pmid: "31292453"
title: "Diminuição do acetato sérico materno e desenvolvimento prejudicado de células T tímicas e reguladoras fetais na pré-eclâmpsia."
authors: "Hu M, Eviston D, Hsu P, Mariño E, Chidgey A, Santner-Nanan B, Wong K, Richards JL, Yap YA, Collier F, Quinton A, Joung S, Peek M, Benzie R, Macia L, Wilson D, Ponsonby AL, Tang MLK, O'Hely M, Daly NL, Mackay CR, Dahlstrom JE, BIS Investigator Group, Vuillermin P, Nanan R"
journal: "Nature communications"
pubdate: "2019 Jul 10"
doi: "10.1038/s41467-019-10703-1"
source: "PMC Full Text"
Diminuição do acetato sérico materno e desenvolvimento prejudicado de células T tímicas e reguladoras fetais na pré-eclâmpsia.
Autores
Hu M, Eviston D, Hsu P, Mariño E, Chidgey A, Santner-Nanan B, Wong K, Richards JL, Yap YA, Collier F, Quinton A, Joung S, Peek M, Benzie R, Macia L, Wilson D, Ponsonby AL, Tang MLK, O'Hely M, Daly NL, Mackay CR, Dahlstrom JE, BIS Investigator Group, Vuillermin P, Nanan R
Periodico
Nature communications (2019 Jul 10)
Conteudo
Diminuição do acetato sérico materno e comprometimento do desenvolvimento do timo fetal e de células T reguladoras na pré-eclâmpsia
A desregulação imunológica materna parece afetar o desenvolvimento imunológico fetal ou pós-natal. A pré-eclâmpsia é um distúrbio associado à gravidez com base imunológica e está ligada a distúrbios atópicos na prole. Aqui mostramos redução do tamanho do timo fetal, alteração da arquitetura tímica e redução da produção de células T reguladoras (Treg) do timo fetal em gestações pré-eclâmpsicas, que persiste até os 4 anos de idade na prole humana. Em camundongos livres de germes, o desenvolvimento de células T CD4+ e células Treg no timo fetal é comprometido, mas resgatado pela suplementação materna com o metabólito bacteriano intestinal acetato de ácido graxo de cadeia curta (AGCC), que induz a regulação positiva do regulador autoimune (AIRE), conhecido por contribuir para a geração de células Treg. Em nossas coortes humanas, o baixo acetato sérico materno está associado à pré-eclâmpsia subsequente e se correlaciona com o acetato sérico no feto. Esses achados sugerem um papel potencial do acetato na patogênese da pré-eclâmpsia e no desenvolvimento imunológico da prole.
A desregulação imunológica materna pode afetar o desenvolvimento imunológico do feto. Aqui os autores mostram que a diminuição do acetato materno está associada à pré-eclâmpsia, ao comprometimento da produção tímica fetal e ao desenvolvimento de células T reguladoras.
Introdução
O ambiente materno e intrauterino precoce provavelmente afeta a saúde e a doença mais tarde na vida. Isso é particularmente verdadeiro para doenças não transmissíveis, como alergia e autoimunidade. A pré-eclâmpsia é um distúrbio comum associado à gravidez, exclusivo de humanos. Acredita-se que se desenvolva devido a uma ruptura na tolerância imunológica materno-fetal, conforme demonstrado por alterações imunológicas maternas, incluindo redução de células T reguladoras (Treg). As alterações imunológicas maternas na pré-eclâmpsia geralmente se refletem no sistema imunológico fetal. Por sua vez, há algumas evidências de que a pré-eclâmpsia está associada a maiores taxas de alergia e doença cardiovascular na prole. Isso sugere um fator comum, ambiental ou fisiológico, que influencia ambos os sistemas imunológicos materno e fetal.
Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs), principalmente acetato, butirato e propionato, são os principais produtos metabólicos da microbiota intestinal, produzidos principalmente através da fermentação bacteriana da fibra alimentar. Os AGCCs possuem potentes efeitos anti-inflamatórios, que provavelmente se relacionam com seu papel na homeostase imune intestinal e sistêmica. O butirato é principalmente (70–90%) absorvido pelo epitélio colônico, enquanto o propionato é em grande parte captado pelo fígado, deixando o acetato como o AGCC circulante mais proeminente. As concentrações séricas de acetato variam de 70–170 μM, em contraste com o propionato e butirato, cujas concentrações séricas variam de 1–13 μM.
Três estudos recentes em murinos também mostraram que o acetato e o butirato da dieta podem proteger contra o desenvolvimento de alergia alimentar, asma e diabetes tipo 1 autoimune (DT1) através da modulação da tolerância imunológica. Por exemplo, o acetato e o butirato de uma dieta rica em fibras aumentaram o número de Tregs ao aumentar a atividade da retinol desidrogenase em células dendríticas (DCs) tolerogênicas CD103+ ou diretamente via inibição da HDAC. A ingestão materna de fibra alimentar/acetato durante a gravidez protegeu a prole contra a doença alérgica das vias aéreas (AAD) correlacionada com um aumento acentuado da função das Tregs. Camundongos jovens não obesos diabéticos (NOD), tratados com uma combinação de amidos modificados que liberam acetato e butirato microbianos, foram protegidos do desenvolvimento de diabetes tipo 1 autoimune (DT1) em 90% dos casos, resultando na cessação da destruição das células β e restauração da tolerância imunológica associada à expansão das células Treg, e redução das células T CD4+ e CD8+ autorreativas. Além disso, descobriu-se que o acetato da dieta também protege contra doenças cardiovasculares e hipertensão em modelos murinos.
Curiosamente, há algumas evidências sugerindo que a microbiota intestinal materna pode influenciar a patogênese da pré-eclâmpsia, com o uso de probióticos associado a um risco reduzido de pré-eclâmpsia. Além disso, a dieta mediterrânea, bem como uma dieta rica em fibras, que promovem a produção de AGCCs, também estão associadas à diminuição da pré-eclâmpsia. Ademais, em um modelo murino, a suplementação com fibras altas ou a suplementação direta de acetato reduziu significativamente tanto as pressões arteriais sistólica quanto diastólica, um achado altamente relevante para a pré-eclâmpsia, que apresenta a hipertensão como característica clínica definidora.
A ecologia microbiana materna é conhecida por influenciar o desenvolvimento imunológico fetal. Em camundongos, vários estudos mostraram que a composição microbiana materna é importante para a proteção contra o desenvolvimento de doenças alérgicas na prole e pode influenciar a resposta imune infantil. Em humanos, diversos estudos transversais e de coorte confirmaram esses achados e mostraram que a exposição microbiana materna (por exemplo, no ambiente de fazenda) está associada a alterações nos perfis imunológicos da prole e proteção contra distúrbios atópicos. Exatamente como essa proteção é conferida é desconhecido; no entanto, um papel para as células Treg e receptores de ligantes Toll (TLR), que podem ser ativados por produtos bacterianos, foi inferido. Portanto, um conceito atraente é que os níveis de produção de SCFAs pela microbiota intestinal materna podem influenciar a homeostase imunológica materna e fetal durante a gravidez.
Neste estudo, apresentamos evidências de uma associação entre metabólitos microbianos intestinais maternos e o desenvolvimento imunológico fetal na pré-eclâmpsia. Especificamente, demonstramos em camundongos uma ligação entre acetato e desenvolvimento e produção tímica fetal, com associações concordantes em coortes humanas entre a diminuição do acetato sérico e subsequente pré-eclâmpsia, e entre pré-eclâmpsia e diminuição do tamanho e produção tímica na prole. A suplementação materna com acetato teve um impacto significativo no sistema imunológico fetal em um modelo de camundongo livre de germes, com a prole demonstrando aumento na produção de células T CD4+, melhora na expressão de Foxp3 e resgate de células epiteliais tímicas especializadas que expressam o gene AIRE, essencial para a indução de autotolerância e geração de células Treg no início da vida.
Resultados
O desenvolvimento tímico fetal é comprometido em gestações com pré-eclâmpsia
Mostramos anteriormente que o tamanho tímico fetal reduzido é evidente em gestações com pré-eclâmpsia ao examinar imagens de ultrassom fetal em séries de caso-controle montadas retrospectivamente. Aqui, realizamos estudos prospectivos em duas coortes separadas. Primeiro, comparamos as medidas de volume e diâmetro do timo fetal entre 50 mulheres grávidas com pré-eclâmpsia e 50 sem pré-eclâmpsia (coorte Nepean 1, as características das pacientes são mostradas na Tabela Suplementar 1a). Em seguida, em uma segunda coorte, recrutamos 887 mulheres grávidas entre 17 e 22 semanas de gestação, das quais 24 desenvolveram pré-eclâmpsia mais tarde em suas gestações (coorte Nepean 2, as características das pacientes são mostradas na Tabela Suplementar 2).
Desenvolvimento tímico fetal prejudicado na pré-eclâmpsia. a
Coorte Nepean 1: Cálculo de análise computadorizada assistida por órgão virtual do volume do timo fetal com 26 semanas de gestação, mostrando três planos ortogonais (superior esquerdo: transversal, superior direito: coronal, inferior esquerdo: sagital) e volume do timo reconstruído (inferior direito). b Gráfico de pontos mostrando volumes do timo fetal em diferentes semanas gestacionais nos grupos não pré-eclâmptico (n = 50, pontos pretos) e pré-eclâmptico (n = 50, pontos vermelhos). Média ± DP: 2,6 ± 1,3 mL e 1,6 ± 1,2 mL, respectivamente (p < 0,001, teste t não pareado). c
Coorte Nepean 2: Medição do diâmetro do timo fetal: uma vista axial do timo fetal foi obtida, dentro de uma imagem padrão do trato de saída do ventrículo direito (TSVD). Em seguida, uma linha foi traçada conectando a coluna vertebral e o esterno fetal (I). O diâmetro do timo fetal foi medido como seu maior diâmetro (II), perpendicular à linha I. Sp = coluna vertebral, S = veia cava superior, A = aorta, P = artéria pulmonar. Barra de escala = 5 mm. d Gráfico de pontos mostrando o diâmetro do timo fetal em diferentes semanas gestacionais nos grupos não pré-eclâmptico (n = 863, pontos pretos) e pré-eclâmptico (n = 24, pontos vermelhos), as médias ajustadas foram 18,3 mm e 16,5 mm, respectivamente (p < 0,001, teste t não pareado)
As características maternas e fetais na Coorte Nepean 1 foram semelhantes entre os grupos, exceto que a pré-eclâmpsia foi associada a uma maior taxa de nuliparidade, maior índice de massa corporal materno (IMC; medido na primeira consulta pré-natal), maior peso fetal estimado médio e idade gestacional mais precoce no parto (Tabela Suplementar 1a). As ultrassonografias pré-natais mostraram que, em comparação com a gestação normal, a pré-eclâmpsia foi associada a uma redução de 38% no volume tímico fetal (1,6 versus 2,6 mL, p < 0,001 (teste t não pareado), Tabela Suplementar 1b) e a uma redução de 12,1% no diâmetro tímico fetal (2,9 versus 3,3 cm, p = 0,01 (teste t não pareado), Tabela Suplementar 1b). A evidência de diferença persistiu após ajuste para percentil de peso fetal estimado, IMC materno e tabagismo (p = 0,04 e p = 0,009 para volume médio e diâmetro médio do timo fetal (regressão logística univariada), respectivamente). As diferenças nos volumes do timo entre pré-eclâmpsia e controles saudáveis foram pequenas no início da gestação, mas aumentaram linearmente ao longo da gestação (Fig. 1b). No termo, o volume médio do timo em fetos de mulheres com pré-eclâmpsia era aproximadamente metade do volume em fetos de gestações normais. Para cada aumento de 1 mL no volume, o diâmetro médio do timo (DMT) aumentou em média 1,03 cm (IC 95%: 0,79–1,28, p < 0,001 (regressão logística univariada), R2 = 41%).
Na coorte 2 de Nepean, cada gestação teve medidas do timo fetal realizadas no meio da gestação, entre 18 e 22 semanas, muito antes do início da pré-eclâmpsia clínica. Novamente, a pré-eclâmpsia foi associada a um diâmetro menor do timo fetal (Fig. 1d); as médias ajustadas foram 16,5 versus 18,3 mm, respectivamente (p < 0,001 (teste t não pareado), Tabela Suplementar 2). As chances de pré-eclâmpsia aumentaram em 1,41 (1,17, 1,69) para cada redução de 1 mm no diâmetro do timo fetal (p < 0,001, regressão logística univariada). Ajustando para idade gestacional e IMC materno, a regressão logística multivariada (Modelo 1) constatou que as chances de pré-eclâmpsia aumentaram em 1,47 (1,22, 1,78) para cada redução de 1 mm no diâmetro do timo fetal (p < 0,001, regressão logística univariada). A magnitude e a evidência de associação também persistiram após o ajuste para perímetro cefálico fetal e IMC materno (razão de chances do diâmetro do timo fetal = 1,51 (1,23, 1,85, p < 0,001, regressão logística univariada).
Curvas de característica de operação do receptor (ROC) foram geradas para avaliar o diâmetro do timo fetal no meio da gestação como ferramenta preditiva para pré-eclâmpsia. O diâmetro do timo fetal no meio da gestação isoladamente apresentou uma área sob a curva (AUC) de 0,71. Juntamente com a idade gestacional e o IMC materno, a AUC aumentou para 0,78. Como nosso grupo havia descoberto anteriormente que o aumento do crescimento cefálico fetal também estava associado à pré-eclâmpsia após ajustar os confundidores, incluímos então o perímetro cefálico fetal no modelo. Quando o diâmetro do timo fetal no meio da gestação, o perímetro cefálico fetal no meio da gestação, a idade gestacional e o IMC materno foram incluídos, pudemos alcançar uma AUC de 0,81 (Figura Suplementar 1).
Produção de células Treg tímicas fetais é reduzida na pré-eclâmpsia
Número reduzido de células Treg fetais e produção tímica fetal de Treg na pré-eclâmpsia. Coorte 3 de Nepean:
a Gráfico de dispersão de pontos mostrando as frequências de células Treg em díades materno-fetais a termo em gestações não pré-eclâmpticas (não-PE) (n = 62, pontos pretos) e pré-eclâmpticas (PE) (n = 26, pontos vermelhos). Foi utilizada correlação de Pearson. Coeficiente r e valores de p conforme indicado. b Gráficos de dispersão de pontos comparando a %Foxp3+ (Média) dentro de células CD4+ em sangue de cordão umbilical (n = 66 para não-PE, n = 29 para grupo PE) e sangue materno (n = 62 para grupo não-PE, n = 27 para grupo PE) (teste t não pareado). A estratégia de seleção para Tregs Foxp3+ a partir de PBMC é mostrada na Figura Suplementar 2. c Gráfico de pontos representativo mostrando células Foxp3+Helios+ em sangue de cordão umbilical selecionadas em células CD4+. d Gráficos de dispersão de pontos mostrando a porcentagem de células Foxp3+Helios+ (Média) em sangue de cordão umbilical. Painel esquerdo comparando %Foxp3+Helios+ nos grupos não-PE (n = 20) e PE (n = 19) (teste t não pareado). Painel direito dividindo o grupo PE em dois subgrupos com base no tratamento com corticoides: n = 10 para sem corticoides e n = 9 para com corticoides (ANOVA de uma via com teste de comparações múltiplas de Dunnett). *p < 0,05, **p < 0,01
Mostramos anteriormente que as porcentagens de células Treg no sangue do cordão umbilical e no sangue materno eram altamente correlacionadas, sugerindo um mecanismo comum para o controle de Treg tanto na mãe quanto no feto. Aqui, ampliamos essa descoberta e mostramos uma correlação entre as proporções de células Treg maternas e fetais tanto na gravidez saudável quanto na pré-eclâmpsia. As características dos pacientes (coorte Nepean 3) são mostradas na Tabela Suplementar 3. As células Treg maternas periféricas correlacionaram-se com as Treg do sangue do cordão umbilical, mas em menor extensão na pré-eclâmpsia em comparação com gestações não pré-eclâmpticas, e a frequência geral de Treg foi menor em díades pré-eclâmpticas em comparação com não pré-eclâmpticas (intercepto Y em X = 0: 2,68 ± 0,56 versus 2,51 ± 0,92, p = 0,019, teste t não pareado) (Fig. 2a).
As Tregs do sangue materno (a porcentagem de células Foxp3+ dentro das células CD4+) foram menores na pré-eclâmpsia (p = 0,004, teste t não pareado) e, similarmente, houve algumas evidências de que as frequências de células Treg no sangue do cordão umbilical foram menores em filhos de gestações pré-eclâmpticas versus não pré-eclâmpticas (p = 0,09, teste t não pareado) (Fig. 2b). Um subgrupo da coorte Nepean 3 que incluiu 21 amostras não pré-eclâmpticas e 19 pré-eclâmpticas foi selecionado com base no acesso a amostras armazenadas, e realizamos análises fenotípicas adicionais de células Treg. Descobrimos que as frequências de Tregs naturais derivadas do timo (nTreg) CD4+Foxp3+Helios+ no sangue do cordão umbilical também foram significativamente menores na pré-eclâmpsia (p = 0,035, teste t não pareado), especialmente naquelas que não receberam tratamento com esteroides (p = 0,01, ANOVA de uma via com teste de comparações múltiplas de Dunnett) (Fig. 2d). Em conjunto, esses achados mostram que os filhos de mães pré-eclâmpticas apresentam volume e diâmetro tímicos reduzidos, com um déficit associado na produção de Treg tímicas.
Número reduzido de células Treg naive persiste até a primeira infância
Alterações nas células Treg naive em lactentes expostos à pré-eclâmpsia. Estudo BIS: a Gráfico de pontos representativo mostrando a estratégia de gate para Tregs naive selecionadas em células CD4+. b Os gráficos de linha mostrando as proporções longitudinais de células Treg naive (Média ± DP, como porcentagem da população CD4+) em crianças de mães pré-eclâmpticas (Vermelho: ao nascer n = 11; 6 meses n = 19; 1 ano n = 22; 4 anos n = 10) e crianças de mães não hipertensas (Preto: ao nascer n = 434; 6 meses n = 558; 1 ano n = 629; 4 anos n = 377). A diferença geral é –0,49% (IC 95% –0,83, –0,16) (p = 0,004, equação de estimativa generalizada)
Para examinar mais detalhadamente se as alterações no sangue de cordão umbilical na pré-eclâmpsia eram persistentes, examinamos as células Treg naive derivadas do timo CD4+CD45RA+Foxp3+ ao nascimento, aos 6 e 12 meses e aos 4 anos de idade da coorte BIS, um estudo de coorte de nascimento australiano (n = 1064 mães/1074 bebês, as características dos pacientes são mostradas na Tabela Suplementar 4). Houve algumas evidências de que a proporção de células Treg naive no sangue de cordão umbilical era menor em bebês nascidos de mães com pré-eclâmpsia (p = 0,057, regressão linear) (Fig. 3b), e essa associação foi mais forte após ajuste para exposição ao modo de parto e sexo (p = 0,025, regressão linear), fatores que demonstraram influenciar a proporção de células Treg naive no sangue de cordão umbilical. A análise longitudinal revelou um déficit persistente na proporção de células Treg naive nos filhos de mães com pré-eclâmpsia ao longo dos primeiros 4 anos de vida pós-natal (p = 0,004, equação de estimação generalizada) (Fig. 3b).
Córtex tímico reduzido e números de células T na autópsia na pré-eclâmpsia
Histopatologia do timo fetal. Fotomicrografias de timos fetais coradas para comparar as populações de células T CD4+ e Foxp3+ entre o grupo controle e aquelas mães com pré-eclâmpsia no momento do óbito fetal. a Timos fetais de controle (painel superior) e mães com pré-eclâmpsia (painel inferior), com 24 semanas de gestação. b Um feto controle de 33 semanas (painel superior), versus um feto de 37 semanas falecido de uma mãe que teve pré-eclâmpsia (painel inferior). Barras de escala para colorações H&E e colorações CD4 = 100 µm. Barras de escala para colorações Foxp3 = 20 µm
Timos de casos com pré-eclâmpsia da coorte de autópsia fetal (as características dos pacientes são mostradas na Tabela Suplementar 5a), apresentaram características de involução tímica grau 2–3 com perda da distinção normal entre córtex e medula observada em baixa ampliação devido à linfofagocitose avançada, resultando em um estreitamento irregular do córtex, focos de linfodepleção e aumento da separação dos lóbulos tímicos (Fig. 4). Estas são características comumente observadas em associação com hipóxia intrauterina crônica que é vista na pré-eclâmpsia. Além disso, para o grupo de pré-eclâmpsia, nenhuma coloração de Foxp3 foi observada nesses tecidos. Por outro lado, tanto no timo quanto no baço, 4 em cada 6 fetos do grupo não pré-eclâmpsia demonstraram coloração Foxp3+ em <15% das células. Nos timos de fetos nascidos de mães sem pré-eclâmpsia, a expressão de Foxp3+ foi limitada principalmente à medula.
Em todos os fetos de casos sem pré-eclâmpsia, as células T CD4+ tímicas foram predominantes no córtex, versus a medula. No entanto, em 4 em cada 5 fetos de casos com pré-eclâmpsia, as células T CD4+ foram igualmente prevalentes no córtex e na medula do timo. Dentro do baço, a expressão de células T CD4+ foi reduzida em fetos de mães com pré-eclâmpsia versus mães sem pré-eclâmpsia (Tabela Suplementar 5b). Em conjunto, os achados acima demonstram consistentemente que a pré-eclâmpsia está associada à involução tímica e à redução da expansão de Treg na prole.
Acetato sérico na gravidez saudável e na pré-eclâmpsia
Acetato sérico na gravidez saudável e na pré-eclâmpsia. Estudo BIS:
a Gráfico de barras mostrando os níveis séricos maternos (Média ± EPM, µM) de acetato, butirato e propionato às 28 semanas de gestação (n = 324) (ANOVA unidirecional de medidas repetidas com teste de comparações múltiplas de Tukey, com correção de Greenhouse-Geisser). Gráficos de caixa e bigodes (Tukey) mostrando evidências de associações entre níveis mais baixos de (b) acetato, (c) butirato e (d) propionato (µM, transformados em log base 10) de mulheres com pré-eclâmpsia subsequente (PE, n = 31) e mulheres sem pré-eclâmpsia (não PE, n = 293). Valores de p calculados usando regressão logarítmica ponderada. Coorte Nepean 4 (e): Gráfico de dispersão de pontos mostrando os níveis relativos de acetato sérico em sangue periférico materno e sangue do cordão umbilical pareados a termo (n = 46) (amostras coletadas no parto a termo). Os níveis de acetato foram baseados nas alturas dos picos dos espectros de RMN normalizadas pela intensidade total. u.a. = unidades arbitrárias (valores são divididos por 1000). Pearson r = 0,367, p = 0,012; Spearman rho = 0,416, p = 0,004
Diante das evidências da associação entre microbiota intestinal e pré-eclâmpsia, examinamos então os metabólitos da microbiota intestinal — AGCCs — no soro materno com 28 semanas de gestação e sua relação com pré-eclâmpsia subsequente na coorte BIS. Consistente com achados anteriores, os níveis séricos de acetato foram pelo menos dez vezes maiores em comparação com butirato e propionato (Fig. 5a). Na análise de regressão logarítmica ponderada, também houve evidências de associações entre níveis séricos mais baixos de AGCCs e pré-eclâmpsia subsequente (Fig. 5b–d). O risco relativo de desenvolver pré-eclâmpsia diminuiu a cada aumento de 30% no acetato sérico (RR 0.77, 95% CI 0.61–0.96, p = 0.021, regressão logarítmica ponderada). Essa evidência persistiu após ajuste para idade materna (p = 0.031, regressão logarítmica ponderada). Em um subconjunto menor no qual o IMC pré-gestacional havia sido registrado (24 com pré-eclâmpsia, 253 sem), a evidência de uma associação entre acetato sérico e pré-eclâmpsia foi fraca (p = 0.178, regressão logarítmica) mas mudou minimamente com o ajuste para IMC pré-gestacional (p = 0.143, regressão logarítmica). O IMC pré-gestacional foi associado à pré-eclâmpsia (p = 0.003, regressão logarítmica) mas não houve evidência de que essa associação fosse mediada pelo acetato sérico (proporção do efeito total mediada –3%, 95% CI –55 a 20%). A evidência de uma associação univariada entre acetato sérico e pré-eclâmpsia também foi atenuada pela exclusão de uma mãe mais velha com baixo acetato sérico e pré-eclâmpsia pós-natal (RR 0.46, 95% CI 0.20–1.06, p = 0.067, regressão logarítmica). Em resumo, uma associação inversa entre níveis mais baixos de acetato sérico e pré-eclâmpsia subsequente foi observada na coorte geral com e sem ajuste para idade materna, mas em um subconjunto menor, onde os valores de IMC pré-gestacional estavam disponíveis, essa associação não atingiu significância. Não houve evidência de que o acetato sérico materno medido com 28 semanas de gestação estivesse positivamente associado a células Treg ingênuas do sangue do cordão umbilical. Na coorte Nepean, 4 pares de soro materno e fetal (as características dos pacientes são mostradas na Tabela Suplementar 6), coletados com intervalo não superior a 4 h, encontramos uma correlação (r = 0.367, p = 0.012, correlação de Pearson) entre os níveis de acetato no sangue do cordão umbilical e no sangue materno (Fig. 5e). Isso sugere que o acetato materno pode atravessar a placenta e, portanto, influenciar os níveis de acetato fetal. Isso é apoiado por nosso trabalho anterior, que mostrou que em camundongos o acetato realmente atravessa a placenta e afeta as concentrações no feto em desenvolvimento.
O acetato materno resgata o timo fetal em camundongos livres de germes
Reduced Foxp3 MFI em células Treg tímicas de filhotes GF recuperados com suplementação de acetato. Filhotes C57BL/6 de três semanas de idade de mães controle SPF e GF e mães GF tratadas com acetato na água de beber (ADW). Dados cumulativos mostrando análise fenotípica por citometria de fluxo no timo de filhotes fêmeas e machos agrupados (n = 7–10/grupo). a Peso do timo. b Celularidade de timócitos por lobo tímico. c Celularidade da medula óssea. d A frequência de células progenitoras multipotentes linfoide-primadas (LMPP) CD62L+ da medula óssea. e O número total de células CD4SP. f O número total de células CD4SP Foxp3+. g Expressão da proteína Foxp3 por célula em células CD4SP Foxp3+ tímicas. As estratégias de gate para células LMPP, células CD4SP e células Foxp3+ são mostradas nas Figs. Suplementares 3 e 4. Os dados são mostrados como intensidade média de fluorescência (MFI). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Todos os dados foram analisados por ANOVA de uma via com teste de comparações múltiplas de Bonferroni. Os dados representam a média; cada símbolo representa um camundongo individual. Os dados são representativos de pelo menos dois experimentos independentes.
Evidências crescentes sugerem que os SCFAs e outros metabólitos bacterianos influenciam o desenvolvimento de células T/células Treg. Portanto, investigamos se a carga bacteriana materna poderia afetar o desenvolvimento tímico fetal, comparando o peso do timo de filhotes (21 dias de idade) nascidos de camundongos isentos de germes (GF) com aqueles nascidos de camundongos livres de patógenos específicos (SPF). O peso tímico (Fig. 6a) e a celularidade de timócitos (Fig. 6b) em camundongos GF foram aproximadamente metade dos camundongos SPF, o que é semelhante às nossas descobertas na pré-eclâmpsia, que descobrimos estar associada a baixos níveis de acetato. Como nossa coorte humana mostrou que os níveis séricos de acetato eram dez vezes maiores em comparação com butirato e propionato, suplementamos então as camundongas GF grávidas com acetato na água de beber e analisamos os filhotes. Curiosamente, a suplementação materna de acetato resgatou tanto o peso tímico quanto a celularidade de timócitos nos filhotes para níveis comparáveis aos camundongos SPF (Fig. 6a, b). Isso sugere que o acetato derivado da microbiota intestinal materna contribui para o desenvolvimento tímico fetal. Os progenitores tímicos são derivados da medula óssea e, além da menor celularidade tímica, os camundongos GF também apresentaram celularidade da medula óssea significativamente reduzida (Fig. 6c); em particular, progenitores multipotentes linfoide-primados (CD62L+ LMPP; Fig. 6d), que fornecem ao timo células progenitoras para o desenvolvimento de células T. A suplementação materna de acetato melhorou tanto a celularidade da medula óssea quanto as proporções de células CD62L+ LMPP nos filhotes (Fig. 6c, d), em paralelo com a normalização da celularidade tímica.
O acetato materno potencializa o desenvolvimento de células T fetais.
Em seguida, comparamos o desenvolvimento de subconjuntos de células T em fetos GF e SPF. A prole de camundongos GF apresentou números reduzidos de células T CD4+ totais (Fig. 6e) e menos Tregs CD4+ Foxp3+ (Fig. 6f). Além disso, uma abundância reduzida da proteína Foxp3 por célula, medida pela intensidade média de fluorescência (MFI), era aparente em camundongos GF (Fig. 6g). Curiosamente, a suplementação materna com acetato restaurou o número total de células T CD4+ nos filhotes para os níveis dos camundongos SPF. Embora os números de Treg não tenham aumentado, a suplementação com acetato resgatou a MFI de Foxp3 nas células Treg (Fig. 6g), com implicações na função das Treg. Em conjunto, esses resultados sugerem que o acetato derivado de bactérias é importante para o desenvolvimento de células T CD4+ fetais e de células Treg, e que a suplementação dietética com acetato pode corrigir defeitos resultantes da ausência de microbiota.
O acetato materno recupera a expressão de AIRE no timo da prole
Expressão reduzida de AIRE no timo de filhotes GF recuperada com suplementação de acetato. Filhotes C57BL/6 com três semanas de idade de mães SPF e GF controle, e de mães GF tratadas com acetato na água de beber (ADW). a–c Análise representativa de citometria de fluxo demonstrando expressão de AIRE em subconjuntos de células epiteliais tímicas. d, e Citometria de fluxo e análise numérica da expressão de AIRE em subconjuntos cTEC e mTEC de filhotes machos e fêmeas agrupados (n = 5–10/grupo). O asterisco denota significância em relação ao SPF, *p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001; ^ denota significância em relação ao controle GF, ^^^p < 0,001, ^^^^p < 0,0001. Todos os dados foram analisados por ANOVA de uma via com teste de comparações múltiplas de Bonferroni. Os dados representam a média; cada símbolo representa um camundongo individual. Os dados são representativos de pelo menos dois experimentos independentes.
A AIRE contribui para a geração de células Treg no início da vida e os níveis de Foxp3 são importantes para a função das Treg, portanto investigamos alterações na expressão de AIRE em células epiteliais do timo. A AIRE é expressa principalmente em células epiteliais do timo. Nossa estratégia de seleção para citometria de fluxo foi baseada na expressão da lectina aglutinina I de Euonymus europaeus (UEA1), que discrimina células epiteliais tímicas corticais (cTEC; UEA1-) de células epiteliais medulares (mTEC; UEA1+), enquanto ambos os subconjuntos expressam o complexo principal de histocompatibilidade II (MHC II) (Fig. 7a e Fig. Suplementar 5a). A maioria das células AIRE+ é encontrada na região da medula positiva para queratina 14 (Fig. Suplementar 5b). No entanto, também encontramos uma minoria de células AIRE+ com fenótipo cortical (β5t+, queratina 14−) situadas na junção cortico-medular (setas brancas, Fig. Suplementar 5b). Encontramos uma redução significativa no número e na proporção de células que expressam AIRE no subconjunto cTEC em camundongos GF, enquanto as células AIRE-positivas entre as mTEC permaneceram inalteradas (Fig. 7d, e), sugerindo um papel diferencial dos metabólitos bacterianos intestinais na expressão de AIRE nesses subconjuntos. A proporção de cTEC que expressam AIRE foi normalizada na prole de camundongos suplementados com acetato durante a gestação (Fig. 7b, c). Portanto, o impacto do acetato na população de cTEC AIRE+ pode contribuir para o efeito do acetato na expressão de Foxp3 nas Tregs.
Discussão
Estes estudos fornecem uma ligação plausível entre o metabólito bacteriano intestinal materno acetato, o timo e o desenvolvimento de células Treg no contexto da pré-eclâmpsia, que é um distúrbio gestacional associado a importantes desfechos adversos tanto para a mãe quanto para sua prole. Demonstramos definitivamente uma associação entre pré-eclâmpsia e hipoplasia tímica fetal. O diâmetro do timo fetal no meio da gestação pode ter utilidade clínica como ferramenta preditiva para pré-eclâmpsia. Isso é ilustrado pela análise da curva ROC, que retornou uma AUC de 0,81 para um modelo composto pelo diâmetro do timo fetal no meio da gestação, perímetro cefálico fetal no meio da gestação, idade gestacional e IMC materno. Um preditor tão precoce e não invasivo de pré-eclâmpsia poderia ter valor clínico significativo; no entanto, a utilidade deste índice exigiria avaliação adicional.
Além disso, mostramos o impacto do desenvolvimento tímico fetal prejudicado com redução na produção de células Treg na prole de mães com pré-eclâmpsia, que era evidente ao nascimento e persistiu na primeira infância. Em seguida, mostramos uma redução na frequência de células Treg em díades mãe-bebê com pré-eclâmpsia em comparação com gestações saudáveis, consistente com um déficit em um fator regulador imune capaz de atravessar a placenta. Uma análise mais aprofundada das células Treg do sangue do cordão umbilical revelou que a deficiência reside principalmente nas células Treg de repouso e derivadas do timo, implicando uma produção reduzida de células Treg tímicas, o que também é consistente com a ausência de células Foxp3+ em cortes tímicos de fetos falecidos de mães com pré-eclâmpsia. Não encontramos evidências de que gestações com pré-eclâmpsia estivessem associadas a alterações nas porcentagens de células T tímicas fetais (células T CD3) ou subconjuntos convencionais de células T CD4/CD8 (Figura Suplementar 6). Não temos dados sobre os números absolutos (totais) de células Treg tímicas ou subconjuntos de células T CD4/CD8. Para calcular o número total desses subconjuntos, seria necessária a disponibilidade de hemogramas completos, que não foram coletados sistematicamente para nenhuma das coortes. No entanto, há dados convincentes sugerindo que alterações nas porcentagens de células Treg dentro das células CD4+ desempenham um papel central em muitas patologias mediadas pelo sistema imune. Em linha com isso, nosso próprio grupo mostrou que porcentagens reduzidas de Treg maternas são uma característica da imunidade alterada na pré-eclâmpsia. Portanto, as diferenças nas porcentagens de células Treg da prole descritas neste estudo entre os grupos com e sem pré-eclâmpsia parecem altamente relevantes. Importante, mostramos que as alterações tímicas fetais precedem a pré-eclâmpsia clínica, sugerindo que esses déficits no desenvolvimento imune fetal podem ser um componente da patologia primária que impulsiona a pré-eclâmpsia, em vez de uma consequência do estresse fisiológico associado à doença clinicamente manifesta.
Muitos fatores podem afetar o desenvolvimento imune fetal. Anteriormente, mostramos que a IL-10 provavelmente está envolvida no alinhamento feto-materno das células Treg. No entanto, embora os níveis de IL-10 estejam reduzidos na pré-eclâmpsia, há pouca evidência que apoie seu papel no desenvolvimento tímico fetal. Por outro lado, evidências crescentes implicam o papel da produção microbiana de AGCCs na modelagem do sistema imune inato e adaptativo. Curiosamente, alterações na microbiota oral e placentária foram observadas na pré-eclâmpsia, e uma dieta rica em fibras parece ser protetora contra o desenvolvimento de pré-eclâmpsia, consistente com um papel da interação dieta-microbiota na prevenção da pré-eclâmpsia. Além disso, o fato de o acetato também ter um efeito direto na pressão arterial sistêmica implica, além de seus efeitos moduladores imunes, um papel especial desse AGCC na pré-eclâmpsia, cuja característica definidora é a hipertensão.
Nesse contexto, buscamos testar se os metabólitos da microbiota intestinal materna poderiam influenciar o desenvolvimento imunológico tímico fetal. Em um modelo de camundongo, encontramos um papel fundamental da microbiota materna no desenvolvimento de órgãos linfoides e células imunes. Mostramos que o acetato materno pode afetar o desenvolvimento tanto do timo quanto da medula óssea na prole, bem como o desenvolvimento de células T CD4+ e a expressão de AIRE e Foxp3, componentes-chave para a função das células Treg.
A ausência de uma microbiota intestinal materna levou a prole com precursores LMPP derivados da medula óssea reduzidos, que podem sustentar a redução substancial no tamanho tímico e na produção tímica. Isso pôde ser revertido suplementando a água de beber materna com acetato, que é o SCFA mais abundante no soro humano.
Níveis reduzidos de Foxp3 em células Treg também foram encontrados coincidindo com uma redução na expressão de AIRE em células epiteliais tímicas especializadas na ausência de microbiota intestinal materna. Ambos foram recuperados com suplementação materna de acetato.
A geração de células Treg é influenciada pelos níveis de expressão de AIRE nas células epiteliais tímicas medulares e seu estado funcional é refletido pelos níveis de Foxp3. Embora a maioria da expressão de AIRE seja encontrada profundamente na medula tímica, identificamos uma pequena proporção de células epiteliais tímicas corticais maduras que expressam AIRE localizadas na junção córtico-medular que foi influenciada pela microbiota intestinal materna.
Nossas descobertas de que uma redução nessa população especializada de células epiteliais AIRE+ está associada aos níveis de expressão de Foxp3 em células Treg sugere um papel na funcionalidade das Treg. Enquanto as células epiteliais medulares que expressam AIRE expressam autoantígenos especializados restritos a tecidos, essas células epiteliais corticais podem apresentar autoantígenos abundantes e onipresentes no início do desenvolvimento das Treg.
Assim, a recuperação da expressão de AIRE em células epiteliais corticais e o aumento dos níveis de expressão de Foxp3 com suplementação materna de acetato sugerem que o acetato derivado da mãe pode influenciar o desenvolvimento funcional das células Treg na prole. No entanto, os mecanismos exatos pelos quais o acetato melhora a expressão de AIRE e Foxp3 e como eles podem estar relacionados requerem investigações adicionais.
Coletivamente, esses dados sugerem que o acetato derivado da mãe desempenha papéis importantes na modelagem do desenvolvimento e produção tímica fetal. Isso também é consistente com a correlação materno-fetal para os níveis séricos de acetato que encontramos na gravidez humana, sugerindo que o acetato materno provavelmente atravessa a placenta e influencia a imunidade fetal, como visto anteriormente em um modelo de asma em camundongos.
Em apoio à nossa hipótese, encontramos evidências de uma associação entre baixos níveis séricos de acetato e subsequente pré-eclâmpsia em uma coorte de gestantes. Os níveis de acetato flutuam dependendo da ingestão alimentar recente e da composição microbiana. Portanto, uma única medição dos níveis séricos de acetato pode fornecer apenas um instantâneo e não a exposição cumulativa ao acetato ao longo da duração da gravidez. Estudos longitudinais adicionais, com um número maior de mulheres com pré-eclâmpsia, são necessários para avaliar a produção de acetato no contexto da composição da microbiota e da dieta durante a pré-eclâmpsia e a gravidez saudável.
De forma importante, descobrimos que as consequências imunológicas fetais da pré-eclâmpsia são persistentes, com redução da frequência de Treg observada além da infância e durante o início da infância. Isso sugere que a pré-eclâmpsia tem implicações de longo prazo para a função imunológica na prole. Embora os mecanismos precisos subjacentes ao desenvolvimento tímiico fetal prejudicado na pré-eclâmpsia permaneçam incertos, sugerimos uma influência chave da microbiota materna nesse processo, possivelmente através de um efeito direto dos SCFAs na medula óssea e no timo fetal.
Em conclusão, esta pesquisa amplia nossa compreensão da interação materno-fetal humana na pré-eclâmpsia e adiciona uma dimensão alternativa à nossa concepção das origens desenvolvimentais da saúde e da doença. Além da morbidade materna, o desenvolvimento tímiico fetal e a produção de Treg são adversamente afetados em gestações com pré-eclâmpsia. Essas alterações imunológicas associadas persistem durante o início da infância, o que pode explicar a associação entre pré-eclâmpsia e alergia posterior na prole, embora sejam necessárias mais investigações em estudos de coorte longitudinais. Além disso, se a hipoplasia tímica fetal é mediada por disbiose e consequentes alterações nos metabólitos bacterianos em humanos precisa ser mais investigada. As respostas a essas questões podem ajudar a estabelecer futuras estratégias de prevenção primária para pré-eclâmpsia e desfechos imunológicos fetais adversos.
Métodos
Nepean coorte 1: Estudo prospectivo, caso-controle, comparativo: mulheres pré-eclâmpticas (n = 50) e gestantes saudáveis (n = 50) foram recrutadas. Consentimento por escrito foi obtido de todas as participantes antes da entrada. Pacientes pré-eclâmpticas foram identificadas por monitoramento diário da enfermaria pré-natal, sala de parto e consultas ambulatoriais. As participantes do grupo pré-eclâmpsia realizaram um exame de ultrassom no Nepean Hospital (NSW, Austrália) dentro de 48 h do diagnóstico. As participantes do controle foram mulheres que compareceram ao Nepean Hospital para um exame de ultrassom gestacional de rotina. As participantes foram recrutadas consecutivamente, sujeitas à elegibilidade. As participantes eram elegíveis se tivessem uma gestação única de idade gestacional ≥ 20 semanas, um ultrassom morfológico normal entre 18–20 semanas e tivessem entre 18–40 anos sem condições médicas pré-existentes. As participantes foram excluídas com base em hipertensão crônica, uso de drogas ilícitas ou consumo de álcool, ou complicações obstétricas durante a gestação (excluindo pré-eclâmpsia no grupo pré-eclâmpsia), ou histórico de deficiência intelectual ou mental. O Comitê de Ética do Sydney West Area Health Service, Austrália, aprovou este projeto (Study12/23—HREC/12/NEPEAN/45).
Nepean coorte 2: Prospectivo, (n = 887), deste grupo 24 desenvolveram pré-eclâmpsia. Gestantes carregando um único feto foram recrutadas entre 15 de janeiro de 2011 e 15 de julho de 2013, no momento do seu ultrassom de meio de gestação (17–22 semanas). Em todos os casos, uma folha de informações ao participante foi fornecida, e o consentimento por escrito foi obtido pelos ultrassonografistas na Unidade de Ultrassom Perinatal do Nepean Hospital. Durante o período de coleta de dados, 1155 gestantes consentiram em participar. Medições do diâmetro do timo fetal foram realizadas por um dos autores (D.P.E.) a partir de 1139 ultrassons de meio de gestação, com uma imagem do trato de saída do ventrículo direito (TSVD) indisponível em 16 exames. Uma vez que todas as medições foram realizadas e permitindo tempo suficiente para a última mulher participante dar à luz, o banco de dados ObstetriX foi pesquisado por diagnósticos de pré-eclâmpsia, além de outras variáveis maternas e infantis. O ObstetriX é atualizado durante e após a gestação, por médicos e parteiras, e contribui para a coleta de dados em todo o estado. No total, 950 gestações consentidas tiveram o parto no Nepean Hospital. Cinquenta gestações foram excluídas, com base em outro diagnóstico hipertensivo (hipertensão gestacional = 34, hipertensão essencial = 16). Outras 13 gestações foram excluídas porque seu ultrassom foi realizado fora do intervalo de 17–22 semanas. As mulheres participantes não estavam representadas em mais de uma gestação. O Comitê de Ética do Sydney West Area Health Service, Austrália, aprovou este projeto (Study 10/14—HREC/10/NEPEAN/33).
Coorte Nepean 3: Amostras de sangue periférico foram obtidas de pacientes grávidas saudáveis (n = 66) ou com pré-eclâmpsia (n = 30). Consentimento formal foi obtido de todas as pacientes. A pré-eclâmpsia foi definida de acordo com os critérios da Sociedade Internacional para o Estudo da Hipertensão na Gravidez (ISSHP) como início de pressão arterial elevada (>140/90) e proteinúria (>0,3 g/24 h) após 20 semanas de gestação. Nenhuma das pacientes apresentava síndrome HELLP ou eclâmpsia. Os critérios de exclusão incluíram diabetes gestacional, condições infecciosas, gestações múltiplas e anomalias cromossômicas. O Comitê de Ética do Sydney West Area Health Service, Austrália, aprovou este projeto (HREC 05/041).
Coorte Nepean 4: Amostras de soro de sangue materno e fetal pareado, coletadas com intervalo máximo de 4 h, foram extraídas das amostras de sangue e armazenadas a -80° até análises posteriores. Consentimento formal foi obtido de todas as pacientes. Os critérios de seleção foram os mesmos da Coorte Nepean 3. O Comitê de Ética do Sydney West Area Health Service, Austrália, aprovou este projeto (HREC 05/041).
Coorte BIS: Os objetivos e a metodologia do Estudo de Lactentes de Barwon (BIS) foram descritos anteriormente. Em resumo, o Estudo de Lactentes de Barwon (BIS) é um estudo de coorte de nascimento australiano (n = 1064 mães/1074 lactentes) recrutado antes de 32 semanas de gestação. Os critérios de exclusão incluíram nascimento antes de 32 semanas de gestação, malformação congênita maior e/ou doença geneticamente determinada. A pré-eclâmpsia foi definida conforme acima. Os participantes com pré-eclâmpsia (n = 31) foram comparados a uma subcoorte selecionada aleatoriamente de 293 participantes sem pré-eclâmpsia. Todos os participantes forneceram consentimento informado. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana da Barwon Health (HREC 10/24).
Coorte de autópsia fetal: Duas coortes de pacientes foram recrutadas: uma do Westmead Children's Hospital (Sydney, Austrália), e a outra do Canberra Hospital (Canberra, Austrália). As amostras de tecido foram arquivadas após a biópsia, e todas as famílias dos falecidos consentiram com a retenção dos tecidos como parte da avaliação da autópsia. Como as amostras de tecido pertenciam à Categoria S3 sob as Diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa Humana, que são consideradas de baixo risco, o comitê de ética aprovou o uso das amostras de tecido e informou que nenhum consentimento adicional era necessário (ACT Health, Comitê de Ética em Pesquisa Humana, ethlr.12.182). No geral, cinco fetos nascidos de gestantes pré-eclâmpticas no segundo ou terceiro trimestre de gestação e seis controles pareados por idade foram estudados. As pacientes controle não apresentavam evidência clínica ou bioquímica de pré-eclâmpsia. Mães com outras complicações relacionadas à gravidez, como diabetes gestacional ou problemas autoimunes subjacentes, foram excluídas do estudo. Fetos com anomalias congênitas conhecidas por afetar o desenvolvimento tímico (por exemplo, deleção 22q11) ou conhecidas por estar associadas a qualquer efeito nas populações de células T foram excluídos. Todos os casos selecionados histologicamente mostraram apenas autólise mínima dos tecidos e tiveram suas necropsias realizadas próximo ao momento do parto. Casos sequenciais foram selecionados que atendiam aos critérios de inclusão. Os dados demográficos de ambas as coortes, incluindo idade gestacional, idade da mãe, paridade da mãe, causa da morte fetal, duração da pré-eclâmpsia, maior PA registrada, manejo medicamentoso da pressão arterial, peso do feto, peso do timo e baço e peso e achados placentários estão resumidos na Tabela Suplementar 5a. Nenhuma informação estava disponível em relação à dieta materna ou aos níveis séricos de acetato materno ou fetal.
Medição do volume do timo fetal
O volume do timo fetal para a coorte 1 de Nepean foi obtido por ultrassonografia tridimensional (US-3D) usando um ângulo de varredura de 45 graus quando uma imagem de ultrassonografia bidimensional (US-2D) mostrava bordas tímicas claras. Uma vez adquiridos os dados de imagem da US-3D, a informação foi armazenada digitalmente e posteriormente analisada por análise virtual auxiliada por computador de órgãos (VOCAL) no software Viewpoint, versão 5.6.12.601 (ViewPoint Bildverarbeitung GmbH, uma subsidiária da GE Healthcare). Os planos transversal, coronal e sagital foram exibidos pelo VOCAL. O plano transversal foi identificado e girado em incrementos de 30 graus por 180 graus, e as bordas foram desenhadas manualmente durante toda a rotação. Dessa forma, o VOCAL identificou as bordas tímicas nos planos coronal e sagital e calculou automaticamente o volume (Fig. 1a). Quando imagens de alta qualidade do timo não puderam ser obtidas, exames repetidos foram realizados. Cada parâmetro foi medido três vezes, com a média de cada parâmetro usada na análise dos dados.
A confiabilidade intraobservador foi realizada pelo mesmo examinador (S.J.) em uma data posterior, a partir de 30 imagens selecionadas aleatoriamente. Para avaliar a confiabilidade interavaliadores, 30 medidas de timo fetal foram selecionadas aleatoriamente e repetidas por um examinador independente (A.E.Q.).
Medição do diâmetro do timo fetal
O diâmetro do timo fetal para a coorte Nepean 2 foi medido usando US-2D (Voluson 730 e E8; GE Healthcare, Zipf, Áustria), com uma visão transversal do timo fetal obtida e armazenada usando o software ViewPoint, versão 5.6.12.601 (ViewPoint Bildverarbeitung GmbH, uma subsidiária da GE Healthcare). O timo fetal foi visualizado no mediastino anterior, dentro de uma imagem salva da via de saída do ventrículo direito (VSVD). O diâmetro do timo fetal foi medido como sua maior largura perpendicular a uma linha conectando o esterno e a coluna vertebral (Fig. 1c).
Para testar a confiabilidade intraobservador das medidas do diâmetro do timo fetal, 40 medidas repetidas foram realizadas por D.P.E. várias semanas após as medidas primárias. A confiabilidade interavaliadores foi avaliada comparando 40 medidas primárias com aquelas feitas por um segundo avaliador (A.E.Q.). As gestações foram selecionadas aleatoriamente em ambas as ocasiões. Um bom grau de correlação foi observado para medidas repetidas do diâmetro do timo tanto nas análises de confiabilidade intraobservador (r de Pearson = 0,87, p < 0,001) quanto na confiabilidade interavaliadores (r de Pearson = 0,72, p < 0,001). Além disso, a confiabilidade intraobservador e interavaliadores mostrou boa correlação tanto no diâmetro quanto no volume do timo, com coeficientes de concordância de Lin de 0,96 e 0,99, respectivamente.
Isolamento de células mononucleares
Células mononucleares das Coortes Nepean foram isoladas usando centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia, Piscataway NJ). Todas as amostras foram congeladas a −196 °C para posterior análise citométrica de fluxo. Amostras de soro humano foram obtidas após centrifugação a 1000 × g por 10 min, aliquotadas e armazenadas a −80 °C.
Coorte BIS: O sangue do cordão umbilical foi coletado por seringa e imediatamente diluído em 10 UI/mL de heparina sódica livre de conservantes (Pfizer) em 10 mL de RPMI 1640 (Gibco, Life Technologies). O sangue venoso periférico (SP) foi coletado aos 6 meses, 1 ano e 4 anos de idade e adicionado a um tubo de 15 mL contendo 10 UI/mL de heparina sódica livre de conservantes (Pfizer). Todo o sangue foi processado dentro de 18 h após a coleta. As células mononucleares foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade (Lymphoprep, Axis-Shield), e a citometria de fluxo foi realizada em bebês de mães com pré-eclâmpsia (sangue de cordão umbilical, n = 11; SP de 6 meses, n = 19; SP de 1 ano, n = 22; SP de 4 anos, n = 10) e bebês de mães não hipertensas (sangue de cordão umbilical, n = 434; SP de 6 meses, n = 558; SP de 1 ano, n = 629; SP de 4 anos, n = 377).
Citometria de fluxo
Coorte Nepean 3: As células mononucleares foram primeiramente coradas com anticorpos de superfície; após fixação e permeabilização com o Foxp3 Fix/Perm Buffer Set, a coloração intracelular para Foxp3 foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. A coleta de dados foi realizada em um FACSVerse (BD) e os arquivos de dados analisados usando o software FlowJo V9 (Treestar, San Carlos, CA).
Coorte BIS: Para medir subconjuntos de Treg, as células foram coradas com anticorpos para anticorpos de superfície e fixadas em formalina. Após fixação overnight, as células foram permeabilizadas (Tween 0,5%) e coradas com anti-Foxp3. As amostras foram analisadas pelo FACSCalibur (3 canais, BD) ou FACSCanto II (8 canais, BD) e analisadas em software complementar. Os anticorpos usados para coloração por citometria de fluxo das amostras da Coorte Nepean 3 incluem: V500 anti-CD4 (BD, 562970, 1:40), APC-H7 anti-CD3 (BD, 560176, diluição 1:40), AF488 anti-Foxp3 (BioLegend, 320212, 1:50) e V450-anti-Helios (Biolegend, 137220, 1,5:100). Os anticorpos usados para a Coorte BIS incluem: AF488-anti Foxp3 (BD, 560047, 1:20), PE-anti-CD4 (BD, 550630, 1:20) e PE-Cy5.5-anti-CD45RA (BD, 555490, 1:20). Para ambas as coortes, controles de isotipo foram usados para configurar o instrumento para o gating positivo e, uma vez estabelecidas, essas configurações foram mantidas durante todo o processo.
Medição de acetato sérico
Amostras de soro materno coletadas com 28 semanas de gestação foram transportadas a −80 °C para os laboratórios da CSIRO (Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization), Adelaide, Austrália, onde o acetato sérico foi quantificado por cromatografia gasosa capilar (CG; série 5890 II Hewlett Packard, Austrália). Os pesquisadores estavam cegos quanto ao grupo experimental.
Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)
Amostras armazenadas a −80 °C foram descongeladas e 110 µL de soro transferidos para um tubo Eppendorf fresco de 1,5 mL, e 450 µL de DPBS 1x (Gibco Life Technologies), 50 µL de D2O (Cambridge Isotope Laboratories, Inc, MA, EUA) e 10 µL de 2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfonato de sódio (DSS) (Cambridge Isotope Laboratories, Inc, MA, EUA) (3,7 mg em 700 µL de água MilliQ) foram adicionados. As amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 10 min a 4 °C, e 550 µL transferidos para um tubo de RMN. Espectros de RMN unidimensionais (128 varreduras) foram registrados a 298 K usando uma sequência CPMG padrão em um espectrômetro Bruker Avance III 600 MHz equipado com uma criossonda usando coleta automatizada de dados via software IconNMR (Bruker). Espectros bidimensionais foram registrados em amostras selecionadas, incluindo COSY, TOCSY e 1H-13C-HSQC. As amostras foram processadas aleatoriamente. As atribuições dos metabólitos foram baseadas no Human Metabolome Database e nos deslocamentos químicos derivados de amostras padrão. Para a análise estatística, os espectros foram normalizados para a intensidade total.
O baço e o timo dos fetos foram fixados em formalina e processados em blocos de parafina usando métodos laboratoriais de rotina. A imunocoloração IHC sequencial foi realizada para avaliar a presença, localização e intensidade da expressão de CD4 e Foxp3 dos linfócitos usando o sistema totalmente automatizado Leica Bond (Vision Biosystems, Mt. Waverley, Austrália), seguindo um protocolo padrão. Os casos foram desidentificados no momento do corte.
Resumidamente, cortes de tecido foram feitos (4 µm de espessura) e secos em estufa a 60 °C por 1 h. Foxp3 (ab20034; Abcam, Cambridge, Reino Unido), diluição 1:200 foi incubado por 15 min após 20 min de recuperação antigênica por calor usando Bond Epitope Retrieval Solution (BERS) 2 da Leica Microsystems (Sydney, Austrália), pH 8,9 a 9,1. O kit de detecção utilizado foi o Leica Bond Polymer Refine Detection Kit (um sistema conjugado de anticorpo polimérico HRP-linker, Sydney, Austrália). O mesmo protocolo foi usado para CD4 (NCL-L CD4–368, Novocastra diluição 1/50). Os cortes foram contracorados com hematoxilina para permitir a visualização dos núcleos, montados com lamínula e visualizados.
O número de células CD4+ e Foxp3+ foi contado em dez campos de alta potência (aumento original, x40) e pontuado como 0 = 0% de células, 1 = <10%, 2 = 10–75%, 3 = >75%. A intensidade da coloração foi registrada como fraca (1), moderada (2) ou forte (3). Isso foi realizado em duas ocasiões separadas e a pontuação média utilizada. O controle positivo externo para os anticorpos foi uma amígdala adulta. O controle interno negativo foram células endoteliais e também a omissão do anticorpo primário. A localização das células T foi registrada como medula apenas, principalmente córtex, principalmente medula e córtex apenas. O patologista (J.D.) estava cego para a coorte de pacientes no momento da avaliação da imunorreatividade dos cortes. Todos os casos foram fotografados e enviados a um segundo pesquisador para revisão.
Experimentos com camundongos
Camundongos C57BL/6 Livres de Germes (GF) foram derivados da Unidade de Livres de Germes (Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research). Camundongos GF prenhes a partir de E18 foram alimentadas ad libitum com acetato de sódio (200 mM, exceto quando indicado) fornecido na água de beber. Em seguida, filhotes de 3 semanas de idade (total, n = 10) foram estudados para análise tímica. As análises tímicas de camundongos foram realizadas a partir de duas ou três coortes separadas de filhotes para obter reprodutibilidade. Todos os procedimentos experimentais envolvendo camundongos estavam em conformidade com todos os regulamentos éticos relevantes para testes e pesquisa em animais, e realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética Animal relevante da Monash University, Melbourne, Austrália.
Os timos de camundongos foram isolados e processados para análise de células T ou análise de células epiteliais tímicas. As células T CD4+ foram coradas usando anti-CD4 de camundongo (Clone: RM4–5, Pacific Blue, BD Biosciences, 558107, diluição 1:400), anti-CD25 de camundongo (Clone: PC61, PE Cy7, 552880, BD Biosciences, diluição 1:400) e anti-Foxp3 de camundongo (Clone: FJK-16s, FITC, eBioscience, 11–5773–82, diluição 1:200). Os seguintes anticorpos para análise de células epiteliais tímicas por citometria de fluxo ou estudos de imunofluorescência foram utilizados: CD45 (30-F11, 1:400, BD Biosciences 557659), CD326/EpCAM (G8.8, 1:3000, eBioscience 25–5791–80), lectina UEA-1 (1:4000, Vector Labs B-1065), MHC Classe II (1:5000, Biolegend 107620), Ly51 (1:2000, BD Biosciences 553735), e AIRE (5G12, 1:100, eBioscience 3–5934–82), β5t (1:400, MBL PD021) e Queratina 14 (1:400, Biolegend 906004). Para coloração intracelular, as células foram fixadas usando o Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit (eBiosciences) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de camundongos coradas foram analisadas usando citômetros de fluxo BD LSRII com software FACSDiva (BD Biosciences) e software FlowJo versão 9.3.2 (Tomy Digital Biology).
Estatística
Para comparações entre dois ou mais grupos, foram realizados teste t não pareado ou ANOVA de uma via com diferentes tipos de correções para dados paramétricos; enquanto o teste de Mann–Whitney ou teste de Kruskal–Wallis com correção de Dunn foram utilizados para dados não paramétricos. Testes de qui-quadrado foram utilizados para comparar grupos em variáveis categóricas. Para testar correlações, foi realizado o coeficiente de correlação de Pearson. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism7 para Windows (GraphPad Prism, San Diego, CA), SAS v9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA) ou Stata 15.1 (StataCorp, College Station, TX, EUA). Para todas as análises, um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Além das análises estatísticas mencionadas acima, análises especiais para cada coorte estão listadas em detalhes a seguir:
Para a coorte Nepean 1, um cálculo de poder inicial revelou uma amostra de 100 indivíduos (50 casos com pré-eclâmpsia e 50 controles) para fornecer mais de 80% de poder para detectar um tamanho de efeito de 0,6 no volume do timo ao nível de significância de 5%. Um efeito dessa magnitude representou uma interpretação conservadora dos resultados de nosso estudo anterior, que encontrou uma diferença no diâmetro do timo correspondente a um tamanho de efeito de 0,8 e obteve resultados semelhantes usando um volume aproximado do timo baseado nas medidas de diâmetro. A confiabilidade intraobservador e entre avaliadores foi avaliada usando um gráfico de Bland-Altman e um teste t pareado para cada avaliação. Além disso, o coeficiente de concordância de correlação de Lin foi calculado para demonstrar a reprodutibilidade.
Para a coorte 2 de Nepean, um cálculo de poder previu que um estudo de n = 800 teria pelo menos 80% de poder no nível de significância estatística bilateral de 5% para identificar, usando modelagem de regressão logística, uma razão de chances de 0,8 para pré-eclâmpsia para cada aumento de 1 mm no diâmetro do timo, dado um desvio padrão nas medidas do timo de 2,7 mm, e assumindo que a prevalência subjacente de pré-eclâmpsia é de 2,8%. O cálculo amostral foi realizado usando o método Shieh-Brien implementado no SAS v9.2 e confirmado por simulação. A prevalência estimada de pré-eclâmpsia no Hospital Nepean foi baseada em nosso estudo retrospectivo anterior. As estimativas do desvio padrão nas medidas do diâmetro do timo e da razão de chances plausível também são informadas pelos resultados de nosso estudo retrospectivo anterior. O efeito do diâmetro do timo fetal nas chances de pré-eclâmpsia foi avaliado em análises de regressão logística univariada e multivariada (Modelo 1 e Modelo 2). O Modelo 1 examinou a relação entre o diâmetro do timo fetal e a pré-eclâmpsia, ajustado para idade gestacional e índice de massa corporal (IMC) materno. O Modelo 2 multivariado foi semelhante, exceto que o ajuste foi feito para o perímetro cefálico fetal e o IMC materno. A associação entre o diâmetro do timo e a idade gestacional foi modelada usando métodos de regressão linear múltipla com o status de pré-eclâmpsia incluído como fator explicativo.
Para a coorte BIS: Ao examinar a relação entre o acetato sérico materno e a subsequente pré-eclâmpsia, potenciais variáveis de confusão foram determinadas a partir de um modelo causal representado por um grafo acíclico dirigido (Figura Suplementar 7). Implicações testáveis foram verificadas em R usando código gerado pelo Dagitty. As razões de risco para pré-eclâmpsia foram calculadas usando regressão binomial com função de ligação logarítmica, com ponderação pelo inverso da probabilidade de amostragem para levar em conta o desenho caso-coorte. A mediação foi avaliada usando o procedimento “medeff” do Stata. Para examinar potenciais diferenças sustentadas nas proporções de nTreg (nascimento, 6 e 12 meses, e 4 anos), foi utilizado um modelo de regressão de equações de estimação generalizadas (GEE) para medidas longitudinais.
Para a coorte de autópsia fetal, a expressão tímica e esplênica fetal de CD4+ e Foxp3+ foi comparada entre os grupos usando uma interpretação exata do teste de Cochrane Armitage para tendência (SAS v9.3; SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).
Resumo de relatório
Mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Resumo de Relatório de Pesquisa da Nature vinculado a este artigo.
Informações suplementares
Informações de revisão por pares: A Nature Communications agradece a Jakob Stokholm e outros revisores anônimos por sua contribuição à revisão por pares deste trabalho. Os relatórios dos revisores estão disponíveis.
Nota do editor: A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Estes autores contribuíram igualmente: Mingjing Hu, David Eviston, Peter Hsu.
Estes autores supervisionaram conjuntamente este trabalho: Peter Vuillermin, Ralph Nanan.
Informações suplementares
Informações suplementares acompanham este artigo em 10.1038/s41467-019-10703-1.
Contribuições dos autores
M.H.: coleta de espécimes, citometria de fluxo, análise e interpretação de dados e preparação do manuscrito; D.E.: investigações de ultrassom, análise e interpretação de dados e preparação do manuscrito; P.H.: citometria de fluxo, interpretação de dados e preparação do manuscrito; E.M.: delineamento experimental livre de germes e materno/SCFAs, interpretação de dados e preparação do manuscrito; A.C.: desenvolvimento conceitual e delineamento experimental do estudo de medula óssea, timo e AIRE em camundongos, interpretação de dados e preparação do manuscrito; B.S.N.: citometria de fluxo, interpretação de dados e preparação do manuscrito; J.L.R. e Y.Y.: experimentos de citometria de fluxo em timo e medula óssea de camundongos, análise e interpretação de dados; K.W.: realizou estudos de citometria de fluxo e imunofluorescência em camundongos; F.C.: realizou os experimentos e análises de dados para a coorte BIS; A.Q., S.J., M.P. e R.B.: recrutamento para estudos de ultrassom e análises de dados; L.M.: interpretação de dados e preparação do manuscrito; D.W.: medições de acetato e preparação do manuscrito; A.P.: auxiliou com os experimentos da coorte BIS; M.L.K. e M.O'H.: interpretação de dados e preparação do manuscrito; N.L.D.: planejou e realizou medições de acetato e interpretação de dados; C.R.M.: desenvolvimento do conceito de estudos animais, interpretação de dados e preparação do manuscrito; J.D.: imuno-histoquímica do timo, análise e interpretação de dados e preparação do manuscrito; O Grupo de Investigadores BIS esteve envolvido no estabelecimento da coorte BIS; P.V. e R.N.: conceito geral do estudo, planejaram experimentos, analisaram dados e preparação do manuscrito. R.N.: conceituou a ideia principal deste projeto.
Disponibilidade de dados
Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado (e seus arquivos de informações suplementares) ou disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável. Os dados fonte subjacentes às Figs. 1b, 1d, 2b, 2d, 3, 5a–e, 6a–g e 7d, e são fornecidos como um arquivo de Dados Fonte.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Referências
Determinantes ambientais no início da vida de doenças alérgicas e a pandemia mais ampla de doenças inflamatórias não transmissíveis
Aumento sistêmico na proporção entre células T CD4+ produtoras de Foxp3+ e IL-17 na gravidez saudável, mas não na pré-eclâmpsia
Células apresentadoras de antígeno DC-SIGN+ deciduais alteradas e indução prejudicada de células T reguladoras na pré-eclâmpsia
O alinhamento fetal-materno das células T reguladoras correlaciona-se com a regulação positiva de IL-10 e Bcl-2 na gravidez
Pré-eclâmpsia associa-se com asma, alergia e eczema na infância
Nascimento após gestações pré-eclâmpticas: associação com sensibilização alérgica e rinoconjuntivite alérgica no final da infância; um estudo de coorte historicamente pareado
Hipertensão na gravidez e risco cardiovascular na prole em adultos jovens: estudos prospectivos e de irmãos no estudo HUNT (Estudo de Saúde de Nord-Trondelag) na Noruega
Fatores de risco cardiovascular em crianças e adultos jovens nascidos de gestações pré-eclâmpticas: uma revisão sistemática
Risco cardiovascular clínico durante a idade adulta jovem na prole de gestações hipertensivas: insights de uma coorte de nascimento com seguimento prospectivo de 20 anos
Dieta, microbiota intestinal e respostas imunes
Dieta, metabólitos e doenças inflamatórias do "estilo de vida ocidental"
Ácidos graxos de cadeia curta no intestino grosso humano, sangue portal, hepático e venoso
Fibra alimentar e SCFA bacterianos melhoram a tolerância oral e protegem contra alergia alimentar por meio de diversas vias celulares
Evidências de que a asma é uma doença de origem desenvolvimental influenciada pela dieta materna e metabólitos bacterianos
Dieta rica em fibras e suplementação de acetato alteram a microbiota intestinal e previnem o desenvolvimento de hipertensão e insuficiência cardíaca em camundongos hipertensos
Além das sensações intestinais: como a microbiota intestinal regula a pressão arterial
Ingestão de alimentos probióticos e risco de pré-eclâmpsia em mulheres primíparas: o Estudo de Coorte Norueguês de Mães e Filhos
Padrões alimentares maternos e desfecho da gravidez
Ingestão de fibra alimentar no início da gestação e risco de pré-eclâmpsia subsequente
Dieta rica em fibras e suplementação de acetato alteram a microbiota intestinal e previnem o desenvolvimento de hipertensão e insuficiência cardíaca em camundongos hipertensos: perspectiva clínica
O microbioma materno durante a gravidez e doença alérgica na prole
A sinalização de TLR materna é necessária para a proteção pré-natal contra asma pelo micróbio não patogênico Acinetobacter lwoffii F78
A aplicação materna perinatal de Lactobacillus rhamnosus GG suprime a inflamação alérgica das vias aéreas na prole de camundongos
A microbiota materna impulsiona o desenvolvimento imunológico inato pós-natal precoce
A exposição pré-natal a um ambiente rural modifica a sensibilização atópica ao nascimento
Exposição à agricultura no início da vida e desenvolvimento de asma e alergia: um estudo transversal
Contato pré-natal com animais e expressão gênica de receptores da imunidade inata ao nascimento estão associados à dermatite atópica
Tolerância imune. Células T reguladoras geradas no início da vida desempenham um papel distinto na manutenção da autotolerância
Crescimento tímico fetal prejudicado precede a pré-eclâmpsia clínica: um estudo caso-controle
Crescimento cefálico fetal alterado na pré-eclâmpsia: um estudo de coorte retrospectivo de prova de conceito
Perfil da coorte: O Estudo Barwon Infant
Influência do modo de parto nas subpopulações e replicação de linfócitos em mães e recém-nascidos
Involução aguda do timo durante a infância e a niñez: imuno-histoquímica do timo e tecidos linfoides periféricos após doença aguda
Os metabólitos microbianos, ácidos graxos de cadeia curta, regulam a homeostase das células Treg do cólon
Metabólitos produzidos por bactérias comensais promovem a geração de células T reguladoras periféricas
Butirato derivado de micróbios comensais induz a diferenciação de células T reguladoras do cólon
Metabólitos microbianos intestinais limitam a frequência de células T autoimunes e protegem contra diabetes tipo 1
Níveis de Foxp3 em células T reguladoras refletem seu status funcional no transplante
Projeção de uma sombra imunológica própria dentro do timo pela proteína aire
Controle homeostático da diversidade de células T reguladoras
Lee, G. R. O equilíbrio entre células Th17 e Treg na autoimunidade. Int. J. Mol.Sci.19, pii: E730 (2018).
Equilíbrio entre células Th17 e T reguladoras em doenças autoimunes e inflamatórias
Correlação do aumento da razão Th17/Treg com estresse do retículo endoplasmático na doença renal crônica
Interações imunes inatas e adaptativas na interface fetal-materna na gravidez humana saudável e na pré-eclâmpsia
Análise multivariada usando citometria de fluxo de alta definição revela distintos repertórios de células T entre a interface fetal-materna e o sangue periférico
Pré-eclâmpsia grave está associada a uma perturbação da rede de citocinas em direção a um estado inflamatório sistêmico
Regulação da função das células imunes por ácidos graxos de cadeia curta
Microbioma da placenta na pré-eclâmpsia apoia o papel das bactérias na causa multifatorial da pré-eclâmpsia
Um componente microbiano dormente no desenvolvimento da pré-eclâmpsia
Amido resistente na dieta aumenta o hidrogênio exalado e o acetato sérico em indivíduos humanos
Horário do dia e status de tolerância à glicose afetam as concentrações séricas de ácidos graxos de cadeia curta em humanos
Geração aumentada de células T reguladoras Foxp3(+) pela manipulação da apresentação de antígenos no timo
Expressão ectópica de aire no córtex tímico revela propriedades inerentes de aire como fator tolerogênico na medula
A classificação, diagnóstico e manejo dos distúrbios hipertensivos da gravidez: Uma declaração revisada do ISSHP. Gravidez
Perfil da Coorte: O Estudo Barwon Infantil
Dinâmica populacional bacteriana e concentrações fecais de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) em humanos saudáveis
HMDB 3.0 – o banco de dados do metaboloma humano em 2013
Enzimas purificadas melhoram o isolamento e a caracterização do epitélio tímico adulto
Um coeficiente de correlação de concordância para avaliar a reprodutibilidade
Sobre cálculos de poder e tamanho amostral para testes de razão de verossimilhança em