clementina mostraram que dois segmentos parálogos em A. chinensis corresponderam a uma região ortóloga em X. sorbifolium e C. clementina (Fig. 2D, Fig. Suplementar 6). Esses resultados apoiaram que um evento WGD específico da espécie pode ter ocorrido em A. chinensis após sua divergência do ancestral comum de A. chinensis e X. sorbifolium. Além disso, as distribuições de substituições sinônimas por sítio sinônimo (KS) para genes parálogos e pares âncora em regiões colineares de A. chinensis mostraram um pico claro em aproximadamente 0,24 e um pico menor em ~1,75, sugerindo que o genoma de A. chinensis pode ter experimentado dois eventos WGD (Fig. 2E, Fig. Suplementar 7). Estudos anteriores sugeriram que nenhum evento WGD ocorreu em C. clementina, X. sorbifolium e D. longan após o evento ancestral de triplicação gama (γ-WGT). Nossa análise confirmou que apenas um pico de KS foi detectado em C. clementina e X. sorbifolium, em aproximadamente 1,5 e 1,75, respectivamente. Este pico ancestral de KS, compartilhado pelos genomas de A. chinensis, C. clementina e X. sorbifolium, representa o evento γ-WGT. A distribuição de KS de ortólogos entre A. chinensis e X. sorbifolium mostrou um pico de KS em ~0,25, ligeiramente maior que o valor de KS dos parálogos em A. chinensis. Este resultado sugere novamente que o evento recente de WGD em A. chinensis ocorreu após a divergência entre A. chinensis e X. sorbifolium. Usando o tempo de divergência e o valor médio de KS dos ortólogos entre A. chinensis e X. sorbifolium, entre A. chinensis e C. clementina e entre A. chinensis e V. vinifera, estimamos que o evento WGD específico da espécie em A. chinensis (Aα) ocorreu há ~30,8 ± 1,33 milhões de anos (Fig. 2B). Além disso, identificamos 3358 genes que retiveram duplicatas do evento Aα recente em A. chinensis. As análises de anotação funcional e enriquecimento GO mostraram que as duplicatas retidas podem estar relacionadas às respostas de A. chinensis a vários estímulos (por exemplo, estímulo biótico, químico ácido e estresse) e à regulação dessas respostas (Dados Suplementares 1).
A origem de linhagens taxonômicas grandes e diversas pode estar relacionada a eventos ancestrais de poliploidia. WGD é a principal força evolutiva para a produção de diversidade fenotípica, especiação e domesticação. Exemplos de diversidade fenotípica e metabólica derivada de WGD que contribuem para a expansão gênica específica da espécie incluem a biossíntese de óleo na domesticação da oliveira selvagem, a síntese de triterpeno ursano na domesticação da nêspera (Eriobotrya japonica), a produção de camptotecina na domesticação da árvore feliz (Camptotheca acuminata) e o conteúdo de triptolida na domesticação da videira do trovão (Tripterygium wilfordii). Para investigar o impacto do evento WGD específico de A. chinensis na biossíntese de aescina, calculamos sistematicamente Ks para cada par de genes duplicados parálogos, enfatizando os genes da via upstream envolvidos na biossíntese de terpenos (isto é, AACT, HMGS, HMGR, MVA, MVK, PMK, MVD, IDI, DXS, DXR, MCT, CMK, MDS, HDS, HDR, FPS, SQS e SQE) (Tabela Suplementar 9). Descobrimos que o WGD Aα levou apenas à retenção de duplicatas na via dos terpenos, sugerindo que o fluxo metabólico pode ter mudado em direção ao metabolismo de triterpenoides, resultando na produção de aescina.
Análises de BGC e rede de coexpressão gênica ponderada (WGCNA) para descobrir a via da escina Ia (2)
Mineração e identificação da via da escina Ia em A. chinensis.
A A colinearidade de dois BGCs BAT. AcCluster I e AcCluster II apresentam fortes sinais sintênicos, e a colinearidade desses dois blocos originou-se do evento WGD Aα específico de Aesculus. A espessura das linhas sintênicas representa a identidade dos genes sintênicos. As setas cinzas significam os genes não sintênicos. Os genes biossintéticos, incluindo membros OSC, CSL, CYP716A, CYP716BX e BAHD, são marcados em cores diferentes. B A expressão de genes sintênicos e AcBAHD6 relacionados à biossíntese de triterpenoides em diferentes tecidos de A. chinensis, incluindo semente, ramo, folha, pericarpo e flor. C A via biossintética proposta da escina Ia e as enzimas candidatas para cada etapa. As setas sólidas representam as transformações verificadas neste estudo, e as setas pontilhadas representam as reações propostas. D–F Sobreposição de cromatogramas de íons extraídos por GC–MS para β-amirina (7) (m/z 218, D), 16α-hidroxi-β-amirina (8) (m/z 216, F) e 21β-hidroxi-β-amirina (9) (m/z 291, E) produzidas em N. benthamiana expressando AcOSC6 e AstHMGR (KY284573.1), e co-expressando AcCYP716A275 ou BfCYP716Y1 e AcCYP716A278 ou GmCYP72A69. BfCYP716Y1 foi comprovado como hidroxilando 7 na posição C-16α. A soja GmCYP72A69 foi relatada anteriormente como catalisando a hidroxilação de 7 na posição C-21β. G, H Sobreposição de cromatogramas de íons extraídos por LC–MS para 3-O-β-D-glucuronopiranosil ácido-protoaescigenina (10,
m/z 681, G) produzido na cepa de levedura WAT11 expressando AcCSL e GmCSL usando ácido UDP-glucurônico como doador de açúcar, e para 11 (m/z 593, H) e 2 (m/z 1129,5436, I) produzidos em E. coli expressando AcBAHD3 e AcBAHD6. A GmCSL1 da soja foi previamente relatada como catalisadora da 3-O-glucuronosilação. Os dados de origem são fornecidos em um arquivo de Dados de Origem.
Aescina (por exemplo, 2 e 3) são saponinas triterpênicas, biossintetizadas a partir do intermediário de 30 carbonos 2,3-oxidoesqualeno (6) pelas ações sequenciais de múltiplas enzimas, incluindo OSC, P450s, UGTs e aciltransferases (Tabela Suplementar 10, Dados Suplementares 2–4). O esqueleto triterpênico pentacíclico é derivado de um cátion dammenarenil e da expansão dos anéis D e E no caminho para o β-amirina (7). O 7 sofre ainda oxidação sítio-específica catalisada por P450s, formando diversas agliconas não glicosiladas, que são coletivamente referidas como 1. A acilação e glicosilação de 1 contribuem para a diversificação estrutural das saponinas triterpênicas (Fig. Suplementar 8). Para identificar BGCs envolvidos na biossíntese de triterpenoides no genoma de A. chinensis, buscamos regiões genômicas contendo OSCs e/ou enzimas de modificação (por exemplo, a família CYP716 mais comum que modifica esqueletos triterpênicos) conhecidas por atuarem nesse metabolismo. Como resultado, quatro BGCs contendo OSCs e um BGC contendo genes CYP716 foram descobertos, conhecidos como AcClusters I–V; esses BGCs foram então implicados na biossíntese de triterpenoides no genoma de A. chinensis (Fig. Suplementar 9). A análise de genes sintênicos de parálogos de A. chinensis revelou que o AcCluster II é fisicamente sintênico com o AcCluster I (Fig. 3A, Fig. Suplementar 9). Destes, o AcCluster I está localizado no cromossomo 15 e contém dois homólogos de OSC (AcOSC6 e AcOSC9 parcial), sete P450s (AcCYP716A274, AcCYP716A276, AcCYP716A277, AcCYP716A278, AcCYP716BX1, AcCYP716BX3 e AcCYP716BX6) e cinco BAHDs (AcBAHD1-AcBAHD5) dentro de uma região de 350 kb. O AcCluster II está localizado no cromossomo 8 e consiste em dois genes P450 (AcCYP716A275 e AcCYP716BX2) e um gene semelhante à celulose sintase (AcCSL1) (Dados Suplementares 5). Os dados de RNA-seq mostraram ainda que um OSC (AcOSC6), quatro P450s (AcCYP716A275, AcCYP716A278, AcCYP716BX1 e AcCYP716BX2) e três genes BAHD (AcBAHD1, AcBAHD3 e AcBAHD5) foram abundantemente expressos em sementes de A. chinensis, em concordância com o alto acúmulo de 2 e 3 nas sementes, que putativamente participam da formação de aescina via ciclização do triterpeno, hidroxilação, glucuronidação e acilação (Fig. 3B, Dados Suplementares 5). Para expandir o escopo dos genes candidatos, um exame mais aprofundado do ensaio WGCNA revelou genes potenciais, incluindo um OSC, três CSLs, nove UGTs, 13 P450s e 19 BAHDs, no módulo "turquesa" específico de sementes (Fig. Suplementar 10, Dados Suplementares 6). Combinando BGCs e WGCNA, priorizamos a validação de genes altamente expressos na semente que estão localizados dentro dos BGCs e subsequentemente focamos em genes altamente expressos na semente que não estão presentes nos BGCs.
Identificação bioquímica de genes na via da escina Ia (2)
Heterologous overexpression of full-length AcOSC6 (β-amyrin synthase, BAS) in Nicotiana benthamiana, which does not naturally generate 7, led to the production of 7 in plants as measured by GC–MS/MS and confirmed by comparing mass spectral fragmentation with an authentic standard (Fig. 3C, D and Supplementary Fig. 11). The function of AcOSC6 matches its phylogenetic relationships, as AcOSC6 clusters with other OSCs that exhibit BAS activity (Supplementary Fig. 12). To further explore whether seed-specific CYP716 genes from AcClusters I and II can catalyze the early steps of the biosynthetic pathway of 2, we co-expressed AcCYP716A275 or AcCYP716A278 with AcOSC6, as well as AstHMGR, to increase metabolic flux to terpenoids using N. benthamiana infiltration system. Both products exhibited detectable activity toward 7, creating peaks at 13.6 and 14.9 min, respectively. Co-expression of AcCYP716A275 and AcOSC6 in N. benthamiana at 13.6 min led to the production of 16α-hydroxy-β-amyrin (8), as similarly verified by comparison to the known production by AcOSC6/BfCYP716Y1 (Fig. 3C, E and Supplementary Fig. 11). According to the matching MS fragmentation pattern at 14.9 min, the compound produced by AstHMGR/AcOSC6/AcCYP716A278 is 21β-hydroxy-β-amyrin (9), which is known to be produced by AstHMGR/AcOSC6/GmCYP72A69 (Fig. 3C, F and Supplementary Fig. 11). AcCYP716A275, BfCYP716Y1, AcCYP716A278, and GmCYP72A69 were also, respectively, transferred into engineered yeast strains Y1-20-6, which produces 7, leading to identical catalytic activity as that observed in N. benthamiana (Supplementary Figs. 13 and 14). The divergent evolution and multiple functions of CYP72A and CYP716A play crucial roles in the diversity of terpenoids. CYP716A subfamily members are involved in catalyzing the conversion of pentacyclic triterpenoids to 28-hydroxy-β-amyrin, 16β-hydroxy-β-amyrin, 3-oxo pentacyclic triterpenoid, and 2α-hydroxy-oleanolic acid. Here, we showed that AcCYP716A275 catalyzes the region-specific C-16α oxidation of 7, consistent with the broader function of the CYP716A subfamily in triterpenoid oxidation. CYP72A members exhibited diverse hydroxylation activities towards terpenoids, including the 13-hydrolyzation of gibberellins, C-30 oxidation of 7, C-21β oxidation of soyasapogenol B and 7, C-21β hydroxylation of avenacin triterpenoid backbone, C-22β oxidation of 24-hydroxy-β-amyrin, and C-23 or C-2β oxidation of oleanolic acid.
Especificamente, dois membros da subfamília CYP72A do clã CYP72, a aveia AsCYP72A475 e a soja GmCYP72A69, foram caracterizados como oxidases de triterpenos C-21β com base em sua atividade em relação aos triterpenoides do tipo oleanano. No entanto, descobrimos que um membro da subfamília CYP716A, e não um membro da subfamília CYP72A, realiza a hidroxilação em C-21β para a biossíntese de 2 em A. chinensis. Esses resultados indicam que a oxidação em C-21β de triterpenoides do tipo oleanano passou por evolução independente dentro das (sub)famílias CYP716A e CYP72A. Compostos idênticos produzidos por espécies distantes podem se originar de diferentes enzimas; no entanto, esses compostos surgem com mais frequência pela mesma via, independentemente de essas enzimas serem homólogas.
Anexar um fragmento de carboidrato hidrofílico ao esqueleto triterpenoide melhora suas propriedades farmacêuticas e solubilidade em água. Relatos recentes identificaram uma série de glicosiltransferases derivadas da celulose sintase (CSyGT) que transferem a porção de ácido glucurônico para a posição C-3 de agliconas triterpenoides nas seguintes plantas leguminosas: G. max, Glycyrrhiza uralensis, Lotus japonicus e Spinacia oleracea.

Construímos a relação filogenética de AcCSL1 com proteínas caracterizadas e relacionadas de diferentes plantas disponíveis na literatura. AcCSL1 está agrupada com um clado de proteínas caracterizadas em uma subfamília CslM envolvida na glucuronidação na posição C-3 de triterpenoides do tipo oleanano, sugerindo uma função similar em A. chinensis (Figura Suplementar 15). Para examinar se AcCSL1 funciona como uma transferase de ácido glucurônico, ensaios de alimentação de substrato in vivo e ensaios in vitro com levedura foram realizados com o GmCSyGT1 previamente caracterizado como controle positivo. Os experimentos de alimentação de substrato, realizados com expressão recombinante em levedura, demonstraram que GmCSyGT1 e AcCSL1 atuaram no substrato 1, levando a um pico com um íon molecular em m/z 681,3 Da; este peso molecular é equivalente ao de [M + COOH]− mais ácido glucurônico (Fig. 3G). Ensaios enzimáticos com microssomos de levedura contendo AcCSL1 recombinante ou GmCSyGT1 geraram os mesmos resultados (Figura Suplementar 16).
Estudos farmacodinâmicos mostraram que a acilação nas posições C-21 e C-22 aumentou a citotoxicidade da aescina. Alguns BAHDs foram identificados como principais aciltransferases para a acetilação de triterpenoides tricíclicos derivados de talianol em Arabidopsis, cucurbitacinas tetracíclicas em cucurbitáceas e triterpenoides pentacíclicos em espinafre e árvores de Boswellia. Para investigar a atividade dos BAHDs transcritos (AcBAHD1, AcBAHD3 e AcBAHD5) no AcCluster I e AcBAHD6 no WGCNA em direção ao substrato 1 com acetil-CoA como doador, ensaios enzimáticos in vitro foram realizados utilizando proteínas recombinantes de E. coli (Fig. Suplementar 17). AcBAHD3 e AcBAHD6 foram capazes de acetilar o grupo hidroxila de 1, produzindo um produto com m/z 593,3 (Fig. 3H, Fig. Suplementar 18). No entanto, a taxa de conversão de AcBAHD3 foi muito menor do que a de AcBAHD6. O produto catalítico instável de AcBAHD6 foi finalmente confirmado como 22-O-acetilprotoaescigenina (11) por meio de análises de RMN (Fig. Suplementar 19). Além disso, AcBAHD3 e AcBAHD6 podem usar acetil-CoA como doador de acetil para catalisar a desacetilaescina I (12), resultando na formação de 2 (C22-O-acetilação de 12). Este resultado foi confirmado pela comparação do tempo de retenção e dos espectros de MS/MS do produto com um padrão autêntico (Fig. 3I, Fig. Suplementar 20). Este estudo fornece, portanto, um segundo exemplo de um membro da família BAHD que visa a acilação de triterpenos pentacíclicos, complementando um relato anterior de que o membro da família BAHD BsAT1 de Boswellia serrata poderia catalisar a C3a-O-acetilação de ácidos α-boswélicos (BA), β-BA e 11-ceto-β-BA, formando assim todos os principais C3a-O-acetil-BAs (3-acetil-α-BA, 3-acetil-β-BA e 3-acetil-11-ceto-β-BA). A reconstrução filogenética confirmou ainda que o BsAT1 é o ortólogo mais próximo de AcBAHD1, 3, 5 e 6, que estão posicionados com os BAHDs do clado IIIa, representando ATs que atuam em aceptores distintos (Fig. Suplementar 21). Nossos resultados demonstram que os BGCs AcCluster I e AcCluster II contribuem para a biossíntese de BAT, que denominamos BAT BGCs.
Identificação funcional de Ac4CLs, AcF6’Hs e AcUGTs para a biossíntese de aesculina (5)
Identificação funcional de Ac4CLs, AcF6’Hs e AcUGTs envolvidos na aesculina (5) e biossíntese de novo de 5.
A Enzimas caracterizadas para a via biossintética de 5. B Ensaio de atividade das enzimas Ac4CL. As isoformas Ac4CL1-3 foram testadas quanto à atividade contra o substrato ácido cafeico (13). A atividade enzimática foi medida registrando a absorbância a 375 nm da formação do produto cafeoil-CoA (14) ao longo do tempo. Maior absorbância indica maior atividade da enzima Ac4CL. Os dados são apresentados como valores médios ± d.p. (n = 3 amostras biologicamente independentes). C Ensaio de atividade das enzimas AcF6’H. Células de E. coli expressando AcF6’H1 ou AcF6’H2 converteram o substrato 14 no produto 4. A espectrometria LC-MS detectou um pico com o mesmo tempo de retenção e espectro de massa do padrão de 4. Padrão: 4 e cafeato; CK: E. coli contendo o vetor vazio. D Análise por UPLC da atividade enzimática de AcUGT92G7 ou AcUGT84A56 em relação a 4; CK: E. coli contendo o vetor vazio. E A via artificial para a biossíntese de 5 a partir de tirosina em E. coli. Setas tracejadas representam conversão em múltiplas etapas. A linha vermelha cruzada representa o bloqueio da via; genes em azul indicam superexpressão. Via das pentoses fosfato PPP; UDPG UDP-α-d-glicose; E4P d-eritrose-4-fosfato; PEP fosfoenolpiruvato; PIR piruvato; DAHP 3-desoxi-arabino-heptulonato-7-fosfato; CHA corismato; Tkta transquetolase; PpsA sintase de fosfoenolpiruvato; PykA/pykF piruvato quinase; AroG fosfo-2-desidro-3-desoxi-heptonato aldolase; TyrA mutase do corismato-desidrogenase do prefenato; TAL tirosina amônia liase; HpaBC ácido 4-hidroxifenilacético 3-hidroxilase; 4CL1 4-cumarato-CoA ligase; F6′H feruloil-CoA 6′-hidroxilase; AcUGT84A56 e AcUGT92G7 glicosiltransferases. F Biossíntese de novo de 5 pela cepa XC-6 (BW-1, pCS-TPTA-HpaBC e pET-648T). Os dados são apresentados como valores médios ± d.p. (n = 3 amostras biologicamente independentes). Letras diferentes (a–c) acima das colunas representam diferenças significativas entre as amostras usando ANOVA de uma via com P < 0,05. Os dados fonte são fornecidos como um arquivo de Dados Fonte.
Aesculina (5), uma cumarina (1,2-benzopironas), é produzida pela via dos fenilpropanoides e distribuída em Aesculus, Fraxinus e Populus. Os genes upstream relevantes identificados neste estudo a partir do genoma de A. chinensis incluem sete fenilalanina amônia-liases (PALs), três ácido cinâmico 4-hidroxilases (C4Hs), cinco ácido cinâmico 3-hidroxilases (C3Hs), quatro 4CLs e cinco F6’Hs (Fig. Suplementar 22, Tabela Suplementar 11). Neste estudo, três Ac4CLs (Ac4CL1-3) e quatro AcF6’H (AcF6’H1-4) foram clonados com base em seus padrões de expressão e caracterizados funcionalmente. Nossos achados revelaram que Ac4CL1 exibiu um padrão de expressão amplo, enquanto Ac4CL2 e Ac4CL3 foram expressos de forma restrita no pericarpo. O nível de expressão de AcF6’H1 foi alto no pericarpo e no ramo, mas baixo na flor, enquanto AcF6’H2-4 foi expresso de forma restrita na flor. Ensaios enzimáticos usando espectrofotometria demonstraram que todas as três enzimas Ac4CL caracterizadas apresentaram afinidade catalítica pelo ácido cafeico (13) para formar cafeoil-CoA (14) (Fig. 4A, B). Notavelmente, em comparação com todas as outras enzimas Ac4CL, a Ac4CL2 demonstrou propriedades catalíticas superiores para 13 (Fig. Suplementar 23). Ensaios enzimáticos mostraram que tanto AcF6’H1 quanto AcF6’H2 exibiram atividade de hidroxilação utilizando 14 como substrato. A análise por LC-MS/MS dos produtos da reação, comparada com o tempo de retenção e os espectros de MS/MS do composto autêntico, revelou que os produtos hidroxilados eram 4 (Fig. 4A, C, Fig. Suplementar 24). Em comparação com AcF6’H1, a AcF6’H2 exibiu a maior eficiência catalítica contra 14 (Fig. Suplementar 25).

Dezenove AcUGTs putativos foram identificados a partir de análise filogenética baseada em homologia com as UGTs conhecidas envolvidas na biossíntese de flavonoides e cumarinas (Tabela Suplementar 12). Esses AcUGTs foram clonados e expressos em E. coli para produzir proteínas recombinantes; as atividades enzimáticas dessas proteínas foram então investigadas usando 4 como aceptores e UDP-glicose como substrato doador (Fig. Suplementar 26). Verificou-se que AcUGT84 A56 e AcUGT92G7 utilizam 4 (Fig. 4A, D). Dados de MS revelaram que ambos os AcUGTs podem catalisar a adição de uma glicose, conforme indicado por aumentos no peso molecular dos produtos em relação às agliconas correspondentes em 162 Da. Comparando os espectros de massa e o tempo de retenção com os dos padrões autênticos, os produtos enzimáticos dos AcUGTs com 4 como substrato foram confirmados como sendo 5 (Fig. Suplementar 27). Testes de cinética enzimática mostraram que a afinidade de AcUGT92G7 (KM = 48,96 μM) foi mais forte do que a de AcUGT84A56 (KM = 177,25 μM) por 4 (Tabela Suplementar 13).

Produção de novo de aesculina (5) em E. coli
As enzimas caracterizadas Ac4CL2, AcF6'H1 e AcUGT92G7 foram utilizadas para montar uma via biossintética de novo para o composto 5. Conforme demonstrado anteriormente, o fornecimento de fosfoenolpiruvato (PEP) e eritrose 4-fosfato pode ser aumentado pela superexpressão de ppsA e tktA, respectivamente; além disso, a produção de tirosina pode ser melhorada pela superexpressão de variantes resistentes à inibição por retroalimentação de tyrA e aroG. Neste estudo, quatro enzimas-chave foram expressas para aumentar o fluxo de carbono na via do chiquimato.

Para a síntese de novo do composto 5, escolhemos BWΔpykAΔpykF como cepa basal para reduzir a conversão de PEP em piruvato. BWΔpykAΔpykF foi cotransformada com os plasmídeos pZE-649T e pCS-TPTA-HpaBC, formando a cepa BW1. Meio M9 suplementado com 5 g/L de extrato de levedura foi utilizado para a produção de novo do composto 5. As curvas de fermentação correspondentes e o título do composto 5 são mostrados na Fig. 4D. A taxa de crescimento da cepa foi mais rápida durante a fermentação de 0–24 h e diminuiu após 24 h, e a biomassa atingiu um OD600 de 18,1 em 72 h. A produção do composto 5 também aumentou constantemente à medida que a fermentação prosseguia. A produção final do composto 5 em 72 h atingiu 16,3 ± 0,7 mg/L. Portanto, reconstruímos uma via biossintética para o composto 5 combinando três genes de A. chinensis. Além disso, essas estratégias de engenharia de vias podem fornecer ferramentas poderosas e insights para progredir e descobrir mais na biossíntese de cumarinas.

Evolução e organização dos BGCs de BAT

A origem dos BGCs de plantas decorre da montagem de genes após duplicação gênica, neofuncionalização e realocação genômica. O genoma atual disponível é abundante e pode fornecer pistas cruciais sobre como genes que codificam enzimas de uma via biossintética comum são montados para formar BGCs. A genômica comparativa em combinação com a caracterização funcional indica que BGCs surgidos precocemente passaram por mudanças dinâmicas em enzimas auxiliares para gerar triterpenoides estruturalmente diversos dentro e entre Arabidopsis ou entre cucurbitáceas. No entanto, pouco se sabe sobre as trajetórias evolutivas dos BGCs de triterpenoides em outros clados de plantas.

Evolução dos agrupamentos gênicos relacionados à biossíntese de triterpenoides BAT entre angiospermas.
A A árvore filogenética foi construída usando o OrthoFinder com base nas informações do genoma relatadas. Genes sintéticos ou não sintéticos foram marcados por cores diferentes, e o cluster de genes de colinearidade ancestral foi identificado pela primeira vez na angiosperma de divergência inicial A. trichoppda. B A distribuição do comprimento dos blocos sintênicos entre as angiospermas. C O número de genes localizados em blocos sintênicos entre as angiospermas. D A relação filogenética de OSCs, P450s e BAHDs, que estão localizados nos BAT BGCs. As diferentes cores representam as atividades catalíticas correspondentes na biossíntese de 2. E O modelo evolutivo dos BAT BGCs após muitas duplicações em tandem, inserções gênicas, perdas gênicas e WGDs. O modelo ilustra que os genes biossintéticos de BAT foram trocados e duplicados no cluster gênico e subsequentemente evoluíram para o acúmulo de triterpenoides BAT enriquecidos por espécie. I inserção, L perda, TD duplicação gênica em tandem. Os dados fonte são fornecidos como um arquivo de Dados Fonte.
Nossos dados funcionais demonstraram que os genes AcOSC6, CYP716, BAHD IIIa e CSL distribuídos em AcCluster I e AcCluster II são enzimas cruciais para a catálise da biossíntese de BAT. O valor médio de KS de 17 pares de genes parálogos localizados nos blocos sintênicos de AcCluster I e AcCluster II foi de 0,27, o que é mais geralmente semelhante ao valor de KS dos parálogos em A. chinensis (0,24), sugerindo que o evento de duplicação de AcCluster I e AcCluster II pode ter se originado do evento WGD específico de A. chinensis, Aα WGD. A análise sintênica mostrou que AcCluster I e AcCluster II são conservados entre as espécies de Hippocastanoideae, incluindo A. chinensis, Acer yangbiense e X. sorbifolium (Fig. 5A), de acordo com a alta acumulação de BAT nessas espécies. Os genes CYP716, que são especificamente enriquecidos em A. chinensis, A. yangbiense e X. sorbifolium, são presumivelmente responsáveis pela diversidade da biossíntese de BAT nessas espécies.
Uma análise adicional em larga escala da dinâmica evolutiva para este BGC BAT entre 21 genomas de plantas publicados, incluindo genomas de angiospermas de divergência inicial, monocotiledôneas e eudicotiledôneas, foi conduzida para examinar como essa região sintênica pode ter evoluído (Fig. 5A). Um segmento de ~1 Mb contendo 64 genes (Fig. 5B, C), incluindo um gene da cicloartenol sintase (CAS) e um gene BAHD IIIb na angiosperma de divergência inicial Amborella trichopoda, foi rastreado como a região ancestral. Regiões sintênicas também estão presentes em monocotiledôneas (Oryza sativa e Zostera marina), mas essas linhagens contêm apenas um gene CAS, não os genes BAS, CYP716, CSL e BAHD relacionados à biossíntese de BAT. O membro CYP716A apareceu primeiro na região correspondente das espécies dentro de Ranunculales, ou seja, Papaver somniferum. No entanto, a região sintênica não está presente em todas as espécies de Superasterídeas examinadas. Após a separação das espécies de Superasterídeas, quase todos os segmentos sintênicos retêm pelo menos um gene OSC, exceto os representantes de Cruciferae, como A. thaliana e B. rapa em Superrosídeas. Notavelmente, uma duplicação em tandem espécie-específica considerável de 10 genes OSC completos e 10 parciais foi encontrada na região sintênica conservada do genoma de V. vinifera. Inserção, deleção, duplicação e rearranjos complexos dos genes OSC, CYP716, BAHD e CSL nas regiões sintênicas das espécies de Superrosídeas foram observados. O BGC BAS/CYP716/BAHD foi sempre encontrado na região sintênica de espécies de Superrosídeas, mas ocorreram duplicação e reorganização dinâmicas (Fig. 5A). Propomos que o BGC BAT completo BAS/CYP716/BAHD/CSL foi montado pela primeira vez em espécies de Hippocastanoideae, ou seja, plantas produtoras de BAT (A. chinensis, A. yangbiense e X. sorbifolium). Além disso, o BGC passou por evolução dinâmica adicional durante a especiação, como a duplicação em tandem dos genes CYP716A e CYP716BX e a duplicação específica de Aesculus de AcCluster I e AcCluster II a partir do evento Aα WGD observado aqui.
Para examinar mais a fundo as origens evolutivas de OSCs, P450s, CSLs e BAHDs, geramos uma série de árvores filogenéticas usando o método de máxima verossimilhança; este procedimento foi baseado em alinhamentos múltiplos de sequências de proteínas das espécies mencionadas para análise de sintenia (Fig. 5D). As árvores filogenéticas baseadas nas regiências sintênicas de espécies de Sapindales, incluindo A. chinensis, A. yangbiense, X. sorbifolium, D. longan e C. clementina, juntamente com V. vinifera, confirmaram que os genes BAS, CYP716, CSL e BAHD III são conservados em relação à biossíntese de triterpenoides. Além disso, os números de cópias gênicas e as relações filogenéticas revelaram que os eventos de duplicação em tandem específicos de espécie dos membros da família CYP716 em A. chinensis e A. yangbiense levaram à expansão dos membros das subfamílias CYP716A e CYP716BX. A árvore filogenética da identificação em nível de reino dos genes da superfamília celulose-sintase sugeriu que os genes AcCSL e seus genes colineares de A. yangbiense e X. sorbifolium, bem como os CSLs funcionalmente verificados, que catalisam a conjugação de ácido glucurônico ao esqueleto triterpenoide, compartilham uma relação filogenética próxima (identidades de sequência de 44,7–55,2%). Esses resultados indicaram que os genes CSL localizados nos BAT BCGs de A. chinensis, A. yangbiense e X. sorbifolium foram recrutados para catalisar a atividade de glucuronidação antes de sua especiação.

Aqui, propusemos trajetórias evolutivas para o nascimento, morte e evolução do BAT BGC entre as angiospermas com base na reconstrução de estados ancestrais (Fig. Suplementar 28). (1) Nascimento em angiospermas de divergência inicial: O BGC ancestral contém um CAS e um BAHD IIIb em A. trichopoda; (2) Morte em monocotiledôneas: A região que contém CAS e outros genes funcionais não-BAT é retida, mas BAHD IIIb é perdido; (3) Evolução em eudicotiledôneas específicas de divergência inicial: BAS sofre evolução e CYP716 é adicionado; (4) Morte em Superasterídeas: O BGC é perdido nesta linhagem; (5) Montagem do BAT BGC em Hippocastanoideae: Este BGC funcional (BAS/CYP716/CSL/BAHD) é formado, levando à produção de BAT; (6) Reorganização e diversificação do BAT BGC: Este BGC sofre evolução dinâmica de maneira específica de espécie por meio de duplicação em tandem e WGD (Fig. 5E).
Embora os princípios da evolução de vias metabólicas com múltiplas etapas sejam menos claros em plantas, é bem compreendido que enzimas individuais evoluíram por meio de duplicações gênicas para adquirir diversidade metabólica. Pistas para determinar as causas subjacentes da origem dos compostos são fornecidas por genes vegetais ligados na região genômica conhecida como BGC, que inclui vários tipos de enzimas codificadoras. Atualmente, muitos pesquisadores utilizam os ricos recursos de sequências genômicas para desvendar processos evolutivos complexos que impactam a conservação e a flexibilidade do BGC, os quais determinam o aparecimento, a manutenção e a inovação de componentes químicos no âmbito interespecífico ou intraespecífico. Neste estudo, nossas táticas baseadas no genoma forneceram perspectivas sobre a síntese e evolução de triterpenoides do tipo barrigenol em angiospermas. As trajetórias evolutivas dos BGCs entre angiospermas revelaram que o BGC funcional que leva à biossíntese de BAT foi especificamente montado em espécies de Hippocastanoideae e que a evolução dinâmica foi espécie-específica por meio de duplicação em tandem e WGD após a especiação de A. chinensis. Além disso, sem Aesculus selvagem, é difícil sintetizar economicamente aescina e aesculina. Embora a biologia sintética ofereça um método promissor para produzir componentes desejados em sistemas heterólogos, as reações enzimáticas responsáveis por sua biossíntese permanecem inexploradas. Técnicas refinadas de edição genômica podem ser usadas para bioengenheirar espécies de culturas e microrganismos, a fim de manipular as múltiplas enzimas envolvidas nos processos de biossíntese de aescina e aesculina, por meio dos quais componentes farmacêuticos de alto valor podem ser fabricados em larga escala.

Métodos
Materiais vegetais e produtos químicos
Plantas de A. chinensis foram coletadas do Instituto de Desenvolvimento de Plantas Medicinais (IMPLAD), da Academia Chinesa de Ciências Médicas (CAMS), China. N. benthamiana foi cultivada por um período de ~4 semanas sob um ciclo de 18 h de luz/6 h de escuro dentro de uma estufa localizada no Banco Nacional de Genes de TCM, Instituto de Matéria Médica Chinesa, Academia Chinesa de Ciências Médicas Chinesas. Padrões de alta qualidade para protoaescigenina (1), desacetilaescina I (12), escina Ia (2), escina Ib (3), esculetina (4) e aesculina (5) foram adquiridos da Chenguang Biotechnology Inc. (Xi'an, China). Ácido cafeico (13), 2-oxoglutarato dissódico, cafeoil-CoA (14) foram adquiridos da Chengdu Push Bio-technology Co., Ltd (Chengdu, China). UDP-Glicose (UDPG), UDP-Ácido glucurônico (UDPGA), adenosina 5'-trifosfato e S-adenosilmetionina (SAM), acetil-CoA foram adquiridos da Sigma-Aldrich (EUA). Todos os produtos químicos utilizados eram de grau analítico ou HPLC.
Imagem por MALDI MS
Cápsulas frescas de A. chinensis foram colhidas e imediatamente envolvidas em uma solução de gelatina a 10% (p/v). Inicialmente, os tecidos foram posicionados dentro de criomoldes Tissue-Tek (25 × 20 × 5 mm) e envolvidos pela solução de gelatina. Em seguida, os moldes foram transferidos para um freezer a −80 °C por 1 h para solidificar em blocos. Durante o corte criostático, os blocos de amostra foram fixados diretamente no suporte de amostras de um criostato (Leica, Alemanha) usando água deionizada como adesivo. Secções com espessura de 16 µm foram obtidas a −20 °C e imediatamente fixadas em lâminas de vidro revestidas com óxido de índio e estanho para análises de imagem subsequentes. Para evitar condensação, as secções de tecido passaram por um processo de dessecação a vácuo por ~10 min antes da aplicação da matriz. Imagens ópticas das secções foram capturadas utilizando um microscópio Zeiss Axio M2 (Zeiss, Alemanha). Para aplicação consistente da matriz, um sistema pneumático automatizado personalizado foi empregado. O sistema de aplicação da matriz e o procedimento de revestimento foram conduzidos. Em resumo, uma solução de 50 mg/mL de ácido 2,5-di-hidroxibenzoico dissolvido em acetonitrila:H₂O (0,1% TFA, ácido trifluoroacético) (7:3, v/v) foi aplicada para experimentos de MALDI em modo positivo. O sistema MALDI (TransMIT GmbH, Giessen, Alemanha) foi operado sob pressão atmosférica e acoplado a um espectrômetro de massas Q Exactive HF Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemanha). Para garantir deposição uniforme nas amostras de cápsula, o nebulizador foi posicionado a 3 cm acima da amostra e oscilou sobre a placa 100 vezes. A taxa de fluxo foi ajustada para 6–8 mL/h, enquanto a pressão do gás foi ajustada para 50 psi para facilitar a entrega e nebulização da solução de matriz.

Cada espectro de varredura única foi composto por 100 acumulações de pulsos de laser a uma frequência de 1 kHz, empregando uma configuração de foco laser "pequeno". Imagens de MALDI foram adquiridas com resolução espacial de 50 µm. Os instrumentos foram calibrados utilizando a entrada ESI, empregando aglomerados de trifluoroacetato de sódio (NaTFA) abrangendo a faixa de m/z de 158,9640–1926,6365. A calibração do instrumento foi realizada usando a parte ESI do instrumento com aglomerados de NaTFA e uma calibração quadrática dos aglomerados. A análise de dados foi executada utilizando o pacote de software SMALDIControl (TransMIT GmbH, Giessen, Alemanha).

Perfis de metabólitos em A. chinensis por LC–MS/MS
Todos os tecidos foram submetidos à liofilização a vácuo, e cada amostra individual foi precisamente pesada em 100 mg e posteriormente reunida para extração com solvente. Para efetuar esse processo, 10 mL de uma mistura de metanol:H2O (7:3, v/v) foram introduzidos em tubos de centrífuga de 50 mL, seguidos por um período de sonicação de 30 min utilizando um limpador ultrassônico 8891 (Billerica, MA). Em seguida, os extratos foram centrifugados a 14.000 × g por 5 min, e os sobrenadantes foram coletados. Essas soluções de extrato foram empregadas para análises subsequentes. Para a quantificação de 1, 2, 3, 4 e 5, ensaios de LC–QQQ–MS/MS foram executados utilizando um espectrômetro de massa Triplo Quadrupolo 6470 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) acoplado a um sistema Advance 1290 UHPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Os analitos foram resolvidos usando uma coluna Agilent Eclipse Plus C18 (RRHD 1,8 μm, 2,1 mm × 50 mm). A fase móvel A compreendeu ácido acético a 0,1%, enquanto a fase B foi composta por H2O contendo ácido acético a 0,1%. O programa de eluição gradiente foi o seguinte: 0–25 min, A:B = 68:32. Um volume de 1 μL foi injetado, e a vazão foi ajustada para 0,30 mL/min, com a temperatura da coluna mantida a 30 °C. O espectrômetro de massa, operado no modo de íons positivos ou negativos, foi configurado para o modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM). Para cada composto, duas transições MRM de íons precursor-produto foram monitoradas seletivamente. A aquisição de dados e a análise subsequente foram executadas utilizando o software MassHunter (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), facilitando a quantificação de todos os sete metabólitos para os quais padrões correspondentes estavam disponíveis.
Sequenciamento e montagem do genoma
A citometria de fluxo foi empregada para estimar o tamanho do genoma de A. chinensis utilizando Solanum lycopersicum (900 Mb) e Brassica rapa (485 Mb) como padrões em um BD AccuriTM C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Além disso, o tamanho do genoma de A. chinensis também foi estimado de acordo com a frequência de k-mer (comprimento do k-mer 17) dos dados de sequenciamento do genoma usando Jellyfish (v.2.0).
O isolamento de DNA de folhas de A. chinensis foi realizado por meio de um kit de extração de DNA de plantas (Tiangen Co. Ltd., http://www.tiangen.com). Bibliotecas paired-end de leitura curta foram construídas seguindo as diretrizes do fabricante e sequenciadas em uma plataforma Illumina Hiseq X-ten (Illumina, San Diego, CA, EUA). Para o sequenciamento de leitura longa, DNA genômico de alta qualidade de A. chinensis foi empregado na preparação de bibliotecas de insertos de 20 kb, seguindo os protocolos padrão de preparação de bibliotecas ONT. Essas bibliotecas foram então sequenciadas utilizando a plataforma ONT GridION X5 (v.9.4.1; Oxford Nanopore Technologies). A chamada de bases das leituras brutas de ONT foi realizada usando o chamador de bases Oxford Nanopore Guppy (v.1.8.5) com parâmetros padrão. As leituras de ONT foram submetidas a correção, corte e montagem em contigs genômicos usando CANU (v.1.5) e SMARTdenovo. Os contigs montados foram posteriormente polidos três vezes utilizando leituras curtas Illumina com Pilon (https://github.com/broadinstitute/pilon, v.1.24). A completude da montagem do genoma foi estimada usando Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO; v4) com o conjunto de dados Embryophya odb10. Uma biblioteca Hi-C de folhas jovens de A. chinensis foi preparada pela Annoroad Genomics (http://en.annoroad.com) seguindo o procedimento padrão. Os dados de sequenciamento Hi-C foram alinhados aos contigs montados pelo BWA-MEM (v.0.7.17), e então os contigs foram agrupados em cromossomos com 3D-DNA.
Sequenciamento de transcritos e análise WGCNA
Para análise de RNA-Seq, amostras de RNA de A. chinensis foram meticulosamente extraídas de diversos tecidos, incluindo folhas jovens, ramos, flores, pericarpos e sementes, usando o RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, https://www.qiagen.com). Essas amostras de RNA foram então empregadas para construir bibliotecas de RNA-Seq utilizando o TruSeq RNA Library Prep Kit v.2 (Illumina, San Diego, CA, EUA). Em seguida, as bibliotecas foram submetidas a sequenciamento usando a plataforma NextSeq 500. A quantificação da abundância de transcritos foi medida calculando os valores de Fragmentos por Quilobase do modelo de éxon por Milhão de leituras mapeadas (FPKM). Essa quantificação foi executada através da utilização do alinhamento HISAT2 (v.2.0.5) e FeatureCounts (v.1.6.3). Empregando os valores de FPKM derivados de diferentes tecidos, uma análise de rede de coexpressão gênica ponderada (WGCNA) foi realizada para inferir redes de genes coexpressos. Os valores de eigengene dos módulos foram calculados dentro da estrutura WGCNA e posteriormente correlacionados com os perfis de acúmulo de metabólitos potenciais em distintos tecidos vegetais.
Anotação do genoma e identificação de genes candidatos
Sequências repetitivas dentro do genoma de A. chinensis foram exploradas por meio de estratégias de novo e baseadas em homologia, facilitadas pelo software RepeatModeler (v.1.0.9). Para identificação e classificação de repetições de novo, os programas LTR_Finder e LTR_retriever foram empregados para identificar e classificar elementos repetitivos. A montagem de transcriptoma de novo foi realizada usando Trinity (v. 2.2.0) com parâmetros padrão, e as sequências de peptídeos foram previstas pelo TransDecoder (https://github.com/TransDecoder, v.2.1.0). O pipeline de anotação MAKER foi usado para predições ab initio de genes codificadores de proteínas no genoma mascarado de A. chinensis (v.2.31.9).
Anotações baseadas em BLASTP e HMMER em combinação foram usadas para encontrar proteínas de alta confiança associadas à biossíntese de triterpenoides e cumarinas em A. chinensis. Sequências de proteínas de proteínas caracterizadas em triterpenoides e cumarinas foram usadas para identificar genes candidatos por BLASTP (E-value < 1e−5, identidade > 50% e cobertura >50%) no genoma de A. chinensis. Os genes candidatos identificados foram verificados pelo HMMER; apenas proteínas com domínios representativos foram retidas.
Árvore filogenética e análise evolutiva
Uma árvore filogenética de máxima verossimilhança (ML) de genes de cópia única, que foram agrupados em grupos ortólogos, dos genomas de A. chinensis com M. domestica, C. sativus, G. max, P. trichocarpa, C. clementina, D. longan, X. sorbifolium, B. rapa, A. thaliana, T. cacao, G. raimondii e V. vinifera foi construída usando RaxML (v.8.2.10) utilizando o modelo de substituição JTT + G + I para aminoácidos com 1000 réplicas de bootstrap. O tempo de divergência das espécies selecionadas foi calculado usando o programa MCMCTREE no PAML, de acordo com os pontos de tempo de divergência fóssil para a separação específica de Sapindaceae e Rutaceae (21,8–50,4 MYA) obtidos do TimeTree (http://www.timetree.org). Em seguida, CAFE (v.2.1) foi utilizado para identificar análises de contração e expansão dessas famílias gênicas após a predição da divergência de espécies sob um modelo gráfico probabilístico. MCScan (versão Python) foi aplicado para realizar análise de sintenia genômica.
Cluster de genes envolvidos na biossíntese de triterpenoides
Usamos o pipeline online plantiSMASH (http://plantismash.secondarymetabolites.org/) e uma busca manual para anotar os BGCs de triterpenoides. Para atribuir BGCs à biossíntese de triterpenoides, investigamos se esses genes continham um ou mais genes OSC e anotamos os 20 genes circundantes que eram fisicamente adjacentes. O BGC obtido contendo OSC6 foi mapeado para o próprio genoma e quatro outros genomas (A. yangbiense, C. clementina, D. longan e X. sorbifolium) para descobrir segmentos colineares usando MCScan (versão Python).
Clonagem de genes
O RNA total foi extraído usando um Kit EasyPure® Plant RNA (TransGen, Pequim, China). O cDNA de primeira fita foi sintetizado a partir do RNA total usando o kit de síntese de cDNA TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (TransGen, Pequim, China) de acordo com o protocolo do fabricante. As ORFs completas de AcOSC6, AcCYP716A275, AcCYP716A278, AcCSL1, AcBAHDs (AcBAHD1, AcBAHD3, AcBAHD5 e AcBAHD6), 19 AcUGTs e AcF6’Hs (AcF6’H1, AcF6’H2, AcF6’H3 e AcF6’H4), e três Ac4CLs (Ac4CL1, Ac4CL2 e Ac4CL3) foram amplificadas usando a DNA polimerase KOD-Plus-Neo (TOYOBO Bio, Japão), e os iniciadores foram listados (Tabelas Suplementares 12, 14 e 15). AtHMGR (KY284573), GmCYP72A69 (NM_001354946), BfCYP716Y1 (KC963423.1) e GmCSyGT1 (ou GmCSL1, LC500227.1) foram sintetizados (GenScript Biotech).

Caracterização funcional dos genes AcOSC6 e P450 em N. benthamiana

Os genes AcOSC6 e P450 foram primeiro recombinados no vetor doador pDONR207 e depois subclonados e inseridos no pEAQ-HT-DEST1 usando a enzima LR clonase II (Thermo Fisher Scientific, EUA). Os constructos pEAQ-HT-DEST foram eletrotransformados na linhagem de Agrobacterium tumefaciens (EHA105). As linhagens transformadas de A. tumefaciens carregando os genes candidatos foram infiltradas sozinhas ou igualmente em combinação com AtHMGR em N. benthamiana usando uma seringa. Folhas infiltradas de N. benthamiana foram coletadas para análise de metabólitos após 4–5 dias. A N. benthamiana infiltrada foi liofilizada, moída e pesada em 10 mg. O pó foi extraído com 1 mL de solução de saponificação (EtOH:H2O:KOH 9:1:1 v:v:w) a 65 °C por 2 h. Os extratos foram então evaporados até secura e re-extraídos com 500 μL de acetato de etila por agitação por 2 min. Após adição de um volume igual de H2O, as amostras foram vortexadas, e 100 μL da fase orgânica superior foram transferidos para um frasco novo e secos. A trimetilsililação foi realizada com 50 μL de N-metil-N-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (Sigma‒Aldrich, Darmstadt, Alemanha). As amostras trimetilsililadas foram analisadas por GC‒MS.

Caracterização funcional dos genes P450 em levedura modificada

A linhagem de levedura Y0 foi derivada da linhagem Cenpk2-1D, adquirida da EUROSCARF, por meio do knockout dos genes BTS1 e ERG27 usando CRISPR/Cas9. Os cassetes gênicos de Ppgk-tHMG-Tadh1, Ptef1-ERG1-Tpgk, Ptdh3-ERG20+ERG9-TCYC1 e PpgK-β-AS-Tadh1 foram amplificados a partir dos plasmídeos correspondentes. Em seguida, esses cassetes e o gene marcador URA3 foram integrados no sítio delta da linhagem Y0. A linhagem que produziu a maior quantidade de 7 foi designada linhagem Y1-20-6. As ORFs de AcCYP716A275, BfCYP716Y1, AcCYP716A278 e GmCYP72A69 foram subclonadas e inseridas no vetor de expressão em levedura pESC-HIS, e os constructos de recombinação foram cotransformados na linhagem de levedura Y1-20-6. O extrato de metabólitos foi processado conforme descrito acima para análise por GC‒MS.

Ensaio de alimentação em levedura e microssomos para glicuronosilação de agliconas triterpenoides
As construções do vetor de expressão em levedura pESC-HIS com AcCSL1 ou um vetor vazio foram transformadas na levedura S. cerevisiae WAT11. As cepas de levedura recombinantes foram inicialmente cultivadas em 20 mL de meio SD-His contendo 20 g/L de glicose a 30 °C por 24 h. 200 μL da suspensão da cepa foram utilizados com tiras de teste de glicose na urina para garantir que a glicose fosse completamente consumida. Após o teste de glicose, as células de levedura foram coletadas por centrifugação a 1000 × g por 5 min e lavadas duas vezes com ddH2O. Meio SD-His com 20 g/L de galactose foi utilizado para ressuspender as cepas. Um mililitro de cada cepa foi utilizado para a reação in vivo da levedura. O substrato 1 foi suplementado a 100 μM nas culturas. Após 16 h, acetato de etila foi utilizado para interromper a reação, e o sobrenadante foi concentrado a baixa pressão após centrifugação ultrassônica até que o acetato de etila estivesse completamente volatilizado. A pelota foi dissolvida em 200 μL de metanol e armazenada a 4 °C para posterior análise por UPLC‒MS. Proteínas microssomais foram isoladas e dissolvidas em um tampão de armazenamento de proteínas (20% [v/v] glicerol, 100 mM Tris–HCl [pH 7,5]). A atividade enzimática do AcCSL1 foi ensaiada em 100 μL de volume de reação, contendo 35 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1 mM ditiotreitol, ~30 μg de proteínas microssomais, 100 μM de 1 e 1 mM de UDPGA. Os ensaios foram incubados por 1 h a 30 °C. As reações foram interrompidas usando 100 μL de metanol. Finalmente, os extratos foram centrifugados por 10 min a 14.000 × g e analisados por UPLC-MS.
Ensaio enzimático de AcUGTs e AcBAHDs
Sequências completas de cDNA dos genes UGT e BAHD de A. chinensis foram obtidas usando KOD Plus-Neo de acordo com as instruções do kit (TOYOBO, Xangai, China). Os produtos de PCR dos genes UGT foram purificados com um EasyPure Quick Gel Extraction Kit (TransGen, Pequim, China), digeridos com a enzima de restrição correspondente e ligados em vetores pMAL-c2x ou pET28a (New England BioLabs, EUA) pré-digeridos de forma similar. As proteínas recombinantes de fusão MBP ou His foram purificadas usando resina de maltose de acordo com as instruções do fabricante (New England Biolabs, EUA). Para analisar a atividade de dezenove UGTs recombinantes in vitro, reações finais de 100 µl foram adotadas, consistindo em 10 mM DTT, 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 0,1 mM de substratos, 1 mM de UDP-glicose como doador de açúcar e proteínas recombinantes (5-10 µg). Após incubação por 1 h a 37 °C, as reações foram interrompidas com 100 μL de metanol. Os produtos foram analisados por HPLC após centrifugação a 14.000 × g por 10 min e filtração através de um filtro de microporo de 0,22 μm. O KM e Vmax das AcUGTs foram medidos usando 1 mM de UDP-Glc como doador de açúcar e 4 como aceptor de açúcar; a concentração do substrato foi ajustada em uma faixa de 0–400 μM como aceptor em tampão Tris-HCl (pH 7,0). Para a acetilação dos candidatos AcBAHDs em relação a 1 e 12, 1 mM de acetil-CoA, 100 μM de substrato e 10 μg de proteína AcBAHD purificada em 100 μL de solução de Tris-HCl (50 mM, pH 8,0) foram incubados a 28 °C por 2 h. A reação foi interrompida com um volume igual de metanol. Finalmente, os extratos foram centrifugados por 10 min a 14.000 × g, e os produtos catalíticos foram analisados por LC–MS.

Ensaio enzimático de Ac4CLs e AcF6′Hs
Todos os genes AcF6′H e Ac4CL foram então inseridos no vetor pET-32a (+) e transformados na cepa de expressão E. coli BL21(DE3). Após incubar a cultura bacteriana, a expressão proteica foi induzida por 1,0 mM de IPTG por 22 h a 16 °C. O sedimento bacteriano foi coletado e ressuspenso em Tris-HCl (pH 6,5 para proteínas AcF6′H ou pH 8,0 para proteínas Ac4CL). A purificação proteica foi realizada usando o Kit de Purificação de Proteínas com His-tag (Beyotime, Pequim, China).
Para a triagem funcional e ensaio cinético para medir a atividade enzimática de Ac4CL, a espectrofotometria foi utilizada para medir as alterações nos valores de absorbância nos comprimentos de onda de 324 e 357 nm. Cada mistura reacional de 100 μL foi preparada com uma quantidade moderada de proteína Ac4CL, 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM de adenosina 5′-trifosfato, 0,5 mM de MgCl2, 0,03 mM de CoA e 2 mM de substrato 13. Para determinar os valores cinéticos de Ac4CL1 e Ac4CL2, o Substrato 13 em diferentes concentrações variando de 0,01 a 0,48 mM foi adicionado à mistura reacional. Os valores cinéticos enzimáticos foram calculados a partir da concentração de 14 gerada por minuto usando um coeficiente de extinção molar de ε = 18.000 M−1 cm−1.
Para realizar um ensaio enzimático com AcF6’Hs, cada mistura de reação de 100 μL foi preparada com uma quantidade moderada de proteína, 100 mM de Tris–HCl (pH 6,5), 1,0 mg/mL de BSA, 0,005 mM de FeSO4, 1 mM de 2-oxoglutarato dissódico, 0,1 mM de ascorbato de sódio e 14 em concentrações variando de 0,005 a 0,3 mM para determinar os valores cinéticos e 2 mM para avaliar a atividade da proteína candidata. A reação foi conduzida a 30 °C por 2 min, 20 μL de NaOH 3 M foram adicionados, e a mistura foi incubada a 37 °C por 10 min. Em seguida, 20 μL de ácido acético foram adicionados, e a mistura da reação foi centrifugada a 14.000 × g por 10 min. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro de membrana de 0,2 μm e analisado por LC–MS. O modo de íons negativos foi utilizado para detecção do produto, e uma coluna C18 Waters Acquity UPLC® BEH C18 (1,7 μm, 100 mm × 2,1 mm) foi usada para cromatografia, com fase móvel A consistindo em 0,1% de ácido fórmico e água e fase móvel B consistindo em acetonitrila. A vazão foi ajustada para 0,3 mL/min, e a temperatura da coluna foi mantida a 40 °C. O programa de gradiente da fase móvel foi o seguinte: 5% B em 0 min; 5% B em 2 min; 6% B em 13 min; 95% B em 13,1 min, 95% B em 14,1 min; e 5% B em 14,5 min. Para determinar os valores cinéticos, um marcador de fluorescência foi usado para detectar os valores de fluorescência a 345 nm/462 nm usando um ensaio de imunoabsorção enzimática. Os parâmetros cinéticos da enzima foram calculados usando GraphPad Prism 8.0.2.

Análise por LC–MS/MS e GC–MS/MS para identificação de produtos enzimáticos

LC–QQQ–MS ou LC–TOF–MS foi usado para analisar os produtos catalíticos de AcUGTs, AcBAHDs e AcF6’H. A utilização e os parâmetros de LC–MS estão listados na Tabela Suplementar 16.

Para a identificação de β-amirina e produtos hidroxilados correspondentes, análises por GC–QQQ–MS foram realizadas em um GC Agilent Technology 7890 acoplado a um MS de Triplo Quadrupolo 7000C (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Um microlitro da amostra foi injetado em modo splitless com temperatura do injetor de 250 °C. A coluna foi DB-5 ms (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), 30 m × 0,25 mm d.i. × 0,25 μm de espessura de filme, e foi conectada por uma união final purgada (PUU) para fornecer separação da amostra. Hélio foi utilizado como gás de arraste a uma vazão constante de 1,2 mL/min. A temperatura foi ajustada da seguinte forma: iniciar a 170 °C por 2 min, aumentar para 300 °C a 20 °C/min, e mantida a 300 °C por 11,5 min (o tempo total de corrida foi de 20 min). As temperaturas da linha de transferência do MS e da fonte de íons foram ajustadas para 300 e 280 °C, respectivamente. Espectros de massa completos foram gerados por varredura dentro da faixa de m/z de 50–700 amu com um atraso de solvente de 8 min. 7, 8 e 9 foram identificados comparando o tempo de retenção e os espectros de massa com os padrões autênticos 7, e os produtos da reação catalítica de BfCYP716Y1 e GmCYP72A69, respectivamente.

Purificação e identificação de 22-O-acetilprotoescigenina
Células bacterianas expressando proteínas recombinantes pET28a-AcBAHD6 foram coletadas de 4 L de meio de cultura e ressuspendidas em 480 mL de tampão fosfato. Enzimas brutas foram obtidas por ultrassonicação a 4 °C e então misturadas com 50 mM de 1 e 30 mM de acetil-CoA. Uma reação suficiente foi realizada a 30 °C e 180 rpm por 5 h. Em seguida, a mistura reacional foi extraída três vezes com volume igual de acetato de etila, evaporada até secura e dissolvida em 6 mL de acetato de etila. O composto 11 foi purificado deste extrato orgânico usando HPLC preparativa. A HPLC preparativa foi realizada em um sistema HPLC Agilent 1100 equipado com um detector de comprimento de onda variável (VWD) e um detector evaporativo de dispersão de luz (ELSD). A separação foi realizada em uma coluna Cosmosil C18 de 250 × 10 mm d.i. × 2,5 μm usando água (A) e acetonitrila (B) a 2,5 mL/min com o seguinte gradiente: 0–55 min, 40% B; 56–60 min, 100% B; 61–70 min, 40% B. O volume injetado foi 100 μL, e o produto alvo foi coletado entre 21 e 23 min. As frações coletadas foram agrupadas e secas por sopro de nitrogênio (para remover acetonitrila sob temperatura de 0 °C) e liofilizadas (para remover água). Este processo rendeu 1,5 mg de 11, posteriormente submetido a RMN em dimetilsulfóxido-d6. Espectros de RMN foram registrados em um espectrômetro de ressonância magnética Bruker Avance Neo 600 MHz, com tetrametilsilano (TMS) como padrão interno. Deslocamentos químicos são relatados em partes por milhão (ppm) relativos ao solvente residual.

Experimento de novo de produção de aesculina

Os plasmídeos derivados pZE12-luc (alto número de cópias) e pCS27 (número médio de cópias) foram usados para a montagem da via. Os plasmídeos pCS-TPTA-HpaBC e pCS-TAL foram construídos em nosso estudo anterior. O gene RgTAL foi amplificado usando pCS-TAL como molde. O plasmídeo pZE-649T foi construído inserindo AcF6’H1, Ac4CL2, AcUGT92G7 e RgTAL em pZE-12-luc usando Kpn I, Sph I, BamH I, Not I e Xho I. Informações sobre os plasmídeos e as cepas utilizadas estão resumidas na Tabela Suplementar 17. Os primers usados neste estudo estão listados na Tabela Suplementar 18. Para produção de novo de 5, 1 mL de culturas overnight em semente foi inoculado em 50 mL de meio M9Y suplementado com antibióticos apropriados. A cepa BW1 foi cultivada a 37 °C e 200 rpm por 3 h e então induzida com 0,5 mM de IPTG. As culturas induzidas continuaram a crescer a 30 °C e 200 rpm. Amostras foram obtidas a cada 24 h. O crescimento celular foi monitorado medindo a densidade óptica a 600 nm, e as concentrações do produto e dos intermediários foram analisadas por HPLC.

Resumo do relatório

Mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Resumo do Relatório do Nature Portfolio vinculado a este artigo.

Informações suplementares

Dados fonte

Nota do editor
Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Estes autores contribuíram igualmente: Wei Sun, Qinggang Yin, Huihua Wan, Ranran Gao.
Informações complementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41467-023-42253-y.
Contribuições dos autores
W.S., Z.C.X., e S.L.C. conceberam e desenharam a pesquisa. Q.G.Y., R.R.G., H.H.W., X.H.X, Chong Xie, H.Y., Y.L.M., X.T.W., W.Q.C., e Chao Xiong realizaram os experimentos. X.X.M. analisou os resultados. H.Y. coletou os materiais. D.R.N nomeou todas as sequências P450 do genoma de Aesculus. W.S., Z.C.X., X.X.S., Q.G.Y., e H.H.W. escreveram o manuscrito. Z.G.H., C.X.W., Ziyan Xie, Zheyong Xue, e P.S. revisaram e editaram o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito para publicação.
Revisão por pares
Informações da revisão por pares
A Nature Communications agradece a Søren Bak e ao(s) outro(s) revisor(es) anônimo(s) por sua contribuição na revisão por pares deste trabalho. Um arquivo de revisão por pares está disponível.
Disponibilidade de dados
Os dados brutos de sequenciamento do genoma e transcriptoma gerados neste estudo foram depositados no Genome Sequence Archive no BIG Data Center, Instituto de Genômica de Pequim (BIG), Academia Chinesa de Ciências, sob os códigos de acesso CRA009101 e CRA009093. O genoma montado e as estruturas gênicas de A. chinensis estão disponíveis no Figshare [10.6084/m9.figshare.21350865]. Os dados de origem são fornecidos neste artigo.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Referências
Um cluster de 10 genes de Papaver somniferum para síntese do alcaloide anticancerígeno noscapina
Seleção de um cluster de genes de diterpeno específico de subespécie implicado na resistência a doenças do arroz
Um cluster de genes para metabolismo secundário em aveia: Implicações para a evolução da diversidade metabólica em plantas
Biossíntese, regulação e domesticação do amargor em pepino
O genoma de Taxus yunnanensis oferece insights sobre a filogenia de gimnospermas e a produção de taxol
O genoma de Taxus fornece insights sobre a biossíntese de paclitaxel
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Formação e diversificação de um cluster de genes biossintéticos paradigmático em plantas
Desvendando a diversidade metabólica vegetal: uma visão (pan)-genômica
A biossíntese de alcaloides antinutricionais em culturas solanáceas é mediada por genes agrupados
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Transferências laterais levam ao nascimento de clusters de genes biossintéticos de momilactona em gramíneas
Duplicações gênicas em tandem impulsionam a evolução divergente das vias biossintéticas de cafeína e crocina em plantas
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A mudança metabólica de saponinas triterpenoides adstringentes e benéficas em soja é alcançada por uma mutação de perda de função no citocromo P450 72A69
Produção eficiente de ácido glicirretínico em Saccharomyces cerevisiae metabolicamente modificada por meio de uma estratégia integrada
P450s e UGTs: atores-chave na diversidade estrutural de saponinas triterpenoides
A antiga família CYP716 é um importante contribuinte para a diversificação da biossíntese de triterpenoides em eudicotiledôneas
OSC2 e CYP716A14v2 catalisam a biossíntese de triterpenoides para a cutícula de órgãos aéreos de Artemisia annua
P450s controlando bifurcações metabólicas no metabolismo especializado de terpenos em plantas
Duas monooxigenases do citocromo P450 da subfamília CYP716A do manjericão-doce desempenham papéis semelhantes, mas não redundantes, na biossíntese de triterpenos pentacíclicos dos tipos ursano e oleanano
A monooxigenase do citocromo P450 CYP716A141 é uma β-amirina C-16β oxidase única envolvida na biossíntese de saponinas triterpenoides em Platycodon grandiflorus
As enzimas CYP72A catalisam a 13-hidroxilação de giberelinas
Genômica funcional de triterpenos em alcaçuz para identificação de CYP72A154 envolvida na biossíntese de glicirrizina
Base molecular da regiosseletividade do produto C-30 de oxidases de leguminosas envolvidas na biossíntese de triterpenoides de alto valor
Rumo ao controle do mal-do-pé: uma C-21β oxidase necessária para acilação de compostos triterpênicos de defesa em aveia
Biossíntese combinatória de triterpenoides naturais e raros de leguminosas em levedura geneticamente modificada
O citocromo P450 CYP72A552 é chave para a produção de saponinas baseadas em hederagenina que medeiam a defesa de plantas contra herbívoros
Deleção e duplicações em tandem de genes biossintéticos impulsionam a diversidade de triterpenoides em Aralia elata
CYP72A67 catalisa uma etapa oxidativa chave na biossíntese de saponinas hemolíticas em Medicago truncatula
Evolução convergente no metabolismo especializado de plantas
Efeito dos padrões de glicosilação de antocianinas de berinjela chinesa e outros derivados na eficácia antioxidante em linhagens de células do cólon humano
Atividades moleculares, biossíntese e evolução de saponinas triterpenoides
Acilação enzimática de flavonoides
Uma enzima derivada da celulose sintase catalisa a 3-O-glucuronosilação na biossíntese de saponinas
O metabolismo de terpenoides em plantas co-opta um componente da maquinaria de biossíntese da parede celular
Acilação com grupos diangeloil nas posições C21-22 em saponinas triterpenoides é essencial para a citotoxicidade contra células tumorais
Uma rede metabólica especializada modula seletivamente a microbiota da raiz de Arabidopsis
A acetiltransferase BAHD contribui para a biossíntese induzida por ferimento de triterpenos de resina oleogomosa em Boswellia
Uma dioxigenase dependente de 2-oxoglutarato de Ruta graveolens L. exibe atividade de p-coumaroil CoA 2-hidroxilase (C2H): uma etapa faltante na síntese de umbeliferona em plantas
Biossíntese de cumarinas em plantas: uma via principal ainda a ser desvendada para as enzimas do citocromo P450
Estabelecendo uma via artificial para a biossíntese eficiente de hidroxitirosol
Engenharia metabólica de Escherichia coli para síntese microbiana de monolignóis
Visando a regeneração de cofatores em metilação e hidroxilação para produção em alto nível de ácido ferúlico
Impulsionadores da diversificação metabólica: como vizinhanças genômicas dinâmicas geram novas vias biossintéticas em Brassicaceae
Novo triterpenoide natural tipo barrigenol isolado das cascas de Xanthoceras sorbifolia Bunge
Triterpenoides naturais tipo barrigenol: uma revisão abrangente de suas contribuições para a química medicinal
Saponinas triterpenoides tipo barringtogenol C da casca do caule do bordo-da-Noruega (Acer platanoides)
Os caminhos evolutivos rumo à complexidade: uma perspectiva metabólica
Evolução da diversidade de glucosinolatos por meio de duplicações do genoma inteiro, rearranjos gênicos e promiscuidade de substrato
A via biossintética dos solanidanos da batata divergiu da dos espirosolanos devido à evolução de uma dioxigenase
Clusters de genes biossintéticos de plantas no contexto da evolução metabólica
Ativação e ciclização desacopladas na biossíntese de terpenoides redutivos em néveda
A caracterização de CYP76M5-8 indica plasticidade metabólica dentro de um cluster de genes biossintéticos de plantas
Evolução de um cluster de genes de plantas em solanáceas e surgimento de diversidade metabólica
Um método de aplicação de matriz em uma etapa para imageamento por espectrometria de massa MALDI de biofilmes de colônias bacterianas
Canu: montagem de leitura longa escalável e precisa por meio de ponderação adaptativa de κ-mer e separação de repetições
Montagem de novo de um novo acesso de Solanum pennellii usando sequenciamento nanopore
Mapeamento abrangente de interações de longo alcance revela princípios de enovelamento do genoma humano
Reconstrução de novo da sequência do transcriptoma a partir de RNA-seq usando a plataforma Trinity para geração e análise de referência
Anotação e curadoria de genoma usando MAKER e MAKER-P
RAxML versão 8: uma ferramenta para análise filogenética e pós-análise de grandes filogenias
Sun, W. & Meng, X. O genoma do castanheiro-da-índia fornece insights sobre a descoberta da biossíntese de medicamentos para aliviar a insuficiência venosa crônica e a astenopia. figshare 10.6084/m9.figshare.21350865.v1 (2022).