pmid: "32010146"
title: "Usando Precisamente Definido"
authors: "Wyss M, Brown K, Thomson CA, Koegler M, Terra F, Fan V, Ronchi F, Bihan D, Lewis I, Geuking MB, McCoy KD"
journal: "Frontiers in immunology"
pubdate: "2019"
doi: "10.3389/fimmu.2019.03107"
source: "PMC Full Text"
Usando Precisamente Definido
Autores
Wyss M, Brown K, Thomson CA, Koegler M, Terra F, Fan V, Ronchi F, Bihan D, Lewis I, Geuking MB, McCoy KD
Periodico
Frontiers in immunology (2019)
Conteudo
Usando Microbiotas in vivo Precisamente Definidas para Compreender a Regulação Microbiana da IgE
A exposição precoce a micróbios desempenha um papel importante no desenvolvimento do sistema imunológico. Camundongos livres de germes, ou camundongos colonizados com uma microbiota de baixa diversidade, apresentam altos níveis séricos de IgE. Um aumento na riqueza microbiana, desde que ocorra em uma janela crítica de desenvolvimento no início da vida, leva à inibição dessa IgE induzida pela higiene. No entanto, se essa inibição depende exclusivamente de certas espécies microbianas, ou é um efeito aditivo da riqueza microbiana, ainda precisa ser determinado. Aqui, relatamos que camundongos colonizados com uma combinação de espécies bacterianas com características específicas é necessária para inibir os níveis de IgE. Essas características definidas incluem a presença no início da vida, produção de acetato e imunogenicidade refletida pela indução de IgA. A supressão de IgE não se correlacionou com a produção dos ácidos graxos de cadeia curta propionato e butirato, ou com a indução de Tregs induzidas perifericamente em tecidos mucosos. Assim, a inibição da indução de IgE pode ser mediada por micróbios específicos e suas vias metabólicas e propriedades imunogênicas associadas.
Introdução
A prevalência de alergias tem aumentado nos últimos 50 anos. A hipótese da higiene postulou uma ligação entre a diminuição da exposição microbiana e o aumento das respostas imunes do tipo 2. Observações posteriores revelaram que o aumento da higiene levou a mudanças tanto em doenças alérgicas quanto autoimunes, levando ao modelo contra-regulatório. O crescente entendimento do impacto do microbioma intestinal na regulação imunológica levou à formulação da hipótese da microflora, que sugeriu que as mudanças na composição e riqueza das comunidades microbianas intestinais estão na base das doenças alérgicas. De fato, muitos estudos agora apoiam a sugestão de que a colonização microbiana durante uma janela crítica no início da vida é particularmente importante para o desenvolvimento de um sistema imunológico regulado tanto em camundongos quanto em humanos.
Níveis séricos totais elevados de IgE são uma marca registrada de alergias, mas também são observados em múltiplas imunodeficiências, incluindo algumas caracterizadas por deficiências em células T reguladoras. Mostramos anteriormente que a hiper-IgE está associada a uma desregulação ou deficiência imunológica subjacente. De acordo com isso, camundongos livres de germes apresentam níveis séricos de IgE anormalmente altos. Mostramos anteriormente que a exposição a uma maior diversidade de micróbios no início da vida, durante uma “janela de oportunidade”, poderia inibir completamente esses níveis elevados de IgE sérica. No entanto, não estava claro se a inibição da IgE durante essa janela crítica era um resultado aditivo do aumento da diversidade ou refletia a presença de uma espécie microbiana “chave”. Os mecanismos celulares e moleculares subjacentes envolvidos na inibição da IgE também não estavam claros. As células T reguladoras desempenham um papel importante na supressão das respostas imunes a autoantígenos, micro-organismos comensais e antígenos ambientais inofensivos. Defeitos na indução ou função das células T reguladoras têm sido associados ao desenvolvimento de autoimunidade, alergia alimentar e respostas Th2 desequilibradas dependentes da idade em sítios mucosos. Acredita-se que existam duas populações de Tregs; uma derivada do timo, denominada tTregs, e outra originada de células T ingênuas na periferia (pTregs).
Bactérias intestinais, como algumas espécies de Clostridia, demonstraram induzir a diferenciação de pTregs por meio de sua produção de butirato, um ácido graxo de cadeia curta (AGCC), no cólon. Além disso, uma subpopulação de Tregs, definida como CD4+Foxp3+RORγt+Helios−, demonstrou ser induzida pela microbiota no intestino delgado, cólon e tecidos GALT. No entanto, não está claro se existe uma ligação funcional entre a colonização microbiana, a indução de pTregs, em particular a subpopulação de pTregs RORγt+Helios−, e a regulação da IgE. Nossa hipótese foi de que certas espécies bacterianas e sua produção de AGCC poderiam induzir a regulação imune da IgE aumentando as pTregs induzidas perifericamente. Aqui, geramos uma extensa coleção de colônias de camundongos gnotobióticos e descobrimos que três espécies bacterianas que colonizam o intestino delgado no início da vida podem, juntas, suprimir a hiper-IgE mediada pela higiene. Identificamos a produção de acetato, a imunogenicidade e a associação à mucosa como características-chave de consórcios bacterianos que, quando combinados, conferem a capacidade de inibir a indução de hiper-IgE.
Materiais e Métodos
Camundongos, Status de Higiene e, Colonização Bacteriana
Camundongos C57BL/6J foram rederivados para o status axênico via transferência de embriões de duas células. Camundongos axênicos e gnotobióticos (axênicos e precisamente colonizados) foram criados e mantidos em isoladores de filme flexível no Clean Mouse Facility (CMF), Universidade de Berna, Suíça, ou no International Microbiome Centre (IMC), Universidade de Calgary, Canadá. A linhagem C57BL/6J axênica e gnotobiótica usada em Berna e Calgary era idêntica. Para alguns experimentos, camundongos foram alojados em isocages ventilados individualmente (Tecniplast) no IMC. O status axênico foi monitorado rotineiramente por métodos dependentes e independentes de cultura, e todas as colônias axênicas foram confirmadas independentemente como livres de patógenos. Para iniciar colônias de camundongos gnotobióticos, casais reprodutores axênicos foram gavados com culturas bacterianas únicas ou mistas, conforme indicado. Coloração de Gram, coloração de DNA SYTOXTM (Fisher) e sequenciamento de amplicon do gene 16S rRNA de seus conteúdos intestinais foram realizados para confirmar seu status de colonização. A prole desses casais reprodutores gnotobióticos foi analisada com 10–13 semanas de idade, salvo indicação em contrário. Camundongos SPF foram adquiridos da Envigo (Suíça) ou criados e mantidos na Universidade de Calgary. Os camundongos SPF da Universidade de Calgary foram alimentados com a mesma dieta autoclavada que seus equivalentes axênicos e gnotobióticos. Embora duas colônias SPF diferentes tenham sido usadas, uma na Suíça (Envigo, Países Baixos) e outra no Canadá (colônia SPF interna), não observamos diferenças significativas em nossos resultados entre essas duas colônias SPF. Os únicos dados derivados de camundongos SPF da Envigo são n = 18 de um total de n = 80 camundongos mostrados na Figura 1B, bem como os dados mostrados na Figura Suplementar 3. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Escritório Federal Veterinário Suíço ou pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais e foram aprovados pela Comissão de Experimentação Animal do Escritório Veterinário do Cantão de Berna ou pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Calgary.
Uma espécie bacteriana produtora de butirato não pode regular os níveis séricos de IgE (A) Abundância relativa de espécies no intestino delgado (ID) e ceco de um camundongo representativo colonizado por C1 e C2, n = 3–4 camundongos por grupo. (B) Níveis totais de IgE sérica em camundongos axênicos (GF) (n = 113), C1 (n = 15), C2 (n = 28) e SPF (n = 80). (C) Níveis de SCFA nos conteúdos cecais de camundongos GF (n = 15–16), C1 (n = 4), C2 (n = 6–10) e SPF (n = 13–14). Cada símbolo representa um camundongo individual. Linhas horizontais pretas representam a média geométrica (B) ou a média (C). Todos os camundongos tinham 10–13 semanas de idade. *p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001, calculado por ANOVA de uma via com pós-teste de Tukey (B) ou Dunnett (C).
Cultura Bacteriana
As bactérias foram cultivadas em meio de Infusão de Cérebro e Coração (BHI) conforme descrito anteriormente. Frascos e meios foram gaseificados com 10% H2, 10% CO2 e 80% N2 enquanto estavam em uma incubadora anaeróbica Whitley A95 antes de serem selados e inoculados com espécies bacterianas específicas.
Citometria de Fluxo Bacteriana
A citometria de fluxo bacteriana foi realizada conforme descrito anteriormente. Resumidamente, as bactérias foram cultivadas por 24–48 h conforme descrito acima, com a modificação de que o meio BHI foi esterilizado por filtração antes da inoculação. Para o crescimento de Akkermansia muciniphila YL44, 0,25 g/L de mucina gástrica suína Tipo II autoclavada (Sigma) foi adicionada ao meio BHI esterilizado por filtração. As culturas bacterianas foram centrifugadas por 10 min a 3.000 g, lavadas duas vezes e ressuspensas em PBS/2%BSA/0,02% de azida sódica esterilizado por filtração e diluídas para aproximadamente 10^7 bactérias/ml (OD595 0,1 = 10^8 bactérias/ml). O soro foi diluído 1:10 em PBS/2%BSA/0,02% de azida sódica, inativado pelo calor a 56°C por 30 min e centrifugado a 16.000 g por 5 min a 4°C para remover quaisquer contaminantes do tamanho de bactérias. Este sobrenadante de soro foi utilizado para realizar diluições seriadas. 2,5 × 10^5 bactérias foram adicionadas a cada poço e incubadas com as diluições seriadas de soro por 1 h a 4°C, centrifugadas por 10 min a 3.000 g, lavadas duas vezes e, em seguida, ressuspensas em anticorpo monoclonal APC de rato anti-IgG1 de camundongo (1:40, A85-1) (BD) e BV605 de rato anti-IgA de camundongo (1:40, C10-1) (BD) e incubadas durante a noite a 4°C. As bactérias foram lavadas duas vezes em PBS/2%BSA/0,02% de azida sódica e, em seguida, ressuspensas em PBS/2%BSA/0,02% de azida sódica e adquiridas em um FACS Canto (BD) usando FSc (dispersão frontal) e SSc (dispersão lateral) em modo logarítmico. Os dados foram analisados usando o software FlowJo (Tree Star Inc.).
Coleta de Lavado do Intestino Delgado
O intestino delgado inteiro foi removido e lavado com 5 ml de tampão de lavagem intestinal gelado [10% de EDTA 0,5 M pH 8,0, 10% de PBS 10x, ddH2O e 0,1 mg ml−1 de inibidor de tripsina de soja (Sigma)] com 40 μl de 100 μM de fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF, Sigma) por 5 ml de tampão de lavagem intestinal. O lavado do intestino delgado foi centrifugado a 4.000 g por 10 min a 4°C e armazenado a −80°C.
Extração de DNA do Conteúdo Intestinal
Intestinos delgados, cecos e cólons foram abertos longitudinalmente. Os conteúdos foram removidos e congelados rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados a −80°C. O DNA foi extraído dos conteúdos usando o QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as amostras foram homogeneizadas em tampão InhibitEX por agitação com esferas usando esferas de tamanhos diferentes (esferas de vidro, 0,5–0,75 mm; esferas de zircônia, <100 μM), tratadas com tampão de lise (1,2% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris·HCl) contendo lisozima (20 mg ml−1, Sigma), seguidas por tratamento com Proteinase K. O DNA bacteriano foi precipitado com etanol em uma membrana de coluna e eluído com água estéril. Extrações de DNA em branco do procedimento foram realizadas em paralelo com cada lote de extrações de DNA e processadas como controles durante as etapas downstream de PCR para confirmar a ausência de sequências de DNA contaminantes do processo de extração.
Sequenciamento de Amplicons do Gene 16S rRNA
Duas plataformas foram utilizadas para o sequenciamento de amplicons do gene 16S rRNA.
Para os modelos gnotobióticos C1 e C2 (Tabela Suplementar 1), os segmentos do gene 16S rRNA que abrangem as regiões variáveis V5 e V6 foram amplificados a partir do DNA de amostras de conteúdo intestinal usando uma abordagem multiplex com o primer de fusão direto com código de barras 5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG CÓDIGO DE BARRAS ATTAGAT ACCCYGGTAGTCC-3′ em combinação com o primer de fusão reverso 5′-CCTCT CTATGGGCAGTCGGTGATACGAGCTGACGACARCCATG-3′. As sequências em itálico são sequências adaptadoras específicas do Ion torrent PGM. Os amplicons de 16S rRNA V5-V6 amplificados por PCR foram purificados e preparados para sequenciamento no sistema Ion torrent PGM de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies). Amostras com mais de 1.000 leituras foram utilizadas para a análise. A análise de dados foi realizada usando o pipeline QIIME versão 1.8.0. Unidades taxonômicas operacionais foram selecionadas usando UCLUST com um limite de identidade de sequência de 97%, seguido pela atribuição de taxonomia usando um banco de dados personalizado C1 ou C2 para amostras intestinais gnotobióticas C1 e C2. Para todos os outros modelos gnotobióticos, o segmento do gene 16S rRNA que abrange a região variável V4 foi amplificado a partir do DNA extraído de amostras de conteúdo intestinal usando uma abordagem multiplex com o primer de fusão direto com código de barras 5′- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC i5BARCODE TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′ em combinação com o primer de fusão reverso 5′CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT i7BARCODE AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′. Uma reação de PCR continha 0,25 mM de cada primer, KAPA HiFi Hot Start Ready Mix (Roche) e 20–100 μg de DNA molde. As condições de PCR foram 98°C por 2 min, seguidas por 25 ciclos de 98°C por 30 s, 55°C por 30 s e 72°C por 20 s e uma etapa de extensão final a 72°C por 7 min. A amplificação da região do gene V4 foi verificada por eletroforese em gel de agarose a 1,2%. As reações foram purificadas usando esferas de limpeza NucleoMag NGS (Macherey-Nagel) e normalizadas usando o Kit de Placa de Normalização SequalPrep (Invitrogen). Os amplicons foram agrupados e a concentração e a qualidade foram determinadas usando o kit Qubit HS DNA (Qubit) e o ensaio Tapestation D1000 (Agilent), respectivamente. O sequenciamento de amplicons foi realizado em um sequenciador de DNA de bancada MiSeq (Illumina) usando um kit V2-500 cycle (Illumina Inc.). Usando os pacotes Dada2, phyloseq e reshape2 no R, as leituras direta e reversa foram cortadas para 230 e 210 pb, respectivamente, e as quimeras foram removidas usando a função removeBimeraDenovo. A taxonomia foi atribuída usando bancos de dados personalizados contendo as sequências do gene 16S rRNA de todas as espécies bacterianas usadas nos modelos gnotobióticos. Variantes de sequência de amplicon (ASVs) que estavam presentes em <0,5% foram excluídas.
Sequenciamento de Comprimento Total do Gene 16S rRNA
Para confirmar o status de monocolonização, fezes foram coletadas de camundongos monocolonizados e o DNA foi extraído. A PCR de comprimento total do rRNA 16S foi realizada usando os primers diretos fD1 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′ e fD2 5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′ e o primer reverso rP1 5′ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3′. Cada reação de PCR continha 0,2 μM de cada primer, tampão Green GoTaq® Flexi 1X (Promega), 0,2 mM de dNTP (Promega), 1,25 Unidades de GoTaq® DNA polimerase (Promega) e 100 ng de DNA fecal extraído. As condições da PCR foram 94°C por 5 min, seguidas por 35 ciclos de 94°C por 1 min, 43°C por 1 min e 72°C por 2 min, e uma etapa de extensão final a 72°C por 7 min. Os produtos da PCR foram submetidos ao sequenciamento Sanger e os resultados do sequenciamento foram comparados com o banco de dados BLAST do NCBI.
Isolamento de Células e Coloração Intracelular de Citocinas
Todo o intestino delgado e todo o cólon foram excisados e a gordura residual e as placas de Peyer (PP) foram removidas. Os intestinos foram abertos longitudinalmente, lavados em Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS) sem CaCl2 e MgCl2 (Invitrogen), cortados em pedaços de 1-2 cm de comprimento e lavados uma vez (cólon) ou duas vezes (intestino delgado) em 25 ml de solução salina balanceada de Hank (HBSS) contendo 0,5 mM de EDTA, 10 mM de HEPES e 5% de soro de cavalo (HS) por 20 min a 37°C com agitação a 220 rpm, a fim de remover a camada epitelial. Aqui, a HBSS consistia em 5,4 mM de KCl, 0,3 mM de NaH2PO4, 0,4 mM de KH2PO4 e 137 mM de NaCl. O tecido residual foi lavado com DPBS e transferido para uma solução de HBS/5% HS (HBSS com 10 mM de HEPES e 25 mM de NaHCO3) contendo 1,0 mg ml−1 de colagenase Tipo VIII (Sigma) e 10 U de DNAse I (Roche), e foi picado e digerido por 20–30 min (intestino delgado) ou 25–35 min (cólon) a 37°C com agitação a 220 rpm. A suspensão celular resultante foi passada através de um filtro de células (100 μM). As células foram lavadas com HBS/5% HS e centrifugadas a 400 g por 5 min e ressuspensas para quantificação.
Para a Figura 3, após a digestão e centrifugação, o pellet de células do intestino delgado foi ressuspenso em solução de Percoll a 40% e colocado sobre uma solução de Percoll a 70% (GE Healthcare). A centrifugação em gradiente foi realizada a 700 g por 20 min à temperatura ambiente, sem freio. As células na interface 40%/70% foram coletadas e lavadas com HBS/5% HS e centrifugadas a 400 g por 5 min e ressuspensas para quantificação. Os linfonodos mesentéricos (MLNs) e as PP foram digeridos com HBS/5% HS contendo 1 mg ml−1 de colagenase IA (Sigma) e 10 U de DNAse I (Roche) por 20 min a 37°C e passados através de um filtro de células (100 μM), lavados com HBS/5% HS e centrifugados a 400 g por 5 min e ressuspensos para quantificação. Os baços foram passados através de um filtro de células (100 μM) e centrifugados a 400 g por 5 min. Os pellets de células do baço foram ressuspensos em 1 ml de NH4Cl a 0,88% por 10 min à temperatura ambiente para lisar os glóbulos vermelhos. As células foram lavadas com HBS/5% HS e centrifugadas a 400 g por 5 min e ressuspensas para quantificação.
Para coloração intracelular de citocinas, suspensões de células únicas do intestino delgado foram estimuladas por 4 h a 37°C/5% CO2 em Meio Iscove Modificado por Dulbecco (IMDM, Fisher) contendo 10% de Soro Fetal Bovino (FBS, Fisher) na presença ou ausência de 50 ng ml−1 de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, Sigma) e 750 ng ml−1 de ionomicina (Invitrogen) com 10 μg ml−1 de Brefeldina A (Sigma).
Citometria de Fluxo
As células foram lavadas duas vezes com DPBS e coradas com corante de viabilidade fixável eFluor506 (eBioscience) ou corante de viabilidade fixável 780 (BD) e anti-CD16/CD32 (2.4G2; BD) em DPBS por 10 min a 4°C. As células foram então lavadas com tampão FACS contendo 2% de soro fetal bovino (Invitrogen), 2,5 mM de EDTA (MP Biomedicals) em PBS. Para coloração de superfície celular, os pellets celulares foram ressuspendidos em anticorpos diluídos em tampão FACS e corados por 30 min a 4°C. A coloração intranuclear foi realizada usando o kit de coloração Foxp3 (eBioscience). A coloração intracelular de citocinas foi realizada com o kit de coloração Cytofix/Cytoperm (BD). Os seguintes anticorpos conjugados específicos para camundongo foram usados: CD45-PerCP-Cy5.5 (30-F11; BD), CD45-BV510 (30-F11; BD), TCRβ-BV786 (H57-597; BD), CD4-Pe-Cy7 (RM4-5; BD), Helios-AlexaFluor488 (22F6; BD), CD3-PB (145-2C11; Biolegend), CD4-BV785 (RM4-5; Biolegend), Helios-FITC (22F6; Biolegend), IL10-Pe-Cy7 (JES5-16E3; Biolegend) Foxp3-AlexaFluor700 (FJK-16s; eBioscience), e RORγt-PE (Q31-378; eBioscience). As células foram adquiridas em um FACS Fortessa (BD Biosciences) ou um FACS Canto (BD) com o software FACSDIVA (BD). A análise de dados foi realizada usando o software FlowJo (Tree Star Inc.).
ELISA de IgE e Imunoensaio de Eletroquimioluminescência de IgE (IgE-ECL)
O sangue foi coletado em tubos separadores de soro (Sarstedt e BD) e as concentrações totais de IgE no soro foram medidas usando o Kit BD OptEIA Mouse IgE ELISA (BD) de acordo com as instruções do fabricante, ou um multi-array (Meso Scale Discovery) utilizando o Kit BD OptEIA Mouse IgE ELISA.
Imunoensaio de Eletroquimioluminescência de IgA e IgG1
As concentrações totais de IgA e IgG1 no soro e no lavado do intestino delgado foram determinadas usando o kit Mouse Isotyping Panel 1 de acordo com as instruções do fabricante (Meso Scale Discovery).
Análise de Metabólitos de Ácidos Graxos de Cadeia Curta por LC/MS/MS
Os conteúdos cecais foram coletados, congelados instantaneamente em nitrogênio líquido e armazenados a −80°C até o processamento. Os AGCCs nativos foram extraídos das amostras cecais com uma solução gelada de acetonitrila a 50% (proporção 2:1 (v/p)) contendo quantidades conhecidas dos seguintes padrões analíticos de AGCC-13C usados como padrões internos (PI): ácido acético (1,2-13C2, 99%, #CLM-113, Cambridge Isotope Laboratories, Inc, Andover, MA, EUA), ácido propiônico (13C3, 99%, #589586, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e ácido butírico (1,2-13C2, 99%, #491993, Sigma-Aldrich) (Tabela Suplementar 2). As amostras foram homogeneizadas a 30 Hz por 3 min com um tissue lyzer (Qiagen) e centrifugadas a 18.000 g por 10 min a 4°C. Os sobrenadantes foram coletados e centrifugados nas mesmas condições. Os sobrenadantes foram então derivatizados com EDC (cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida) e anilina da seguinte forma: uma alíquota de 100 μL foi incubada com EDC (50 mM, concentração final) e anilina (100 mM, concentração final) por 2 h a 4°C. Uma alíquota de cada amostra foi ainda diluída com metanol/água grau HPLC a 50%. Todas as amostras foram armazenadas a 4°C até a análise no mesmo dia.
A análise por LC-MS/MS dos conteúdos cecais foi realizada em um Sistema VanquishTM UHPLC acoplado a um Espectrômetro de Massas triplo quadrupolo TSQ QuantumTM Access MAX (Thermo Scientific) equipado com uma sonda de ionização por electrospray (HESI-II). A plataforma UHPLC-MS foi controlada pelo sistema de dados XcaliburTM (Thermo Scientific).
A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna Hypersil GOLDTM C18 (200 X 2,1 mm, 1,9 μm, Thermo Scientific) utilizando um sistema de solventes binário composto por H2O grau LC-MS com 0,1% (v/v) de ácido fórmico (Solvente A) e metanol grau LC-MS com 0,1% (v/v) de ácido fórmico (solvente B). O seguinte gradiente de 21 min foi utilizado: 0–1 min, 40% B; 1–7 min, 40–98% B; 7–15 min, 98% B; 15–16 min, 98–40% B; 16–21 min, 40% B. O eluente do LC foi desviado para o resíduo nos primeiros 5 min da corrida. A vazão foi de 200 μL/min e o volume de injeção da amostra foi de 2 μL. O amostrador automático foi mantido a 4°C e a coluna a 30°C.
Os dados de MS/MS foram adquiridos em modo de ionização positiva com o espectrômetro de massas operando em modo de Monitoramento de Reação Selecionada (SRM). Os parâmetros de fragmentação foram otimizados usando o programa EZ Tune com infusão direta dos padrões derivatizados de grau analítico. Subsequentemente, as seguintes transições, correspondentes aos três AGCCs nativos derivatizados e respectivos padrões de AGCC-13C derivatizados, foram monitoradas, com tempo de varredura de 0,05 s e energia de colisão fixa de 14 eV: [M+H]+ m/z 136.07, 138.08, 150.09, 153.10, 164.10, 166.11 → m/z 94.06. As condições da fonte de ionização por electrospray foram as seguintes: voltagem do spray de 3.000 V, temperatura do vaporizador de 300°C, gás de bainha de 5 (unidades arbitrárias), gás de varredura de 1 (unidades arbitrárias), gás auxiliar de 2 (unidades arbitrárias), temperatura do capilar de 275°C.
As análises de dados, nos arquivos mzXML convertidos, foram realizadas no MAVEN. Em resumo, para cada SCFA, a determinação da concentração nativa de SCFA foi baseada na razão de intensidade de sinal 12C/13C e na respectiva concentração de 13C-IS.
Análise Estatística
A análise estatística foi realizada por ANOVA de uma via com pós-teste de Tukey ou Dunnett, dependendo se a comparação foi realizada entre todas as médias (Tukey) ou comparada a uma média de controle (Dunnett) usando GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc.). Os dados de concentrações de IgE sérica foram primeiro transformados por log antes de realizar ANOVA de uma via com pós-teste de Tukey. Os SCFA no cólon vs. ceco (na Figura Suplementar 1) foram comparados usando o teste t de Student. Um p < 0.05 foi considerado estatisticamente significativo. Os valores de p são indicados da seguinte forma: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, não significativo (ns).
Resultados
A Presença de uma Espécie Bacteriana Produtora de Butirato Tem um Efeito Mínimo nos Níveis Séricos de IgE em Adultos
Nós mostramos anteriormente que camundongos colonizados com a Flora Schaedler Alterada (ASF), abrigando oito espécies bacterianas intestinais comensais, exibem uma dicotomia em termos de desenvolvimento de altos níveis de IgE. Altos níveis de IgE na idade adulta correlacionaram-se com uma baixa diversidade de ASF no início da vida, enquanto uma alta diversidade de ASF no início da vida suprimiu a indução de IgE. Também observamos que a presença da bactéria produtora de butirato Pseudoflavonifractor sp. ASF500 no início da vida correlacionou-se com a supressão de IgE. Nós e outros também mostramos anteriormente que a colonização com ASF ou colonização com consórcios microbianos contendo espécies de Clostridia resulta na indução de pTregs intestinais e o SCFA butirato demonstrou apoiar a indução de pTreg. Para testar se o butirato produzido por Pseudoflavonifractor sp. ASF500 poderia suprimir a hiper-IgE, introduzimos por gavagem casais reprodutores C57BL/6 livres de germes com a Comunidade microbiana #1 (C1, Tabela Suplementar 1) consistindo em três espécies de ASF não produtoras de butirato que sabemos não suprimem a hiper-IgE, ou a comunidade C2, que tinha o produtor de butirato Pseudoflavonifractor sp. ASF500 adicionado à comunidade (Tabela Suplementar 1). Essa abordagem foi necessária porque Pseudoflavonifractor sp. ASF500 é incapaz de colonizar um camundongo livre de germes por conta própria e requer a presença de outras espécies bacterianas (dados não mostrados). A colonização com C1 ou C2 no intestino delgado e ceco da prole foi confirmada por sequenciamento de amplicon do gene 16S rRNA (Figura 1A). Pseudoflavonifractor sp. ASF500 foi detectado apenas no grupo C2 e Lactobacillus intestinalis ASF360 (presente no inóculo para C1 e C2) estava abaixo do limite de detecção em ambos os grupos.
Os níveis séricos totais de IgE foram medidos em grandes coortes controle de camundongos GF e camundongos livres de patógenos específicos (SPF) (Figura 1B). Conforme demonstrado anteriormente, os níveis de IgE em camundongos GF adultos estavam elevados e significativamente aumentados em relação aos níveis de SPF. Descobrimos que os níveis de IgE em descendentes adultos colonizados com C1 ou C2 permaneceram significativamente elevados, no nível dos controles GF (Figura 1B). Constatamos que a colonização com C1 e C2 levou a aumentos significativos nos níveis de acetato e propionato em comparação aos níveis GF, enquanto apenas C2 aumentou significativamente os níveis de butirato no conteúdo cecal, conforme esperado (Figura 1C). Todos os níveis de AGCC nas coortes C1 e C2 permaneceram significativamente mais baixos do que os observados em camundongos SPF (Figura 1C). Esses dados indicaram que níveis baixos de AGCC eram insuficientes para inibir a hiper-IgE induzida por higiene. Vale notar que os níveis de AGCC no conteúdo cecal eram comparáveis aos níveis observados no conteúdo do cólon (Figura Suplementar 1).
Um Aumento Adicional na Diversidade Microbiana Não Inibe a Hiper-IgE Apesar da Indução de pTregs
Investigamos em seguida se o aumento sequencial da diversidade bacteriana levaria à supressão da hiper-IgE. Portanto, adicionamos Clostridium sp. ASF356 à comunidade C2 para formar a comunidade C3 e adicionamos Clostridium sp. ASF502 ao C3 para gerar o C4 (Tabela Suplementar 1). O sequenciamento do amplicon do rRNA 16S do conteúdo do intestino delgado e cecal de descendentes adultos colonizados com C3 e C4 confirmou a presença de Clostridium sp. ASF356 em camundongos colonizados com C3 e C4 e de Clostridium sp. ASF502 apenas nos camundongos colonizados com C4 (Figura 2A). Apesar do aumento na riqueza microbiana, os níveis séricos de IgE em camundongos colonizados com C3 e C4 permaneceram comparáveis aos níveis GF e significativamente elevados em comparação aos níveis de IgE SPF (Figura 2B). Além disso, apesar do aumento na riqueza microbiana, os níveis de SCFA no conteúdo cecal de camundongos colonizados com C3 e C4 não diferiram daqueles encontrados em camundongos colonizados com C2 (Figura 2C). Como se acredita que as células T reguladoras sejam importantes na regulação da imunidade tipo 2, avaliamos em seguida a indução de Tregs (estratégia de gating mostrada na Figura Suplementar 2A). Descobrimos que, embora houvesse apenas um efeito mínimo nas proporções e nos números totais de Tregs Foxp3+ (Figuras Suplementares 2B–D), a colonização com C3 e C4 levou à indução significativa de pTregs RORγt+Helios− nos linfonodos mesentéricos (MLN), placas de Peyer (PP), intestino delgado (siLP) e lâmina própria do cólon (cLP) (Figuras 2D,E). A colonização com C4 também levou a um aumento de pTregs RORγt+Helios− no baço (Figuras 2D,E). O fator de transcrição Helios tem sido sugerido para identificar tTregs, enquanto pTregs são caracterizadas como Helios negativas. No entanto, permanece controverso se Helios, ou outros marcadores como a Neuropilina-1, pode identificar inequivocamente tTregs vs. pTregs. Portanto, incluímos a expressão de RORγt para melhor identificar pTreg induzidas por microrganismos. Esses resultados indicam que, embora as comunidades microbianas de C3 e C4 tenham produzido SCFA e induzido pTregs RORγt+Helios−, isso não foi suficiente para inibir a hiper-IgE.
Um aumento na diversidade microbiana não inibe a hiper-IgE apesar da indução de pTreg. (A) Abundância relativa de espécies no intestino delgado (ID) e ceco de um camundongo representativo colonizado por C3 e C4, n = 3 camundongos por grupo. (B) Níveis séricos totais de IgE em camundongos C3 (n = 31) e C4 (n = 56). As linhas horizontais azul e laranja representam a média geométrica das coortes GF e SPF, respectivamente (da Figura 1B). (C) Níveis de AGCC no conteúdo cecal de camundongos C3 (n = 10–13) e C4 (n = 7–9). As linhas horizontais laranja e marrom representam a média das coortes SPF e C2, respectivamente (da Figura 1C). (D) Gráficos representativos de citometria de fluxo de células Treg RORγt+Helios− em diferentes tecidos (Baço, Placas de Peyer, LNs mesentéricos, Lâmina própria do intestino delgado, Lâmina própria do cólon) de camundongos GF, C3, C4 e SPF. (E) Frequências de células Treg RORγt+Helios− entre células T CD45+TCRβ+CD4+Foxp3+ em diferentes tecidos de camundongos GF (n = 10–15), C3 (n = 4–9), C4 (n = 4–8) e SPF (n = 7–16). Todos os camundongos tinham 10–13 semanas de idade. Os dados de AGCC e células Treg RORγt+Helios− são agrupados de pelo menos dois experimentos independentes. Cada símbolo representa um camundongo individual. As linhas horizontais pretas representam a média geométrica (B) ou média (C,E). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, calculado por ANOVA de uma via com pós-teste de Tukey (B,E) ou Dunnett (C).
Demonstramos anteriormente que a diversidade bacteriana durante o início da vida é importante para suprimir a hiper-IgE. Como nosso aumento sequencial da diversidade ASF (C1 < C2 < C3 < C4) não teve efeito inibitório nos níveis séricos de IgE, levantamos a hipótese de que nenhuma dessas microbiota (C1 a C4) atinge uma diversidade suficientemente alta no início da vida para suprimir a hiper-IgE. Como o ASF completo mostrou apenas supressão parcial da hiper-IgE dependendo da diversidade de colonização no início da vida, levantamos a hipótese de que aumentar ainda mais a diversidade microbiana experimentalmente resultará eventualmente na supressão da hiper-IgE. Estabelecemos recentemente uma microbiota gnotobiótica composta por 12 espécies bacterianas definidas e bem caracterizadas. Esta microbiota é referida como microbiota moderadamente diversa definida estável de camundongos (sDMDMm2) ou microbiota de camundongos Oligo (Oligo-MM12) (Tabela Suplementar 3). A análise da composição da microbiota no intestino delgado e ceco de nossa coorte de camundongos gnotobióticos Oligo-MM12 revelou que 11 das 12 espécies foram detectáveis por sequenciamento do amplicon do gene 16S rRNA (Figura 3A), com Bifidobacterium longum subsp. animalis YL2 indetectável [como observado anteriormente ]. Mais importante, no entanto, a colonização com Oligo-MM12 resultou na supressão da hiper-IgE (Figura 3B), que se correlacionou com aumento da produção de acetato e propionato em comparação com camundongos colonizados por C4, enquanto os níveis de butirato permaneceram inalterados (Figura 3C). No entanto, a supressão da hiper-IgE não atingiu os níveis observados em camundongos SPF (Figura 2B), o que indica que aumentar ainda mais a diversidade bacteriana para SPF melhora a supressão da hiper-IgE induzida pela higiene. Notavelmente, a colonização com Oligo-MM12 também resultou em indução significativa de pTregs RORγt+Helios− (Figuras 3D,E e Figura Suplementar 3).
Um aumento adicional na diversidade microbiana suprime a hiper-IgE e demonstra um perfil dinâmico de colonização bacteriana no intestino delgado e cólon no início da vida. (A) Abundância relativa de espécies no intestino delgado (ID) e ceco de um camundongo adulto representativo Oligo-MM12, n = 4 camundongos. (B) Níveis séricos totais de IgE em camundongos Oligo-MM12 (n = 100). As linhas horizontais azul e laranja representam a média geométrica dos níveis séricos de IgE das coortes GF e SPF, respectivamente (da Figura 1B). (C) Níveis de SCFA no conteúdo cecal de camundongos Oligo-MM12 (n = 19). As linhas horizontais laranja e roxa representam a média dos níveis de SCFA nas coortes SPF e C4, respectivamente (das Figuras 1C, 2C). (D) Gráficos representativos de citometria de fluxo de Tregs RORγt+Helios− em diferentes tecidos (Bç, baço; PP, placas de Peyer; MLN, linfonodos mesentéricos; ID, lâmina própria do intestino delgado; Cólon, lâmina própria do cólon) de camundongos Oligo-MM12. (E) Frequências de Tregs RORγt+Helios− entre células T CD3ε+CD4+Foxp3+ em diferentes tecidos de camundongos Oligo-MM12 (n = 12–13). As linhas horizontais azul e laranja representam a média das coortes GF e SPF, respectivamente (da Figura 2E). (F) Abundâncias relativas de espécies bacterianas Oligo-MM12 no intestino delgado e cólon de camundongos Oligo-MM12 com 8 a 43 dias de idade. n = 2–5 camundongos por ponto de tempo. Todos os camundongos tinham 10–13 semanas de idade (A–E). Os dados de SCFA e Tregs RORγt+Helios− são agrupados de pelo menos dois experimentos independentes. Cada símbolo representa um camundongo individual. As linhas horizontais pretas representam a média geométrica (B) ou média (C, E). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, calculado por ANOVA de uma via com pós-teste de Tukey (B, E) ou Dunnett (C).
Em seguida, acompanhamos a dinâmica de colonização do Oligo-MM12 no início da vida, no intestino delgado e cólon, a partir do dia 8 até o dia 43 após o nascimento (Figura 3F). Até cerca de 2 semanas de idade, houve dominância de Enterococcus faecalis KB1 e Akkermansia muciniphila YL44 tanto no intestino delgado quanto no cólon. O nível de E. faecalis KB1 então declinou drasticamente concomitantemente com um aumento em Bacteroides caecimuris I48 (Figura 3F). Essas mudanças coincidiram com o desmame dos filhotes, sugerindo que a mudança na dieta de leite para alimento sólido contribui para o aumento de certas espécies bacterianas. À luz de nossas descobertas anteriores, esses dados sugerem que as duas espécies (E. faecalis KB1 e A. muciniphila YL44) mais proeminentes no início da vida podem contribuir para a regulação dos níveis de IgE. Além disso, como as espécies de Clostridia são conhecidas por serem as principais produtoras de SCFA, e descobrimos que C. clostridioforme YL32 e a espécie de Clostridiales B. coccoides YL58, também estavam presentes no início da vida, embora em níveis mais baixos, dissecamos ainda mais o potencial protetor dessas quatro espécies bacterianas.
Dois Clostridiales Dominantes do Início da Vida São Incapazes de Regular os Níveis de IgE
Como são frequentemente anaeróbios obrigatórios, muitas espécies de Clostridiales são incapazes de monocolonizar um intestino livre de germes. Portanto, adicionamos B. coccoides YL58 ao C2 para gerar a comunidade C5 e adicionamos C. clostridioforme YL32 ao C5 para gerar C6 (Tabela Suplementar 1). A adição bem-sucedida dessas espécies foi confirmada por sequenciamento de amplicon do gene 16S rRNA (Figura 4A). Descobrimos que os níveis totais de IgE não foram alterados em relação aos níveis de animais livres de germes em camundongos colonizados com C5 ou C6 (Figura 4B). A adição das espécies de Clostridiales também não alterou significativamente os níveis de SCFA em comparação com camundongos colonizados com C4 (Figura 4C), apesar da indução de pTregs RORγt+Helios− nesta coorte (Figuras 4D,E e Figura Suplementar 4). Esses resultados indicaram que outros membros do Oligo-MM12 provavelmente estão contribuindo para a supressão da hiper-IgE.
Duas bactérias Clostridiales do Oligo-MM12 no início da vida são incapazes de regular os níveis séricos de IgE. (A) Abundância relativa de espécies no intestino delgado (ID) e ceco de um camundongo representativo colonizado com C5 e C6, n = 2–4 camundongos por grupo. (B) Níveis séricos totais de IgE em camundongos C5 (n = 30) e C6 (n = 49). As linhas horizontais azul e laranja representam a média geométrica dos níveis séricos de IgE das coortes GF e SPF, respectivamente (da Figura 1B). (C) Níveis de SCFA no conteúdo cecal de camundongos C5 (n = 10–11) e C6 (n = 9). As linhas horizontais laranja e roxa representam a média dos níveis de SCFA nas coortes SPF e C4, respectivamente (das Figuras 1C, 2C). (D) Gráficos representativos de citometria de fluxo de Tregs RORγt+Helios− em diferentes tecidos (Baço; PP, placas de Peyer; MLN, linfonodos mesentéricos; ID, lâmina própria do intestino delgado; Col, lâmina própria do cólon) de camundongos C5 e C6. (E) Frequências de Tregs RORγt+Helios− entre células CD45+TCRβ+CD4+Foxp3+ em diferentes tecidos de camundongos C5 (n = 4–9) e C6 (n = 3–8). As linhas horizontais laranja e azul representam as frequências médias de Tregs RORγt+Helios− das coortes SPF e GF, respectivamente (da Figura 2E). Todos os camundongos tinham 10–13 semanas de idade. Os dados de SCFA e Tregs RORγt+Helios− são agrupados de pelo menos dois experimentos independentes. Cada símbolo representa um camundongo individual. Linhas horizontais pretas representam a média geométrica (B) ou a média (C,E). ***p < 0,001, ****p < 0,0001, não significativo (ns), calculado por ANOVA de uma via com pós-teste de Tukey (B,E) ou Dunnett (C).
Acetato Produzido por B. coccoides YL58 Contribui para a Supressão dos Níveis Séricos de IgE
Como a regulação da IgE é dependente da colonização microbiana no início da vida, investigamos a seguir se E. faecalis KB1 e A. muciniphila YL44, os dois membros mais dominantes do consórcio Oligo-MM12 no início da vida (Figura 3F), eram capazes de regular individualmente os níveis séricos de IgE. Monocolonizamos casais reprodutores com E. faecalis KB1 ou A. muciniphila YL44 e determinamos os níveis séricos de IgE e as concentrações de SCFA no conteúdo cecal de sua prole (Figura 5). A colonização bem-sucedida com essas bactérias individuais foi confirmada pelo sequenciamento completo do gene 16S rRNA do DNA extraído das fezes e pela coloração de Gram do conteúdo intestinal (dados não mostrados). Descobrimos que os níveis séricos totais de IgE em camundongos monocolonizados com E. faecalis KB1 e A. muciniphila YL44 não foram significativamente alterados em relação aos níveis de animais livres de germes (Figura 5A).
A cooperação entre uma espécie imunogênica e uma espécie produtora de acetato pode suprimir a hiper-IgE. (A) Níveis séricos totais de IgE em camundongos colonizados com E. faecalis KB1 (n = 40), A. muciniphila YL44 (n = 40), B. caecimuris YL58 (n = 46), KB1 + YL58 (n = 23), YL44 + YL58 (n = 28) e KB1 + YL44 + YL58 (n = 61). As linhas horizontais azul, rosa e laranja representam a média geométrica dos níveis séricos de IgE dos camundongos GF, Oligo-MM12 e SPF, respectivamente (das Figuras 1B, 3B). (B) Abundância relativa de espécies no intestino delgado (ID) e ceco de um camundongo representativo KB1 + YL58, YL44 + YL58 e KB1 + YL44 + YL58, n = 3–4 camundongos por grupo. (C) Níveis de SCFA no conteúdo cecal de camundongos colonizados com KB1 (n = 4), YL44 (n = 3–4), YL58 (n = 4), KB1 + YL58 (n = 6), YL44 + YL58 (n = 6) e KB1 + YL44 + YL58 (n = 8–9). As linhas horizontais azul, rosa e laranja representam os níveis médios de SCFA das coortes GF, Oligo-MM12 e SPF, respectivamente (das Figuras 1C, 3C). Todos os camundongos tinham 10–13 semanas de idade. Os dados de SCFA são agrupados de pelo menos dois experimentos independentes. Cada símbolo representa um camundongo individual. As linhas horizontais pretas representam a média geométrica (A) ou a média (C). ***p < 0,001, ****p < 0,0001, não significativo (ns), calculado por ANOVA de uma via com pós-teste de Tukey (A) ou pós-teste de Dunnett (C).
Como nem E. faecalis KB1 nem A. muciniphila YL44, por si só, foram capazes de suprimir a IgE, testamos em seguida essas duas em combinação. Infelizmente, o sequenciamento do amplicon do rRNA 16S da nossa colônia duplamente colonizada revelou que ela foi contaminada com a espécie adicional do Oligo-MM12, B. coccoides YL58 (YL44 + KB1 + YL58) (Figura 5B). No entanto, observamos uma redução nos níveis séricos de IgE nessa colônia YL44 + KB1 + YL58 (Figura 5A). Para investigar se esse efeito dependia da presença de B. coccoides YL58, geramos coortes monocolonizadas com B. coccoides YL58, bem como coortes duplamente colonizadas com E. faecalis KB1/B. coccoides YL58 (KB1 + YL58) e A. muciniphila YL44/B. coccoides YL58 (YL44 + YL58). Descobrimos que, embora B. coccoides YL58 sozinha não fosse capaz de reduzir os níveis séricos de IgE, observamos níveis reduzidos de IgE quando B. coccoides YL58 estava presente em combinação com E. faecalis KB1 ou A. muciniphila YL44 (Figura 5A). Isso indicou que a cooperação funcional entre espécies bacterianas com características diferentes era necessária para induzir um efeito supressor de IgE. Vale notar que as proporções de pTregs nessas diferentes coortes não se correlacionaram com a redução dos níveis séricos de IgE, indicando que a inibição da IgE não foi mediada apenas pela indução de pTregs (Figuras Suplementares 5, 6). Além disso, a ausência de butirato em todas as coortes (Figura 5C) e a ausência de propionato no modelo KB1 + YL58 sugerem que propionato e butirato não são necessários para suprimir a hiper-IgE induzida por higiene. Em contraste, a produção de acetato se correlacionou com níveis séricos reduzidos de IgE, com exceção do grupo monocolonizado com B. coccoides YL58 (Figuras 5B, C). Portanto, como B. coccoides YL58 sozinha não foi suficiente para suprimir a IgE, concluímos que o acetato fornecido por B. coccoides YL58 (Figura 5C) é necessário, mas não suficiente, para reduzir os níveis de IgE. Como E. faecalis KB1 e A. muciniphila YL44 não produzem altos níveis de acetato (Figura 5C), investigamos em seguida quais poderiam ser as características particulares de E. faecalis KB1 e A. muciniphila YL44 que são necessárias para suprimir a IgE quando presentes em combinação com um produtor de acetato.
Imunogenicidade é um Requisito Adicional para a Supressão de IgE
Um estudo recente identificou A. muciniphila como um forte indutor de IgA e IgG1 sistêmicas. Portanto, medimos a reatividade de IgA e IgG1 séricas contra A. muciniphila YL44 nas coortes monocolonizadas com YL44, bicolonizadas com YL44 + YL58 e tricolonizadas com YL44 + KB1 + YL58 (Figura Suplementar 7). Todas as coortes colonizadas com A. muciniphila YL44 apresentaram reatividade de IgA e IgG1 contra A. muciniphila YL44. Enquanto camundongos monocolonizados com E. faecalis KB1 também apresentaram reatividade específica de IgA sérica, camundongos monocolonizados com B. coccoides YL58 não (Figura Suplementar 7). Para estender essa triagem de imunogenicidade, medimos IgA total (em oposição à IgA específica para bactérias) em lavados do intestino delgado e soro de várias coortes gnotobióticas (Figura Suplementar 8). Também incluímos camundongos monocolonizados com bactérias filamentosas segmentadas (SFB) como controle, pois sabe-se que SFB é um potente indutor de IgA. Descobrimos que A. muciniphila YL44, E. faecalis KB1 e SFB foram capazes de promover a indução de IgA (Figura Suplementar 8). Importantemente, embora SFB tenha induzido uma forte resposta de IgA (Figura Suplementar 8), bem como uma resposta de pTreg RORγt+Helios− no cólon, apenas SFB não foi suficiente para suprimir a hiper-IgE induzida pela higiene, possivelmente devido à falta de produção de acetato (Figura Suplementar 9). Concluímos, portanto, que a imunogenicidade de IgA em combinação com a produção de acetato é necessária para conduzir um fenótipo supressor de IgE.
A Produção de IL10 Não Correlaciona com Proteção contra Hiper-IgE
Por último, investigamos se a produção de IL10 no intestino delgado, que é necessária para manter a homeostase imunológica intestinal, era necessária para inibir a hiper-IgE induzida pela higiene. Encontramos proporções semelhantes de células IL10+CD45+TCRβ− no intestino delgado de coortes com níveis séricos de IgE altos vs. baixos, indicando que apenas a produção de IL10 no intestino delgado não é suficiente para suprimir a hiper-IgE induzida pela higiene (Figura Suplementar 10). Além disso, camundongos monocolonizados com SFB, que apresentaram a maior proporção de células IL10+ (Figura Suplementar 10), mantiveram a hiper-IgE induzida pela higiene (Figura Suplementar 9).
Em resumo, geramos uma ampla gama de microbiotas gnotobióticas claramente definidas e com controle de qualidade in vivo, em combinação com leituras dos níveis séricos de IgE, níveis intestinais de SCFA, indução de Treg, produção de IgA e IL10, para identificar características de espécies bacterianas comensais individuais ou comunidades com capacidade de suprimir a síndrome de hiper-IgE observada em camundongos livres de germes. Descobrimos que as espécies bacterianas indutoras de IgA A. muciniphila YL44 e E. faecalis KB1, ambas dominantes no intestino delgado no início da vida, podem cooperar com B. coccoides YL58 produtora de acetato para inibir a hiper-IgE. Além disso, esse efeito inibitório foi independente da produção de propionato e butirato, das frequências de células IL10+CD45+TCRβ− na lâmina própria do intestino delgado e das frequências de pTregs RORγt+Helios− nos tecidos intestinais e GALT.
Discussão
Níveis elevados de IgE sérica em animais germ-free, mas também em animais imunodeficientes colonizados, têm sido uma observação de longa data. Também demonstramos anteriormente que existe um período crítico no início da vida, por volta do desmame, no qual a exposição a um grupo diverso de micróbios é essencial para prevenir a troca de isotipo para IgE. No entanto, o mecanismo pelo qual essa indução aberrante de IgE é regulada após a colonização intestinal e quais espécies comensais são mediadoras potentes de proteção permanece desconhecido. Aqui mostramos que a colonização com A. muciniphila ou E. faecalis, ambas predominantemente presentes antes do desmame e indutoras de IgA, em combinação com a espécie bacteriana produtora de acetato B. coccoides YL58, resulta em proteção parcial contra hiper-IgE sérica. Surpreendentemente, essa proteção não se correlacionou com a indução microbiana de RORγt+Helios− pTregs nos tecidos mucosos, indução de células IL10+CD45+TCRβ− ou produção de propionato ou butirato.
Identificamos a indução de IgA e a associação à mucosa como características-chave das bactérias envolvidas na inibição de IgE. De fato, tanto A. muciniphila quanto E. faecalis estão presentes próximas à superfície epitelial do intestino delgado e grosso. Embora A. muciniphila seja conhecida por ter funções protetoras da barreira, também é uma potente indutora de respostas sistêmicas de IgA e IgG1 específicas para bactérias. Além disso, diminuições em A. muciniphila foram associadas à atopia na infância. Isso indica que A. muciniphila é uma espécie comensal imunogênica e essa característica contribui para a inibição da IgE induzida pela higiene. Em humanos, uma forte resposta IgG sérica contra um conjunto comum de antígenos microbianos intestinais foi associada à proteção contra o desenvolvimento de alergia durante a infância. Sabe-se também que a associação à mucosa promove uma resposta de IgA. No entanto, essas características não são suficientes para inibir a IgE, pois a monocolonização com A. muciniphila, E. faecalis ou SFB não conseguiu reduzir os níveis de IgE.
Curiosamente, identificamos a produção de acetato como uma característica crítica necessária para a inibição de IgE. A troca de classe de células B para IgE ocorre nas placas de Peyer em camundongos germ-free e descobrimos que o acetato (1,9 ± 0,31 μmol/grama), mas não o butirato ou o propionato, e a bactéria produtora de acetato B. coccoides YL58 estavam presentes no intestino delgado. Além disso, ffar2/gpr43, um receptor de acetato, também é expresso no intestino delgado, predominantemente em leucócitos na lâmina própria. Em humanos, verificou-se que o acetato estava significativamente reduzido em bebês de 3 meses de idade que subsequentemente desenvolveram atopia e sibilância, e o acetato também foi identificado como o SCFA mais abundante nas fezes de bebês de 3 a 5 meses. Portanto, o acetato pode ser um metabólito bacteriano importante que regula a imunidade no início da vida, incluindo a regulação de IgE.
Mostramos anteriormente que existe uma janela crítica no início da vida onde a colonização microbiana é necessária para inibir a IgE induzida por higiene. Agora mostramos que as bactérias capazes de inibir a IgE são dominantes no início da vida, antes do desmame.
Al Nabhani et al. caracterizaram recentemente uma resposta imune vigorosa no desmame, denominada reação de desmame, pois está associada a mudanças na microbiota no desmame. A reação de desmame consiste em um aumento dependente do tempo do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interferon-γ (IFNγ), e é impulsionada por bactérias, SCFA e vitamina A. Assim, é tentador especular que uma forte reação de desmame induzida por bactérias como A. muciniphila YL44 e E. faecalis KB1 na presença de uma bactéria produtora de acetato (como B. coccoides YL58) durante essa janela crítica seja suficiente para suprimir a IgE. Esse estado de colonização poderia potencialmente favorecer eventos de troca de isotipo para IgA e IgG1, enquanto ainda induz a importante população de RORγt+Helios−pTregs. Embora a indução de RORγt+Helios− pTregs no desmame tenha sido crítica para a proteção contra inflamação mais tarde na vida, nossos dados indicam que a indução de RORγt+Helios− pTregs sozinha é insuficiente para inibir a IgE.
Em conjunto, mostramos que tanto a riqueza bacteriana quanto a presença de espécies bacterianas-chave no início da vida são importantes para regular a IgE sérica. Uma publicação recente demonstrou que os níveis aumentados de IgE em camundongos livres de germes são induzidos por antígenos alimentares. No contexto da reação de desmame e de nossas descobertas, isso sugere que sinais bacterianos apropriados no início da vida são necessários para prevenir a sensibilização a antígenos alimentares. Portanto, além das espécies de Clostridia previamente identificadas, nossos dados fornecem candidatos bacterianos adicionais e vias para estratégias de prevenção baseadas em microbiota na alergia alimentar.
É importante notar que nossas combinações bacterianas forneceram apenas supressão parcial dos níveis de IgE sérica, e outras características microbianas adicionais são necessárias para inibir completamente a IgE aos níveis encontrados em camundongos SPF. Portanto, será interessante investigar melhor o papel de outras características bacterianas e metabólitos na regulação da IgE, a fim de desenvolver terapêuticas baseadas em microbiota para prevenção de doenças alérgicas em humanos. Além disso, seria interessante rastrear espécies comensais que são dominantes no início da vida, induzem IgA e produzem acetato, para verificar se essas espécies sozinhas podem suprimir a hiper-IgE. Infelizmente, até agora não encontramos espécies com essas capacidades em nossa extensa triagem gnotobiótica in vivo. Alternativamente, uma vez que ferramentas genéticas apropriadas estejam disponíveis, A. muciniphila YL44 e E. faecalis KB1 podem ser geneticamente modificadas para produzir acetato e testadas isoladamente.
Declaração de Disponibilidade de Dados
As sequências de amplicon do 16S rRNA geradas para este estudo podem ser encontradas no repositório figshare em https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4763306.
Declaração de Ética
O estudo animal foi revisado e aprovado pela Comissão de Experimentação Animal do Escritório Veterinário do Cantão de Berna e pelo Comitê de Cuidados com Animais em Ciências da Saúde da Universidade de Calgary.
Contribuições dos Autores
MW contribuiu para o delineamento experimental, realizou e analisou todos os experimentos e contribuiu para a redação do manuscrito. KB contribuiu para a análise bioinformática. FT, KB, CT e FR contribuíram para experimentos avaliando a indução de pTreg. MK e VF realizaram e analisaram a FACS bacteriana. DB e IL estabeleceram o protocolo metabolômico direcionado para os AGCCs. MG e KM analisaram e interpretaram os dados e redigiram o manuscrito. KM concebeu e delineou o projeto.
Conflito de Interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Financiamento. Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça (KM SNF310030_134902) e pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde CIHR (201903PJT-420305 e 201709PJT-391060). O estudo também foi apoiado por infraestrutura financiada pela Fundação Canadense para Inovação (CFI).
Material Suplementar
O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2019.03107/full#supplementary-material
Referências
Febre do feno, higiene e tamanho da família
A teoria asséptica da doença alérgica: revisitando a hipótese da higiene
O efeito das infecções na suscetibilidade a doenças autoimunes e alérgicas
A hipótese da microflora das doenças alérgicas
Asma e o microbioma: definindo a janela crítica no início da vida
Desvendando a associação entre imunodeficiência parcial de células T e desregulação imunológica
Imunodeficiências primárias com produção aberrante de IgE
Produção natural de IgE na ausência de ajuda cognitiva de MHC Classe II
Desregulação da inflamação alérgica das vias aéreas na ausência de colonização microbiana
Sinais derivados de bactérias comensais regulam a hematopoiese de basófilos e a inflamação alérgica
A diversidade microbiana intestinal durante a colonização precoce molda os níveis de IgE a longo prazo
Desenvolvimento e manutenção de células T reguladoras intestinais
Um papel crítico para o controle mediado por células T reguladoras da inflamação na ausência de microbiota comensal
Células T reguladoras geradas extratimicamente controlam a inflamação TH2 mucosal
Células T reguladoras em doenças alérgicas
Respostas de células T reguladoras antígeno-específicas à microbiota intestinal
Metabólitos produzidos por bactérias comensais promovem a geração periférica de células T reguladoras
Butirato derivado de micróbios comensais induz a diferenciação de células T reguladoras colônicas
IMUNOLOGIA MUCOSA. A microbiota regula a imunidade do tipo 2 através de células T RORgammat(+)
IMUNOLOGIA MUCOSA. Simbiontes intestinais individuais induzem uma população distinta de células T RORgamma(+) reguladoras
Antígenos dietéticos limitam a imunidade mucosal ao induzir células T reguladoras no intestino delgado
Desenho guiado pelo genoma de uma microbiota murina definida que confere resistência à colonização contra Salmonella enterica sorovar Typhimurium
Imunidade inata e adaptativa cooperam de forma flexível para manter o mutualismo hospedeiro-microbiota
Colonização microbiana reversível de camundongos livres de germes revela a dinâmica das respostas imunes IgA
O QIIME permite a análise de dados de sequenciamento comunitário de alto rendimento
Busca e agrupamento ordens de magnitude mais rápidos que o BLAST
DADA2: Inferência de amostras de alta resolução a partir de dados de amplicon Illumina
Identificação e gerenciamento de preocupações com desempenho em farmacêuticos comunitários no Reino Unido
Remodelagem de dados com o pacote reshape
Amplificação do DNA ribossômico 16S para estudo filogenético
Quantificação simultânea de metabólitos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia usando cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria de massa e marcação com 13C in vitro
Um novo método LCMSMS para medição quantitativa de ácidos graxos de cadeia curta em fezes humanas derivatizadas com anilina marcada com (12)C e (13)C
Mecanismo de análise metabolômica e visualização para dados de LC-MS
Processamento de dados LC-MS com MAVEN: um mecanismo de análise metabolômica e visualização
Filogenia da microbiota murina definida: flora Schaedler alterada
Colonização bacteriana intestinal induz respostas mutualísticas de células T reguladoras
Indução de células T reguladoras do cólon por espécies de Clostridium indígenas
Indução de Treg por uma mistura racionalmente selecionada de cepas de Clostridia da microbiota humana
A expressão de Helios, um membro da família de fatores de transcrição Ikaros, diferencia células T reguladoras Foxp3+ derivadas do timo das induzidas perifericamente
Subpopulações de Treg Helios(+) e Helios(-) são fenotípica e funcionalmente distintas e expressam repertórios de TCR dissimilares
A Neuropilina 1 é expressa em células T reguladoras naturais derivadas do timo, mas não em células T reg Foxp3+ induzidas geradas na mucosa
A Neuropilina-1 distingue células T reguladoras naturais e indutíveis entre subconjuntos de células T reguladoras in vivo
Diferenças no nível de expressão de helios e neuropilina-1 não distinguem células T reguladoras CD4+Foxp3+ derivadas do timo das induzidas extratimicamente
A camada externa de muco abriga um nicho microbiano intestinal distinto
Sequências completas do genoma de 12 espécies de microbiota murina estável definida moderadamente diversa 2
Sequências de genoma completo de alta qualidade da comunidade bacteriana oligo-mouse-microbiota
Akkermansia muciniphila induz respostas imunes adaptativas intestinais durante a homeostase
Bactérias filamentosas segmentadas são estímulos potentes de um estado fisiologicamente normal do sistema imune mucosal do intestino murino
Sinalização do receptor de interleucina 10: regulador mestre da homeostase mucosal intestinal em camundongos e humanos
Modulação da resposta imune mucosal, tolerância e proliferação em camundongos colonizados pelo degradador de mucina Akkermansia muciniphila
Enterococcus faecalis coloniza prontamente todo o trato gastrointestinal e forma biofilmes em um modelo de camundongo livre de germes
Proteínas semelhantes a pili de Akkermansia muciniphila modulam as respostas imunes do hospedeiro e a função da barreira intestinal
Uma proteína de membrana purificada de Akkermansia muciniphila ou a bactéria pasteurizada melhora o metabolismo em camundongos obesos e diabéticos
A microbiota intestinal neonatal está associada à atopia multissensibilizada na infância e à diferenciação de células T
Sororreatividade humana a antígenos da microbiota intestinal
Respostas humorais inatas e adaptativas revestem bactérias comensais distintas com imunoglobulina A
GPR41/FFAR3 e GPR43/FFAR2 como cossensores para ácidos graxos de cadeia curta em células enteroendócrinas vs FFAR3 em neurônios entéricos e FFAR2 em leucócitos entéricos
Alterações microbianas e metabólicas no início da infância afetam o risco de asma infantil
Variações de ácidos graxos de cadeia curta fecais de acordo com o status de amamentação em lactentes aos 4 meses: diferenças nas concentrações relativas versus absolutas
Uma reação de desmame à microbiota é necessária para a resistência a imunopatologias no adulto
Antígenos alimentares impulsionam a elevação espontânea de IgE na ausência de microbiota comensal
Bactérias comensais protegem contra a sensibilização a alérgenos alimentares