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pmid: "41507168"
title: "O neuropeptídeo SP protege contra colite e comportamento do tipo ansiedade associado através dos papéis putativos da microbiota intestinal e do metabólito inositol."
authors: "Lan J, Wang J, Huang S, Li C, Deng Z, Hao Z, Ma Y"
journal: "Nature communications"
pubdate: "2026 Jan 08"
doi: "10.1038/s41467-025-67904-0"
source: "PMC Full Text"

O neuropeptídeo SP protege contra colite e comportamento do tipo ansiedade associado através dos papéis putativos da microbiota intestinal e do metabólito inositol.

Autores

Lan J, Wang J, Huang S, Li C, Deng Z, Hao Z, Ma Y

Periodico

Nature communications (2026 Jan 08)

Conteudo

O neuropeptídeo SP protege contra colite e comportamento ansioso associado através dos papéis putativos da microbiota intestinal e do metabólito inositol
O eixo intestino-cérebro liga a inflamação intestinal a sintomas psiquiátricos na doença inflamatória intestinal (DII), mas os mecanismos subjacentes permanecem obscuros. Demonstramos que o neuropeptídeo substância P (SP) aliviou a lesão intestinal e os distúrbios comportamentais induzidos pelo sulfato de dextrano sódico em camundongos. O SP mitigou a neuroinflamação hipocampal e inibiu a ativação microglial e a perda de astrócitos. Além disso, o SP melhorou a desregulação do microbioma intestinal, e seus efeitos protetores dependeram dos papéis putativos da microbiota. Notavelmente, através da modulação da microbiota, o SP atenuou a via NF-κB na micróglia e aumentou a sinalização GABAérgica/Ca2+ nos astrócitos. O SP elevou o metabólito inositol derivado da microbiota. A suplementação de inositol mimetizou os benefícios do SP e ativou a sinalização GABAérgica, enquanto o inibidor de inositol reverteu os impactos neuroprotetores do SP, destacando o papel indispensável do inositol. Coletivamente, o SP exerce efeitos benéficos através dos papéis putativos da microbiota e do inositol, envolvendo a supressão da via NF-κB microglial enquanto potencializa a sinalização GABAérgica/Ca²⁺ astrocítica. Nossos achados destacam o potencial do SP como intervenção terapêutica para esses distúrbios na DII.
A alta prevalência de ansiedade em pacientes com doença inflamatória intestinal. Aqui, os autores mostram que o SP alivia a colite e os comportamentos ansiosos via microbiota intestinal e inositol, bloqueando o NF-κB microglial e potencializando a sinalização GABAérgica/Ca²⁺ astrocítica.
Introdução
A doença inflamatória intestinal (DII), que compreende a colite ulcerativa e a doença de Crohn, é uma doença complexa, crônica e incapacitante que provoca inflamação gastrointestinal ao longo da vida. Pesquisas recentes encontraram uma forte associação entre os sintomas de lesões intestinais na DII e comorbidades psiquiátricas. Clinicamente, a ocorrência de ansiedade e depressão é de até 30% e 25% em pacientes com DII. Os distúrbios psicológicos em pacientes com DII não apenas afetam negativamente a qualidade de vida, mas também deterioram a gravidade da doença em sofrimento. Infelizmente, os desafios de saúde mental associados à DII tendem a receber menos atenção do que as manifestações intestinais da doença. Embora a etiologia precisa por trás do desenvolvimento da DII e das comorbidades psiquiátricas relacionadas seja complexa e ainda não completamente compreendida.
Evidências crescentes sugerem que a composição do microbioma intestinal não apenas impacta a saúde intestinal, mas também controla a função fisiológica cerebral através do eixo intestino-cérebro, que permite a comunicação bidirecional entre o microbioma intestinal e o sistema nervoso central (SNC), destacando a importância do eixo microbiota-intestino-cérebro (MGB) na neurociência. O desequilíbrio do microbioma intestinal pode contribuir para comprometimentos do SNC. Estudos recentes ilustraram que a perturbação da microbiota intestinal de camundongos com colite pode impactar significativamente o eixo intestino-cérebro, levando à neuroinflamação e patologia cerebral. A transferência da microbiota de indivíduos saudáveis para o trato gastrointestinal de pacientes com DII aliviou os sintomas inflamatórios intestinais e o comprometimento mental. Crucialmente, os metabólitos produzidos pela microbiota intestinal foram relatados como mediadores das interações hospedeiro-microbiota, mostrando potencial para regular a fisiologia do hospedeiro através do eixo MGB. No entanto, pouco se sabe sobre como as alterações induzidas por DSS na microbiota intestinal e seus metabólitos derivados impactam os sistemas centralmente mediados envolvidos no humor, justificando pesquisas adicionais.
O crescente conjunto de evidências indica que desequilíbrios do microbioma intestinal podem comprometer a integridade da barreira intestinal, permitindo a translocação de moléculas inflamatórias e produtos nocivos gerados por bactérias patogênicas do lúmen intestinal para a circulação sistêmica. Esses fatores podem então se disseminar para o cérebro, eliciando diretamente cascatas de sinalização neuroinflamatória. A neuroinflamação pode alterar os níveis normais e as interações de neurotransmissores chave no cérebro, como serotonina (5-HT), dopamina e ácido gama-aminobutírico (GABA), que são importantes para regular o humor e o comportamento. Indubitavelmente, a micróglia, reconhecida como um ator crucial nos distúrbios neurodegenerativos, torna-se persistentemente ativada sob estímulos inflamatórios, levando à produção de mediadores neurotóxicos, incluindo citocinas. Portanto, uma compreensão mais aprofundada das vias biomoleculares específicas e cascatas de sinalização que medeiam a influência do microbioma intestinal na neuroinflamação seria essencial para avançar o campo de pesquisa sobre distúrbios do humor. Além disso, como as células mais abundantes no cérebro, os astrócitos foram ativados e transitaram para astrócitos reativos após lesão no SNC. Os astrócitos estão implicados na remodelação do SNC através de seus papéis duplos. Por outro lado, os astrócitos reativos secretam uma diversa gama de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas. Por um lado, eles liberam fatores neurotróficos, mantêm os níveis sinápticos de neurotransmissores e transmitem informações através de junções comunicantes e ondas de cálcio. Curiosamente, as pesquisas mais recentes sugeriram que um subgrupo específico de astrócitos, que são regulados pelo microbioma intestinal, exibe uma função protetora anti-inflamatória dentro do cérebro. Não se pode negar que o conjunto atual de trabalhos sobre ansiedade tem se centrado até agora nos neurônios hipocampais e circuitos neurais ligados ao transtorno. Em contraste, o mecanismo de ação dos astrócitos hipocampais na ansiedade não foi suficientemente abordado. Independentemente disso, essas descobertas fornecem evidências de que a microbiota intestinal tem sido reconhecida como um regulador fundamental entre a transdução de sinais do intestino e do cérebro. Visar a modulação da microbiota intestinal e dos metabólitos produzidos parece ser uma abordagem muito promissora para o tratamento ou prevenção de distúrbios impulsionados por disbiose.
Nos últimos anos, vários pesquisadores relataram que os neurotransmissores, conhecidos como mediadores cruciais na comunicação cruzada entre o intestino e o cérebro, possuem a capacidade de afetar a comunidade microbiana intestinal. Neuropeptídeos como a substância P (SP) são gerados em todos os níveis do eixo MGB e contribuem substancialmente para os processos de sinalização bidirecional que ocorrem entre o intestino e o cérebro. Em princípio, esperar-se-ia que a microbiota intestinal exibisse uma resposta aos neuropeptídeos, se possuísse o receptor correspondente. No entanto, ainda faltam evidências diretas que apoiem o envolvimento da SP na comunicação entre as comunidades microbianas do intestino e o SNC. A SP tem sido implicada na modulação de vários transtornos psiquiátricos. Por um lado, diversos estudos indicam o envolvimento da SP nos processos fisiopatológicos. Por exemplo, Schwarz et al. relataram que a concentração de SP está elevada sob estresse, e que o antagonismo farmacológico ou a depleção genética dos receptores NK-1 resulta em uma resposta ansiolítica, sugerindo a SP como um potencial alvo terapêutico para o tratamento de distúrbios relacionados ao estresse e à ansiedade. Por outro lado, os efeitos neuroprotetores da SP têm recebido atenção significativa. Demonstrou-se que a SP promove a memória, reforça o aprendizado e exibe efeitos semelhantes aos ansiolíticos quando administrada sistemicamente ou diretamente no núcleo basal do pálido ventral. Além disso, a SP pode neutralizar a neurotoxicidade da proteína beta-amiloide, um fator-chave na neuropatologia da doença de Alzheimer, e também poderia ter efeitos benéficos no contexto da doença de Parkinson e seus modelos relacionados. Além disso, Ahn et al. demonstraram que a SP mitiga as deficiências funcionais resultantes de uma lesão parcial com 6-hidroxidopamina do sistema nigroestriatal e fornece neuroproteção no acidente vascular cerebral isquêmico ao regular a polarização da micróglia M2. Nosso trabalho anterior demonstrou a capacidade da SP de melhorar a colite aguda induzida por DSS, mostrando que a SP neutralizou a resposta inflamatória e a ferroptose desencadeadas pela exposição ao DSS. Também resta investigar se e como a SP altera os impactos microbianos intestinais na disfunção da barreira intestinal e no SNC em sintomas semelhantes à ansiedade na DII.
Neste estudo, investigamos os efeitos protetores da SP contra as características patológicas da colite induzida por sulfato de sódio dextrano (DSS), bem como a neuroinflamação hipocampal e distúrbios comportamentais em camundongos. Exploramos a capacidade da SP de melhorar a disbiose microbiana e verificamos ainda o suposto papel da microbiota intestinal e do metabólito derivado da microbiota, inositol, nos impactos benéficos da SP sobre o comprometimento intestinal e o comportamento do tipo ansioso através do transplante de microbiota fecal (FMT), tratamento com antibióticos e suplementação de inositol. Importante, demonstramos que a atividade neuroprotetora da SP foi alcançada através da supressão da via NF-κB na microglia e do aumento da neurotransmissão GABAérgica e da sinalização downstream de Ca2+ nos astrócitos do hipocampo.
Resultados
SP melhora os sintomas de colite e comportamentos do tipo ansioso em camundongos induzidos por DSS
SP melhora os sintomas de colite e comportamentos do tipo ansioso em camundongos induzidos por DSS.
a Desenho do estudo para o estudo 1 (Alguns elementos esquemáticos foram criados pelo Figdraw.com), e uma descrição detalhada é fornecida na seção Métodos. b DAI diário durante toda a duração do estudo. n = 8 camundongos/grupo. c Porcentagem de alteração do peso corporal. n = 8 camundongos/grupo. d Imagem dos comprimentos do cólon. e Imagens representativas de secções do cólon coradas com hematoxilina e eosina, e escores histológicos. Barra de escala = 100 μm. n = 6 camundongos/grupo. f Microvilosidades na ultraestrutura do cólon observadas por MET. Barra de escala = 2 μm. n = 5 experimentos independentes. g Imagens representativas de secções do cólon coradas com azul alciano, e o número de células caliciformes por cripta. n = 6 camundongos/grupo (CON, DSS + SP, SP) e 5 camundongos/grupo (DSS). h Imunofluorescência para MUC2 (verde) com DAPI (azul) em tecidos do cólon e análise estatística, Barra de escala = 100 μm. n = 4 camundongos/grupo. i A concentração de FITC-Dextrano no soro. n = 4 camundongos/grupo. j Os níveis de citocinas inflamatórias nos tecidos do cólon. n = 4 camundongos/grupo. k Diagrama do teste de campo aberto (Criado pelo Figdraw.com) e imagem de trajeto representativa. l Distância total percorrida, tempo gasto e distância percorrida na região central. n = 6 camundongos/grupo. m Diagrama do labirinto em cruz elevado (Alguns elementos esquemáticos foram criados pelo Figdraw.com) e imagem de trajeto representativa. n Porcentagem de distância percorrida nos braços abertos, porcentagem de tempo gasto nos braços abertos e porcentagem de vezes que entrou nos braços abertos. n = 6 camundongos/grupo. o Diagrama do labirinto zero elevado (Alguns elementos esquemáticos foram criados pelo Figdraw.com) e imagem de trajeto representativa. p Análise estatística (porcentagem de distância percorrida nas zonas abertas, porcentagem de tempo gasto nas zonas abertas e porcentagem de vezes que entrou nas zonas abertas). n = 6 camundongos/grupo. q Diagrama da caixa claro-escuro (Criado pelo Figdraw.com) com análise estatística (porcentagem de distância percorrida na área clara, porcentagem de tempo gasto na área clara e transições entre as duas caixas). n = 6 camundongos/grupo. Os dados foram apresentados como médias ± DP. Para o escore DAI e alteração do peso corporal, foi realizada ANOVA de medidas repetidas de duas vias, e o restante das estatísticas foi analisado usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Neste estudo, utilizamos o tratamento com DSS para induzir com sucesso o modelo de colite em camundongos, um modelo químico amplamente utilizado que se assemelha à colite ulcerativa humana. Conforme mostrado na Fig. 1a, os camundongos receberam DSS na água de beber e foram administrados por via intravenosa com SP. Para avaliar o papel da SP na patogênese da colite, o peso, sangramento retal e consistência das fezes dos camundongos foram monitorados. A suplementação de SP atenuou notavelmente os sintomas gerais da colite (Fig. 1b–d e Fig. Suplementar 2a). Como mostrado na Fig. 1e, o tecido do cólon de camundongos normais foi observado sem infiltração de células inflamatórias ou erosão da mucosa. Em contraste, os camundongos do grupo DSS apresentaram edema intestinal da mucosa e submucosa, infiltração grave de células inflamatórias, perda de criptas e lesão epitelial. Os escores histológicos dos camundongos tratados com DSS foram significativamente maiores do que os dos camundongos normais. A administração de SP mostrou efeitos protetores no cólon, com criptas e células epiteliais mucosas intactas, e nenhum edema ou infiltração de células inflamatórias significativa observada na submucosa. Consistentemente, os escores histológicos foram significativamente reduzidos pela administração de SP em comparação com o grupo tratado com DSS. A profundidade das criptas diminuiu acentuadamente no grupo DSS, mas foi aliviada após a administração de SP (Fig. Suplementar 2b). Conforme ilustrado na Fig. 1f, a análise de microscopia eletrônica de transmissão (MET) revelou epitélio intestinal intacto no grupo CON, com microvilosidades dispostas ordenadamente. O grupo DSS exibiu irregularidades no epitélio colônico, caracterizadas por espaços intercelulares alargados, bem como microvilosidades encurtadas e curvadas. Por outro lado, o tratamento com SP atenuou efetivamente essas alterações. Pesquisas anteriores indicaram que a mucina e as células caliciformes servem como linhas básicas de defesa para proteger o intestino. Exploramos o papel da SP nas células caliciformes do cólon durante a colite. Substâncias mucosas ácidas foram coradas em azul lago usando Azul Alcião (AB), enquanto substâncias mucosas neutras foram coradas em azul púrpura com Ácido Periódico-Schiff (PAS). Conforme ilustrado na Fig. 1g, a coloração AB-PAS revelou que as células caliciformes coradas positivamente na mucosa colônica estavam densamente distribuídas em ambos os lados das criptas, exibindo uma forma regular e cheia no grupo normal de camundongos.
Em contraste, o grupo DSS apresentou apenas algumas criptas remanescentes na lâmina, levando a uma diminuição notável no número de células caliciformes coradas positivamente que contêm muco. No entanto, após o tratamento com SP, a perda de células caliciformes foi notavelmente atenuada. A mucina 2 (MUC-2), produzida pelas células caliciformes, é um componente principal da barreira de muco do cólon. A coloração imunofluorescente revelou que a secreção de MUC-2 na colite induzida por DSS foi significativamente diminuída em comparação ao grupo CON. Por outro lado, um aumento na expressão de MUC-2 foi observado após a administração de SP (Fig. 1h).

O aumento da permeabilidade intestinal permite a entrada de substâncias estranhas e compromete a integridade da função de barreira. Em seguida, avaliamos a permeabilidade intestinal medindo os níveis séricos de FITC-dextrano. Os níveis séricos de FITC-dextrano estavam acentuadamente elevados nos camundongos induzidos por DSS em comparação aos do grupo CON; no entanto, essa elevação foi atenuada pela administração de SP (Fig. 1i). Os resultados indicam que a SP reparou efetivamente o comprometimento da barreira intestinal e diminuiu a permeabilidade do epitélio intestinal. Estudos anteriores mostraram que fatores pró-inflamatórios excessivos estão associados à destruição do epitélio intestinal. Medimos ainda os níveis de citocinas inflamatórias nos tecidos do cólon usando ensaios multiplex Luminex (Fig. 1j). As quantidades de TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ e IL-12P70 foram dramaticamente maiores no grupo DSS do que no grupo CON. De particular nota, após a administração de SP, os níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ e IL-12P70 foram reduzidos. Curiosamente, nenhum sintoma clínico óbvio ou alterações histopatológicas foram observados no grupo tratado apenas com SP em comparação ao grupo CON. Esses dados sugerem que a SP pode preservar a integridade da barreira intestinal e aliviar a inflamação do cólon.
Há um crescente corpo de evidências sugerindo que comportamentos semelhantes à ansiedade são comumente observados em pacientes com DII, mas o impacto da SP nas anormalidades comportamentais associadas à DII não foi comprovado. No presente estudo, empregamos o teste de campo aberto (OFT), o labirinto em cruz elevado (EPM), o labirinto zero elevado (EZM) e a caixa claro-escuro (LDB) para avaliar os efeitos da SP em comportamentos semelhantes à ansiedade em camundongos induzidos por DSS. No teste OFT, a distância total percorrida em toda a área, bem como o tempo gasto e a distância percorrida na região central no grupo DSS foi dramaticamente menor do que no grupo CON, demonstrando que o DSS reduziu notavelmente a atividade autônoma e o desejo de exploração dos camundongos. No entanto, a SP reverteu significativamente esse fenômeno (Fig. 1k, l). Além disso, a potencial atividade ansiolítica da SP, avaliada pelo EPM em camundongos, é apresentada na Fig. 1m, n e na Fig. Suplementar 3a. Os resultados demonstraram que o grupo DSS apresentou menor porcentagem de distância percorrida e tempo gasto nos braços abertos, juntamente com menor porcentagem de entradas nos braços abertos e redução da distância total percorrida, em comparação ao grupo CON. Em contraste, o tratamento com SP reverteu efetivamente as alterações comportamentais induzidas pelo DSS. Como uma modificação do EPM, o EZM é utilizado para avaliar comportamentos semelhantes à ansiedade. Examinamos os efeitos ansiolíticos da SP através do teste EZM. Conforme mostrado na Fig. 1o, p e na Fig. Suplementar 3b, a porcentagem de distância percorrida e tempo gasto nas zonas abertas, a porcentagem de vezes que entraram nas zonas abertas e a distância total percorrida no grupo DSS foram significativamente menores do que no grupo CON. No entanto, o grupo DSS + SP apresentou porcentagem significativamente maior de distância percorrida e tempo gasto nas zonas abertas, porcentagem de vezes que entraram nas zonas abertas e distância total percorrida em comparação ao grupo modelo. No teste LDB, em comparação ao grupo CON, os camundongos expostos ao DSS apresentaram menor porcentagem de distância percorrida e porcentagem de tempo gasto na caixa clara, indicando que a exposição ao DSS diminuiu o desejo de exploração dos camundongos, juntamente com menor distância total percorrida. Por outro lado, o tratamento com SP aumentou a porcentagem de distância percorrida na caixa clara, a porcentagem de tempo gasto na caixa clara e a distância total percorrida (Fig. 1q e Fig. Suplementar 3c). Além disso, os camundongos podiam se mover livremente entre as caixas clara e escura, com o número de passagens pela porta mostrado na Fig. 1q. No entanto, não foram observadas diferenças nas frequências de transição entre os quatro grupos. Notavelmente, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre o grupo CON e o grupo tratado apenas com SP em todas as análises comportamentais. Coletivamente, esses dados sugerem que a SP protege contra comportamentos semelhantes à ansiedade em camundongos com colite.
Considerando que o mal-estar potencial induzido pela inflamação pode afetar a leitura comportamental da ansiedade, avaliamos o comportamento do tipo ansioso quando a inflamação colônica foi eliminada. Conforme mostrado na Fig. Suplementar 4a-c, após a retirada do DSS (dia 15), o DAI e a estrutura do tecido colônico nos grupos DSS e DSS + SP se recuperaram aos níveis do grupo normal. Para além disso, examinamos os efeitos ansiolíticos do SP utilizando os testes OFT e EPM. No teste OFT, foi gasto menos tempo e percorrida uma distância menor na área central nos camundongos tratados com DSS em comparação com o grupo CON. Em contraste, o SP melhorou notavelmente essas alterações comportamentais (Fig. Suplementar 5a-c). No teste EPM, a porcentagem de entradas nos braços abertos, bem como a porcentagem de tempo gasto e distância percorrida nos braços abertos, foram significativamente diminuídas no grupo DSS em relação ao grupo CON. No entanto, o SP reverteu profundamente essas alterações (Fig. Suplementar 5e-h). Notavelmente, nenhuma diferença significativa na distância total percorrida foi observada entre os três grupos nos testes OFT e EPM, indicando que a atividade locomotora foi recuperada (Fig. Suplementar 5d, i). Esses resultados indicam que o comportamento do tipo ansioso associado à colite é persistente, mesmo após o desconforto potencial induzido pela inflamação intestinal ter sido resolvido; enquanto isso, o SP exerce efeitos ansiolíticos.
SP mitiga danos hipocampais e neuroinflamação em camundongos induzidos por DSS
SP mitiga danos hipocampais e neuroinflamação em camundongos induzidos por DSS.
a, b Imagem representativa da coloração H&E no hipocampo e quantificação de células com lesões. n = 6 camundongos/grupo. c, d Imagens representativas da coloração de Nissl e quantificação de neurônios hipocampais com lesões. n = 4 camundongos/grupo. e, f Mapas de calor e concentrações de citocinas pró-inflamatórias representativas, IL-1β, TNF-α, IL-9, IFN-γ, IL-13, IL-6 IL-4, IL-5, G-CSF, IL-10, GM-CSF, IL-10, GM-CSF, MIP-1β e IL-12P70 no hipocampo. n = 4 camundongos/grupo. g, h Imagens de imunofluorescência de DAPI (azul) e Iba-1 (vermelho) na região DG do hipocampo, e análise quantitativa do número de micróglias positivas para Iba-1. Barra de escala = 50 μm. n = 3 camundongos/grupo. i, j Imagens de imunofluorescência de GFAP (vermelho) e DAPI (azul) na região DG do hipocampo, análise quantitativa do número de astrócitos positivos para GFAP. Barra de escala = 50 μm. n = 3 camundongos/grupo. k Análise por Western blot das expressões das proteínas GFAP e iNOS no hipocampo. l Quantificação dos valores normalizados dos níveis de GFAP e iNOS com β-actina. n = 3 experimentos independentes. Os dados foram apresentados como média ± DP. A significância estatística foi determinada usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *P  ≤  0,05, **P  ≤  0,01, ***P  ≤  0,001. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
O comprometimento do hipocampo pode afetar a função do centro de regulação emocional, o que pode levar a transtornos psiquiátricos, como depressão e ansiedade. Portanto, a coloração H&E tem sido utilizada para avaliar alterações morfológicas no hipocampo de cada grupo. Como mostrado na Fig. 2a, b, alterações patológicas significativas, como perda neuronal, condensação nuclear e encolhimento neuronal, foram observadas no grupo DSS. No entanto, os corpos celulares estavam claramente visíveis e pareciam contínuos e uniformes, sem rupturas óbvias no grupo DSS + SP. Notavelmente, nenhuma alteração patológica aparente foi observada entre o tratamento apenas com SP e o grupo CON. A coloração de Nissl foi realizada para analisar os potenciais efeitos do SP na distribuição das células neuronais. Os resultados mostraram que o grupo DSS exibiu uma grande perda de corpúsculos de Nissl e células desorganizadas e dispostas de forma frouxa na região DG do hipocampo. Em contraste com o grupo DSS, o SP atenuou acentuadamente o dano neuronal causado pelo DSS, ajudando a preservar a estrutura morfológica neuronal e o número de corpúsculos de Nissl. A densidade e distribuição neuronal nas regiões CA1 e CA3 não exibiram alterações óbvias entre os quatro grupos (Fig. 2c, d). A resposta neuroinflamatória demonstrou agravar o comprometimento do hipocampo e perturbar o importante equilíbrio dos neurotransmissores, afetando assim a regulação emocional e causando transtornos do tipo ansiedade. Aqui, para explorar o papel do SP na mitigação da neuroinflamação, investigamos as concentrações de mediadores inflamatórios no tecido hipocampal (Fig. 2e, f). Os resultados mostraram que o SP diminuiu significativamente os níveis de IL-1beta, TNF-alfa, IL-9, IFN-gama, IL-13, IL-6, G-CSF, GM-CSF, MIP-1bata e IL-12P70, mas elevou os níveis de IL-4, IL-5 e IL-10 no hipocampo de camundongos tratados com DSS. Esses resultados sugerem que o SP mitiga a neuroinflamação hipocampal induzida por DSS ao modular o equilíbrio entre citocinas pró-inflamatórias e fatores anti-inflamatórios.
Estudos anteriores demonstraram a ativação da micróglia em resposta à neuroinflamação. Além disso, os astrócitos também têm a capacidade de exibir atividades anti-inflamatórias e neuroprotetoras no contexto da neuroinflamação, como na doença de Parkinson ou na esclerose múltipla. Para investigar como a SP afeta a micróglia/astrócitos, contamos os dois tipos celulares no hipocampo de cada grupo. Conforme ilustrado na Fig. 2g, h, a análise de imunofluorescência foi realizada para as regiões DG e CA1, e os resultados mostraram que o número de células microgliais Iba-1-positivas estava elevado no grupo DSS em comparação ao grupo CON; no entanto, o grupo SP exibiu uma regulação negativa significativa nas células Iba-1-positivas. Por outro lado, um aumento nas células GFAP-positivas, marcador de astrócitos, foi observado no grupo SP em comparação ao grupo DSS (Fig. 2i, j). O fenótipo M1 da micróglia está intimamente associado à promoção da neuroinflamação. Micróglias M1 ativadas secretam mediadores pró-inflamatórios para exacerbar o dano neuronal e perturbar a função homeostática do SNC. Para elucidar o fenótipo característico da micróglia ativada, a expressão do marcador associado a M1, iNOS, foi analisada por western blot. Conforme mostrado na Fig. 2k, l, o nível proteico de iNOS estava marcadamente aumentado em camundongos tratados com DSS em comparação com os camundongos do grupo CON, enquanto a suplementação com SP reverteu essa alteração. Simultaneamente, os dados do western blot mostraram resultados consistentes com a análise de imunofluorescência, revelando aumento da expressão proteica de GFAP após o tratamento com SP (Fig. 2k, l). Pode-se inferir razoavelmente que a SP melhorou o comportamento do tipo ansioso em camundongos com colite ao atenuar as lesões patológicas e a neuroinflamação no hipocampo, o que pode estar relacionado à supressão da polarização da micróglia em direção ao fenótipo M1 e à prevenção da perda de astrócitos.
A SP melhora a disbiose microbiana intestinal e altera as funções do microbioma em camundongos induzidos por DSS
Para avaliar se a SP poderia atravessar a barreira hematoencefálica e afetar diretamente o cérebro, avaliamos a expressão de SP no hipocampo entre diferentes grupos usando ELISA. Não encontramos diferenças significativas na concentração de SP entre os grupos CON, DSS e DSS + SP (Fig. Suplementar 6a). Além disso, a SP é produzida pela clivagem enzimática da proteína precursora (pré-protacinina-A). A análise de RT-qPCR revelou que, após a administração de SP, a expressão do mRNA de TAC1, que codifica a pré-protacinina-A no hipocampo do grupo DSS + SP, não diferiu significativamente daquela no grupo DSS (Fig. Suplementar 6b). Esses resultados sugerem que a administração de SP não conseguiu atravessar efetivamente a barreira hematoencefálica para exercer seus efeitos no cérebro.
A SP melhora a disbiose microbiana intestinal e altera as funções do microbioma em camundongos induzidos por DSS.
a Diversidade α representada pelo índice de Shannon, com ANOVA one-way bilateral. b Análise de coordenadas principais (PCoA) da microbiota intestinal baseada na distância binária de Jaccard. PERMANOVA: R2 =  0,331, valor P bilateral  =  0,001. PERMANOVA: análise multivariada permutacional de variância. c Distribuições taxonômicas da composição bacteriana intestinal ao nível de filo. d Distribuições taxonômicas da composição bacteriana intestinal ao nível de família. e Distribuições taxonômicas da composição bacteriana intestinal ao nível de gênero. f Bactérias importantes com base na análise de floresta aleatória. g–i A ANOVA mostra a abundância relativa da microbiota intestinal dominante em cada grupo, ao nível de filo e gênero, respectivamente. n = 6 camundongos/grupo. Os bigodes indicam os valores mínimo e máximo observados dentro do intervalo de Q1 − 1,5 × IQR a Q3  +  1,5 × IQR. A caixa revela o intervalo interquartil (IQR) entre os percentis 25 (Q1) e 75 (Q3), e a linha dentro da caixa representa a mediana (percentil 50). j, k Análise diferencial da função do microbioma intestinal prevista pelo PICRUSt2 com base no banco de dados KEGG. Os valores de P foram determinados usando o teste t de Student bilateral. n = 6 camundongos/grupo. As barras de erro representam a proporção das diferenças na abundância de microbiota funcional dentro de um intervalo de confiança de 95%. n  =  6 para sequenciamento do gene 16S rRNA. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Pesquisas emergentes estabeleceram uma forte ligação entre alterações no microbioma intestinal e condições relacionadas à ansiedade. Para investigar se SP poderia mitigar os desequilíbrios da microbiota induzidos pela exposição ao DSS, a composição da microbiota intestinal foi analisada por sequenciamento do gene 16S rRNA. Avaliamos a alteração na diversidade α usando o índice de Shannon. Em comparação com a indução por DSS, SP não pareceu ter um impacto significativo na riqueza e diversidade da flora intestinal (Fig. 3a). Para avaliar completamente a diversidade β das comunidades microbianas, a estrutura geral da microbiota intestinal foi definida usando uma análise de coordenadas principais (PCoA) com base na distância binária de Jaccard (Fig. 3b). Diferenças significativas na diversidade β foram observadas entre os grupos CON, DSS e DSS + SP (PERMANOVA, p = 0,001), indicando que as estruturas da comunidade bacteriana eram significativamente diferentes. No nível de filo, em comparação com o grupo CON, o grupo DSS apresentou enriquecimentos em Bacteroidetes e Proteobacteria, enquanto em comparação com o grupo DSS, o grupo DSS + SP exibiu uma maior abundância relativa de Firmicutes (Fig. 3c). No nível de família, a abundância relativa de Bacteroidaceae e Enterobacteriaceae foi elevada no grupo DSS em comparação com o grupo CON, enquanto a abundância relativa de Lachnospiraceae e Muribaculaceae foi significativamente aumentada no grupo DSS + SP, em comparação com o grupo DSS (Fig. 3d). No nível de gênero, a abundância relativa de Bacteroides e Alistipes foi reduzida, e a de unclassified_Lachnospiraceae, unclassified_Muribaculaceae e Lachnospiraceae_NK4A136_group foi regulada positivamente no grupo DSS + SP, em comparação com aquelas no grupo DSS (Fig. 3e). A análise de floresta aleatória previu que g_Unclassified_Christensenellaceae e g_Parasutterella poderiam ser classificações bacterianas proeminentes, que tiveram um impacto significativo nas diferenças entre os grupos (Fig. 3f). Análise de variância unidirecional (ANOVA) foi realizada para comparar a abundância relativa de espécies dominantes entre os três grupos. No nível de filo, uma abundância significativamente maior de p_Firmicutes foi observada em camundongos tratados com SP em comparação com camundongos tratados com DSS. A exposição ao DSS provocou uma escalada substancial na abundância de p_Bacteroides, que também foi dramaticamente revertida por SP (Fig. 3g).
Enquanto isso, no nível de gênero, g_Bacteroides e g_Escherichia_Shigella foram notavelmente reduzidos em abundância no grupo SP em comparação ao grupo DSS, enquanto g_unclassified_Muribaculaceae, g_Prevotellaceae_UCG_001, g_Candidatus_Arthromitusm, bem como g_unclassified_Lachnospiraceae foram significativamente mais abundantes no grupo SP (Fig. 3h, i). A análise de Investigação Filogenética de Comunidades por Reconstrução de Estados Não Observados (PICRUSt2) foi utilizada para prever a função metabólica microbiana intestinal. Em comparação com o grupo CON, vários módulos funcionais no grupo DSS (por exemplo, via das pentoses fosfato, formação de biofilme - Vibrio cholerae, metabolismo de glicerolipídios, quorum sensing, fotossíntese) foram encontrados suprimidos (Fig. 3j). Em contraste, o grupo DSS + SP apresentou aumento de atividade em módulos funcionais, como reparo por excisão de nucleotídeos, metabolismo de fosfato de inositol, metabolismo de metano, secreção biliar, via de sinalização de receptores do tipo NOD, sinalização de células epiteliais na infecção por Helicobacter pylori e absorção de minerais) em comparação ao grupo DSS (Fig. 3k). No geral, esses dados sugerem que a administração de SP protegeu contra a disbiose da microbiota intestinal induzida por DSS em camundongos.
Além disso, investigamos os efeitos regulatórios do SP na composição da microbiota intestinal usando análise de sequenciamento do rRNA 16S do conteúdo do cólon em camundongos sem colite. Notavelmente, a análise de diversidade α, avaliada pelo índice de Shannon, não revelou diferenças significativas na riqueza e diversidade bacteriana entre os dois grupos (Figura Suplementar 7a). A estrutura geral da microbiota intestinal, investigada usando PCoA baseado em Jaccard binário, indicou que o grupo SP exibiu uma mudança no agrupamento da composição bacteriana, distinta do grupo CON, sugerindo que o tratamento com SP induziu alterações na composição da microbiota intestinal (Figura Suplementar 7b). Em seguida, analisamos a composição bacteriana intestinal em nível de gênero. Os resultados revelaram que o SP reduziu significativamente a abundância relativa de Limosilactobacillus e Bacteroides em comparação com camundongos controle. Por outro lado, a abundância de não_classificado_Muribaculaceae, grupo_Lachnospiraceae_NK4A136 e não_classificado_Lachnospiraceae foi significativamente aumentada em camundongos tratados com SP em comparação com camundongos controle (Figura Suplementar 7c). As diferenças na abundância relativa da microbiota intestinal em nível de gênero entre o grupo CON e o grupo SP foram analisadas usando ANOVA (Figura Suplementar 7d).

O SP protege contra danos intestinais e transtornos do tipo ansiedade induzidos por DSS através da modulação da microbiota intestinal

O SP protege contra danos intestinais e transtornos do tipo ansiedade induzidos por DSS de maneira dependente da microbiota intestinal.

a Diagrama esquemático do desenho experimental (Alguns elementos esquemáticos foram criados pelo Figdraw.com). b, c Comparação da unidade formadora de colônia (UFC) bacteriana nas fezes sob condição aeróbica em LB. n = 6 camundongos/grupo. d Índice de atividade da doença. n = 6 camundongos/grupo. e Gráfico de linhas mostrando as mudanças no peso corporal após o tratamento com ABX. n = 5 camundongos/grupo (ABX-CON) e 4 camundongos/grupo (ABX-DSS, ABX-DSS + SP). f Imagens representativas do cólon. g Imagens representativas do baço. h, i Imagens representativas de cortes corados com H&E e escores histológicos. Barra de escala = 100 μm. n = 5 camundongos/grupo. j, k Imagens representativas da camada de muco interna do cólon corada com Azul Alciano, e o número de células caliciformes por cripta. Barra de escala = 100 μm. n = 6 camundongos/grupo. l Mapa do percurso do OFT. m Distância percorrida, distância na região central e tempo gasto na região central. n = 6 camundongos/grupo (CON, DSS + SP) e 5 camundongos/grupo (os grupos restantes). Os dados foram apresentados como médias ± DP. Para a medição das UFC, foi realizada ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey, e o restante das estatísticas foi analisado usando ANOVA de duas vias. *P  ≤  0,05, **P  ≤  0,01, ***P  ≤  0,001. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Com base em nossas evidências de que a SP regula eficazmente a microbiota intestinal para aliviar a colite, investigamos mais a fundo o possível papel da microbiota intestinal na mitigação da colite e dos comportamentos do tipo ansiedade após o tratamento com SP. Para isso, foi realizado um tratamento com antibióticos em camundongos por 14 dias para eliminar a microbiota intestinal, conforme ilustrado na Fig. 4a. Ao final do tratamento com ABX (no dia 14), a adição de antibióticos reduziu drasticamente a microbiota em condições aeróbicas (Fig. 4b, c). Após o tratamento com DSS (no dia 21), a microbiota permaneceu significativamente reduzida em comparação ao grupo normal, embora um ligeiro aumento tenha sido observado. Além disso, a análise de DNA fecal revelou que o DNA fecal dos camundongos tratados com antibióticos (no dia 14) e continuamente tratados com DSS por 6 dias (no dia 21) foi menor do que o dos camundongos normais (Fig. Suplementar 8a). A perturbação da microbiota induzida por antibióticos pode desregular a homeostase intestinal e comprometer a integridade das defesas intestinais. Como esperado, o aumento significativo do ceco foi consistente com as características típicas observadas em camundongos pseudo-livres de germes (PGF) em comparação com camundongos não tratados (Fig. 4f). Esses resultados indicam que a administração do coquetel de antibióticos desestruturou a composição da microbiota e reduziu eficazmente a microbiota intestinal nos dias 14 e 21, sugerindo que um modelo de camundongo PGF foi estabelecido com sucesso.
Análises subsequentes indicaram que a intervenção com antibióticos não teve efeito significativo no peso corporal dos camundongos saudáveis (Fig. Suplementar 8b). Surpreendentemente, os efeitos benéficos da SP nos sintomas clínicos, como DAI (Fig. 4d), peso corporal (Fig. 4e), comprimento do cólon (Fig. 4f e Fig. Suplementar 9a), razão baço/peso corporal (Fig. 4g e Fig. Suplementar 9b) e integridade estrutural intestinal (Fig. 4h-k e Fig. Suplementar 9c), foram notavelmente enfraquecidos na ausência do microbioma intestinal nos camundongos. Consistentemente, os comportamentos do tipo ansiedade melhorados pelo tratamento com SP foram completamente revertidos após a depleção da microbiota intestinal (Fig. 4l-m). Esses resultados indicam que a microbiota intestinal pode exercer efeitos na proteção da SP contra a colite e o comportamento do tipo ansiedade.
O experimento de FMT revela que a SP atenua a colite e o comportamento do tipo ansiedade induzidos por DSS através da modulação da microbiota intestinal.
a Ilustração esquemática do desenho experimental (alguns elementos esquemáticos foram criados pelo Figdraw.com). b Alteração do peso corporal. n = 5 camundongos/grupo. c Índice de atividade da doença. n = 5 camundongos/grupo. d, e Imagens representativas e comprimento do cólon. n = 6 camundongos/grupo. f Imagens representativas da coloração H&E dos tecidos do cólon de cada grupo. Barra de escala = 100 µm. n = 5 camundongos/grupo. g, h Coloração AB-PAS do cólon murino e o número de células caliciformes por cripta. Barra de escala = 100 µm. n = 6 camundongos/grupo. i Determinação dos níveis de IL-6 (n = 8 camundongos/grupo) e TNF-α (n = 8 camundongos/grupo) por ELISA no cólon e atividade de MPO (n = 6 camundongos/grupo). j Traçados representativos durante o OFT de 5 min. k Distância da região central, n = 5 camundongos/grupo, tempo gasto na área central, n = 5 camundongos/grupo (FMT-CON) e 4 camundongos/grupo (FMT-DSS, FMT-DSS + SP) e distância total percorrida, n = 5 camundongos/grupo. l Imagens representativas da coloração H&E para as secções do hipocampo e análise quantitativa. Barra de escala = 100 µm. n = 6 camundongos/grupo. m Ensaio de RT-qPCR de citocinas inflamatórias (IL-6, TNF-α, IL-4 e IL-1β) no hipocampo. n = 5 camundongos/grupo. n Imagem de western blots mostrando a expressão proteica relativa de iNOS, CD80, CD206, GFAP e β-actina no hipocampo de camundongos. n = 3 experimentos independentes. o Dupla imunofluorescência para Iba-1 (vermelho)/iNOS (verde) nas regiões CA1 e DG do hipocampo e análise estatística. Barra de escala = 50 µm. n = 3 experimentos independentes. p Imagens representativas de imunofluorescência de dupla marcação para Iba-1 (vermelho) e CD206 (verde) em tecidos do hipocampo e análise estatística. Barra de escala = 50 µm. n = 3 experimentos independentes. q Análise de coordenadas principais (PCoA) da microbiota intestinal com base na distância binária de Jaccard. n = 6 camundongos/grupo. r Distribuições taxonômicas da composição bacteriana intestinal no nível de filo. n = 6 camundongos/grupo. s Distribuições taxonômicas da composição bacteriana intestinal no nível de gênero. n = 6 camundongos/grupo. t Resultado da ANOVA mostrando a abundância relativa da microbiota intestinal dominante no nível de gênero em cada grupo. n = 4 camundongos/grupo. Os dados foram apresentados como média ± DP. Para o escore DAI e a alteração do peso corporal, foi realizada ANOVA de medidas repetidas de duas vias e as demais estatísticas foram analisadas usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Para confirmar ainda mais o papel putativo da microbiota intestinal nos efeitos protetores do SP, transplantamos as fezes de camundongos doadores CON, DSS e DSS + SP em camundongos receptores por uma semana (Antes do FMT, todos os camundongos receptores foram pré-tratados com antibióticos por 14 dias). Como mostrado na Fig. 5a, o grupo FMT-DSS + SP, que recebeu fezes do grupo DSS + SP, apresentou menor perda de peso corporal (Fig. 5b), menor DAI (Fig. 5c), alívio do encurtamento do cólon (Fig. 5d, e) e diminuição da relação baço/peso corporal (Fig. Suplementar 10a, b) quando comparado ao grupo FMT-DSS, que recebeu fezes do grupo DSS. Conforme ilustrado na Fig. 5f, os camundongos submetidos à indução por FMT-DSS exibiram danos histológicos pronunciados, com comprometimento epitelial, perda de criptas e infiltração de células inflamatórias, mas essas alterações patológicas foram notavelmente atenuadas após o tratamento com FMT-DSS + SP, evidenciado por menores escores histológicos e aumento da profundidade das criptas (Fig. Suplementar 10c). A coloração AB-PAS revelou que, no processo de colite, as reduções nas abundâncias de mucina ácida e neutra, bem como na quantidade de células caliciformes, foram amplamente restauradas a níveis normais através do FMT de camundongos doadores tratados com SP (Fig. 5g, h). Para avaliar os efeitos do tratamento com FMT-DSS + SP nas citocinas, medimos as concentrações de fatores inflamatórios no cólon usando ELISA. Níveis elevados de TNF-α e IL-6 foram observados no cólon do grupo FMT-DSS; no entanto, esses níveis foram atenuados após o tratamento com FMT-DSS + SP (Fig. 5i). Além disso, a mieloperoxidase (MPO), uma enzima encontrada em neutrófilos, serve como um índice comum para inflamação, com o aumento da atividade da MPO indicando maior infiltração de neutrófilos no cólon. O tratamento com FMT-DSS resultou em aumento da atividade da MPO em comparação com camundongos FMT-CON, enquanto o tratamento com FMT-DSS + SP reduziu significativamente a atividade da MPO (Fig. 5i).
Investigamos a influência do FMT de camundongos tratados com DSS+SP nas características comportamentais de camundongos com colite. Para começar, um teste de campo aberto foi realizado para avaliar seu comportamento do tipo ansioso. Distância percorrida reduzida na área central, menos tempo gasto na área central e distância total percorrida reduzida foram observados em camundongos com colite tratados com FMT-DSS em comparação com o grupo FMT-CON. No entanto, o tratamento com FMT-DSS+SP melhorou profundamente essas alterações comportamentais no grupo FMT-DSS (Fig. 5j, k). Além disso, a coloração H&E foi realizada para validar as alterações histopatológicas observadas no hipocampo. Conforme mostrado na Fig. 5l, a degeneração celular e núcleos danificados ou encolhimento nuclear foram aumentados nos camundongos FMT-DSS em comparação com o grupo FMT-CON nas regiões DG e CA3. Todos esses efeitos observados foram aliviados pelo tratamento com FMT-DSS+SP. Na Fig. 5m, os níveis de mRNA de citocinas inflamatórias como TNF-α e IL-1β no hipocampo exibiram uma tendência ascendente óbvia no grupo DSS, e a expressão de mRNA de IL-4 foi regulada negativamente, mas o tratamento com FMT-DSS+SP foi capaz de impedir as alterações induzidas por FMT-DSS. Além disso, nenhuma diferença significativa foi observada na expressão de mRNA de IL-6 entre os grupos FMT-DSS e FMT-DSS+SP. Da mesma forma, a análise de western blot mostrou que os níveis de proteína de iNOS e CD80 foram significativamente regulados negativamente no hipocampo do grupo FMT-DSS+SP quando comparado ao grupo FMT-DSS, no entanto, o tratamento com FMT-DSS+SP suprimiu significativamente a diminuição induzida por FMT-DSS na expressão da proteína CD206 (Fig. 5n e Fig. Suplementar 11a-c). Além disso, o FMT de camundongos tratados com DSS+SP teve uma regulação positiva significativa nas expressões da proteína GFAP em comparação com o FMT de camundongos tratados com DSS, implicando que o tratamento com FMT-DSS+SP poderia inibir o declínio dos astrócitos induzido pelo tratamento com FMT-DSS (Fig. 5n e Fig. Suplementar 11d). Para esclarecer o fenótipo característico da micróglia ativada no hipocampo, a co-localização de iNOS (marcador associado a M1) ou CD206 (marcador associado a M2) com Iba-1 foi analisada usando coloração por imunofluorescência dupla, respectivamente. Os dados mostraram que após o tratamento com FMT-DSS, o número de células imunopositivas para iNOS (iNOS+) aumentou no hipocampo, incluindo as regiões CA1 e DG. No entanto, os números foram significativamente menores no grupo FMT-DSS+SP do que no grupo FMT-DSS (Fig. 5o e Fig. Suplementar 11e). Da mesma forma, observamos que a micróglia imunopositiva para CD206 (CD206+) era escassa após o tratamento com FMT-DSS, enquanto em comparação com o grupo FMT-DSS, o grupo FMT-DSS+SP mostrou um aumento dramático no número de micróglia CD206+ (Fig. 5p e Fig. Suplementar 11f).
A microbiota doadora foi originada dos grupos CON, DSS e DSS + SP, cuja composição da microbiota intestinal foi mostrada na Fig. 3. Para investigar a reconstrução da microbiota nos grupos receptores, analisamos a microbiota intestinal no conteúdo colônico de camundongos FMT-CON, FMT-DSS e FMT-DSS + SP usando análise de sequenciamento do gene 16S rRNA. Primeiramente, o índice de Shannon, indicativo de riqueza da flora intestinal, mostrou um aumento na diversidade da microbiota intestinal no grupo FMT-DSS + SP, em comparação ao grupo FMT-DSS, embora não tenham sido observadas diferenças significativas entre os grupos (Fig. Suplementar 12). A PCoA usando distâncias binárias de Jaccard demonstrou que a microbiota intestinal desses três grupos estava distintamente separada, indicando diferenças na composição microbiana (Fig. 5q). Como visto na Fig. 5r, o tratamento com FMT-DSS + SP aumentou a abundância de p_Firmicutes e p_Bacteroidetes enquanto diminuiu a abundância de p_Proteobacteria em comparação ao grupo FMT-DSS. Além disso, o tratamento com FMT-DSS + SP resultou em um aumento nas abundâncias de g_unclassified_Muribaculaceae e g_unclassified_Lachnospiraceae, enquanto as abundâncias relativas de g_Bacteroides e g_Ligilactobacillus foram reduzidas em comparação ao grupo FMT-DSS (Fig. 5s). ANOVA foi conduzida ao nível de gênero para identificar as espécies para análise de box plot de abundância relativa, permitindo a comparação da microbiota intestinal dominante que diferiu significativamente entre os três grupos. Em comparação ao grupo FMT-DSS, as abundâncias relativas de unclassified_Muribaculaceae, unclassified_Lachnospiraceae e Lactobacillus foram elevadas, enquanto as abundâncias de unclassified_Bacillaceae, uncultured_proteobacterium, Ligilactobacillus e Bacteroides foram reduzidas no grupo FMT-DSS + SP (Fig. 5t). Portanto, FMT de camundongos tratados com DSS + SP melhorou efetivamente o desequilíbrio da microbiota intestinal. Em conjunto, a microbiota intestinal desempenha um papel importante e putativo na proteção da SP contra colite, dano hipocampal e transtornos do tipo ansiedade.
SP afeta a expressão de genes hipocampais pela modulação do microbioma intestinal, envolvendo as vias de sinalização NF-κB e GABAérgica/Ca2+
SP afeta a expressão de genes hipocampais pela modulação do microbioma intestinal, envolvendo as vias de sinalização NF-κB e GABAérgica/Ca2+
a, b Mapas de calor revelando expressão gênica diferencial nos grupos FMT-DSS vs FMT-CON, FMT-DSS + SP vs FMT-DSS. n = 4 camundongos/grupo. Os genes relacionados à via foram selecionados (log2 fold change pelo menos > 1, p  <  0,05). c, d Análise KEGG dos genes totais, regulados positivamente e regulados negativamente no grupo FMT-DSS em comparação com o grupo FMT-CON (Top 20). n = 4 camundongos/grupo. e, f Análise KEGG dos genes totais, regulados positivamente e regulados negativamente no grupo FMT-DSS + SP vs o grupo FMT-DSS (Top 20). n = 4 camundongos/grupo. g Análise por PCR quantitativo em tempo real das expressões de mRNA dos genes da via de sinalização NF-κB (p65 e IKBα) no hipocampo. n = 4 camundongos/grupo. As hastes indicam os valores mínimo e máximo observados dentro do intervalo de Q1 − 1,5 × IQR a Q3  +  1,5 × IQR. A caixa revela o intervalo interquartil (IQR) entre os percentis 25 (Q1) e 75 (Q3), e a linha dentro da caixa representa a mediana (percentil 50). h A expressão proteica de p-p65 e p-IKBα no tecido do hipocampo, conforme determinado por western blotting. n = 3 experimentos independentes. i Análise por PCR quantitativo em tempo real das expressões de mRNA dos genes do receptor GABA e da sinalização de Ca2+ (Gabra1, Gabra3, Gabrg2, Gabrb2 e Camk2d). n = 4 camundongos/grupo. As hastes indicam os valores mínimo e máximo observados dentro do intervalo de Q1 − 1,5 × IQR a Q3  +  1,5 × IQR. A caixa revela o intervalo interquartil (IQR) entre os percentis 25 (Q1) e 75 (Q3), e a linha dentro da caixa representa a mediana (percentil 50). j As expressões proteicas de GABAAR, GABABR, GAD65 e CaMKII foram medidas no tecido do hipocampo por western blot. n = 3 experimentos independentes. k Imagens representativas de imunofluorescência de dupla marcação para p-IKBα (vermelho)/Iba1 (verde) em tecidos do hipocampo. Barra de escala = 50 μm. n = 3 experimentos independentes. I Imagens representativas de imunofluorescência de dupla marcação para GABAAR (verde)/GFAP (vermelho) em tecidos do hipocampo. Barra de escala = 50 μm. n = 3 experimentos independentes. m Dupla marcação por imunofluorescência para CaMKII (verde)/GFAP (vermelho) em tecidos do hipocampo e análise estatística. Barra de escala = 50 μm. n = 3 experimentos independentes. n As expressões gênicas diferenciais foram apresentadas pelo heatmap em micróglia de três grupos, e análise GSEA de micróglia do grupo FMT-DSS + SP vs o grupo FMT-DSS. n = 4 camundongos/grupo. o Mapas de calor da expressão gênica diferencial em astrócitos de três grupos e análise GSEA de astrócitos do grupo FMT-DSS + SP vs o grupo FMT-DSS. n = 4 camundongos/grupo. Os dados foram apresentados como médias ± DP. A significância estatística foi determinada usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *P  ≤  0,05, **P  ≤  0,01, ***P  ≤  0,001. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo Source Data.
Ao modular o microbioma intestinal, a SP reduz a lesão patológica e as respostas neuroinflamatórias no hipocampo, melhorando assim o comportamento do tipo ansioso, mas o mecanismo de ação potencial permanece incerto. Para explorar como a SP afeta a função do hipocampo mediada pela flora intestinal, realizamos a análise de RNA-seq no hipocampo de camundongos submetidos ao tratamento com FMT. A análise de componentes principais (PCA) mostrou que houve diferenças significativas nos transcriptomas entre os três grupos com quatro réplicas independentes (Fig. Suplementar 13a). Em comparação com o grupo FMT-CON, 436 genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados no grupo FMT-DSS, dos quais 271 foram regulados positivamente e 165 foram regulados negativamente. Além disso, 387 genes significativamente alterados foram identificados nos grupos FMT-DSS+SP vs. FMT-DSS. Entre eles, 82 genes foram regulados positivamente e 305 genes foram regulados negativamente pelo tratamento com FMT-DSS+SP (Fig. Suplementar 13b). Um diagrama de Venn revelou que havia 436 DEGs regulados por FMT-DSS entre os grupos FMT-DSS e FMT-CON, 387 DEGs regulados por SP entre os grupos FMT-DSS+SP e FMT-DSS, e 158 genes que foram co-regulados pelo tratamento com FMT-DSS e FMT-DSS+SP (Fig. Suplementar 13c). O perfil de expressão gênica no hipocampo comparando FMT-DSS com FMT-CON, ou comparando FMT-DSS+SP com o grupo FMT-DSS, foi apresentado em um heatmap hierárquico agrupado (Fig. 6a, b). O gráfico de vulcão também revelou resultados semelhantes nos grupos FMT-DSS vs. FMT-CON e nos grupos FMT-DSS+SP vs. FMT-DSS (Fig. Suplementar 13d, e). Para obter uma compreensão mais profunda dessas diferenças de sinalização, foi realizada a análise da via da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG). Os resultados mostraram o enriquecimento notável em uma série de vias de sinalização (top 20 enriquecidas), incluindo alterações reguladas positivamente ou negativamente, no FMT-DSS vs FMT-CON (Fig. 6c, d), bem como no FMT-DSS+SP vs FMT-DSS (Fig. 6e, f). Notavelmente, a via de sinalização NF-κB foi ativada no grupo FMT-DSS, o que pôde ser dramaticamente revertido pela administração de FMT-DSS+SP. A análise de RT-qPCR demonstrou que as expressões de mRNA de IKBα e p65 foram reguladas positivamente no hipocampo do grupo FMT-DSS em comparação com o grupo FMT-CON, no entanto, o tratamento com FMT-DSS+SP reverteu notavelmente esses processos (Fig. 6g). A análise de Western blotting demonstrou que as moléculas da via NF-κB, incluindo p-p65 e p-IKBα, foram reguladas positivamente no hipocampo do grupo FMT-DSS em comparação com o grupo FMT-CON, no entanto, o tratamento com FMT-DSS+SP reverteu notavelmente essas alterações (Fig. 6h e Fig. Suplementar 14a, b).
Notavelmente, a análise da via KEGG também revelou que as interações ligante-receptor neuroativo e a via de sinalização de Ca2+ foram significativamente ativadas no grupo FMT-DSS + SP. Entre a sinalização de interações ligante-receptor neuroativo, canais dependentes de ligantes, como o receptor de ácido gama-aminobutírico (GABAR), são permeáveis ao cálcio após ativação. Da mesma forma, as expressões de mRNA dos genes Gabra1, Gabra3, Gabrb2 e Camk2d foram reduzidas no grupo FMT-DSS em comparação com o grupo FMT-CON, mas o tratamento com FMT-DSS + SP suprimiu significativamente a redução desses genes no hipocampo (nenhuma alteração significativa foi observada no gene Gabrg2) (Fig. 6i). Consequentemente, o aumento da expressão proteica de GABAARα1, GABABR2, GAD65 (uma enzima chave responsável pela síntese de GABA) e CaMKII (um sensor de alteração na concentração de cálcio) nos tecidos do hipocampo do grupo FMT-DSS + SP foi ainda confirmado por ensaio de western blotting (Fig. 6j e Fig. Suplementar 14c-f). Além disso, o banco de dados UALCAN foi utilizado para investigar o possível envolvimento da via NF-κB e da sinalização GABAérgica/Ca2+ em pacientes com COAD. Nossa análise revelou que houve um aumento significativo nos níveis de mRNA de genes-chave relacionados ao NF-κB (Fig. Suplementar 15a-e), e as expressões de mRNA de genes na via de sinalização GABAérgica/Ca2+ foram reduzidas (Fig. Suplementar 15f-l).
Microglia, como atores-chave no processo de sinalização inflamatória, estão associadas à via de sinalização NF-κB, que é crucial para regular a inflamação. Empolgantemente, foi demonstrado que a SP previne a diminuição do número de astrócitos induzida pelo DSS. Sabe-se que os astrócitos desempenham muitas funções importantes que sustentam os neurônios e mantêm a saúde cerebral. Hipotetizamos que os efeitos do tratamento com FMT nas vias de sinalização NF-κB e GABAérgica/Ca²⁺ podem estar intimamente ligados a alterações na microglia e nos astrócitos. Para investigar isso, realizamos dupla imunofluorescência para testar a sinalização de p-IKBα dentro da microglia Iba1+ nas regiões CA1 e DG do hipocampo. Conforme mostrado na Fig. 6k e na Fig. Suplementar 14g, a administração de FMT-DSS aumentou significativamente o número de microglia p-IKBα+ no hipocampo dos camundongos. Em contraste, a microglia p-IKBα+ foi dramaticamente menor nos camundongos FMT-DSS + SP do que nos camundongos FMT-DSS. A imunorreatividade de GABAARα1 foi observada nos astrócitos, e o tratamento com FMT-DSS + SP elevou dramaticamente a expressão de GABAARα1 nos astrócitos (Fig. 6l e Fig. Suplementar 14h). Usando dupla imunofluorescência, a colocalização da CaMKII com o marcador de astrócito GFAP foi analisada. Da mesma forma, em consonância com os resultados do western blotting, o número de astrócitos CaMKII+ foi reduzido no grupo FMT-DSS, o que pôde ser revertido pelo tratamento com FMT-DSS + SP (Fig. 6m e Fig. Suplementar 14i). Para obter uma compreensão mais precisa dos mecanismos moleculares envolvidos na microglia e nos astrócitos, isolamos essas células do tecido hipocampal por separação por citometria de fluxo. Conforme ilustrado na Fig. Suplementar 16a, a microglia foi identificada como CD11b+CD45low, e os astrócitos foram identificados como ACSA2+. A microglia e os astrócitos coletados foram submetidos a análises separadas de sequenciamento de RNA. Um heatmap representou os genes diferencialmente expressos na via de sinalização NF-kappa B na microglia, revelando que o enriquecimento de genes nessa via era evidente no grupo FMT-DSS, mas ausente no grupo FMT-DSS + SP (Fig. 6n). A análise de vias KEGG dos genes diferencialmente expressos mostrou uma regulação negativa de vias pró-inflamatórias, incluindo a via de sinalização NF-kappa B, a via de sinalização TNF e as interações receptor-citocina-citocina, na microglia de camundongos tratados com FMT-DSS + SP em comparação com aqueles tratados com FMT-DSS (Fig. Suplementar 16b).
A análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) indicou que o conjunto de genes associados à via de sinalização do NF-kappa B foi significativamente regulado negativamente no grupo FMT-DSS + SP em comparação com o grupo FMT-DSS (Fig. 6n). Além disso, a análise de RNA-Seq de astrócitos de camundongos tratados com FMT-DSS + SP revelou amplo enriquecimento de genes na interação receptor-ligante neuroativo e na via de sinalização do cálcio em comparação com aqueles de camundongos tratados com FMT-DSS (Fig. 6o). Notavelmente, a análise da via KEGG revelou que a interação receptor-ligante neuroativo e a sinapse GABAérgica foram significativamente enriquecidas nos astrócitos do grupo FMT-DSS + SP (Figura Suplementar 16c). A GSEA também revelou uma regulação negativa significativa do conjunto de genes na interação receptor-ligante neuroativo no grupo FMT-DSS em comparação com o grupo FMT-CON; no entanto, o grupo FMT-DSS + SP exibiu uma regulação positiva do conjunto de genes relacionado à interação receptor-ligante neuroativo em comparação com o grupo FMT-DSS (Fig. 6o).
Overall, these results suggest that the suppression of the NF-κB pathway in microglia, coupled with the activation of GABAergic and downstream Ca2+ signaling in astrocytes, is responsible for SP’s anti-neuroinflammatory and anti-anxiety activities mediated by the gut microbiota.
SP augments the enrichment of gut microbiota-derived metabolite inositol
SP augments the enrichment of gut microbiota-derived metabolite inositol.
a PLS-DA of metabolomic profiles in colonic contents. b Differentially expressed metabolites were identified by Venn diagram. c The analysis of volcano plots in the DSS group vs the CON group, and d in the DSS group vs the CON group. e Enrichment analysis of metabolites through KEGG pathway analysis in the CON, DSS and DSS + SP groups. f Heat map of significantly altered metabolites in colonic contents of mice. Metabolites with the Variable importance in the projection (VIP) value of PLS-DA model >1 and the P values of two-tailed Student’s t test <0.05 were considered to be significantly different. g The enriched pathways analysis of the differential metabolites in the DSS + SP group. The x-axis represents the pathway impact, and the y-axis represents the pathway enrichment. h, i Concentrations of amino acid, tacrine, neomycin, N(omega)-hydroxyarginine, N-oleoyl GABA, inositol, nebramine, gamma-glutamyl-L-putrescine and 3-methoxytyamine in the colonic contents of mice. n = 6 mice/group. Data were presented as means ± SD. Statistical significance was determined using one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test (h, i). *P  ≤  0.05, **P  ≤  0.01, ***P  ≤  0.001. Source data are provided as a Source Data file.
Considering the interplay between the intestinal microbiota and host metabolism, as well as the role of microbiota-derived metabolites in gut-brain communication, an untargeted metabolomic analysis was subsequently carried out on samples that had previously undergone 16S rRNA gene sequencing. To further verify the differences among samples from three groups, the score plot of partial least squares discriminant (PLS-DA) analysis was performed. There was an obvious separation among the CON, DSS, and DSS + SP groups, and the DSS + SP group was closer to the CON group than to the DSS group, indicating that SP significantly mitigated DSS-induced dramatic alteration of metabolites (Fig. 7a). A total of 980 metabolites were identified in the DSS and CON groups, whereas 395 metabolites were identified in the DSS + SP and DSS groups. A total of 144 metabolites were identified in the three groups (Fig. 7b). The results of volcano plot showed that compared to the CON group, 352 metabolites were up-regulated and 628 down-regulated in the DSS group. However, 215 metabolites were increased, and 180 metabolites declined in the DSS + SP group vs the DSS group in mouse colonic contents (Fig. 7c, d).
O enriquecimento de vias KEGG dos metabólitos diferenciais mostrou que o metabolismo de aminoácidos (metabolismo da arginina e prolina, e metabolismo da cisteína e metionina), a biossíntese de outros metabólitos secundários (biossíntese de neomicina, canamicina e gentamicina, biossíntese de betalaína, biossíntese de vários antibióticos e metabolismo da cafeína) e o metabolismo de carboidratos (metabolismo do ascorbato e aldarato, metabolismo de aminoaçúcares e açúcares nucleotídicos, metabolismo da galactose e metabolismo do fosfato de inositol) foram as principais vias com base na análise KEGG (Fig. 7e). Especificamente, a análise de heatmap foi realizada para observar a expressão relativa desses metabólitos diferencialmente expressos nos três grupos; os cinco metabólitos mais abundantes no grupo DSS + SP, em comparação com o grupo DSS, incluíram mio-Inositol, 6-O-Metilguanina, Treoninil-Gama-glutamato, Diplodiatoxina e Tacrina (Fig. 7f). A análise de enriquecimento dos metabólitos elevados no grupo DSS + SP foi conduzida através do banco de dados KEGG. Os dados indicaram que o metabolismo do fosfato de inositol, a biossíntese de açúcares nucleotídicos do antígeno O, o metabolismo da galactose, o metabolismo da vitamina B6 e as interconversões de pentose e glucuronato foram as cinco principais vias de enriquecimento, e destas, o metabolismo do fosfato de inositol foi notavelmente alterado (Fig. 7g). Notavelmente, identificamos e rastreamos ainda alguns metabólitos evidentemente alterados no grupo DSS + SP vs o grupo DSS, conforme mostrado na Fig. 7h, i. Entre eles, N-oleoil GABA e tacrina foram enriquecidos na biossíntese de neuroquímicos. Em particular, o inositol foi o metabólito mais significativamente aumentado no conteúdo do cólon em resposta à administração de SP, e foi enriquecido em uma variedade de processos metabólicos, envolvendo biossíntese de antibióticos, metabolismo do fosfato de inositol, metabolismo do ascorbato e aldarato, e metabolismo da galactose. Os resultados acima revelam que a administração de SP aumentou a produção de metabólitos derivados da microbiota, particularmente inositol, indicando que os metabólitos podem estar envolvidos na proteção mediada por SP contra colite e comportamentos do tipo ansiedade induzidos por DSS.
A administração de inositol melhora a colite induzida por DSS e distúrbios do tipo ansiedade
O inositol metabólito intestinal medeia os efeitos protetores de SP contra colite e comportamentos ansiosos em camundongos induzidos por DSS.
a Diagrama ilustrando o modelo de colite em camundongos utilizado neste estudo, e os tratamentos com inositol estão indicados (Alguns elementos esquemáticos foram criados por Figdraw.com). b Alterações diárias do peso corporal. n = 8 camundongos/grupo. c Índice de atividade da doença. n = 6 camundongos/grupo. d Imagens macroscópicas dos colos. e Cortes de colo corados com H&E. Barra de escala = 100 μm. n = 5 experimentos independentes. f Imunofluorescência para E-caderina (vermelho)/DAPI (azul) em tecidos do colo. Barra de escala = 100 μm. n = 4 experimentos independentes. g Nível de mRNA de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) no colo. n = 4 camundongos/grupo. h, i Trajetos representativos de movimento no teste de campo aberto e gráficos de barras relacionados (Distância percorrida, distância da região central e velocidade). n = 6 camundongos/grupo. j, k Gráfico de trajetos do labirinto em cruz elevado e análise estatística incluindo porcentagem de tempo gasto nos braços abertos e porcentagem de entradas nos braços abertos. n = 6 camundongos/grupo. l Cortes representativos do hipocampo corados com H&E dos três grupos. Barra de escala = 100 μm. n = 6 experimentos independentes. m Fotomicrografias da coloração de Nissl no hipocampo. Barra de escala = 100 μm. n = 6 experimentos independentes. n Expressões de mRNA das citocinas a jusante (IL-6, IL-1β, TNF-α e IL-10) no tecido do hipocampo. n = 5 camundongos/grupo. o Imagens representativas de imunohistoquímica de Iba-1 no hipocampo. Barra de escala = 100 μm. n = 3 experimentos independentes. p A concentração de GABA no tecido do hipocampo. n = 6 camundongos/grupo. q A expressão de mRNA de GABAARα1 no hipocampo. n = 5 camundongos/grupo. r O nível proteico de GABABR detectado por western blot. n = 3 experimentos independentes. s Dupla imunofluorescência para GFAP (vermelho)/GAT1 (verde) nas regiões DG e CA1 do tecido do hipocampo. Barra de escala = 50 μm. n = 3 experimentos independentes. Os dados foram apresentados como média ± DP. Para a alteração do peso corporal, foi realizada ANOVA de duas vias com medidas repetidas e o restante das estatísticas foi analisado usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *P  ≤  0,05, **P  ≤  0,01, ***P  ≤  0,001. Os dados de origem são fornecidos em um arquivo de Dados de Origem.
Para verificar os efeitos protetores do inositol, que foi um metabólito altamente gerado no grupo DSS + SP, administramos inositol aos camundongos na água de beber (Fig. 8a). A suplementação com inositol reprimiu potentemente a perda de peso e o DAI induzidos pela colite (Fig. 8b, c). O comprimento do cólon diminuiu drasticamente no grupo DSS em comparação com o grupo CON, e essa regulação negativa foi reprimida pela suplementação de inositol (Supplementary Fig. 17a). O exame histológico revelou que as reduções induzidas por DSS na profundidade das criptas, bem como danos ou descamação das células epiteliais, foram substancialmente atenuadas após o tratamento com inositol (Fig. 8e e Supplementary Fig. 17b), conforme indicado por pontuações histológicas mais baixas (Supplementary Fig. 17c). Uma deficiência de E-caderina no epitélio intestinal do camundongo piora os sintomas clínicos e as características histológicas da colite induzida por DSS. Portanto, realizamos coloração imunofluorescente para E-caderina e observamos uma perda severa de E-caderina em camundongos tratados com DSS. No entanto, o inositol restaurou potentemente a expressão de E-caderina durante a colite, sugerindo que o inositol poderia proteger as células epiteliais intestinais da ruptura induzida por DSS (Fig. 8f e Supplementary Fig. 17d). Ademais, descobrimos que as expressões de mRNA de IL-1β, IL-6 e TNF-α foram acentuadamente diminuídas nos tecidos do cólon de camundongos tratados com inositol em comparação com aqueles tratados com DSS (Fig. 8g). Vale ressaltar que não foram observadas diferenças significativas na perda de peso, DAI, comprimento do cólon e alterações patológicas entre o grupo tratado com inositol sozinho e os grupos CON.
Os efeitos protetores do inositol nos comportamentos do tipo ansioso foram avaliados pelos testes de OFT e EPM. Conforme mostrado na Fig. 8h, i, os resultados do OFT demonstraram que camundongos tratados com DSS exibiram um percurso mais curto, menor distância na região central e menor velocidade de movimento. Por outro lado, a suplementação de inositol atenuou visivelmente essas anormalidades comportamentais induzidas pela colite. Em seguida, examinamos o efeito do inositol no teste EPM (Fig. 8j, k). Em comparação ao grupo DSS, os sintomas comportamentais melhoraram no grupo DSS+inositol, que exibiu um aumento evidente na porcentagem de tempo gasto nos braços abertos e na porcentagem de entradas nos braços abertos. Camundongos tratados com inositol também exibiram maior distância total percorrida do que camundongos tratados com DSS (Figura Suplementar 18). Notavelmente, as diferenças nos testes comportamentais entre o grupo CON e o grupo apenas com inositol não alcançaram significância estatística. Conforme mostrado na Fig. 8l e na Figura Suplementar 17e, na região DG, as células do hipocampo estavam clara e uniformemente coradas e ordenadamente dispostas no grupo CON. Em comparação ao grupo CON, o grupo DSS apresentou células dispostas de forma frouxa e evidente condensação nuclear. No entanto, no grupo DSS+inositol, o número de células foi aumentado e a condensação nuclear foi significativamente melhorada. Notavelmente, nenhuma alteração significativa na patologia hipocampal foi detectada no grupo apenas com inositol em comparação ao grupo CON. Além disso, os resultados da coloração de Nissl confirmaram que, após o tratamento com inositol, as alterações patológicas induzidas por DSS na região DG do hipocampo, como a redução dos corpúsculos de Nissl, picnose e encolhimento neuronal, foram notavelmente restauradas (Fig. 8m e Figura Suplementar 17f). Para demonstrar se o tratamento com inositol desempenhou um papel significativo na atenuação da neuroinflamação, o ensaio de RT-qPCR revelou que a intervenção com DSS aumentou a expressão de mRNA dos fatores pró-inflamatórios IL-6, IL-1β e TNF-α no hipocampo, o que foi revertido pela suplementação de inositol. Enquanto isso, o inositol elevou a expressão de mRNA do fator anti-inflamatório IL-10 (Fig. 8n). Investigamos então se a administração de inositol afetou a ativação da micróglia. Resultados da coloração imuno-histoquímica revelaram que uma área aumentada de células positivas para Iba-1 foi observada no grupo DSS em comparação ao grupo CON nas regiões DG e CA1 do hipocampo; no entanto, a suplementação de inositol diminuiu drasticamente a porcentagem de células Iba-1+ (Fig. 8o e Figura Suplementar 17g).
Um estudo anterior relatou que o inositol sofre oxidação para frutose e uma série de reações enzimáticas até L-glutamato, que é então catalisado pela GAD para produzir GABA. Supusemos que o inositol pode melhorar o comportamento de ansiedade promovendo a síntese de GABA. Para verificar essa conjectura, detectamos o conteúdo de GABA no hipocampo por ELISA. Nos camundongos induzidos por DSS, houve uma redução acentuada na concentração de GABA no hipocampo; em contraste, o nível de GABA foi significativamente aumentado após a suplementação com inositol (Fig. 8p). Para avaliar ainda mais o efeito do inositol na sinalização de GABA, a expressão de duas subunidades do receptor de GABA (GABAARα1 e GABABR2) foi analisada no hipocampo. Curiosamente, ambas foram significativamente reguladas positivamente após a suplementação com inositol (Fig. 8q, r e Fig. Suplementar 17h). A atividade do GABA na sinapse é encerrada pela recaptação nos terminais nervosos e astrócitos, mediada por transportadores de GABA ligados à membrana (GATs), que modulam a neurotransmissão GABAérgica. Com isso em mente, realizamos imunocoloração para os transportadores de GABA1 (GAT1) e GFAP. Conforme representado na Fig. 8s e na Fig. Suplementar 17i, os grandes processos dos astrócitos imunopositivos para GFAP foram envolvidos pela área que expressa GAT1 nas regiões DG e CA1, e as imagens sobrepostas mostraram co-localização ocasional da imunocoloração de GAT1 e GFAP. Vale ressaltar que o número de astrócitos GFAP+ foi drasticamente reduzido após o tratamento com DSS, o que pôde ser revertido pela suplementação com inositol. Além disso, a densidade de astrócitos GAT1+ pareceu ser maior no grupo DSS+inositol em comparação ao grupo DSS. Curiosamente, nenhuma alteração intestinal patológica ou comportamental aparente foi observada no grupo apenas com inositol, em comparação ao grupo CON. Coletivamente, esses dados sugerem que o inositol pode servir como um metabólito candidato crítico associado aos efeitos benéficos exercidos pelo SP.
O inositol desempenha um papel essencial na ação do SP contra comportamentos de ansiedade em camundongos induzidos por DSS
O inositol desempenha um papel essencial na ação do SP contra comportamentos de ansiedade em camundongos induzidos por DSS.
a Ilustração esquemática do desenho experimental (Alguns elementos esquemáticos foram criados pelo Figdraw.com). b, c Gráfico de trajetória do labirinto em cruz elevado, e análise estatística incluindo porcentagem de tempo gasto nos braços abertos, porcentagem de distância percorrida nos braços abertos e porcentagem de vezes que entrou nos braços abertos. n = 6 camundongos/grupo. d, e Gráfico de trajetória do labirinto zero elevado, e análise estatística incluindo porcentagem de tempo gasto nas zonas abertas e porcentagem de vezes que entrou nas zonas abertas. n = 6 camundongos/grupo. f Análise estatística, incluindo porcentagem de distância percorrida na área clara, porcentagem de tempo gasto na área clara e número de transições no teste da caixa claro-escuro. n = 6 camundongos/grupo. g Imagens representativas da coloração H&E das secções do hipocampo. Barra de escala = 100 μm. n = 6 experimentos independentes. h Imagens representativas da coloração de Nissl das secções do hipocampo. Barra de escala = 100 μm. n = 4 experimentos independentes. i O conteúdo de inositol no tecido do hipocampo testado por ELISA. n = 8 camundongos/grupo. j O conteúdo de inositol no soro testado por ELISA. n = 8 camundongos/grupo. k–n A expressão de mRNA de TNF-α, IL-1β, IL-6 e iNOS em células BV-2. n = 3 camundongos/grupo. o, p A expressão de mRNA de Gabra3 e Camk2d em células C8D1A. n = 3 camundongos/grupo. q O nível proteico de GABAAR, CaMKII, GABABR detectado por western blot. n = 3 experimentos independentes. Os dados foram apresentados como médias ± DP. A significância estatística foi determinada usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *P  ≤  0,05, **P  ≤  0,01, ***P  ≤  0,001. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Para avaliar se o inositol é necessário para os efeitos positivos do SP nos sintomas de ansiedade, tratamos camundongos com o inibidor da síntese de inositol, L-690330 (Fig. 9a). A análise comportamental indicou que os efeitos ansiolíticos do SP foram revertidos pelo tratamento com L-690330. Especificamente, no teste EPM, camundongos com colite tratados com SP e L-690330 apresentaram diminuição na porcentagem de tempo gasto e distância percorrida nos braços abertos, bem como menor porcentagem de entradas nos braços abertos e distância total percorrida, em comparação com camundongos com colite tratados apenas com SP (Fig. 9b, c e Fig. Suplementar 19a). No teste EZM, após o tratamento com L-690330, tanto a porcentagem de tempo gasto nas zonas abertas quanto a porcentagem de entradas nas zonas abertas foram significativamente reduzidas em relação aos camundongos com colite tratados com SP (Fig. 9d, e). Embora a distância total percorrida tenha mostrado uma tendência de diminuição, essa alteração não foi estatisticamente significativa (Fig. Suplementar 19b). No teste LDB, camundongos com colite tratados com SP e L-690330 exibiram menores porcentagens de tempo gasto na caixa clara, distância percorrida na caixa clara e distância total percorrida, em comparação com aqueles tratados apenas com SP (Fig. 9f e Fig. Suplementar 19c). No entanto, não foram observadas diferenças nas frequências de transição entre os compartimentos claro e escuro entre os três grupos. Para avaliar variações microscópicas no hipocampo, coramos secções hipocampais com H&E (Fig. 9g e Fig. Suplementar 20a). Imagens representativas revelaram que a administração de SP reparou as características patológicas induzidas por DSS, incluindo células nervosas encolhidas, núcleos picnóticos ou indistintos e um aumento de neurônios lesionados na região DG. Curiosamente, o tratamento com L-690330 reverteu marcadamente a influência protetora do SP no hipocampo. Além disso, não foram observadas diferenças estatísticas nas regiões CA1 e CA3 entre os três grupos. Investigamos ainda o impacto da inibição do inositol na sobrevivência neuronal na região DG usando coloração de Nissl. O SP atenuou a perda de corpos de Nissl, núcleos picnóticos e indistintos na região DG, resultando em um aumento significativo no número de neurônios sobreviventes. No entanto, a administração de L-690330 reverteu efetivamente essas alterações (Fig. 9h e Fig. Suplementar 20b). Esses achados corroboram o papel do inositol nas propriedades neuroprotetoras do SP.
Em vista do importante papel do inositol, detectamos se o nível de inositol aumentou após o TMF de camundongos tratados com DSS+SP usando ELISA. Como esperado, a concentração de inositol no hipocampo do grupo TMF-DSS foi marcadamente menor do que a do grupo TMF-CON. No entanto, uma regulação positiva significativa do inositol foi detectada no grupo TMF-DSS+SP em comparação com o grupo TMF-DSS (Fig. 9i). Tendências semelhantes foram observadas no soro (Fig. 9j). Dado o aumento substancial na concentração de inositol tanto no hipocampo quanto no soro após o TMF de camundongos tratados com DSS+SP, levantamos a hipótese de que o inositol poderia exercer um impacto direto no cérebro. Para investigar isso, avaliamos a atividade funcional do inositol cultivando in vitro a linhagem de células microgliais de camundongo (BV-2) e a linhagem de células de astrócitos de camundongo (C8D1A). As células BV-2 foram estimuladas com LPS a uma concentração de 1 μg/mL para simular um ambiente neuroinflamatório. A citotoxicidade do inositol foi avaliada usando um ensaio CCK-8. Conforme mostrado na Fig. Suplementar 21a, as células BV-2 tratadas com diferentes concentrações de inositol (25, 50 e 100 μM) por 24 h não exibiram efeitos citotóxicos perceptíveis. Análises adicionais de RT-qPCR indicaram que os níveis de mRNA de TNF-α, IL-1β e IL-6 foram regulados negativamente nas concentrações de 25 e 50 μM nos grupos de inositol, embora esses níveis não tenham sido significativamente diferentes daqueles observados no grupo LPS (Fig. 9k-m). Importante, o tratamento com 100 μM de inositol reduziu significativamente os níveis desses mediadores inflamatórios. Além disso, a expressão de mRNA de iNOS em todos os grupos de inositol foi menor do que a observada no grupo LPS, embora não tenham sido observadas diferenças estatisticamente significativas (Fig. 9n). Enquanto isso, as células C8D1A foram cultivadas com inositol por 24 h. Os resultados revelaram que o inositol não exibiu toxicidade significativa para as células C8D1A nas concentrações de 50, 100 e 200 μM (Fig. Suplementar 21b). Subsequentemente, as células C8D1A foram tratadas com inositol sob estimulação de LPS por 24 h. Em comparação com a exposição apenas ao LPS, o tratamento com inositol aumentou os níveis de mRNA de Gabra3 e Camk2d, com os efeitos mais pronunciados observados na concentração de 200 μM (Fig. 9o, p). Consistentes com esses achados, as análises de western blot ilustraram que a exposição ao LPS reduziu a expressão proteica de GABAAR1, CaMKII e GABABR nas células C8D1A. Em contraste, a suplementação com inositol tanto a 100 quanto a 200 μM suprimiu marcadamente a regulação negativa dessas expressões proteicas (Fig. 9q e Fig. Suplementar 21c). Os resultados acima sugerem que o inositol, como um metabólito intermediário crucial, desempenha um papel importante nos efeitos protetores do SP contra os transtornos comportamentais do tipo ansiedade induzidos por DSS, ao melhorar a sinalização da neurotransmissão GABAérgica nos astrócitos e modular as respostas neuroinflamatórias desencadeadas pela microglia ativada.
Análise de integração multi-ômica para as conexões entre os fenótipos do hospedeiro, microbioma intestinal, metabólitos e transcrição gênica cerebral
Para identificar as influências do microbioma intestinal sobre os metabólitos no intestino, o microbioma intestinal e os metabólitos foram submetidos à análise de correlação conjunta de Spearman. *Oscillibacter*, *Romboutsia*, *Enterobacter*, *Clostridioides*, *Butyricimonas*, *Coprobacillus*, *Prevotellaceae_UCG_001*, *Muribaculum* e *Roseburia* foram as bactérias-chave relacionadas à secreção de metabólitos. Importante, o *myo*-Inositol foi influenciado por bactérias envolvendo *Prevotellaceae_UCG_001*, *Oscillospiraceae* e *Azospirillum_sp._47_25* (Figura Suplementar 22a). Adicionalmente, as análises de correlação de Spearman identificaram a interação entre bactérias intestinais, que então impactaram os fenótipos do hospedeiro. Descobrimos que *g_unclassified_Clostridia_UCG_014*, *g_unclassified_Muribaculaceae*, *g_unclassified_Lachnospiraceae*, *g_Prevotellaceae_UCG_001* e *p_Firmicutes* mostraram uma correlação negativa com o DAI e o escore patológico, mas apresentaram uma correlação positiva com o comprimento do cólon e MUC-2. Os *g_Bacteroides*, *g_Escherichia_Shigella* e *p_Bacteroides* exibiram uma conexão positiva com o DAI e o escore patológico, enquanto uma correlação negativa foi observada com o comprimento do cólon e MUC-2 (Figura Suplementar 22b). Para investigar melhor a relação entre metabólitos derivados do microbioma intestinal e fenótipos do hospedeiro, realizamos a análise de correlação de Spearman que revelou a interação entre metabólitos, incluindo Tacrina, Neomicina, *myo*-Inositol, 5-Aminopentanoato, N(omega)-Hidroxiarginina, N-Oleoil GABA, Nebramina, Trp Ala Tyr, 3-Metoxitiramina, Gama-glutamil-L-putrescina e 4-Piridoxato. Além disso, observamos que o *myo*-Inositol estava negativamente correlacionado com os fenótipos do hospedeiro (DAI e escore patológico), enquanto estava positivamente correlacionado com os fenótipos do hospedeiro (comprimento do cólon e MUC-2) (Figura Suplementar 22c). Houve uma correlação entre a transcrição gênica do hipocampo e os fenótipos cerebrais, que incluíram níveis de fatores inflamatórios hipocampais e comportamentos do tipo ansiedade (Figura Suplementar 22d). Descobrimos que as alterações na transcrição gênica do hipocampo em camundongos são influenciadas pelo microbioma intestinal (Figura Suplementar 22e). Especificamente, *unclassified_Muribaculaceae*, *unclassified_Lachnospiraceae* e *Prevotellaceae_UCG_001* mostraram a capacidade de inibir a expressão gênica da via NF-κB (*Ikbke*, *Relb*, *Birc3* e *Nfkb2*) e aumentar a sinalização GABAérgica (*Gabarapl2*, *Gabrb2* e *Gabra2*) e de Ca2+ (*Pin* e *Smim6*), respectivamente.
Enquanto uma correlação negativa foi observada com Escherichia_Shigella e Gabarapl2, Pin e Smim6. Para aprofundar, análises combinadas de dados de interação em rede mostraram associações entre fenótipos do hospedeiro, fenótipos cerebrais, DEGs, metabólitos luminais e microbiota intestinal na Figura Suplementar 22f (|R| > 0,50, P < 0,05). Correlações de Spearman revelaram correlações positivas entre comportamentos do tipo ansiedade e a expressão gênica da via NF-κB (Cxcl1, Nfkb2, Rela, Relb, Chuk, Ikbkg e Ikbke), enquanto houve correlações negativas entre comportamentos do tipo ansiedade e a expressão de genes de sinalização GABAérgica (Gabra2, Gabrb2, Gabra1, Gabpb2, Gabbr2 e Gabarapl2) e genes de sinalização de Ca2+ (Pin, Smim6, Camk2d e Camk1). Da mesma forma, a expressão de fatores inflamatórios hipocampais foi negativamente correlacionada com a expressão de genes de sinalização GABAérgica e de Ca2+, enquanto positivamente correlacionada com a expressão de genes da via NF-κB. O Inositol mostrou correlações negativas com a expressão de genes da via NF-κB (Ikbke, Ikbkg, Nfkb2 e Relb) e exibiu correlações positivas com a expressão de genes de sinalização GABAérgica (Gabrb2, Gabarapl2, Gabbr2) e genes de sinalização de Ca2+ (Smim6 e Camk1).
Efeitos protetores da SP nos sintomas clínicos e danos teciduais macroscópicos na colite induzida por TNBS
Por fim, realizamos uma exploração preliminar dos efeitos da SP em um modelo murino induzido por ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico (TNBS), que é conhecido por replicar algumas características da doença de Crohn com inflamação transmural. O delineamento experimental foi revelado na Supplementary Fig. 23a. Os resultados mostraram que, no 7º dia, os camundongos tratados com TNBS apresentaram perda de peso significativa em comparação ao grupo CON, enquanto a administração de SP, tanto em dose baixa quanto alta, atenuou significativamente a perda de peso induzida por TNBS (Supplementary Fig. 23b). O DAI foi utilizado para avaliar a gravidade dos sintomas da colite. Camundongos tratados com SP em ambas as doses apresentaram DAI menor em comparação ao grupo TNBS (Supplementary Fig. 23c). O encurtamento do cólon é um indicador-chave da gravidade da colite desafiada por TNBS, e observamos uma restauração significativa do comprimento do cólon após a administração de SP (Supplementary Fig. 23d). Além disso, as características patológicas da colite foram avaliadas por coloração H&E. Conforme mostrado nas Supplementary Fig. 23e, f, o grupo TNBS demonstrou aumentos significativos na perda de células das criptas, edema submucoso, inflamação (infiltração de células mononucleares), úlceras e hemorragia em comparação ao grupo CON. Notavelmente, a SP melhorou marcadamente a arquitetura da mucosa e os índices patológicos gerais em camundongos com colite induzida por TNBS. Os escores histológicos corroboraram esses achados (Supplementary Fig. 23g), com o grupo TNBS exibindo escores significativamente maiores em comparação ao grupo CON. Por outro lado, a SP (tanto em dose baixa quanto alta) reduziu significativamente os escores histológicos. Embora o grupo SP em dose alta tenha exibido um efeito ameliorativo maior, nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada.
Para avaliar comportamentos semelhantes à ansiedade induzidos por TNBS em camundongos e avaliar os efeitos terapêuticos correspondentes da SP, realizamos testes comportamentais. No OFT (Fig. Suplementar 23h, i), parâmetros como velocidade média, distância na região central e tempo gasto na região central foram significativamente menores no grupo tratado com TNBS em comparação ao grupo CON. Notavelmente, a administração de SP na dose de 5 nmol/kg aumentou significativamente a velocidade média; no entanto, as alterações na distância da região central e no tempo de permanência na região central nessa dose não foram estatisticamente significativas em comparação ao grupo TNBS. Por outro lado, a SP nas dosagens de 10 nmol/kg aumentou marcadamente a velocidade média, a distância e o tempo gasto nas áreas centrais em comparação aos camundongos tratados com TNBS. No teste EPM, o grupo TNBS exibiu tempos reduzidos de entrada nos braços abertos, menor distância percorrida e tempo gasto nos braços abertos e distância total percorrida. No entanto, essas características comportamentais foram atenuadas após a administração de SP nas dosagens de 5 e 10 nmol/kg (Fig. Suplementar 23j, k). Em seguida, realizamos coloração H&E para avaliar o dano patológico induzido por TNBS no hipocampo e os efeitos do tratamento com SP. Conforme mostrado na Fig. Suplementar 23l, m, a região DG do hipocampo no grupo CON exibiu morfologia tecidual normal, caracterizada por núcleos intactos e citoplasma abundante. Em contraste, o tratamento com TNBS resultou em atrofia neuronal significativa, picnose nuclear e coloração citoplasmática irregular. No entanto, a administração de SP aliviou significativamente essas alterações patológicas induzidas por TNBS. Esses resultados sugerem que a SP pode melhorar os comportamentos semelhantes à ansiedade induzidos por TNBS e a lesão do tecido hipocampal induzida por TNBS.
Discussão
Nosso trabalho investigou os efeitos terapêuticos da SP em sintomas semelhantes à DII e distúrbios comportamentais, com foco no eixo microbiota-intestino-cérebro. A SP reduziu a colite preservando a integridade da barreira intestinal e melhorou os distúrbios semelhantes à ansiedade por meio da supressão de alterações patológicas e neuroinflamação no hipocampo de camundongos tratados com DSS. Esses efeitos benéficos da SP foram alcançados pela modulação da composição do microbioma intestinal e subsequente aumento da produção do metabólito derivado da microbiota, inositol, implicando um mecanismo dependente da flora intestinal. Além disso, as atividades ansiolíticas da SP foram atribuíveis à supressão da via de sinalização NF-κB na microglia, bem como à ativação da neurotransmissão GABAérgica e da sinalização downstream de Ca2+ nos astrócitos do hipocampo.
Por um lado, pesquisas em estágio inicial demonstraram que a SP endógena exerceu influências pró-inflamatórias sobre células epiteliais e imunes em doenças inflamatórias relacionadas aos sistemas musculoesquelético, respiratório e gastrointestinal. A liberação de SP foi elevada no intestino após a estimulação com hrlL-1β ou TNBS. A colite foi atenuada em camundongos TRPA1−/− e pelo inibidor farmacológico de TRPA1 ou antagonistas de NK-1R. Conforme relatado em um estudo anterior sobre o neuropeptídeo Y, levantamos a hipótese de que o papel da SP na mediação de respostas inflamatórias está ligado à ativação imunológica sob condições adversas, refletindo os mecanismos de autorregulação e autodefesa do organismo. Por outro lado, após a remoção do DSS por mais 5 dias, os camundongos apresentaram escores de colite reduzidos e leve perda de peso corporal, enquanto os camundongos tratados com o antagonista de NK-1R durante a fase de recuperação mostraram aumento nos escores clínicos de colite e maior perda de peso corporal. Verificou-se que a SP exógena possui propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes. A SP exerceu efeitos significativos na proteção contra disfunção cardiovascular, lesão cutânea, distúrbios intestinais e lesão hepática colestática. A SP melhorou a cicatrização de feridas ao promover a proliferação e migração celular in vitro e in vivo. O papel duplo da SP pode depender de múltiplos fatores, incluindo condições clínico-patológicas, os estágios do desenvolvimento da doença e a fonte de SP (endógena ou exógena). Nosso estudo demonstra os efeitos benéficos da SP exógena na colite.
Tem havido um crescente corpo de pesquisas focado nas contribuições dos neurotransmissores, como 5-HT e GABA, para a saúde intestinal e cerebral. Os neuropeptídeos também são uma classe importante de neurotransmissores expressos no SNC e tecido periférico. Entre esses neuropeptídeos, a SP tem sido relatada como desempenhando um papel central, exercendo efeitos anti-inflamatórios e neuroprotetores que podem aliviar a lesão cerebral isquêmica. Nosso trabalho anterior descobriu o papel fundamental da SP na manutenção da função da barreira intestinal na colite induzida por DSS. Aqui, demonstramos ainda que a SP pode melhorar os transtornos comportamentais do tipo ansiedade induzidos por DSS, mitigar lesões patológicas hipocampais e suprimir a geração de fatores neuroinflamatórios. As microglias são as principais células imunes no cérebro, e quando se tornam ativadas, liberam mediadores inflamatórios que induzem um estado neuroinflamatório para desestabilizar o equilíbrio dos neurotransmissores, provocando assim manifestações do tipo ansiedade ligadas à DII. Em consonância com esses achados, o número de microglias ativadas no hipocampo aumentou no grupo DSS; no entanto, o tratamento com SP reverteu essa alteração na contagem de microglias. Com base no estudo anterior que demonstrou que microglias deletérias com fenótipo M1 medeiam respostas neuroinflamatórias em várias doenças cerebrais, analisamos a seguir se a SP regulava a polarização das microglias ativadas. Como esperado, nossos resultados demonstraram que a supressão das microglias M1 inflamatórias superativadas é uma das possíveis razões para a SP reduzir a neuroinflamação hipocampal. Além disso, evidências crescentes indicam que os astrócitos estão envolvidos em transtornos afetivos e de humor. Inesperadamente, a expressão de GFAP foi significativamente diminuída no hipocampo do grupo DSS, o que contrasta com relatos anteriores indicando que os astrócitos são ativados durante a inflamação. No entanto, sabe-se que a ativação de astrócitos no hipocampo provoca efeitos ansiolíticos. Evidências de imunorreatividade reduzida de GFAP após lesão cerebral traumática (LCT) foram documentadas, atribuídas à degradação dos filamentos intermediários e às alterações concomitantes na função geral das proteínas. Considerando que a LCT induz neuroinflamação no hipocampo, um mecanismo semelhante pode estar subjacente à GFAP reduzida observada no hipocampo dos camundongos modelo de colite induzida por DSS. Em consonância com nossos achados, Zhang et al.
demonstrou que a expressão de GFAP foi significativamente menor na colite induzida por DSS em comparação com camundongos controle. Curiosamente, o nível de GFAP no hipocampo aumentou após o tratamento com eletroacupuntura ou moxabustão. Os astrócitos desempenham papéis cruciais no suporte aos neurônios, facilitando a troca de materiais metabólicos e nutricionais, mantendo as concentrações iônicas e eliminando neurotransmissores em sua vizinhança. Dickerson et al. relataram diminuição do nível de GFAP no hipocampo 52 semanas após lesão por explosão. Mais importante ainda, animais com níveis mais baixos de GFAP e MAP2 exibiram comportamentos do tipo ansiedade mais pronunciados. Eles sugeriram que uma diminuição ou disfunção dos astrócitos poderia interromper a estrutura sináptica tripartite entre astrócitos e neurônios, potencialmente diminuindo a comunicação neuronal e a liberação de neurotransmissores, e levando a comportamentos do tipo ansiedade e depressivos. Em nosso estudo, a redução de astrócitos hipocampais no grupo DSS pode indicar que sua função neuroprotetora está comprometida. Por outro lado, o tratamento com SP pode ativar a expressão de GFAP no hipocampo, melhorando assim os déficits neurológicos. Portanto, a ativação dos astrócitos tem implicações significativas para a proteção cerebral. Além disso, a alteração dos astrócitos pode depender do momento e do contexto da doença. Do et al. demonstraram que as alterações de GFAP variavam conforme a região cerebral e a duração da exposição ao DSS. No hipocampo, tanto a expressão de mRNA quanto de proteína de GFAP estavam elevadas após 3 dias de exposição ao DSS, mas uma regulação negativa foi observada no dia 7. Achados semelhantes foram observados na depressão. Com base nesses resultados, propomos que a ativação precoce dos astrócitos durante a progressão de distúrbios do tipo ansiedade induzidos por colite pode levar a uma disfunção astrocitária subsequente, justificando investigação adicional. Consequentemente, nosso estudo sugere que o SP suprime a ativação microglial em camundongos induzidos por DSS. Importante, descobrimos que o SP resgatou a perda de astrócitos marcados com GFAP, contribuindo para a melhora dos déficits neurológicos no hipocampo, o que pode ser um dos mecanismos pelos quais o SP exerce seus efeitos anti-ansiedade. No entanto, mais pesquisas são necessárias para elucidar o mecanismo pelo qual o SP exerce impactos ansiolíticos em distúrbios emocionais ligados à DII.
É amplamente aceito que a microbiota intestinal promove uma comunicação bidirecional entre o cérebro e o trato gastrointestinal. Alterações na composição e na atividade da flora intestinal foram correlacionadas com diversas condições neurológicas e psiquiátricas. Os neurotransmissores provavelmente emergem como mensageiros neurais e afetam a atividade da microbiota intestinal para orquestrar a comunicação bidirecional intestino-cérebro. Ma et al. descobriram que a 5-HT atenua os déficits cognitivos induzidos pelo estresse crônico ao modular o microbioma intestinal. Outro estudo investigou o GABA e demonstrou que ele pode melhorar a imunidade da mucosa intestinal, o que pode estar relacionado à alteração da estrutura da microbiota intestinal. No entanto, a influência do neuropeptídeo SP na interação entre o microbioma intestinal e o cérebro ainda precisa ser explorada. Portanto, ainda vale a pena estudar se o SP influencia a microbiota intestinal para aliviar os sintomas semelhantes à DII e os transtornos mentais. Numerosos estudos mostraram que o SP tem atividade antimicrobiana e pode regular a virulência de Bacillus cereus, Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis. Estudos anteriores identificaram uma conexão entre alterações na microbiota intestinal e a patologia da DII, especificamente, e estabilizar a microbiota intestinal é capaz de mitigar sintomas relacionados à DII e neuroinflamação. Nossos dados de sequenciamento do gene 16S rRNA revelaram que a microbiota dominante pertencia a Bacteroidaceae e Enterobacteriaceae, e Escherichia_Shigella foi o táxon predominante em nível de gênero nos camundongos do grupo DSS. No grupo DSS + SP, a microbiota representativa foi Lachnospiraceae e Muribaculaceae em nível de família, e, em nível de gênero, Prevotellaceae_UCG_001, unclassified_Muribaculaceae e unclassified_Lachnospiraceae foram identificadas como microbiota dominante. Vários estudos mostraram que a disbiose da microbiota é caracterizada pela proliferação de bactérias pertencentes a Enterobacteriaceae, e Lachnospiraceae e Muribaculaceae são as principais famílias de bactérias para melhorar o comprometimento intestinal na DII. A abundância de Enterobacteriaceae foi maior nas amostras fecais de pacientes com ambas, DII e depressão, em comparação com aqueles com apenas DII. A administração de Enterobacteriaceae e Escherichia coli individualmente ou em combinação por gavagem resultou no desenvolvimento de colite e sintomas semelhantes à depressão em camundongos livres de germes e livres de patógenos específicos.
Essas bactérias gram-negativas podem afetar a inflamação sistêmica e a função cerebral através de seus subprodutos, incluindo lipopolissacarídeos e exopolissacarídeos. Além disso, bactérias probióticas podem exercer um impacto positivo na saúde mental ao melhorar o humor e a qualidade do sono.

Para mais, nosso estudo mostrou que os efeitos benéficos do SP na prevenção de danos ao intestino e ao hipocampo são significativamente prejudicados após a intervenção com ABX, indicando que a microbiota intestinal que é suscetível a antibióticos pode ser um fator crucial na mitigação de comportamentos do tipo ansiedade pelo SP. Um estudo anterior demonstrou que o transplante de microbiota fecal de pacientes com DII aumentou a expressão de genes inflamatórios nos tecidos colônicos de camundongos SPF receptores, e também induziu comportamentos do tipo ansiedade nesses camundongos. Por outro lado, melhorar a composição da microbiota intestinal poderia mitigar sintomas depressivos e do tipo ansiedade. Da mesma forma, em nosso estudo, a análise de sequenciamento do gene 16S rRNA sugeriu que o TMF de camundongos tratados com DSS + SP poderia melhorar a disbiose intestinal ao elevar a abundância relativa de g_unclassified_Muribaculaceae, g_unclassified_Lachnospiraceae e g_Lactobacillus, enquanto diminuía a abundância de g_Bacteroides e g_Ligilactobacillus.

Como esperado, o grupo FMT-DSS apresentou sintomas evidentes de colite e lesão na mucosa intestinal, juntamente com distúrbios do tipo ansiedade e inflamação hipocampal, em comparação com o grupo FMT-CON. No entanto, os camundongos receptores que receberam microbiota fecal do grupo FMT-DSS + SP mostraram alterações patológicas significativamente melhoradas. Mais importante ainda, camundongos que receberam microbiota intestinal do grupo DSS + SP exibiram diminuição de micróglia do tipo M1, mas aumento de micróglia do tipo M2 no hipocampo. Em comparação com o grupo FMT-DSS, os astrócitos regulados negativamente foram resgatados no grupo FMT-DSS + SP. Esses dados destacaram que a administração de SP mitigou a disbiose intestinal induzida por DSS, o que foi responsável pelos efeitos protetores do SP na barreira intestinal e na saúde mental. No entanto, o efeito da alteração da microbiota no surgimento de transtornos neuropsiquiátricos requer uma exploração mais aprofundada.
Investigamos em seguida os mecanismos potenciais da SP contra o comportamento do tipo ansioso através da alteração da flora intestinal. Dados de transcriptoma sugerem que a via NF-κB está regulada positivamente no hipocampo de camundongos após tratamento com FMT-DSS em comparação com camundongos FMT-CON, no entanto, o tratamento com FMT-DSS + SP inibiu a ativação da via NF-κB. Está bem documentado que a via de sinalização NF-κB ativada em micróglia medeia a neuroinflamação em diversas doenças neurológicas. Nosso resultado verificou que as expressões gênicas de p65 e IKBα, bem como os níveis proteicos de p-p65 e p-IKBα, foram menores após o tratamento com FMT-DSS + SP em comparação ao grupo FMT-DSS. Particularmente, o ensaio de imunofluorescência revelou que o sinal positivo para p-IKBα em micróglia foi enfraquecido no grupo FMT-DSS + SP, em comparação ao grupo FMT-DSS. Curiosamente, os dados de sequenciamento de RNA também revelaram que as interações receptor-ligante neuroativo e as vias de sinalização de Ca2+ foram reguladas positivamente no hipocampo do grupo FMT-DSS + SP em comparação com o grupo FMT-DSS. A análise detalhada descobriu um aumento significativo na expressão gênica de GABAAR e GABABR com subunidades distintas após o tratamento com FMT-DSS + SP. Realizamos ainda ensaio de western blot para validar os dados mencionados. Os resultados sugeriram que as expressões de GABAAR, GABABR e GAD65 foram fortemente aumentadas no hipocampo de camundongos tratados com FMT-DSS + SP em comparação com camundongos tratados com FMT-DSS. Há evidências crescentes de que um déficit acentuado na transmissão sináptica GABAérgica tem sido observado em transtornos de ansiedade e depressão maior. Mais recentemente, moduladores dos subtipos de receptores GABAA α2α3 e agonistas de GABABR encontraram comprovação clínica inicial na terapia de transtornos de ansiedade. Portanto, o aumento da expressão de moléculas-chave implicadas na via de neurotransmissão GABAérgica pode explicar a melhora dos comportamentos do tipo ansioso em camundongos tratados com FMT-DSS + SP. Foi descoberto que a ativação ionotrópica de GABAAR evoca despolarização da membrana e pode elevar a concentração de cálcio [Ca2+]i, modulando assim uma variedade de processos celulares dependentes de [Ca2+]i. A ativação metabotrópica de GABABR aumenta a elevação de [Ca2+]i desencadeada pelo receptor metabotrópico de glutamato mGluR1. Os receptores GABAA e GABAB interagem para elicitar uma resposta completa de Ca2+ em células endoteliais cerebrovasculares, e eles elevam sinergicamente o Ca2+ intracelular em células-tronco embrionárias de camundongos.
Em nosso estudo, os resultados de RNA-seq revelaram tendências semelhantes, indicando que o tratamento com FMT-DSS + SP também poderia promover a sinalização a jusante de Ca2+ no hipocampo, evidenciado pelo aumento de uma série de genes envolvidos no processo de sinalização de Ca2+. Além disso, como um sensor sensível da concentração de Ca2+, a calmodulina (CaM) liga-se especificamente ao Ca2+, e então o complexo CaM-Ca2+ pode interagir com a CaMKII alvo. Consistentemente, nosso estudo sugeriu que a administração de FMT-DSS + SP elevou significativamente a expressão de CaMKII no hipocampo. Embora estudos anteriores tenham relatado que os astrócitos podem estar implicados no processo de transtorno psiquiátrico, os mecanismos putativos pelos quais os astrócitos impactam o estado afetivo precisam ser melhor elucidados. Nesse sentido, Cho et al. propuseram evidências inesperadas de que a ativação intracelular de Ca2+ nos astrócitos do hipocampo induziu comportamento ansiolítico, o qual dependia da modulação da homeostase sináptica mediada por ATP. Com base nos dados de transcriptômica e na capacidade demonstrada da SP de prevenir a perda de astrócitos, especulamos que a SP poderia exibir atividade ansiolítica modulando vias de sinalização relevantes nos astrócitos. Para verificar essa conjectura, descobrimos que a expressão positiva de GABAARα1 nos astrócitos do hipocampo foi significativamente maior no grupo FMT-DSS + SP do que no grupo FMT-DSS. Da mesma forma, a administração de FMT do grupo tratado com SP aumentou o sinal positivo de CaMKII nos astrócitos do hipocampo, mas não o FMT do grupo tratado com DSS. Além disso, o sequenciamento de RNA de micróglia e astrócitos separados por fluxo elucidou que FMT-DSS + SP atenuou a ativação de NF-κB na micróglia, enquanto potencializou a sinalização GABAérgica e subsequente de Ca2+ nos astrócitos.

No geral, a combinação de experimentos de transplante de microbiota fecal e sequenciamento de RNA demonstra que os efeitos putativos da microbiota intestinal foram críticos no processo da SP contra colite e comportamento do tipo ansiedade, o que está associado à inibição de NF-κB na micróglia e à ativação da sinalização GABAérgica/Ca2+ nos astrócitos.
Metabólitos derivados da microbiota intestinal têm sido sugeridos como moléculas sinalizadoras que potencialmente cruzam a barreira hematoencefálica e facilitam o eixo intestino-cérebro para afetar a neurofisiologia e o comportamento. A microbiota intestinal possui a capacidade de sintetizar e metabolizar uma ampla gama de neurotransmissores clássicos, incluindo dopamina, serotonina e ácido γ-aminobutírico. Em nosso estudo, a análise metabolômica mostrou que a intervenção com SP causou um aumento no conteúdo de GABA e dopamina, que apresentaram a capacidade de reduzir os sintomas de ansiedade. Notavelmente, o inositol foi significativamente enriquecido após a intervenção com SP. Estudos recentes estabeleceram que o trifosfato de inositol, produzido pela flora intestinal ao metabolizar o ácido fítico da dieta, induz a ativação da HDAC3, promovendo, em última análise, a proliferação de células epiteliais intestinais, bem como a reparação da barreira intestinal na doença inflamatória intestinal. Importante destacar que a flora intestinal pode sintetizar fosfato de inositol, que está envolvido na sinalização neuronal e na osmorregulação. No presente estudo, o inositol foi administrado por via oral a camundongos com colite induzida por DSS para verificar ainda mais os efeitos benéficos do inositol. Como esperado, a administração de inositol demonstrou proteger contra a colite. Em termos de regulação da disfunção mental, o inositol mitigou significativamente os distúrbios comportamentais através do alívio do dano hipocampal e da neuroinflamação. Além disso, após o tratamento com inositol, houve uma redução no número de micróglias. Especulamos que o inositol pode ter como alvo as micróglias para atenuar a resposta neuroinflamatória no hipocampo. No entanto, não estava claro como o inositol afeta os transtornos psiquiátricos relacionados à DII, necessitando de maior exploração. Aqui, foi realizado um estudo preliminar, e os resultados mostraram que a suplementação de inositol promoveu a síntese de GABA no hipocampo, e a expressão de GABAAR e GABABR foi significativamente aumentada pela suplementação de inositol. Na verdade, a atividade do GABA na fenda sináptica é encerrada através da recaptação para os terminais nervosos e astrócitos, mediada por GATs localizados na membrana, e os processos de recaptação facilitados por GATs, portanto, desempenham um papel fundamental na modelagem da neurotransmissão GABAérgica. Surpreendentemente, a suplementação de inositol conseguiu aumentar o número de astrócitos e, especialmente, a expressão imunopositiva de GAT1 foi nitidamente regulada positivamente.
Para investigar o papel do inositol nos efeitos neuroprotetores da SP, camundongos foram tratados com o inibidor da síntese de inositol, L-690330. Os resultados indicaram que o L-690330 reverteu os efeitos ansiolíticos da SP e as melhorias no dano hipocampal. Análises adicionais revelaram aumentos significativos na concentração de inositol tanto no hipocampo quanto no soro após o tratamento com FMT-DSS + SP. Especulamos que o inositol possa ter um impacto direto no hipocampo. Ensaio in vitro corroborou essa hipótese, demonstrando que o inositol melhorou as respostas neuroinflamatórias induzidas por LPS em células BV-2 e atenuou a regulação negativa da via de sinalização GABAérgica /Ca2+ induzida por LPS em células C8D1A. Essas descobertas sugerem que o inositol, como metabólito chave do eixo microbiota-intestino-cérebro, medeia os efeitos da SP na melhora do comprometimento intestinal e dos comportamentos do tipo ansiedade em camundongos induzidos por DSS. A análise combinada de multi-ômica explorou a relação entre fenótipos do hospedeiro, microbiota intestinal, metabólitos e transcrição gênica cerebral. Os resultados mostraram que a SP melhorou a disbiose intestinal e aumentou ainda mais o inositol derivado de microrganismos, o que influenciou a transcrição de genes hipocampais relacionados ao NF-κB, à neurotransmissão GABAérgica e à via de sinalização de Ca²⁺. Essas alterações contribuíram para a melhora das lesões intestinais induzidas por DSS e dos comportamentos do tipo ansiedade. Estudos anteriores em modelos de colite induzida por TNBS relataram a presença de comportamentos aberrantes em testes de ansiedade e depressão. Por fim, demonstramos que a SP poderia aliviar a colite induzida por TNBS e melhorar o dano hipocampal e os comportamentos do tipo ansiedade.
Existem algumas limitações em nosso estudo. Primeiramente, embora tenhamos realizado testes comportamentais de ansiedade sem inflamação colônica após a retirada do DSS, é necessário desenvolver ensaios comportamentais inovadores para obter diretamente resultados de comportamento ansioso sem fatores de confusão, incluindo a atividade locomotora. Em segundo lugar, não foram observados sinais evidentes de toxicidade ou efeitos adversos nos experimentos realizados, indicando que o SP apresenta potencial promissor para ser desenvolvido como um agente terapêutico eficaz. No entanto, serão necessários estudos adicionais para avaliar de forma conclusiva a eficácia e a segurança a longo prazo do SP em pacientes com colite ulcerativa. Em terceiro lugar, o papel emergente da microbiota intestinal na melhora da colite induzida por TNBS tem sido recentemente destacado. Pesquisas futuras continuarão a explorar os mecanismos precisos pelos quais o SP exerce seus efeitos protetores em modelos animais de doença de Crohn induzida por TNBS. Por fim, acreditamos que um experimento de transferência adotiva de microbiota é necessário para obter evidências diretas para uma compreensão abrangente do papel da microbiota intestinal nos efeitos do SP sobre a colite e o comportamento ansioso em pesquisas futuras.
O diagrama esquemático explica o mecanismo pelo qual o SP protege contra a colite e o comportamento ansioso.
A administração de SP mitigou efetivamente o comprometimento intestinal induzido por DSS e os distúrbios comportamentais, melhorando a disbiose microbiana e subsequentemente promovendo o enriquecimento do metabólito derivado da microbiota, o inositol. Além disso, a atividade ansiolítica do SP envolve a supressão da via NF-κB, enquanto ativa a neurotransmissão GABAérgica e a sinalização de Ca2+ a jusante no hipocampo. Pintamos os esquemas de mecanismos pelo figdraw.com.
Coletivamente, nossos resultados sugerem que o SP melhorou efetivamente o comprometimento gastrointestinal semelhante à DII e os distúrbios psiquiátricos através do eixo microbiota-intestino-cérebro, o que foi alcançado restaurando a disbiose microbiana e subsequentemente aumentando a produção do metabólito derivado da microbiota, o inositol. Através do papel putativo da microbiota intestinal, bem como do inositol, o SP inibiu a via NF-κB na micróglia e ativou a neurotransmissão GABAérgica e a sinalização de Ca2+ a jusante em astrócitos no hipocampo, contribuindo assim para a redução da neuroinflamação e a melhora do comportamento ansioso. Nosso trabalho revela um papel crucial, anteriormente não descoberto, do SP na modulação do eixo microbiota-intestino-cérebro, destacando o SP como um candidato terapêutico promissor para doenças nas quais os sintomas gastrointestinais e relacionados à ansiedade estão interligados (Fig. 10).
Métodos
Procedimento do estudo
Um fluxograma do delineamento experimental deste estudo é mostrado na Fig. Suplementar 1.
Animais
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais da Universidade Agrícola da China (AW92303202-2-1, A0090214202-2-02). Camundongos C57BL/6J machos de 7 a 8 semanas de idade, livres de patógenos específicos (SPF) (Vital River Laboratory Animal Technology, Pequim, China), foram alojados em uma instalação SPF padrão em um ambiente (23–25 °C, 45–55% de umidade e ciclo claro/escuro de 12 h). Todos os camundongos foram adaptados ao ambiente e receberam dieta padrão e água por uma semana. Ao final do experimento, os camundongos foram eutanasiados de forma humanitária por asfixia com CO2 seguida de deslocamento cervical. Todos os procedimentos seguiram o princípio de minimizar o sofrimento.

Colite induzida por sulfato de sódio de dextrana (DSS) e desenho experimental
A colite aguda foi induzida pela administração de DSS a 4% (peso molecular 36–50 kDa; Yeasen, Xangai, China) dissolvido em água potável por 6 dias. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto ao peso corporal e avaliados quanto ao índice de atividade da doença (DAI). De acordo com relatos anteriores, o DAI é considerado uma medida padrão da gravidade e prognóstico da retocolite ulcerativa (RCU), compreendendo três indicadores: perda de peso (pontuação de 0 a 4 com base em uma perda de 0 a 15%), consistência das fezes (0 pontos para normal, 2 pontos para fezes amolecidas e 4 pontos para diarreia) e hematoquezia (0 pontos para normal, 2 pontos para sangue oculto positivo e 4 pontos para hemorragia evidente).

Estudo 1: tratamento com SP
O desenho experimental é mostrado na Fig. 1a. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (dez camundongos em cada grupo) da seguinte forma: controle normal (CON), apenas DSS, DSS + SP (5 nmol/kg) e apenas SP (5 nmol/kg). O grupo DSS teve acesso livre a DSS a 4% e recebeu injeção de soro fisiológico estéril diariamente por 6 dias. Os grupos DSS + SP receberam DSS a 4% por 6 dias, e SP (5 nmol/kg/dia em soro fisiológico estéril) foi administrada por injeção. O grupo apenas SP recebeu água normal e SP (5 nmol/kg/dia em soro fisiológico estéril) por 6 dias. Todos os camundongos foram submetidos a uma série de testes comportamentais. O estado das fezes e as alterações de peso foram registrados diariamente. Além disso, os tecidos hipocampais e tecidos do cólon, conteúdo cólico e amostras fecais foram coletados para análises adicionais.

Estudo 2: tratamento com antibióticos
Para explorar o papel potencial da microbiota intestinal na mitigação da colite induzida por DSS através de SP, um desenho experimental abrangente foi empregado. Inicialmente, todos os camundongos foram submetidos a um tratamento de 14 dias com ABX, uma mistura de antibióticos (Meilune, Dalian, China) incluindo 1 g/L de ampicilina, 1 g/L de metronidazol, 0,5 g/L de vancomicina, 0,5 g/L de neomicina e 0,1 g/L de gentamicina na água de beber para depletar efetivamente o microbioma intestinal. Os antibióticos foram trocados a cada dois dias. Após 2 semanas de tratamento com ABX, os camundongos foram aleatoriamente designados para três grupos: ABX (CON), ABX (DSS) e ABX (DSS + SP). O tratamento com SP e a colite induzida por DSS permaneceram consistentes com o Estudo 1 deste estudo. As amostras coletadas foram consistentes com as coletadas no estudo acima. Todos os camundongos foram eutanasiados no dia 20 seguindo o protocolo descrito na Fig. 4a.

Estudo 3: transplante de microbiota fecal (FMT)

Para validar ainda mais o efeito ameliorador do SP na colite induzida por DSS de maneira dependente da microbiota intestinal, realizamos um experimento de FMT seguindo o protocolo estabelecido em um estudo anterior. Inicialmente, coletamos as fezes dos grupos CON, DSS e DSS + SP de acordo com o Estudo 1 como doadores do FMT. As amostras de fezes frescas coletadas foram rapidamente conservadas em 40% de glicerol estéril a -80 °C. Antes do FMT, para depleção substancial da microbiota, os camundongos receptores foram submetidos a um tratamento de 2 semanas com ABX conforme descrito no Estudo 2 do protocolo. Posteriormente, os camundongos foram randomizados em três grupos: grupos FMT-CON, FMT-DSS e FMT-DSS + SP. Cada amostra de 100 mg de fezes foi suspensa em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) e centrifugada a 800 × g por 5 min para separar o sobrenadante. A suspensão bacteriana foi filtrada duas vezes e então administrada por gavagem aos camundongos receptores (150 μL por camundongo) por 7 dias. Posteriormente, os camundongos nos grupos FMT-DSS e FMT-DSS + SP foram tratados com 4% de DSS. As amostras coletadas foram consistentes com as coletadas no estudo acima. A linha do tempo experimental é mostrada na Fig. 5a.

Estudo 4: intervenção com inositol

Para investigar os efeitos protetores do inositol no comportamento ansioso em camundongos com colite, os camundongos foram alocados em quatro grupos. Para o grupo controle (CON), os camundongos receberam água normal por 14 dias durante todo o estudo. Para o grupo tratado com DSS (DSS), os camundongos receberam água normal por 8 dias, e então 4% de DSS foi administrado na água de beber por 6 dias. Para o grupo tratado com inositol e DSS (DSS + inositol), os camundongos foram tratados com 2% (p/v) de inositol (CAT#87-89-8; MACKLIN, China) na água de beber por 8 dias antes da administração de 4% de DSS e continuaram recebendo tratamento por 6 dias durante o tratamento com DSS. Para o grupo tratado apenas com inositol, os camundongos receberam água de beber com 2% (p/v) de inositol por 14 dias. Testes comportamentais foram realizados no último dia. As amostras coletadas foram consistentes com as coletadas no estudo acima. O procedimento experimental é ilustrado de forma abrangente na Fig. 8a.
Estudo 5: administração de inibidor da síntese de inositol
Para investigar o papel do inositol na ação do SP contra comportamentos do tipo ansiedade em camundongos induzidos por DSS. Os camundongos foram divididos em três grupos: (1) grupo DSS, (2) grupo DSS + SP e (3) grupo DSS + SP + L-690330 (inibidor da síntese de inositol). O delineamento da administração de DSS e SP foi o mesmo do Estudo 1. O L-690330 foi diluído em solução salina e administrado por via intraperitoneal na dose de 0,1 μmol 1 h antes da injeção de SP. A solução salina foi tratada como controle veículo. O delineamento experimental é mostrado na Fig. 9a.
Coloração por Hematoxilina e Eosina (H&E)
Os tecidos frescos do cólon e do cérebro foram amostrados aleatoriamente de cada grupo experimental e subsequentemente fixados com uma solução de paraformaldeído a 4% por um período de 48 h. Após a etapa de fixação, os tecidos foram desidratados através de uma série graduada de soluções de etanol, depois clarificados com xileno e, finalmente, embebidos em parafina. As amostras embebidas em parafina foram seccionadas em fatias de 6 μm de espessura. Essas secções foram então submetidas a um processo rotineiro de desparafinização. Em seguida, as secções de tecido foram coradas com hematoxilina e eosina (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.). Depois, as secções foram rapidamente diferenciadas e desidratadas usando etanol a 95%. As amostras foram então clarificadas com xileno e finalmente seladas usando um selante de goma neutra. Após a coloração por H&E, a profundidade das criptas do cólon foi avaliada usando o software ImageJ (versão 2.14.0). Os escores histológicos foram avaliados por um investigador cego para os grupos experimentais de acordo com infiltração inflamatória, dano mucosal e destruição do epitélio intestinal, conforme relatado anteriormente na Tabela S2. Para a coloração por H&E do tecido cerebral, a morfologia tecidual das regiões do hipocampo DG, CA1 e CA3 foi examinada sob um microscópio de luz. O software Image Pro Plus 6.0 foi usado para quantificar o número de células com lesões nas regiões do hipocampo DG, CA1 e CA3.
Microscópio eletrônico de transmissão
Para visualizar a ultraestrutura do tecido, segmentos do cólon foram cortados em amostras de 1 mm3 e fixados em glutaraldeído a 2,5% e tetróxido de ósmio a 1% a 4 °C durante a noite. Em seguida, as amostras foram desidratadas em etanol e embebidas em resina epóxi, e finalmente foram fatiadas em secções ultrafinas. As fatias foram coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo, e observadas sob um microscópio eletrônico TEM-1400 Plus (JEOL JEM-1400 Plus, Tóquio, Japão). Imagens representativas ilustrando estruturas de junções estreitas e microvilosidades foram selecionadas.
Coloração por Azul Alcião-Ácido Periódico-Schiff (AB-PAS)
As fatias de cólon de 6 μm de espessura obtidas pelo método acima também foram coradas com um kit AB-PAS (Solarbio, G1285, Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Pequim, China) seguindo as instruções. Após desparafinização e hidratação, as lâminas foram incubadas em AB por 20 min e depois lavadas com água, seguidas de incubação em ácido periódico a 1% por 10 min. Após a etapa mencionada, as lâminas foram incubadas em reagente de Schiff por 10 min. As lâminas foram finalmente re-coradas com hematoxilina por 30 s, lavadas e desidratadas, e então fixadas com Pertex. As secções coradas foram observadas sob um microscópio óptico (Leica). O número de células caliciformes por cripta foi contado com base na estrutura morfológica típica usando o software Image Pro Plus 6.0.

Imunofluorescência
Resumidamente, após desparafinização, reidratação e recuperação antigênica, as lâminas foram bloqueadas com soro de jumento por 30 min à temperatura ambiente, seguidas de incubação com anticorpos primários contra GFAP (1:1000, A8335, 1:200, NB100-53809, EUA), Iba-1 (DF6442, 1:200, Affinity, China), E-caderina (PB9561, 1:200, Boster, China), Mucina 2 (bsm-60016R, 1:100, Bioss, China), GABAARα1 (1:200, 12708-1-AP, Proteintech, China), proteína quinase II dependente de cálcio/calmodulina (CaMKII) (1:50, ab76703, Abcam, Reino Unido) e p-IKBα (1:100, WLH3930, Wanleibio, China) a 4 °C durante a noite. Em seguida, as lâminas foram lavadas três vezes em PBS e incubadas com anticorpos secundários biotinilados (705-065-147, Jackson, EUA) a 4 °C durante a noite. Após incubação com o anticorpo fluorescente a 37 °C por 2 h, as lâminas foram lavadas três vezes em PBS, secas e tratadas com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (0100-20, SouthernBiotech, Birmingham, AL, EUA). As imagens foram coletadas sob um microscópio confocal de varredura a laser (Nikon, Tóquio, Japão). Adicionalmente, o software Image Pro Plus foi usado para calcular a contagem de células positivas e a intensidade média de fluorescência nas regiões DG, CA1 e CA3 do hipocampo.

Ensaio de permeabilidade intestinal
A permeabilidade intestinal foi avaliada usando dextrana conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrana, peso molecular: 4 kD). Resumidamente, todos os camundongos foram mantidos em jejum por 6 h, e então a solução de FITC-dextrana (Chondrex, Redmond, WA, EUA) na dose de 20 mL/kg foi administrada por gavagem oral. Após 4 h, amostras de sangue dos globos oculares foram coletadas e a intensidade de fluorescência no soro foi determinada em um espectrofluorímetro (excitação, 485 nm; emissão, 528 nm).

O ensaio de matriz de microesferas Luminex
A análise Luminex foi conduzida pela LabEx (Xangai, China). Utilizando o kit Bio-Plex Pro Mouse Cytokines Grp I Panel 23-plex, os níveis de expressão de 23 citocinas foram quantificados, seguindo rigorosamente as instruções do fabricante. Resumidamente, homogeneizados de tecidos de cólon e hipocampo de camundongos foram coletados e incubados em placas de 96 poços com microesferas diluentes por meia hora em ambiente escuro à temperatura ambiente. Após a remoção dos sobrenadantes, as amostras foram expostas aos anticorpos de detecção por mais 30 min em temperatura ambiente. Em seguida, estreptavidina-PE foi adicionada a cada poço e incubada por 10 min à temperatura ambiente.

Teste de campo aberto (OFT)
O OFT foi conduzido para avaliar a atividade exploratória e a função locomotora espontânea em camundongos. Os experimentos comportamentais foram realizados em uma câmara opaca fechada com layout quadrado, utilizando o equipamento de campo aberto. Os camundongos foram suavemente depositados na zona central de uma plataforma de mesa branca, com o teste conduzido sob condições de baixa iluminação e ruído ambiente mínimo. Todos os camundongos passaram por aclimatação ao ambiente por 5 min e se moveram livremente, durante os quais foram registrados a distância total percorrida, o tempo gasto na região central, a distância na região central, bem como a velocidade de movimento na região central.

Labirinto em cruz elevado (EPM)
O EPM é comumente usado em roedores para avaliar atividade exploratória e locomotora, medo incondicionado e potencial ansiedade. O labirinto em cruz elevado (EPM) consiste em braços abertos e braços fechados que se estendem perpendicularmente de uma plataforma central, medindo 35 cm de comprimento e 5 cm de largura, com os braços fechados com 20 cm de altura. O labirinto foi posicionado a 60 cm do chão em uma sala silenciosa. Cada camundongo foi colocado no centro do labirinto em cruz, voltado para um dos braços fechados. Durante um período de observação de 5 min, foram registrados a distância percorrida, o número de entradas e o tempo gasto nos braços abertos.

Caixa claro-escuro (LDB)
No teste LDB, a caixa claro-escuro consistia na câmara clara (27 × 30 cm) com uma luz brilhante no centro, enquanto a câmara escura (27 × 30 cm) tinha paredes pretas e sem fonte de luz. As duas câmaras eram interligadas por uma passagem retangular medindo 15 cm. O camundongo foi inicialmente colocado na câmara clara, voltado para longe da abertura, e teve a liberdade de explorar toda a caixa. O comportamento de cada camundongo, incluindo a frequência de entradas em cada área e o tempo gasto na caixa clara ou na caixa escura, foi registrado durante uma sessão de 5 min.

Labirinto zero elevado (EZM)
Utilizamos o teste EZM devido à sua validade preditiva estabelecida. O labirinto possui quatro quadrantes (duas zonas abertas com bordas translúcidas de 1,5 cm de altura, separadas por duas zonas fechadas com paredes de 20 cm de altura; a largura da plataforma era de 6 cm). Resumidamente, os camundongos foram colocados no labirinto e registrados por 5 min, e imediatamente removidos do labirinto. O tempo gasto e a distância percorrida nas zonas fechadas e abertas, bem como o número de entradas em cada quadrante, foram interpretados como uma redução do comportamento do tipo ansioso.
Coloração de Nissl
O tecido cerebral foi fixado com solução de poliformaldeído a 4%, desidratado com etanol gradiente, clarificado com xileno, embebido em parafina e cortado continuamente a 6 μm. As secções foram coradas a 56 °C por 50 min usando reagentes de Nissl (Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.), seguindo as diretrizes do fabricante. Em seguida, foram desidratadas com álcool gradiente e clarificadas com xileno. Finalmente, as lâminas foram fixadas com resina neutra. No tecido hipocampal de cada grupo, os corpúsculos de Nissl e as alterações patológicas nos neurônios foram examinados cuidadosamente sob um microscópio óptico. Lâminas foram selecionadas aleatoriamente para cada grupo para contar o número de neurônios positivos (células Nissl+) pelo software Image Pro Plus 6.0.
Western blotting
Os tecidos do cérebro e do cólon foram coletados após a eutanásia dos camundongos. As proteínas foram isoladas e quantificadas por um kit de ensaio de proteínas (Beyotime Biotechnology, Xangai, China), seguido de separação eletroforética. Em seguida, a proteína foi transferida para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF), e então as membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% por 2 h a 37 °C. Na sequência, anticorpo primário contra GFAP (1:1000, A8335, 1:200, NB100-53809, EUA), GABAARα1 (1:1000, 12708-1-AP, Proteintech, China), GABABR2 (1:1000, 27567-1-AP, Proteintech, China), CaMKII (1:1000, 12716, Cell Signaling Technology, EUA), GAD65 (1:1000, ab239372, Abcam, EUA), CD206 (1:1000, ab64693, Abcam, EUA), iNOS (1:1000, 18985-1-AP, Proteintech, China), CD80 (1:1000, 66406-1, Proteintech, China), p-p65 (1:1000, A00284-1, Boster, China), p-IKBα (1:1000, WLH3930, Wanleibio, China) e β-actina (50201, 1:1000, Kemei Borui Science and Technology, China) foram incubados com as membranas durante a noite a 4 °C. Após incubação com anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho (115-035-071, Beyotime Biotechnology, Xangai, China) por 1 h a 37 °C. O kit de quimioluminescência ECL (Tanon Science and Technology Co., Ltd) foi utilizado para visualizar as bandas proteicas, e foram observadas por um luminômetro (Tanon® 5200Multi). A β-actina foi usada como controle interno. O software ImageJ (versão 2.14.0) foi utilizado para análise dos Western blots.
Cultura de fezes e medição de unidades formadoras de colônias (UFC)
As fezes foram coletadas em um tubo estéril e diluídas com 10 volumes de PBS em peso. O tubo foi vigorosamente agitado em vórtex. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 100 × g por 10 min. O sobrenadante foi diluído serialmente de 10² a 10⁸ vezes e, então, espalhado com um espalhador celular em uma placa de ágar LB. Após incubação a 37 °C por 24 h, as UFCs foram medidas.

Extração e quantificação de DNA fecal
Após o experimento, amostras fecais foram coletadas para avaliar o conteúdo de DNA fecal. O DNA foi extraído de amostras fecais (100 mg) de camundongos, utilizando o QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A pureza e a concentração do DNA foram medidas com um espectrofotômetro NanoDrop 2000C (Thermo Scientific).

Análise de sequenciamento do rRNA 16S
A análise bioinformática do microbioma foi realizada pela Biomarker Technologies Co., Ltd (Pequim, China). Resumidamente, o DNA microbiano total foi extraído do conteúdo do cólon. A região V3-V4 do gene rRNA 16S é amplificada a partir do DNA extraído usando primers bacterianos universais que visam regiões conservadas do gene. Os produtos de PCR foram quantificados pelo Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit. Os amplicons do gene rRNA 16S são então preparados para sequenciamento de alto rendimento usando a plataforma Illumina Novaseq (Biomarker Technologies, Pequim, China). As leituras brutas do sequenciamento foram filtradas usando Trimmomatic v0.33 e cutadapt 1.9.1 para obter leituras limpas de alta qualidade. Posteriormente, as sequências quiméricas foram detectadas e removidas usando o Algoritmo DADA2. Finalmente, as sequências qualificadas foram agrupadas a um nível de similaridade de 97% usando USEARCH (versão 10.0), e 0,005% do total de sequências foram identificadas como sequências filtradas por qualidade para gerar as variantes de sequência de amplicon (ASVs). A taxonomia foi atribuída às ASVs usando o classify-sklearn com um limite de confiança de 70%. A sequência representativa para cada ASV foi selecionada para anotação adicional. Índices de diversidade alfa, incluindo os índices Chao1, Shannon e Simpson, foram calculados usando o software QIIME2 (Versão 2020.8). A significância estatística entre os grupos foi determinada por análise de variância unidirecional (ANOVA) usando métodos BH-FDR com base no software python2 (scipy v0.17.1). A análise de diversidade beta foi realizada para investigar a variação estrutural nas comunidades microbianas entre as amostras usando métricas de distância binária de Jaccard e visualizada por meio de análise de coordenadas principais (PCoA). A análise de variância multivariada permutacional (PERMANOVA) baseada na distância binária de Jaccard foi aplicada para identificar a significância estatística da diversidade beta entre os grupos usando o pacote vegan no R. A análise de floresta aleatória foi realizada pelo software R v3.1.1 (randomForest v4.6-10). Software PICRUSt2 consultando o banco de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR)
O RNA total do cólon e do hipocampo foi isolado usando TRI Reagent seguindo as diretrizes do fabricante e, em seguida, foi transcrito reversamente usando o kit de síntese de cDNA HiFiScript da Vazyme (Jiangsu, China). A qPCR foi realizada no sistema StepOnePlus Real-Time PCR (Bio-Rad, INC, EUA) usando corante SYBR green (CWBIO, Pequim, China) seguindo o programa padrão. A expressão gênica foi normalizada para β-actina usando o método 2−ΔΔCT. Os primers foram sintetizados pela Sangon Biotech e as sequências dos oligonucleotídeos estão mostradas na Tabela S1.
Análise bioquímica
Os tecidos do cólon foram homogeneizados em PBS e, em seguida, centrifugados a 16.000 × g por 15 min para coletar o sobrenadante, no qual foi medido o conteúdo de proteína por um kit de ensaio de proteína BCA. As concentrações de citocinas foram detectadas usando kits de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para IL-6 (H002-1-1) e TNF-α (H052-1-1) (Instituto de Engenharia Bioquímica Jiancheng, Nanjing, China) no tecido do cólon. A concentração de SP foi detectada por um kit ELISA (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, China) nos tecidos do hipocampo. O nível de MPO das amostras do cólon foi determinado usando um kit disponível comercialmente (H508-1-1, Instituto de Engenharia Bioquímica Jiancheng, Nanjing, China). As citocinas do ácido γ-aminobutírico (GABA) das amostras do hipocampo em cada grupo de camundongos foram avaliadas usando kits ELISA (H168-1-2, NJJCBIO, Nanjing, China). Todos os ensaios estavam de acordo com os protocolos do fabricante. Um leitor de microplacas (Bio-Rad, Alemanha) foi utilizado para obter os valores de densidade óptica (DO). Os resultados foram calculados com referência à curva padrão.
Sequenciamento do transcriptoma e análise bioinformática
As amostras são derivadas do tecido do hipocampo de camundongos, bem como de dois tipos de células separadas por citometria de fluxo. O sequenciamento do transcriptoma e a análise de dados foram realizados pela OE Biotech Co. Ltd (Xangai, China). O RNA total foi extraído usando o reagente TRIZOL (Invitrogen, EUA), incluindo uma etapa adicional de digestão com DNase I. A concentração do RNA extraído foi medida usando um espectrofotômetro NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific, Wilmington, EUA). A qualidade do RNA foi avaliada para garantir a integridade do RNA, conforme avaliado pelo Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). As bibliotecas de RNA-seq foram construídas usando os kits TruSeq™ RNA Sample Preparation (Illumina, San Diego, CA, EUA). O Bioanalyzer 2100 (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) foi usado para controle de qualidade e, em seguida, as bibliotecas foram sequenciadas em uma plataforma NovaSeq 6000 (Illumina, San Diego, CA, EUA). Após o sequenciamento, as leituras brutas no formato FASTQ foram processadas usando o software fastp, que eliminou leituras de baixa qualidade para produzir leituras limpas. O alinhamento de transcritos emendados a uma referência (HISAT2) foi usado para o alinhamento de sequências nas leituras limpas de cada amostra. A análise de expressão diferencial foi conduzida com o pacote DESeq2 (2012) do R. O agrupamento hierárquico dos genes diferencialmente expressos (DEGs) foi realizado para ilustrar os padrões de expressão entre diferentes grupos e amostras. As análises de enriquecimento da via KEGG dos DEGs foram realizadas separadamente usando R, com base na distribuição hipergeométrica.

Análise do banco de dados UALCAN
UALCAN (https://ualcan.path.uab.edu/) são dados abertos do transcriptoma do câncer. O UALCAN foi usado para estimar a expressão de mRNA de genes implicados na via NF-κB e na sinalização GABAérgica/Ca2+ no adenocarcinoma de cólon (COAD).

Separação celular e análise por citometria de fluxo
Suspensões de células únicas foram preparadas a partir do tecido do hipocampo por digestão enzimática e ressuspensas em Percoll a 40% e centrifugadas a 800 × g por 20 min a 15 °C. O sobrenadante, que continha a mielina, foi descartado, e o pellet foi então ressuspenso em tampão MACS frio. As Pérolas de Remoção de Mielina II (130-96-733, Miltenyi Biotec) foram utilizadas de acordo com o protocolo do fabricante.
Os pellets de células foram tratados com bloqueador de receptor Fc para bloquear ligações inespecíficas no escuro por 15 min a 4 °C. Em seguida, as células foram aplicadas a um sistema de separação celular ativada por magnetismo (MACS) usando microesferas magnéticas Anti-ACSA2 e Anti-CD11b (Miltenyi Biotec, #130-097-679 e #130-093-634), de acordo com as instruções do fabricante. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e as células foram ressuspensas em tampão PB. A suspensão celular foi aplicada à coluna LS, que foi colocada no campo magnético do separador MACS (Miltenyi Biotec). Em seguida, as células marcadas magneticamente foram eluídas em um tubo usando 5 mL de PBS. Colete as células-alvo separadas e ressuspenda-as em um tampão FACS apropriado.
As células pré-selecionadas por MACS foram incubadas com anticorpos específicos conjugados com fluorocromos por 30 min no gelo e no escuro, lavadas e ressuspensas em tampão FACS. Os seguintes anticorpos foram utilizados para a imunocoloração: CD45 marcado com APC-Cy7 (103114, Biolegend), CD11b marcado com PE (101208, Biolegend), ACSA2 marcado com APC (130117386, Miltenyi Biotec). O anticorpo não ligado foi removido por lavagem com PBS e centrifugação a 400 × g por 10 min. As células coradas foram analisadas usando BDAriaIII (BD Biosciences) e software BD FACS Diva v8.0.1.

Análise por cromatografia líquida de ultraeficiência acoplada à espectrometria de massas (UPLC-MS)

A análise por cromatografia líquida de ultraeficiência acoplada à espectrometria de massas foi realizada pela Biomarker Technologies Co., Ltd (Pequim, China). Resumidamente, amostras de conteúdo colônico e hemisférios cerebrais direitos (100 mg, ±1%) foram pesadas e dissolvidas em 100 μL de acetonitrila/água (1:1, v/v), vortexadas adequadamente e, em seguida, centrifugadas (13.400 × g, 4 °C, 15 min). Os sobrenadantes foram coletados e separados usando um sistema UPLC (1290 Infinity LC, Agilent Technologies). Os modos de ionização positiva (+) e negativa (−) dos analitos eluídos da coluna foram detectados por ionização por electrospray. As análises foram realizadas usando UPLC acoplado à espectrometria de massas de tempo de voo quadrupolar (AB SCIEX TripleTOF 6600). Durante o experimento, amostras de controle de qualidade foram utilizadas para avaliar a estabilidade do sistema e a confiabilidade dos dados. Os dados originais coletados pelo MassLynx V4.2 foram usados para extração de picos, alinhamento de picos e outras operações de processamento de dados pelo software Progenesis QI. Com base no software Progenesis QI, bancos de dados online como METLIN e bancos de dados próprios da BMG foram usados para identificação de metabólitos de acordo com os tipos de amostra. Os metabólitos diferenciais foram identificados combinando o valor P do teste t e o valor VIP do modelo OPLS-DA (FC > 1, valor P < 0,05 e VIP > 1). Os metabólitos diferenciais foram anotados e submetidos à análise de enriquecimento usando o banco de dados KEGG. A análise de componentes principais (PCA) e os mapas de calor de agrupamento foram realizados no MetaboAnalystR.

Medição do nível de inositol

Os níveis de inositol no soro e nos tecidos hipocampais foram medidos usando um kit ELISA (Hengyuan Biotechnology Co., Ltd, Xangai, China), de acordo com o manual do fabricante. Os tecidos hipocampais foram misturados com PBS (9:1) para homogeneização e, em seguida, os sobrenadantes foram coletados por centrifugação a 16.000 × g por 15 min. A proteína total foi analisada com um kit de determinação de proteínas pelo método do ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante.

Coloração imuno-histoquímica
As amostras de cérebro foram embebidas em parafina e então seccionadas em fatias coronais de 6 μm de espessura usando um micrótomo automatizado. As secções de tecido cerebral foram cuidadosamente espalhadas e assadas. Posteriormente, as secções passaram por um processo de desparafinização usando xileno, seguido de reidratação. Após lavagem com PBS, as peroxidases endógenas presentes no tecido foram bloqueadas por tratamento com H2O2 a 3%. As secções foram bloqueadas com soro de jumento e então incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpo anti-Iba1 (1:200, DF6442, Affinity, China). Após lavagem com PBS, os anticorpos secundários biotinilados (711-065-152, Jackson, EUA) foram adicionados para incubar por 2 h à temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram lavadas em PBS e incubadas com o Reagente ABC VECTASTAIN® (ZD0201, Vector Laboratories, EUA). Após lavagem com PBS, os núcleos foram corados usando 3,3’-diamino-benzidina-tetracloridrato (DAB). Os resultados são expressos como a densidade óptica média (AOD) de células positivas para Iba1 e positivas para GFAP.

Cultura de células e tratamento

A linhagem celular de micróglia de camundongo (BV-2) foi adquirida do Banco de Células da Academia Chinesa de Ciências em Xangai. As células BV-2 foram cultivadas em Meio Eagle Modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco) e 1% de penicilina-estreptomicina em atmosfera umidificada a 37 °C com 5% de CO2. Para mimetizar um estado celular neuroinflamatório, as células foram incubadas com LPS na dose de 1 μg/mL por 24 h. Para determinar a dosagem ideal de inositol, as células BV-2 foram pré-tratadas com concentrações variadas de inositol (25, 50 e 100 μM) por 2 h. Em seguida, as células foram continuamente incubadas com LPS (1 μg/mL) por até 24 h. As células foram subsequentemente coletadas para análises posteriores.

A linhagem celular de astrócitos neuronais de camundongo (C8D1A) foi adquirida da Fuheng Biotechnology Co., Ltd (FH0837, Xangai, China). As células C8D1A foram cultivadas em Meio Eagle Modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco), 1% de penicilina-estreptomicina em atmosfera umidificada em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37 °C. Após atingir a confluência, as células C8D1A foram plaqueadas para os experimentos desejados. Posteriormente, para estudar a ação do inositol na sobrevivência dos astrócitos e na via de sinalização GABAérgica e de Ca2+, as células C8D1A foram incubadas com várias concentrações de inositol (50, 100, 200 μM) com ou sem 1 μg/ml de LPS por 24 h. Posteriormente, as células foram cuidadosamente coletadas para ensaio posterior.

A viabilidade celular foi determinada pelo kit de contagem celular-8 (CCK-8).
A viabilidade celular foi avaliada pelo Cell Counting Kit-8 de acordo com as instruções do fabricante (MedChemExpress, EUA). Células (1 × 105 células/mL) em fase exponencial de crescimento foram semeadas em placas de 96 poços. Células BV-2 e C8D1A foram tratadas com diferentes concentrações de inositol por 24 h, e o meio de cultura como controle. Ao final do tratamento, 10 μL de reagente CCK8 foram adicionados a cada poço e incubados com as células por 4 h. Finalmente, os valores de OD foram detectados a 450 nm usando um leitor de microplacas. A viabilidade celular foi expressa como porcentagem do número de células sobreviventes em relação aos grupos controle.

Indução do modelo de colite em camundongos com ácido trinitrobenzenossulfônico (TNBS) e tratamento com SP

O desenho experimental foi revelado na Fig. Suplementar 23a. O modelo de colite ulcerativa aguda em camundongos foi induzido pela administração de ácido 2,4,6-Trinitrobenzenossulfônico (TNBS) de acordo com o método previamente relatado. Resumidamente, os camundongos foram levemente anestesiados com éter. Em seguida, 3,5 mg de TNBS (Meilune, Dalian, China) em 100 μL de uma solução de etanol a 50% foram lentamente administrados no cólon, 3,0–3,5 cm, a partir do ânus, através de um cateter flexível. Os camundongos foram mantidos em posição vertical por 30 s após a injeção. O SP foi administrado por via intraperitoneal a partir do dia da administração de TNBS e continuado diariamente até o final do estudo no dia 7. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: um grupo controle recebendo veículo (CON), um grupo com colite recebendo TNBS (TNBS) e dois grupos adicionais com colite recebendo 5 nmol/kg ou 10 nmol/kg de SP por injeção (TNBS + SP-L e TNBS + SP-H, respectivamente). Cada grupo consistiu em seis camundongos. Os camundongos do grupo não colite foram tratados com 0,1 ml de etanol a 50% sozinho em vez de TNBS. Os camundongos foram pesados e observados diariamente, e avaliados quanto ao DAI, com base nos critérios descritos acima.

Análise estatística

Os dados foram analisados e os gráficos foram plotados nas figuras usando o software GraphPad Prism (Versão 8.0, GraphPad, San Diego, CA, EUA). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). Correlações de Spearman entre os fenótipos, bactérias do cólon, metabólitos e expressão gênica cerebral foram realizadas utilizando o software R. Diferenças significativas em mais de dois grupos foram analisadas usando análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey ou ANOVA de duas vias com teste de comparações múltiplas de Sidak. Para todas as comparações estatísticas, *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001.

Resumo do relatório

Mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Resumo de Relatório do Nature Portfolio vinculado a este artigo.

Informações suplementares

Dados de origem

Nota da editora A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Informações suplementares

A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41467-025-67904-0.

Contribuições dos autores
Y.M. e J.L. conceberam e desenharam o estudo. J.L. coletou todos os dados do experimento. J.L., J.W., S.H., C.L. e Z.D. realizaram as análises estatísticas. J.L. escreveu o artigo. Y.M., J.L. e Z.H. revisaram o manuscrito. Z.D. forneceu suporte técnico. Z.H. forneceu suporte técnico e material. Y.M. supervisionou o estudo e forneceu suporte administrativo, técnico e material. Todos os autores aprovaram a versão final do manuscrito.
Revisão por pares
Informações sobre revisão por pares
A Nature Communications agradece a Stephen Collins e ao(s) outro(s) revisor(es) anônimo(s) por sua contribuição à revisão por pares deste trabalho. Um arquivo de revisão por pares está disponível.
Disponibilidade de dados
Os dados de sequência do rRNA 16S foram depositados no Sequence Read Archive (SRA) sob os números de acesso do BioProject PRJNA1164042, PRJNA1277767 e PRJNA1279049. Os dados de RNA-seq foram depositados no Gene Expression Omnibus (GEO) sob o número de acesso GSE278270. Os dados de metabolômica foram depositados no banco de dados EMBL-EBI MetaboLights sob o número de acesso MTBLS11203. Todos os outros dados que sustentam as conclusões deste estudo estão disponíveis no artigo e nos materiais suplementares. Os dados de origem são fornecidos com este artigo.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Referências
Interações hospedeiro-microbiota na doença inflamatória intestinal
Aliviando o comportamento semelhante à depressão em camundongos com colite induzida por DSS: explorando naringina e poncirina de extratos de Poncirus trifoliata
O que podemos fazer para lidar com a ansiedade e a depressão em pacientes com doença inflamatória intestinal?
Sintomas de ansiedade e depressão, e qualidade de vida de pacientes com doença de Crohn
O papel do eixo microbiota-intestino-cérebro em processos neurodegenerativos de longo prazo após lesão cerebral traumática
A microbiota e o eixo intestino-cérebro: contribuições para a imunopatogênese da esquizofrenia
Peptídeo derivado de noz melhora o comprometimento cognitivo em camundongos com colite induzida por sulfato de dextrano sódico via eixo microbiota-intestino-cérebro (MGBA)
O efeito do transplante de microbiota fecal em sintomas psiquiátricos entre pacientes com síndrome do intestino irritável, diarreia funcional e constipação funcional: um estudo observacional aberto
Impacto dos metabólitos microbianos no eixo microbiota-intestino-cérebro na doença inflamatória intestinal
A deficiência de menina leva a comportamentos semelhantes à depressão em camundongos ao modular a neuroinflamação mediada por astrócitos
A barreira intestino-cérebro na depressão maior: disfunção da mucosa intestinal com aumento da translocação de LPS de enterobactérias gram-negativas (intestino permeável) desempenha um papel na fisiopatologia inflamatória da depressão
Alvos de citocinas no cérebro: impacto nos neurotransmissores e neurocircuitos
Estresse pré-natal e aumento da suscetibilidade a comportamentos semelhantes à ansiedade: papel da neuroinflamação e equilíbrio entre a transmissão GABAérgica e glutamatérgica
Características da microglia e neuroinflamação relevantes para a exposição ambiental e neurotoxicidade
Astrócitos reativos como potenciais alvos de manipulação na nova terapia de substituição celular da doença de Parkinson
Múltiplos papéis dos astrócitos como efetores de citocinas e mediadores inflamatórios
Cui, C., Grandison, L. & Noronha, A. Interações neurais-imunes na função cerebral e distúrbios relacionados ao álcool (Springer Science & Business Media, 2012).
Sinalização de cálcio intercelular e comunicação por junções comunicantes em astrócitos
Vias de interações neurônio-astrócito e seu possível papel na neuroproteção
A interação entre a microbiota intestinal e o cérebro
Holzer, P. & Farzi, A. Neuropeptídeos e o eixo microbiota-intestino-cérebro. Adv. Exp. Med. Biol. 817, 195–219 (2014).
O papel da substância P na depressão: implicações terapêuticas
Substância P e seu papel nos mecanismos neurais que governam aprendizado, ansiedade e recuperação funcional
Um modelo in vivo para os efeitos neurodegenerativos do beta-amiloide e proteção pela substância P
O pré-tratamento com a neurocinina substância P, mas não com colecistocinina-8S, pode aliviar déficits funcionais da lesão nigroestriatal parcial por 6-hidroxidopamina
O neuropeptídeo substância P atenua a colite ao suprimir inflamação e ferroptose via via de sinalização cGAS-STING
Uma revisão sobre modelos de doença inflamatória intestinal induzida quimicamente em roedores
Tang, X. Propriedades anti-inflamatórias e de modulação da microbiota intestinal dos polissacarídeos do alho Jinxiang (Allium sativum L.) na colite induzida por sulfato de dextrano sódico.pdf. (2021).
Jatrorrizina alivia a colite ulcerativa induzida por DSS ao regular a função da barreira intestinal e inibir a via de sinalização TLR4/MyD88/NF-κB
Uma subpopulação intercrypt de células caliciformes é essencial para a função da barreira de muco do cólon
Barreira intestinal na saúde e doença humana
Mantenha a calma: a barreira intestinal na interface entre paz e guerra
Caracterização comportamental e farmacológica do 'labirinto zero' elevado como modelo animal de ansiedade
Desregulação da neuroplasticidade hipocampal adulta na depressão maior: patogênese e implicações terapêuticas
A via hipocampal-pré-frontal: o elo fraco nos transtornos psiquiátricos?
Escopoletina melhora comportamentos do tipo ansiedade em modelo de camundongo induzido por adjuvante completo de Freund
Neuroinflamação e doença de Alzheimer: implicações para a ativação microglial
Função e valor terapêutico dos astrócitos em doenças neurológicas
Mecanismo molecular dos efeitos protetores da microglia M2 sobre neurônios: uma revisão focada em exossomos e proteínas secretoras
O tratamento com antibióticos altera a camada de muco do cólon e predispõe o hospedeiro à colite exacerbada induzida por Citrobacter rodentium
Novos antioxidantes zolimida e AEOL11201 melhoram a colite em ratos
Receptores GABAA e GABAB medeiam sinais de Ca2+ intracelular induzidos por GABA em células endoteliais microvasculares cerebrais humanas
Vias de sinalização NF-kappaB na inflamação neurológica: uma mini revisão
Papel dos astrócitos na função cerebral e na doença
Metabólitos derivados da microbiota como condutores da comunicação intestino–cérebro
Grill. et al. A deficiência de E-caderina intestinal agrava a colite induzida por sulfato de sódio dextrana.
Descarboxilase do glutamato de bactérias ácido-lácticas—uma enzima chave na síntese de GABA
A expressão de GAT1 e GAT3 é diferentemente localizada no hipocampo epileptogênico humano
Anticorpos contra interleucina 12 abolem a colite experimental estabelecida em camundongos
Efeitos protetores e mecanismos da cápsula HuDiChangRong na colite ulcerativa induzida por TNBS em camundongos
Efeito protetor do okara fermentado na regulação da inflamação, microbiota intestinal e produção de SCFAs em ratos com colite induzida por TNBS
O papel da substância P na doença inflamatória
Aumento induzido por interleucina 1 beta da substância P no plexo miocárdico de rato
TRPA1 e substância P medeiam a colite em camundongos
A substância P regula a colite do tipo Th1 em camundongos knockout para IL-10
O neuropeptídeo Y atenua o remodelamento cardíaco e a deterioração da função após infarto do miocárdio
A substância P medeia respostas antiapoptóticas em colonócitos humanos pela ativação de Akt
A substância P promove a cicatrização de feridas no diabetes modulando a inflamação e o fenótipo de macrófagos
A substância P alivia o dano intestinal induzido por sulfato de sódio dextrana suprimindo a inflamação através do enriquecimento de macrófagos M2 e células T reguladoras
A substância P inibe a disfunção endotelial microvascular cardíaca causada pelo estresse oxidativo induzido por alta glicose
A substância P previne a lesão hepática colestática regulando as respostas inflamatórias
A administração exógena de substância P melhora a cicatrização de feridas em um novo modelo de lesão cutânea
O neuropeptídeo substância P melhora a cicatrização de feridas cutâneas in vitro e in vivo sob hipóxia
Neurotransmissores como suplementos alimentares: os efeitos do GABA no cérebro e no comportamento
Disbiose intestinal e serotonina: 5-HT intestinal como um regulador ubíquo da permeabilidade da membrana em tecidos, órgãos e cérebro do hospedeiro
O GABA atenua a apoptose de células epiteliais intestinais induzida por ETEC envolvendo a sinalização do GABA AR e a via AMPK-autofagia
A substância P reduz o tamanho do infarto e a mortalidade após acidente vascular cerebral isquêmico, possivelmente através da polarização M2 de micróglia/macrófagos e neuroproteção no cérebro isquêmico de rato
Um papel potencial para citocinas pró-inflamatórias na regulação da plasticidade sináptica no transtorno depressivo maior
Papel da densidade da proteína translocadora, um marcador de neuroinflamação, no cérebro durante episódios depressivos maiores
O licopeno alivia a colite induzida por DSS e distúrbios comportamentais mediando o equilíbrio do eixo micróbios–intestino–cérebro
A curcumina inibe a neuroinflamação induzida por LPS promovendo a polarização M2 microglial através das vias TREM2/TLR4/NF-κB em células BV2
Astrócitos: reguladores-chave da neuroinflamação
Astrócitos hipocampais modulam o comportamento do tipo ansioso
A densidade de astrócitos imunorreativos para GFAP está diminuída no hipocampo esquerdo no transtorno depressivo maior
Alterações específicas de região na morfologia de astrócitos e micróglia após exposição a explosões no hipocampo de camundongos
Eletroacupuntura e moxabustão regulam a ativação da glia e mitocôndrias do hipocampo em camundongos com colite induzida por DSS
Perda precoce de astrócitos após lesão cerebral traumática experimental
Comportamentos crônicos do tipo ansiedade e depressão estão associados a patologia mediada pela glia após neurotrauma repetido induzido por explosão
Do intestino ao cérebro: alteração nos marcadores de inflamação no cérebro de camundongos modelo de colite induzida por sulfato de sódio dextrano
Microbiota intestinal de camundongos deficientes em NLRP3 melhora comportamentos do tipo depressivo ao regular a disfunção de astrócitos via circHIPK2
Cryan, J. F. et al. The microbiota-gut-brain axis. Physiol. Rev. 99, 1877–2013 (2019).
Efeito do consumo de uma mistura probiótica multi-cepas nos sintomas de ansiedade e depressão induzidos em camundongos adultos pela separação materna pós-natal
A 5-HT atenua o comprometimento cognitivo induzido por estresse crônico em camundongos por meio da disrupção da flora intestinal
Efeitos da suplementação de GABA na secreção de SIgA intestinal e na microbiota intestinal em leitões desmamados saudáveis e infectados por ETEC
A substância P aumenta a produção de ácido lático e tiramina em Enterococcus faecalis V583 e promove seu efeito citotóxico em células intestinais Caco-2/TC7
Fucoidano atenua colite crônica e déficits comportamentais ao reequilibrar o eixo microbiota intestinal-cérebro
Proteobactérias: assinatura microbiana de disbiose na microbiota intestinal
Efeito regulatório do Garidisan na disbiose da microbiota intestinal no modelo de camundongo de colite ulcerativa induzida por sulfato de sódio dextrano
Exploração da família Muribaculaceae na microbiota intestinal: diversidade, metabolismo e função
A microbiota salivar da periodontite exacerba o comportamento do tipo ansiedade induzido por colite via microbiota intestinal
Enterococcus faecium e Pediococcus acidilactici deterioram a depressão e colite induzidas por Enterobacteriaceae em camundongos
Efeitos de probióticos na reatividade cognitiva, humor e qualidade do sono
Transplante de microbiota fecal de pacientes com doença inflamatória intestinal e depressão altera a resposta imune e o comportamento em camundongos receptores
Efeito do transplante de microbiota fecal nos sintomas de transtornos psiquiátricos: uma revisão sistemática
Urolitinas atenuam a neuroinflamação induzida por LPS em micróglia BV2 via vias de sinalização MAPK, Akt e NF-κB
Plasticidade do GABAAR durante a gestação: relevância para a depressão pós-parto
O sistema GABA na ansiedade e depressão e seu potencial terapêutico
Potencial terapêutico dos ligantes do receptor GABAB na dependência de drogas, ansiedade, depressão e outros distúrbios do SNC
Células e sinais GABAérgicos no desenvolvimento do SNC
GABA: um neurotransmissor pioneiro que excita neurônios imaturos e gera oscilações primitivas
Há mais no GABA do que a inibição sináptica?
A ativação do receptor GABAB potencializa as respostas mediadas por mGluR em sinapses excitatórias do cerebelo
Atividade de Ca2+ nos receptores GABAB promove constitutivamente a sinalização glutamatérgica metabotrópica na ausência de GABA
Receptores GABAA e GABAB de propriedades distintas afetam de forma oposta a proliferação de células-tronco embrionárias de camundongos por meio da elevação sinérgica do Ca2+ intracelular
As quinases II e IV dependentes de cálcio/calmodulina como alvos terapêuticos em distúrbios neurodegenerativos e neuropsiquiátricos
Base estrutural da calmodulina como um sensor dinâmico de cálcio
A plasticidade astroglial no hipocampo é afetada pelo estresse psicossocial crônico e pelo tratamento concomitante com fluoxetina
Interações microbiota-imune: do intestino ao cérebro
Modulação de neurotransmissores pela microbiota intestinal
Mecanismo de intervenção da administração oral repetida de GABA em comportamentos do tipo ansiedade induzidos por estresse emocional em ratos
O papel modulador da dopamina no comportamento do tipo ansiedade
Metabólito derivado da microbiota promove a atividade da HDAC3 no intestino
Shirmohammad, F., Mehri, M. & Joezy-Shekalgorabi, S. Uma revisão sobre o papel do inositol na aquicultura. (2016).
Regulações da homeostase do mio-inositol: mecanismos, implicações e perspectivas
O fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) potencializa o transporte de GABA modulando o tráfego do transportador de GABA-1 (GAT-1) da membrana plasmática de astrócitos corticais de ratos
A eletroacupuntura atenuou o comportamento do tipo ansiedade e depressão por meio da inibição da resposta inflamatória hipocampal e dos distúrbios metabólicos em ratos com DII induzida por TNBS
O deferasirox alivia a colite ulcerativa induzida por DSS em camundongos ao inibir a ferroptose e melhorar a microbiota intestinal
A dihidromiricetina melhora a colite induzida por DSS em camundongos por meio da modulação do metabolismo de ácidos biliares relacionados a bactérias fecais
A decocção modificada de gegen qinlian regula o equilíbrio Treg/Th17 para melhorar a colite experimental aguda induzida por DSS em camundongos, alterando a microbiota intestinal
A restrição moderada de proteína dietética otimizou a microbiota intestinal e a barreira mucosa em modelo de suínos em crescimento
O poli-β-hidroxibutirato aliviou a diarreia e a colite por meio da maturação de sulfomucina mediada pelo biofilme de Lactobacillus johnsonii
O inflamassoma NLRP1 contribui para comportamentos do tipo depressivos induzidos por estresse crônico em camundongos
DADA2: Inferência de amostras de alta resolução a partir de dados de amplícon Illumina
Ciência de dados de microbioma reprodutível, interativa, escalável e extensível usando QIIME 2
PICRUSt2 para predição de funções metagenômicas
KEGG: Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto
Estimativa moderada de mudança de dobra e dispersão para dados de RNA-seq com DESeq2
UALCAN: um portal para facilitar análises de expressão gênica e sobrevivência de subgrupos tumorais
METLIN: um banco de dados de espectrometria de massa de metabólitos
MetaboAnalystR: um pacote R para análise flexível e reprodutível de dados metabolômicos
O butirato de sódio inibe a inflamação e mantém a integridade da barreira epitelial em um modelo de camundongos com doença inflamatória intestinal induzida por TNBS