pmid: "34777363"
title: "A Expressão de GPR em Biópsias Intestinais de Pacientes de TCT é Regulada Positivamente na GvHD e é Suprimida por Antibióticos de Amplo Espectro."
authors: "Ghimire S, Weber D, Hippe K, Meedt E, Hoepting M, Kattner AS, Hiergeist A, Gessner A, Matos C, Ghimire S, Wolff D, Edinger M, Hoffmann P, Poeck H, Herr W, Holler E"
journal: "Frontiers in immunology"
pubdate: "2021"
doi: "10.3389/fimmu.2021.753287"
source: "PMC Full Text"

A Expressão de GPR em Biópsias Intestinais de Pacientes de TCT é Regulada Positivamente na GvHD e é Suprimida por Antibióticos de Amplo Espectro.

Autores

Ghimire S, Weber D, Hippe K, Meedt E, Hoepting M, Kattner AS, Hiergeist A, Gessner A, Matos C, Ghimire S, Wolff D, Edinger M, Hoffmann P, Poeck H, Herr W, Holler E

Periodico

Frontiers in immunology (2021)

Conteudo

Expressão de GPR em Biópsias Intestinais de Pacientes com TCT é Regulada Positivamente na DECH e Suprimida por Antibióticos de Amplo Espectro
A microbiota pode exercer efeitos imunomoduladores por meio de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) em modelos experimentais de doença do enxerto contra hospedeiro (DECH) após transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas (TCT alogênico). Portanto, nosso objetivo foi analisar a expressão dos receptores acoplados à proteína G sensíveis a AGCC, GPR109A e GPR43, por PCR quantitativa em 338 biópsias gastrointestinais (GI) obtidas de 199 pacientes adultos submetidos a TCT alogênico e avaliar a interação de GPR com a expressão de FOXP3 e infiltrados de células T reguladoras. A expressão de GPR foi fortemente regulada positivamente em pacientes com DECH estágio II-IV (p=0,000 para GPR109A, p=0,01 para GPR43) e no início da DECH (p=0,000 para GPR109A, p=0,006 para GPR43) e correlacionou-se fortemente com a expressão de FOXP3 e NLRP3. O uso de antibióticos de amplo espectro (Abx) suprimiu drasticamente a expressão de GPR, bem como a expressão de FOXP3 nas biópsias intestinais dos pacientes (p=0,000 para GPRs, mRNA de FOXP3 e infiltrados celulares FOXP3+). A análise de regressão logística revelou o tratamento com Abx como um fator independente associado à perda de GPR e FOXP3. A regulação positiva dos GPRs foi evidente apenas na ausência de Abx (p=0,001 para GPR109A, p=0,014 para GPR43) no início da DECH. Assim, a expressão de GPR parece ser regulada positivamente na presença de bactérias comensais e associa-se à infiltração de T regs FOXP3+, sugerindo uma resposta imunomoduladora protetora e regenerativa. No entanto, o Abx, que demonstrou induzir disbiose, interfere nessa resposta protetora.
O receptor acoplado à proteína G (GPR109A, GPR43 e GPR41) é predominantemente expresso em células epiteliais e imunes. O GPR é ativado por seu ligante, os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC). Na ausência de antibióticos de amplo espectro (Abx), comensais benéficos produzem AGCC que ativam a via do GPR. Os AGCC envolvem a via GPR-NLRP3 para a manutenção da barreira epitelial. Os AGCC também acionam o GPR em células imunes para induzir células T reguladoras. Pacientes que não recebem Abx mostram uma regulação positiva da expressão de GPR na presença de DECH aguda, sugerindo um mecanismo contrarregulador. O Abx suprime os comensais, levando à redução de AGCC e, consequentemente, menos GPR. O eixo GPR-NLRP3 e o eixo GPR-Tregs são fortemente abrogados pelo Abx. O Abx também interfere na regulação positiva do GPR durante a DECH aguda.
Doença do enxerto contra hospedeiro aguda (DECHa) é a principal causa de mortalidade relacionada ao transplante (TRM) e morbidade após transplante de células-tronco alogênico (SCT). As opções atuais de tratamento para essa complicação são ruins se o tratamento inicial com esteroides falhou. Estudos marcantes no início dos anos 70 por van Bekkum já apontavam para um papel da microflora intestinal na DECH gastrointestinal (GI) e sugeriram proteção de camundongos livres de germes contra DECH. Estudos pré-clínicos e clínicos introduziram, portanto, o uso profilático de descontaminação como uma abordagem para reduzir a DECH e, juntamente com o conceito de prevenção de infecções neutropênicas por gram-negativos, a profilaxia antibiótica tornou-se padrão de cuidado. Com a introdução de tecnologias de sequenciamento de última geração, incluindo 16s rRNA, tornou-se evidente que a microbiota intestinal é um importante modulador da DECHa. Desde 2012, vários estudos utilizando essa técnica em contextos experimentais e clínicos relataram uma forte perda de bactérias comensais (disbiose), mas não descontaminação completa, e uma associação da disbiose com a ocorrência de DECH GI, bem como várias complicações infecciosas graves após SCT alogênico. Antibióticos profiláticos e terapêuticos foram até identificados como o principal impulsionador da disbiose, e esses achados questionaram cada vez mais, pelo menos, os conceitos profiláticos. Relatos recentes também sugeriram que até mesmo a reconstituição de bactérias comensais por transferência de microbiota fecal (FMT) contribui favoravelmente para o tratamento de pacientes (pts) com DECHa refratária a esteroides.

Os mecanismos pelos quais a microbiota intestinal comensal atenua a inflamação intestinal em geral e no contexto da DECHa ainda são mal compreendidos. Metabólitos microbianos produzidos por bactérias comensais após a digestão de fibras alimentares, triptofano e outras fontes foram identificados como moléculas protetoras importantes que atuam como mediadores da interação patógeno-hospedeiro e exercem funções protetoras. Nesse contexto, os ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), como butirato e propionato, não são apenas uma importante fonte de energia para os colonócitos, mas também estabilizam o epitélio e atenuam as reações imunológicas por múltiplos mecanismos, incluindo regulação da inflamação dependente do inflamassoma Nlrp3 e indução de células T reguladoras (T regs). Indóis derivados do triptofano alimentar estabilizam o epitélio através da indução de interleucina 22 em células linfoides inatas e modulam a inflamação induzindo citocinas anti-inflamatórias como a interleucina 10. Forte proteção contra DECHa pelo metabólito do triptofano indol-3-carboxaldeído (ICA) foi observada no estudo de Swimm, onde a administração por gavagem de ICA reduziu a mortalidade por DECHa em grande parte de maneira dependente de interferon tipo I (IFN-I), mantendo a atividade enxerto versus leucemia.
Como todos esses mecanismos foram relatados como modificadores da DECH, não é surpreendente que relatos experimentais tenham encontrado proteção significativa contra a DECH por esses metabólitos. Mathewson e colegas aplicaram gavagem de butirato e uma mistura de clostrídios comensais conhecidos por serem altos produtores de SCFA em um modelo murino de DECH e relataram forte proteção. Recentemente, o mesmo grupo abordou o papel dos SCFA utilizando camundongos knockout para um dos receptores de SCFA, receptor acoplado à proteína G (GPR) 43, e relatou que o knockout de GPR43 em células não hematopoéticas levou à mortalidade acelerada e aumentada relacionada à DECH.
Em humanos, um papel comparável dos SCFA é provável e sugerido por uma análise recente de Romick-Rosendale et al. que relataram redução de SCFA nas fezes após exposição a Abx suprimindo comensais em crianças recebendo TCTH, mas até o momento nenhum dado foi relatado sobre a expressão de GPR na DECH em adultos humanos. Portanto, realizamos uma análise da expressão dos principais receptores de SCFA, GPR43 e GPR109A, por PCR quantitativo em biópsias intestinais obtidas de pts recebendo TCT alogênico em nossa unidade. Observamos regulação positiva de GPR na DECHa que foi fortemente suprimida por antibióticos de amplo espectro.
Material e Métodos
Características dos Pacientes
338 biópsias seriadas foram obtidas e analisadas de um total de 199 pacientes adultos (pts) recebendo TCT alogênico entre novembro de 2008 e novembro de 2015. As características dos pacientes estão resumidas na Tabela Suplementar 1. O status da doença foi definido de acordo com o escore EBMT. Todos os pts deram consentimento informado, os estudos de biópsia e as análises científicas foram aprovados pelo comitê de ética local (aprovação nº 02/220 e 09/059). Todos os estudos foram realizados de acordo com as regulamentações de Helsinque. Biópsias seriadas foram obtidas i) no decorrer de um estudo de triagem em pts assintomáticos, clinicamente livres de DECHa, ou ii) devido a sintomas clínicos indicativos de início de novo ou iii) persistência ou recorrência de DECHa GI. As biópsias foram obtidas por endoscopia GI superior ou inferior.
PCR Quantitativo em Tempo Real (qPCR)
O qPCR em biópsias intestinais foi realizado de acordo com a disponibilidade de RNA. 338 biópsias seriadas para GPR109A, 263 biópsias para GPR43, 103 biópsias para NLRP3, 281 biópsias para mRNA de FOXP3 e 240 biópsias para imuno-histoquímica de FOXP3 estavam disponíveis. As biópsias intestinais foram imediatamente transferidas para 500 µl de RNA later (QIAGEN) e armazenadas a -80°C até a extração de RNA. O RNA foi extraído usando o RNeasy Mini Kit (QIAGEN) conforme recomendação do fabricante. A concentração e pureza do RNA foram monitoradas por NanoDrop e Bioanalyzer, respectivamente. 1 µg de RNA foi transcrito reversamente para cDNA usando transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney (Promega) seguindo as instruções do fabricante. O qPCR foi realizado em um Mastercycler Ep Realplex (Eppendorf) usando o QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). O RNA ribossômico 18S foi usado como gene de referência. O gene de interesse foi normalizado em relação ao gene de referência.
As sequências de primers específicos para genes são as seguintes: GPR109A, forward: 5’ GCG-TTG-GGA-CTG-GAA-GTT-TG-3’, reverse: 5’- GCG-GTT-CAT-AGC-CAA-CAT-GA-3’; GPR43, forward: 5’- GTA-GCT-AAC-ACA-AGT-CCA-GTC-CT -3’, reverse: 5- CTA-GGT-GTT-GCT-TTG-AAG-CTT-GT -3’; FOXP3, forward: 5’-GAA-ACA-GCA-CAT-TCC-CAG-AGT-TC -3’; reverse: 5’- ATG-GCC-CAG-CGG-ATG-AG-3’; NLRP3, forward: 5’-GGA-CTG-AAG-CAC-CTG-TTG-TGC-A-3’, reverse: 5’- TCC-TGA-GTC-TCC-CAA-GGC-ATT-C-3’; 18S, forward: 5’-ACC-GAT-TGG-ATG-GTT-TAG-TGA-G-3’, reverse: 5’-CCT-ACG-GAA-ACC-TTG-TTA-CGA-C-3’.
Análise Imunoistoquímica
O mesmo patologista, cego para os dados clínicos, avaliou biópsias seriadas. A DECH-GI foi classificada de acordo com o sistema de classificação de Lerner. O número de células positivas para FOXP3 foi determinado por imunoistoquímica, analisado com um microscópio Zeiss Axioskop 40. Lâminas de 2-3 µm de espessura, cortadas das biópsias fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE), foram desparafinizadas e coradas automaticamente (Ventana Benchmark Ultra). Após pré-tratamento com tampão CC1, a coloração imunoistoquímica foi realizada com um anticorpo monoclonal de camundongo (1:120, eBioscience 14-4777, clone 236A/E7) e o Kit de Detecção OptiView DAB IHC (Ventana). O número médio de células estromais positivas para FOXP3 foi determinado microscopicamente por campo de alta potência (HPF), contando de 3 a 12 HPFs que exibiam o maior dano histológico de DECHa.
Imunofluorescência das Biópsias
Biópsias FFPE foram cortadas com 2-3 µm de espessura e incubadas a 80°C por 30 minutos, seguidas de imersão em Xilol duas vezes por 10 minutos cada, e então em uma série decrescente de álcool por 5 minutos cada. As secções foram bloqueadas com 20% de Albumina Sérica Bovina (BSA) por 20 minutos à temperatura ambiente (TA). A imunofluorescência simples foi realizada para GPR43 (Biozol, LSA1578-50, policlonal de coelho). A imunofluorescência dupla foi realizada para GPR43 (Biozol, LSA6599, policlonal de coelho) e CD68 (Dako, PG-M1, monoclonal de camundongo). Os anticorpos primários foram diluídos em 1% de BSA e aplicados na secção da biópsia na diluição de 1:50 por 1 hora à TA, seguidos pelos anticorpos secundários Alexa Flour (AF) 488 e Alexa Flour 594 (Invitrogen) por 30 minutos (diluição 1:100) no escuro à TA. CD68 foi conjugado com AF488 e GPR43 foi conjugado com AF594. As secções foram contracoradas com DAPI e seladas com meio de montagem. As secções das biópsias foram lavadas três vezes com PBS após cada etapa. Células positivas para GPR43 foram observadas e imagens foram capturadas em aumento de 200X usando microscópio de epifluorescência Zeiss.
Cultura de Células Dendríticas (DCs) e Determinação de Citocinas
Monócitos foram isolados de PBMC de doadores saudáveis após leucaférese seguida de centrifugação em gradiente de densidade sobre Ficoll/Hypaque conforme descrito anteriormente. Todos os voluntários saudáveis consentiram com o estudo. Monócitos recém-isolados foram diferenciados em DCs conforme descrito anteriormente. No dia 7, 100 ng/mL de LPS (Enzo) foram adicionados para induzir a maturação de DCs imaturas (iDCs) na ausência ou presença de 5 mM de acetato de sódio (NaA), 2,5 mM de propionato de sódio (NaP) e 0,5 mM de butirato de sódio (NaB) por mais 48 horas. NaA, NaP e NaB foram adquiridos da Sigma-Aldrich. No dia 9, DCs maduras (mDCs) foram coletadas para extração de RNA, síntese de cDNA e qPCR conforme descrito acima. Sobrenadantes foram coletados para determinação de citocinas e armazenados a -20°C até análise posterior. As citocinas IL-12 e IL-10 foram analisadas utilizando ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) de acordo com a recomendação do fabricante (R&D).

Cultura de Células Caco-2

A linhagem celular intestinal humana Caco-2 foi adquirida da CLS Germany. As células foram mantidas em meio DMEM com baixa glicose (Sigma) suplementado com 10% de FCS (Sigma), 1% de NEAA, 1% de NaP e 0,5% de P/S (Gibco) em um frasco T75 revestido com colágeno (5 µg/cm²). As células foram semeadas a 9,3x10³ células/cm² e subcultivadas após 60-80% de confluência por no máximo 10 passagens, trocando o meio a cada dois dias. Para diferenciação, a monocamada de células Caco-2 foi cultivada a uma densidade de 3x10⁵ células/cm² em membrana de poliéster revestida com colágeno de 0,4 µm em transwell de 12 poços (área de 1,12 cm²) por 3 semanas. A monocamada foi monitorada medindo a resistência elétrica transepiteal (TEER) com um voltímetro/ohmímetro Millicell ERS-2 (EMD Millipore). O meio foi trocado a cada dois ou três dias. No dia 21, as células foram estimuladas com 50 ng/ml de IL1β e 100 ng/ml de TNF (PromoCell) com ou sem butirato de sódio (Sigma) por 24 horas. A integridade da barreira foi monitorada pela medição de TEER. Os sobrenadantes celulares foram analisados para ELISA de IL-6 e IL-8 conforme recomendação do fabricante (R&D). A coloração imunofluorescente das células Caco-2 foi realizada conforme descrito anteriormente.

Análise Estatística

A análise dos dados foi realizada no SPSS v26. O teste de normalidade foi realizado usando o teste de Shapiro-Wilk. Dados com distribuição normal foram analisados com teste t ou ANOVA de uma via. A análise de correlação foi realizada com o teste de Pearson. Para dados não normais, foram realizados testes de Mann-Whitney ou Kruskal Wallis e a correlação de Spearman foi escolhida. Para análise multivariada, os resultados foram dicotomizados com base na mediana. O estágio de Lerner de aGvHD e o uso de Abx antes da biópsia foram analisados usando regressão logística binária.

Resultados
A Expressão de GPR Correlaciona-se com a Gravidade e o Início da GI-aGvHD
Quando atribuímos biópsias seriadas selecionadas de forma imparcial com base no estágio histológico de Lerner determinado para aGvHD 0-1 ou aGvHD 2-4, descobrimos que pacientes (pts) com estágios de Lerner mais altos apresentaram aumento da expressão de GPR (Figuras 1A, B; p=0,000015 para GPR109A, p=0,008 para GPR43). De acordo com essa observação, pacientes com aGvHD sintomática clínica apresentaram maior expressão de GPR (p=0,0001 para GPR109A, p=0,006 para GPR43) em comparação com pacientes de triagem livres de aGvHD ou pacientes com aGvHD em curso (Figuras 1C, D). Além disso, o fenômeno de regulação positiva de GPR foi observado tanto no trato gastrointestinal (GI) superior quanto inferior (Tabela 1). Em resumo, a expressão de GPR foi regulada positivamente tanto na aGvHD histológica quanto clínica, independentemente da seção anatômica da biópsia.
Expressão de mRNA de GPR nas biópsias seriadas do trato gastrointestinal durante o curso da GvHD. (A) Expressão de GPR109A e (B) GPR43 em relação ao Lerner GI-GvHD. (C) Expressão de GPR109A e (D) GPR43 em biópsias de triagem e no início clínico da GI-GvHD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, teste U de Mann-Whitney.
Distribuição de GPR109A e GPR43 no trato gastrointestinal (GI) superior e inferior.
A. GvHD Histológica Genes Estágio de Lerner Nº de amostras Posto médio Valor de p Trato gastrointestinal superior GPR109A 0-1 82 47,2 0,003 2-4 20 69,15 GPR43 0-1 70 41,06 0,058 2-4 16 54,19 Trato gastrointestinal inferior GPR109A 0-1 179 110,56 0,002 2-4 57 143,43 GPR43 0-1 133 83,96 0,023 2-4 44 104,43 B. GvHD Clínica Genes Característica clínica Nº de amostras Posto médio Valor de p Trato gastrointestinal superior GPR109A Triagem 51 31,69 0,005 Início 20 47,00 GPR43 Triagem 43 27,12 0,017 Início 17 39,06 Trato gastrointestinal inferior GPR109A Triagem 103 79,37 0,007 Início 72 100,34 GPR43 Triagem 76 58,61 0,030 Início 52 73,12

(A) Distribuição de GPR no trato GI de acordo com a classificação de Lerner da GvHD aguda (GvHD 0-1 vs GvHD 2-4). (B) Distribuição de GPR no trato GI de acordo com as características clínicas da GvHD aguda (triagem vs início).
Antibióticos de Amplo Espectro (Abx) Suprimem a Expressão de GPR e FOXP3
O uso de Abx de amplo espectro resulta em rápida perda da diversidade da microbiota. Portanto, consideramos a aplicação de Abx (principalmente piperacilina/tazobactam ou carbapenêmicos) dentro de 7 dias antes da obtenção de biópsias como um indicador de dano à microbiota. A expressão de GPR no grupo Abx foi significativamente reduzida em comparação ao grupo sem Abx ( Figuras 2A, B , p=0,0004 para GPR109A e p=0,0001 para GPR43), sugerindo que bactérias comensais e seus metabólitos são necessários para a indução ideal de GPR. Abx suprimiu não apenas GPR, mas também o mRNA de FOXP3, bem como os infiltrados de células reguladoras FOXP3+ (Tregs) ( Figuras 2C, D , p<0,0001 para ambos mRNA e proteína FOXP3). Após esses resultados, classificamos subsequentemente os pacientes com base na exposição cumulativa e de longo prazo a antibióticos. O primeiro grupo não recebeu Abx precoce (antes ou no dia 0 do transplante) nem no momento da biópsia. O segundo grupo recebeu Abx precoce, mas não no momento da biópsia. O terceiro grupo teve Abx no momento da biópsia, mas sem exposição precoce. O quarto grupo teve tanto exposição precoce a Abx quanto no momento da biópsia. A maior expressão de GPR foi observada no grupo de pacientes que nunca teve exposição a Ab ( Figuras Suplementares 1A, B , p=0,002 para GPR109A, p=0,016 para GPR43, teste de Kruskal-Wallis). Um quadro semelhante foi obtido para mRNA de FOXP3 e infiltrados de Tregs ( Figuras Suplementares 1C, D , p=0,007 para infiltrados celulares FOXP3+, p=0,0004 para mRNA de FOXP3, teste de Kruskal-Wallis). Perda significativa de GPR foi observada no grupo de pacientes com Abx precoce e Abx na biópsia. Isso pode resultar da rápida perda de comensais previamente relatada após o tratamento com Abx em pacientes e é refletido pela redução da expressão de GPR nas biópsias intestinais. Quando agrupamos os pacientes de acordo com o status clínico de DECHa-GI no momento das biópsias (biópsias de triagem livres de DECHa-GI e biópsias de início clínico de DECHa) e os reagrupamos novamente de acordo com o uso de Abx, nossos achados foram confirmados nas biópsias seriadas. Pacientes que não receberam Abx mostraram aumentos significativos de GPR no início da DECHa (p=0,001 para GPR109A, p=0,014 para GPR43), enquanto pacientes com Abx não mostraram regulação positiva de GPR no início da DECHa ( Figuras 3A, B ). Além disso, nas biópsias de triagem, a expressão de GPR109A foi significativamente regulada negativamente no grupo Abx (p=0,028), enquanto GPR43 mostrou apenas uma tendência de regulação negativa. No início da DECHa, ambos os GPR mostraram regulação negativa significativa no grupo Abx (p=0,004 para GPR109A, p=0,021 para GPR43), sugerindo um efeito prejudicial dos Abx no curso da regulação positiva protetora de GPR. Quando realizamos regressão logística binária comparando o estágio de Lerner da DECHa e o uso de Abx, identificamos o uso de antibióticos, mas não a DECHa, como um fator de risco independente para a perda de GPR, bem como de FOXP3 ( Tabela Suplementar 2 ).
Efeito de antibióticos de amplo espectro (Abx) na expressão de GPR e FOXP3 em biópsias seriadas do trato gastrointestinal. (A) RNAm de GPR109A (B) RNAm de GPR43 (C) infiltrados celulares FOXP3+ e (D) expressão de RNAm de FOXP3 em biópsias intestinais de pacientes sem ou com exposição a antibióticos de amplo espectro no momento da coleta da biópsia. HPF - campo de alta potência. ***p < 0.001, ****p < 0.0001, teste U de Mann-Whitney.
Efeito de Abx no início da DECH. (A) Expressão de GPR109A no início da DECH sem ou com Abx. (B) Expressão de GPR43 no início da DECH sem ou com Abx. *p < 0.05, **p < 0.01, teste U de Mann-Whitney. ns, não significativo.
Associação de GPR com Expressão de FOXP3 e NLRP3
Como os AGCC foram relatados como envolvidos na imunorregulação, realizamos PCR simultâneo para expressão de FOXP3 nas biópsias intestinais seriadas. Uma correlação altamente significativa entre GPR e FOXP3 foi observada para ambos os GPR ( Figuras 4A, B , p<0.0001). Dicotomizamos as expressões de GPR em categorias "alta" e "baixa" com base em sua expressão mediana (valor mediano: 2,57xE-002 para GPR109A e 1,5xE-003 para GPR43). A expressão mais alta de GPR foi associada à expressão mais alta de FOXP3 e vice-versa (p=0.000 para ambos os GPR, dados não mostrados). Para confirmar essa associação, realizamos imuno-histoquímica para infiltrados celulares FOXP3+. Descobrimos que a infiltração de Tregs foi significativamente maior na categoria "alta" de GPR (p=0.001 para GPR109A, p=0.003 para GPR43) em comparação com a categoria "baixa" de GPR ( Figuras 4C, D ). Além disso, a regressão logística binária confirmou que tanto GPR109A quanto GPR43 influenciam independentemente a expressão de FOXP3 (GPR109A: odds ratio, 0,74 [IC 95%, 1,24-3,55]; p=0.005, GPR43: odds ratio, 0,61 [IC 95%, 1,08-3,17]; p=0.024). Também observamos uma forte associação dos GPRs com o receptor de inflamassoma NLRP3 em biópsias seriadas ( Figura Suplementar 2A, B ). Biópsias de pacientes com alta expressão de GPR43 também apresentaram expressão significativamente maior de NLRP3 (p=0.003). GPR109A, embora não significativo, mostrou uma forte tendência de regulação positiva com maior expressão de NLRP3 (p=0.087). O modelo de regressão revelou que GPR43, mas não GPR109A, influencia independentemente a expressão de NLRP3 (GPR43: odds ratio, 1,03 [IC 95%, 1,1-6,7]; p=0.02, GPR109A: odds ratio, 0,54 [IC 95%, 0,71-4,1]; p=0.2). A forte associação GPR-NLRP3 foi observada apenas em pacientes que não recebiam Abx. Pacientes em uso de Abx não apresentaram qualquer associação GPR-NLRP3 ( Figura Suplementar 2C, D ).
Associação de GPR com expressão de FOXP3. Correlação de (A) GPR109A e (B) GPR43 com RNAm de FOXP3. Associação de (C) GPR109A e (D) GPR43 com infiltrados celulares FOXP3. **p < 0.01, teste U de Mann-Whitney; valor de r, correlação de Spearman.
Para identificar a fonte celular do GPR, realizamos em seguida imunofluorescência simples e dupla de GPR43 e CD68 em biópsias de cólon sigmoide de pacientes após transplante. No compartimento não hematopoiético, as células epiteliais pareceram ser a principal fonte de expressão de GPR (Figura 5A) marcadas pelo anticorpo GPR43 (domínio citoplasmático, LS-A1578). O lúmen intestinal contém a maior concentração de AGCC e o epitélio intestinal pode expressar GPR em um ciclo de feedback positivo. Na imunofluorescência dupla de CD68 e GPR43 (domínio extracelular, LS-A6599), dois sinais colocalizaram, sugerindo que os macrófagos são uma das fontes celulares de GPR no compartimento de células imunes (Figura 5B). Esses macrófagos positivos para GPR43 pareciam se acumular próximos ao epitélio. O envolvimento de células imunes na expressão de GPR também é sugerido pela expressão de GPR dependente da localização. Quando comparamos a expressão de GPR em biópsias seriadas obtidas de diferentes seções anatômicas do trato gastrointestinal, uma expressão de GPR significativamente maior (p=0,002 para GPR109A, p=0,001 para GPR43, teste de Kruskal-Wallis) foi observada em biópsias ileais (Figuras Suplementares 3A, B). Isso pode refletir uma maior presença de células imunes no íleo.
Imunofluorescência de GPR43 de uma biópsia representativa de paciente. Tempo entre transplante e biópsia: 3,5 anos, sem DECH no momento da biópsia. (A) Coloração de GPR43 no cólon sigmoide de um paciente. GPR43 é marcado com AlexaFluor (AF) 594 (vermelho). (B) Coloração conjunta de GPR43 e CD68 no cólon sigmoide de um paciente. GPR43 é marcado com AF594 (vermelho) e CD68 é marcado com AF488 (verde). A seta branca indica sinais colocalizados. O núcleo é contracorado com DAPI (azul). Barra de escala: 50 µm.
Efeito dos AGCC em Células Imunes e Células Epiteliais In Vitro
AGCC Regulam Positivamente a Expressão de GPR e Alteram a Produção de Citocinas em mDCs
Em seguida, avaliamos o efeito dos AGCC em células dendríticas derivadas de monócitos (mDCs) estimuladas por lipopolissacarídeo (LPS) de três doadores saudáveis. 5 mM de acetato ou 2,5 mM de propionato ou 0,5 mM de butirato foram adicionados juntamente com LPS. A concentração fornecida de AGCC não induziu morte celular das mDCs em comparação com as mDCs controle, conforme observado pela coloração com Anexina/7-AAD (dados não mostrados). Os AGCC, especialmente o butirato, induziram uma expressão significativamente maior de GPR109A e GPR43 em mDCs (Figuras 6A, B). No nível funcional, os AGCC foram capazes de suprimir a ativação induzida por LPS das mDCs, indicada por uma redução da citocina pró-inflamatória IL-12 (Figura 6C) e uma regulação positiva da citocina anti-inflamatória IL-10 (Figura 6D).
Efeito do SCFA em DCs derivadas de monócitos humanos geradas in vitro. As DCs foram cultivadas por 7 dias e estimuladas com 100 ng/ml de LPS por 48 horas. (A, B) Expressão de GPR109A e GPR43 em DCs maduras na presença de SCFA. (C) Liberação de citocina IL-12 por DCs na presença de SCFA. (D) Liberação de citocina IL-10 por DCs na presença de SCFA. n = 3 doadores saudáveis. As barras representam média +/- e.p.m. *p < 0,05, **p < 0,01, teste U de Mann-Whitney para A, B e D (distribuição não normal), ANOVA de uma via com correção de Bonferroni para C (distribuição normal).

Butirato Suprime Citocinas Pró-Inflamatórias e Induz Expressão de GPR43 em Células Caco-2

Após o efeito imunomodulador do butirato nas células dendríticas, buscamos investigar o efeito do butirato no modelo de linhagem celular epitelial Caco-2. Em quatro experimentos individuais, células Caco-2 totalmente diferenciadas em um sistema transwell foram estimuladas com 50 ng/ml de IL-1β e 100 ng/ml de TNF. 5 mM de butirato foi adicionado às células estimuladas por 24 horas. A toxicidade do butirato foi excluída pelo ensaio de MTT (dados não mostrados). Na ausência de estimulação, as células Caco-2 (controle) não produziram citocinas. A estimulação com IL-1β foi um pré-requisito para a produção de citocinas pelas células Caco-2. A produção das citocinas pró-inflamatórias IL-8 e IL-6 pelas células Caco-2 foi significativamente suprimida tanto no lado apical quanto no basolateral do sistema transwell pela adição de butirato (estim+butirato) quando comparado à condição estimulada (estim) (Figuras 7A–D). A estimulação também comprometeu a integridade da barreira, conforme demonstrado pela redução significativa da resistência elétrica transepitelial (TEER) em comparação ao controle (Figura 7E). A adição de butirato mostrou efeito de resgate ao aumentar significativamente a TEER (Figura 7E). Quando marcamos células Caco-2 com anticorpo GPR43, observamos um sinal de GPR43 mais forte em células epiteliais tratadas com butirato em comparação com o controle não tratado ou o controle estimulado (Figura 7F).

Efeito do butirato em células epiteliais humanas. Células Caco-2 foram cultivadas em transwell revestido com colágeno por 21 dias. As células foram tratadas com IL-1β e TNF por 24 horas sem ou com butirato. (A, B) Liberação de citocina IL-8 no lado apical e basolateral das células Caco-2. (C, D) Liberação de citocina IL-6 no lado apical e basolateral das células Caco-2. (E) Alterações na resistência elétrica transepitelial (TEER) com estimulação (estim) isolada ou com butirato. (F) Marcação de GPR43 em células Caco-2 em condição controle não tratada, controle estimulado e tratada com butirato. GPR43 é marcado com AF 594. O núcleo é contracorado com DAPI. Barra de escala: 10 µm. n = 4 experimentos independentes. As barras representam média +/- e.p.m. *p < 0,05, **p < 0,01, teste U de Mann-Whitney.

Discussão
O intestino humano abriga uma infinidade de microrganismos que são cruciais para o desenvolvimento e funções fisiológicas normais. Um desequilíbrio ou má adaptação desses microrganismos essenciais, também denominado disbiose, tem sido associado a numerosos distúrbios intestinais, incluindo a DECH. Vários estudos confirmaram uma forte associação entre danos à microbiota e a ocorrência de DECH e complicações relacionadas ao transplante. Os SCFAs derivados da microbiota, como acetato, propionato e butirato, foram descritos em estudos anteriores como os principais moduladores da inflamação e da DECH, promovendo células mieloides anti-inflamatórias e mantendo a integridade da barreira epitelial. Esses estudos também revelaram o envolvimento dos receptores acoplados à proteína G GPR109A, GPR43 e GPR41 na mitigação da DECH. No entanto, esses estudos foram realizados em camundongos e nenhum dado foi relatado anteriormente sobre o papel da expressão de GPR na DECH humana adulta.

Nossos dados clínicos mostram um aumento da expressão de GPR43 e GPR109A em pacientes (pts) sofrendo de DECH. Especialmente durante o início da DECH ou em DECH gastrointestinal de maior grau (Lerner II-IV), a expressão de GPR foi significativamente aumentada. Isso pode refletir um mecanismo contrarregulador da sinalização protetora de GPR que é reativamente induzido para suprimir a lesão mediada por células T. Existem apenas alguns estudos discutindo mecanismos contrarreguladores no intestino de pacientes com DECH. Landfried et al. mostraram um aumento de IDO no trato gastrointestinal inferior de pacientes com DECH, enquanto Lord et al. mostraram um aumento de células Treg FOXP3 em biópsias gástricas de pacientes com DECH. Takatsuka et al. mostraram um aumento significativo de IL-10 plasmática em pacientes com DECH. Especulamos que o aumento real de parâmetros reguladores como IDO, FOXP3, IL-10 e GPR na DECH é uma contra-reação fisiológica para suprimir as várias reações inflamatórias que ocorrem no sistema dos pacientes. Além disso, sabe-se que estímulos inflamatórios como TNF, IL-1, LPS ou GM-CSF podem induzir a expressão de GPR em monócitos e macrófagos. Portanto, é provável que a indução de GPR seja, em parte, o resultado da inflamação elevada na DECH.
As bactérias comensais são os produtores mais proeminentes de SCFA e têm sido relatadas como suprimidas após o tratamento com antibióticos. Recentemente, demonstramos que Abx suprime as bactérias butirogênicas responsáveis pela produção de SCFA. Consistentemente, descobrimos que (i) SCFAs induzem a expressão de GPR em linhagens de células do cólon humano e mDCs e (ii) Abx suprimiu significativamente a expressão de GPR nas biópsias intestinais de pacientes submetidos a TCT-ALO. Utilizando um modelo de regressão, Abx suprimiu a expressão de GPR independentemente de DECH. Aqui, propomos que o efeito prejudicial dos Abx não se limita apenas à perda de comensais após a redução de SCFA, mas também à perda da expressão de GPR. A exposição cumulativa e de longo prazo a antibióticos revelou que a expressão de GPR foi maior em pacientes que não receberam Abx antes/na transplantação ou antes da obtenção da biópsia. Ao contrário, a expressão de GPR mais baixa foi observada em pacientes que receberam Abx antes do transplante e também no momento da biópsia, indicando disbiose persistente de longo prazo pela exposição cumulativa a ABX. O fato de que GPR é regulado positivamente em pacientes com início de DECH apenas na ausência de Abx, mas não na presença de Abx, implica o eixo “comensal-SCFA-GPR” potencialmente protetor em pacientes com DECH, que é claramente abolido por Abx.

Foi relatado que os SCFAs expandem as células T reguladoras e essas células previnem a DECH e promovem a reconstituição imune. Portanto, abordamos a inter-relação entre a expressão de GPR e FOXP3. Observamos uma alta correlação entre a expressão de GPR e FOXP3 em nível de mRNA, que também foi confirmada em pacientes onde os infiltrados de células imunes foram diretamente corados para FOXP3 e as células positivas foram contadas em campo de alta potência (HPF). A forte associação de GPR com infiltrados de Treg aponta para o eixo GPR-FOXP3, que é novamente abolido pelo uso de Abx. Além disso, vimos uma correlação negativa entre o uso de Abx e a expressão de FOXP3, sugerindo uma ligação entre mudanças na microbiota e imunorregulação, embora as vias exatas que ligam o uso de ABX e a supressão de FOXP3 precisem ser mais analisadas. Como usamos coloração com anticorpo único para nossa análise imunohistoquímica de células FOXP3+, até agora não somos capazes de caracterizar mais detalhadamente as subpopulações de Treg. No contexto clínico, ainda não está claro se tanto as Tregs naturais quanto as induzidas são afetadas pelos SCFA, e estudos futuros usando coloração multiplex são necessários para abordar essas questões.
Estudos murinos anteriores relataram que o efeito benéfico do GPR na mitigação da DECH ocorreu por meio de células não hematopoiéticas, nomeadamente células epiteliais intestinais de maneira dependente de NLRP3. Em consonância com os dados murinos, também observamos uma forte associação de NLRP3 com a expressão de GPR em biópsias intestinais de pacientes, apoiando a regulação do GPR nas células epiteliais. A imunofluorescência revelou as células epiteliais intestinais como uma das fontes celulares de GPR43 no compartimento não hematopoiético, o que está de acordo com um estudo anterior. Em um modelo de linhagem celular epitelial intestinal, o butirato suprimiu a liberação de citocinas inflamatórias, resgatou a barreira epitelial danificada e aumentou a expressão de GPR43, indicando o ciclo de retroalimentação positiva da interação ligante-receptor. Dentro do compartimento hematopoiético, macrófagos CD68 positivos coexpressaram GPR43. Estudos murinos e humanos anteriores descreveram a subpopulação de leucócitos como uma fonte de GPR43. Células imunes como macrófagos, células dendríticas, monócitos e neutrófilos provavelmente desempenham um papel inevitável na proteção mediada por GPR contra a DECH, e o tratamento com antibióticos abole o necessário fenômeno protetor devido à disbiose, ou, ao inibir a translocação bacteriana que de outra forma induziria respostas imunes. Após o tratamento com AGCC, mDCs geradas in-vitro mostraram aumento da expressão de GPR109A e GPR43, seguido pela redução da citocina pró-inflamatória IL-12 e aumento da liberação da citocina anti-inflamatória IL-10, apontando para o fenômeno imunorregulador dos AGCC e estão de acordo com relatos anteriores onde metabólitos bacterianos exerceram regulação imune modulando células apresentadoras de antígenos. Em nosso estudo, pacientes mostraram maior expressão de ambos os GPR no íleo e houve uma recuperação gradual do GPR ao longo do tempo após o transplante, implicando o papel das células hematopoiéticas e do tecido epitelial em recuperação. Nossos dados estão de acordo com estudos murinos anteriores que relataram o envolvimento de células imunes na proteção mediada por GPR contra a inflamação.
Nosso estudo apresenta algumas limitações. Não foi possível avaliar diretamente o status do microbioma no momento da obtenção da biópsia. Isso limitou a análise simultânea da expressão de GPR e da diversidade microbiana e nos levou a usar o tratamento com antibióticos como substituto no contexto clínico da DECH. Além disso, as interações epiteliais dos SCFAs com os GPRs provavelmente são diretamente influenciadas pelos metabólitos luminais dos comensais; no entanto, ainda não sabemos o papel exato das bactérias translocadas e dos metabólitos teciduais, que provavelmente desempenham um papel adicional devido à permeabilidade dos epitélios na DECH e à regulação imune tecidual. Apesar disso, nosso estudo é o primeiro a abordar a interação da microbiota e a regulação das respostas imunes adaptativas em biópsias de tecido humano de pacientes submetidos a TCT. Até agora, apenas a estimulação de Tregs do sangue periférico foi relatada em pacientes recebendo transplante de microbiota fecal (TMF) de doadores saudáveis para tratamento de DECH refratária; portanto, ambas as observações apontam para o fato de que uma microbiota diversa é necessária para montar uma resposta adequada de células Treg. Se a associação observada da expressão de GPR e FOXP3 se deve a um efeito direto dos SCFAs na indução de Tregs, por exemplo, via inibição de HDAC conforme relatado em um estudo anterior, ou envolve outros mediadores liberados por células imunes ou epiteliais, precisa de investigação adicional. O impacto negativo do tratamento com antibióticos na resposta de células Treg nos tecidos até agora foi relatado fora dos modelos de TCTH. Uma associação entre exposição precoce a antibióticos e o desenvolvimento de asma experimental em modelos murinos foi observada. Em um modelo murino de metástases pulmonares, o tratamento com antibióticos reduziu as Tregs e aumentou a resposta de células T citotóxicas. Da mesma forma, o TMF experimental mostrou aumentar as frequências de células Treg no intestino, que foram diminuídas após exposição a Abx. No geral, nossas observações estão de acordo com os efeitos protetores de comensais produtores de altos níveis de SCFAs nas complicações associadas ao TCTH e apoiam o conceito de que a restauração da microbiota, por exemplo, pelo TMF, pode ser benéfica em pacientes com DECH. Até agora, apenas uma pequena e casuística série de TMFs bem-sucedidos na DECH clínica foi relatada, mas ensaios clínicos bem delineados estão agora sendo iniciados para examinar a contribuição exata da reconstituição da microbiota pelo TMF ou por consórcios mais específicos de comensais para a imunomodulação da DECH.

Para concluir, nossos dados sugerem efeitos até então negligenciados, porém deletérios, dos Abx na expressão de GPR e na imunorregulação na DECH clínica. Enfatizamos a necessidade de preservação ou restauração da microbiota, seja por TMF, transferência de consórcios comensais protetores ou por dieta rica em fibras. Além disso, nossos dados sugerem fortemente o uso restritivo de Abx e apoiam uma gestão cuidadosa de antibióticos para manter a microbiota, metabólitos, receptores e imunorregulação. Esta abordagem pode ser relevante para a profilaxia e tratamento da DECH, bem como para várias outras doenças onde a disbiose está envolvida.
As contribuições originais apresentadas no estudo estão incluídas no artigo/ Material Suplementar . Mais esclarecimentos podem ser direcionados aos autores correspondentes.
Declaração de Ética
Os estudos envolvendo participantes humanos foram revisados e aprovados por Aktive Ethikvoten der Ethik-Kommission an der Universität Regensburg E-mail: ethikkomission@ur.de. Os pacientes/participantes forneceram seu consentimento informado por escrito para participar deste estudo (número de aprovação: 02/220, 09/059, 17-619-101).
Contribuições dos Autores
SakG realizou os experimentos, coletou e analisou os dados e escreveu o manuscrito. DWe desenhou o estudo, analisou dados clínicos e discutiu o manuscrito. KH realizou análises imunohistoquímicas. EM, MH e AS-K coletaram e analisaram dados clínicos em relação aos resultados da biópsia. AG, AH, CM, SarG, DWo, ME, PH, HP e WH revisaram e discutiram o manuscrito. EH desenhou o estudo, realizou a análise de dados e escreveu o manuscrito. Todos os autores contribuíram para o artigo e aprovaram a versão submetida.
Financiamento
Este trabalho foi apoiado pela Wilhelm Sander Foundation, Bolsa 2017.020.1 “Disbiose e imunorregulação intestinal em DECH”. Este trabalho foi parcialmente financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 324392634 - TRR 221”, parcialmente pela Marie Curie Initial Training Networks, Número do Projeto 315963, parcialmente pela Mechtild Harf Research Grant da DKMS Foundation for Giving Life, e pela Else-Kroener-Fresenius-Stiftung. DKMS Foundation for Giving Life, a Else-Kroener-Fresenius-Stiftung, CRC 1371, DFG “Assinaturas do microbioma”.
Conflito de Interesse
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesse.
Nota do Editor
Todas as alegações expressas neste artigo são exclusivamente dos autores e não representam necessariamente as de suas organizações afiliadas, ou as do editor, dos editores e dos revisores. Qualquer produto que possa ser avaliado neste artigo, ou alegação que possa ser feita por seu fabricante, não é garantido ou endossado pelo editor.
Material Suplementar
O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2021.753287/full#supplementary-material
Referências
Doença do Enxerto contra o Hospedeiro
Mitigação da doença secundária de quimeras de radiação de camundongos alogênicos pela modificação da microflora intestinal
Supressão completa do microbioma intestinal previne a doença aguda do enxerto contra o hospedeiro após transplante de medula óssea alogênico
Influência da descontaminação bacteriana intestinal usando metronidazol e ciprofloxacino ou ciprofloxacino isolado no desenvolvimento da doença aguda do enxerto contra o hospedeiro após transplante de medula em pacientes com neoplasias hematológicas: resultados finais e acompanhamento de longo prazo de um ensaio randomizado prospectivo aberto
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