pmid: "31574461"
title: "Compreensão do mecanismo de inibição da ferroptose pela ferrostatin-1."
authors: "Miotto G, Rossetto M, Di Paolo ML, Orian L, Venerando R, Roveri A, Vučković AM, Bosello Travain V, Zaccarin M, Zennaro L, Maiorino M, Toppo S, Ursini F, Cozza G"
journal: "Redox biology"
pubdate: "2020 Jan"
doi: "10.1016/j.redox.2019.101328"
source: "PMC Full Text"
Compreensão do mecanismo de inibição da ferroptose pela ferrostatin-1.
Autores
Miotto G, Rossetto M, Di Paolo ML, Orian L, Venerando R, Roveri A, Vučković AM, Bosello Travain V, Zaccarin M, Zennaro L, Maiorino M, Toppo S, Ursini F, Cozza G
Periodico
Redox biology (2020 Jan)
Conteudo
Compreensão do mecanismo de inibição da ferroptose pela ferrostatin-1
A ferroptose é uma forma de morte celular desencadeada pelo ferro e hidroperóxidos lipídicos e prevenida pela GPx4. A ferrostatin-1 (fer-1) inibe a ferroptose de forma muito mais eficiente do que os antioxidantes fenólicos. Estudos anteriores sobre a eficiência antioxidante da fer-1 adotaram testes cinéticos onde um composto diazo gera o radical hidroperoxila sequestrado pelo antioxidante. No entanto, essa reação, responsável por um efeito de quebra de cadeia, é apenas minimamente útil para a descrição da inibição da peroxidação dependente de ferro ferroso e hidroperóxidos lipídicos. O sequestro de radicais hidroperoxila lipídicos, de fato, gera hidroperóxidos lipídicos a partir dos quais o ferro ferroso inicia uma nova reação em cadeia peroxidativa. Mostramos que quando a fer-1 inibe a peroxidação, iniciada por ferro e traços de hidroperóxidos lipídicos em lipossomos, o padrão de espécies oxidadas produzidas a partir de traços de hidroperóxidos pré-existentes é praticamente idêntico ao observado após peroxidação exaustiva na ausência do antioxidante. Isso corroborou a noção de que a atividade antiferroptótica da fer-1 é, na verdade, devida ao sequestro de radicais alcoxila iniciadores produzidos, juntamente com outros produtos de rearranjo, pelo ferro ferroso a partir de hidroperóxidos lipídicos. Notavelmente, a fer-1 não é consumida enquanto inibe a peroxidação lipídica dependente de ferro. O conceito emergente é que é o próprio ferro ferroso que reduz o radical fer-1. Isso foi apoiado por evidências eletroanalíticas de que a fer-1 forma um complexo com o ferro e confirmado adicionalmente em células pela fluorescência da calceína, indicando uma diminuição do ferro lábil na presença de fer-1. A noção de um ciclo pseudocatalítico do complexo ferrostatin-ferro também foi investigada por meio de cálculos de mecânica quântica, que confirmaram a redução de um modelo de radical alcoxila pela fer-1 e a redução do radical fer-1 pelo ferro ferroso. Em resumo, a GPx4 e a fer-1 na presença de ferro ferroso produzem, por mecanismos distintos, o efeito antiferroptótico mais relevante, ou seja, o desaparecimento dos hidroperóxidos lipídicos iniciadores.
Resumo gráfico
Destaques
A ferroptose é uma forma não apoptótica de morte celular desencadeada pela peroxidação lipídica.
A ferrostatin-1, um antioxidante sintético, contribuiu para a definição de ferroptose.
A ferrostatin-1 inibe a peroxidação lipídica de forma muito mais eficiente do que os antioxidantes fenólicos.
A ferrostatin-1 sequestra os radicais alcoxila sem ser consumida durante o processo.
A ferrostatin-1 é regenerada pelo ferro ferroso, reduzindo de volta o radical fer-1.
Ferroptose (FPT) é uma forma recentemente descrita de morte celular regulada (MCR) não apoptótica, primeiramente revelada como um alvo adequado para a terapia anticâncer. A ferroptose foi posteriormente identificada como o mecanismo de morte celular em principais doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Parkinson e Huntington, atrofia cerebelo-cortical e lesão cerebral pós-traumática, bem como sepse, doenças bacterianas e virais. O motivo comum é a ausência de atividade da selenoperoxidase GPx4, resultando na ativação da peroxidação lipídica. O fenótipo de morte do knockout de GPx4, de fato, é reproduzido em doenças experimentais e espontâneas e é resgatado por: i) quelantes de ferro; ii) diminuição da insaturação de ácidos graxos dos fosfolipídios; iii) sequestro de radicais livres.
A FPT pode ser definida, portanto, como uma MCR operada pela peroxidação lipídica (LPO), que só pode prosseguir quando a redução enzimática dos hidroperóxidos de fosfolipídios (PL-OOH) está ausente ou profundamente limitada, em relação à taxa de sua formação.
O mecanismo da LPO que leva à FPT é, de boa fé, totalmente sobreposto ao da peroxidação lipídica microssomal dependente de ferro, descrita há mais de meio século, e que, incidentalmente, levou à descoberta da GPx4 como uma proteína única e peculiar “inibidor da peroxidação”, cuja atividade anti-peroxidante não pode ser substituída por nenhuma outra enzima antioxidante. A LPO de membrana é a degradação oxidativa de fosfolipídios poli-insaturados iniciada por complexos de ferro ferroso e hidroperóxidos lipídicos pré-existentes. Portanto, a única reação enzimática competente para prevenir todo o evento peroxidativo é a redução de PL-OOH pela GPx4 usando GSH como substrato redutor. Em outras palavras, é o efeito da GPx4 que fornece a evidência não ambígua de que a LPO é iniciada a partir de PL-OOH. Embora isso possa parecer contra-intuitivo, sendo PL-OOH o produto da LPO, o enigma é resolvido tendo em mente que traços de PL-OOH podem ser formados independentemente do início e da progressão de reações rápidas de cadeia peroxidativa. Na ausência de desafios específicos, a GPx4 e a GSH continuam catalisando a redução de PL-OOH, que são produzidos em níveis traço durante o metabolismo aeróbico, em álcoois de fosfolipídios correspondentes (PL-OH). Notavelmente, PL-OOH também pode ser produzido por lipoxigenases, com especial referência à 12/15-lipoxigenase (ALOX-12/15), e isso também parece relevante para a FPT. No entanto, também a atividade dessa lipoxigenase requer a ativação de hidroperóxidos lipídicos e está, portanto, sob o controle da atividade da GPx4.
A LPO de membranas biológicas abrange reações de radicais livres resumidas como: i) iniciação, começando com a abstração pelo radical livre iniciante de um átomo de hidrogênio de um fosfolipídio contendo ácido graxo poli-insaturado (PL), levando a um radical centrado no carbono do fosfolipídio (PL•), e prosseguindo com a adição de oxigênio ao PL• (radical hidroperoxila, PL-OO•); ii) propagação em cadeia, através da reação entre PL-OO• e outro PL, resultando em um hidroperóxido de fosfolipídio (PL-OOH); e iii) parada, por sequestro ou interações radical‐radical.
No âmbito deste esquema simplificado do processo, a LPO é iniciada por Fe2+ a partir de PL-OOH. A ligação O–O fraca do PL-OOH é de fato facilmente clivada por Fe2+, produzindo o radical alcoxila extremamente reativo (PL-O•) competente para a iniciação. Assim, PL-O• está envolvido na iniciação da LPO, enquanto PL-OO• está conduzindo a propagação.
Estudos mecanísticos e cinéticos sobre a LPO, nas últimas décadas, aproveitaram amplamente o uso de iniciadores azo introduzidos por Keith Ingold. Por decomposição térmica, em uma reação de primeira ordem, essas espécies produziam um radical centrado no carbono evoluindo para um radical hidroperoxila na reação limitada pela difusão com oxigênio. Esta abordagem cinética permitiu a avaliação cuidadosa da “capacidade antioxidante” de compostos, ou mesmo de misturas heterogêneas, em termos de constante de velocidade aparente para sequestrar radicais hidroperoxila, normalmente tendo como referência o tocoferol, o antioxidante paradigmático. Notavelmente, neste ensaio cinético, é o radical hidroperoxila propagador que realmente inicia a LPO. Por esta razão, a informação obtida a partir do uso de compostos azo é limitada à eficiência de “quebra de cadeia” do antioxidante sob escrutínio. A especificidade deste conceito é frequentemente negligenciada na literatura científica quando a noção de “antioxidante quebrador de cadeia” é considerada totalmente sobreposta ao conceito de “antioxidante sequestrador de radicais livres”. Isso pode ser de relevância não trivial ao lidar com LPO dependente de ferro, uma vez que a redução de PL-OO• gera PL-OOH a partir do qual Fe2+ continua regenerando radicais iniciantes, por reação tipo Fenton.
Por meio de triagem de alto rendimento de bibliotecas de pequenas moléculas, foi relatado de forma independente que fer-1 e liproxstatina-1 (lip-1) atuam como potentes inibidores da ferroptose,. Inesperadamente, o α-tocoferol (α-TOH) surge como um inibidor relativamente fraco da ferroptose quando comparado com fer-1 ou lip-1.
Neste estudo, abordamos o mecanismo do fer-1 em um sistema modelo de LPO, mais representativo dos eventos bioquímicos que levam à FPT.
Fosfolipídios: 1-estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0–18:2 PC, SLPC) e 1-estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:0–18:2 PE, SLPE) foram da Avanti Polar Lipids, EUA. Tris, trolox, ferrostatin (fer-1), ácido ascórbico, FeSO4, glutationa e hexano (grau espectrometria de massa) e éter metil terc-butílico (MTBE) foram da Sigma. Deferasirox da Santa Cruz e calceína-AM da Thermo Fisher. Acetonitrila, Isopropanol da VWR. 2,2′-azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano] (ABIP) foi um presente gentil da Wako Chemicals (Neuss, Alemanha). A GPx4 foi purificada a partir de testículos de rato. Os vetores de expressão contendo a sequência humana de ALOX15 foram um presente gentil de H. Kuhn (Instituto de Bioquímica, Universidade de Medicina Berlim-Charité, Charitéplatz 1, D-10117 Berlim, Alemanha) e a proteína recombinante foi obtida de acordo com a Ref..
Preparação de lipossomos
Soluções clorofórmicas de SLPC e SLPE (10 mg/mL) foram misturadas em proporção equimolar em um tubo de vidro. Após a remoção do clorofórmio por fluxo de nitrogênio, a mistura de fosfolipídios seca foi suspensa com tampão (0,1 M Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4) para obter uma concentração final de lipídios totais de 0,1 mM e então vortexada por 2 min. Uma população homogênea de lipossomos unilamelares foi finalmente obtida por extrusão das suspensões lipídicas 10 vezes através de filtros de policarbonato de 0,1 μm (Whatman Nuclepore Track Etched Membranes), usando um extrusor (LIPEXR Extruder Transferra Nanosciences Inc. Canadá) a 50 °C.
Inibição da peroxidação de lipossomos
A solução de lipossomos foi introduzida em uma célula oxigráfica (volume 1,5 mL) e equilibrada com ar a 37,0 ± 0,1 °C. Após o equilíbrio térmico, 5 μL do inibidor em etanol (fer-1 ou trolox) foram adicionados e após 1 min a peroxidação foi iniciada pela adição de: i) 24 μL de ABIP 0,5 M em água, um composto diazo que se decompõe termicamente produzindo uma fonte constante de radicais peroxil (Kd 2,44 × 10-4 min-1); ou ii) ferro e ácido ascórbico. Foram utilizados 5 μL de solução fresca de ácido ascórbico 9 mM em água e 5 μL de FeSO4 1,2 mM em HCl 10 mM, salvo indicação contrária. A taxa de consumo de oxigênio foi medida na ausência (R0) e na presença (R) do inibidor e a IC50 foi calculada conforme descrito anteriormente.
onde K é uma constante correspondente à taxa relativa de consumo de O2 extrapolada em alta concentração de inibidor, C a concentração do inibidor, IC50 é a concentração do inibidor necessária para diminuir a razão R/R0 de 1 para K+(1-K)/e. No caso da oxidação induzida por ABIP, a estequiometria n, representando a quantidade de radicais peroxil capturados pelo inibidor, foi calculada de acordo com a equação n = Ri x LT/C, onde LT é o tempo de latência da inibição, Ri a taxa de iniciação. A taxa de consumo de oxigênio foi monitorada por um eletrodo de oxigênio Yellow Springs usando um potenciostato Metrohm 663 VA em uma célula oxigráfica termostatizada.
50 μl de suspensão de lipossomas foram misturados com 1 ml de mistura OPE: metanol:MTBE:clorofórmio - 1,33:1:1 v/v/v. Assim, os tubos foram cobertos, vortexados por 30 s e agitados por 20 min a 1000 rpm à temperatura ambiente. Em seguida, os tubos foram centrifugados por 5 min a 12000 g, à temperatura ambiente, depois diluídos 1:2 com fase móvel inicial (68% A: 32% B) e uma alíquota de 0,2 μl foi submetida à análise por LC/MS.
Análise por LC - MS/MS
As amostras foram analisadas por LC-MS/MS utilizando um espectrômetro de massas Q-TOF 6520 controlado pelo software Agilent MassHunter (versão B.05.00), acoplado on-line a um sistema HPLC série 1200 por meio de uma interface nano-ESI Chip Cube (Agilent Technologies, CA, EUA). As separações cromatográficas foram realizadas em uma coluna chip C18 Polaris de fase reversa, alta resolução de 3 μm (Polaris-HR-3C18, Agilent Technologies), integrando uma coluna de captura de capacidade de 360 nL, a coluna (0,75 mm × 150 mm), capilares de conexão e um emissor de nano-spray.
Análise de fosfolipídios por LC/MS
0,2 μl de amostra, extraída conforme descrito acima, foram separados cromatograficamente de acordo com Pellegrino et al., com pequenas modificações. Em resumo, as fases móveis foram A: formato de amônio 5 mM em água/acetonitrila/metanol: 40/50/10, B: formato de amônio 5 mM em isopropanol/acetonitrila/hexano: 90/10/10. O gradiente foi o seguinte: 0–1 min solvente A de 68% a 49%; 1–15 min A de 49% a 4%; manter por 7 min e, em seguida, deixar reequilibrar por 18 min nas condições iniciais; o fluxo foi de 0,35 μL min⁻¹.
O Q-TOF opera em modo MS a 2 GHz de faixa dinâmica estendida, com três íons de referência. A voltagem do capilar foi ajustada para 1350 V (polaridade negativa) com nitrogênio como gás de dessolvatação a 330 °C e 4,8 L/min; fragmentador, skimmer e octapolo foram ajustados para 150, 65 e 750 V, respectivamente.
Os espectros de massa foram adquiridos em modo dependente de dados: espectros de MS/MS dos 7 íons mais intensos foram adquiridos para cada varredura de MS na faixa de 100–1700 Da. A velocidade de varredura foi ajustada para 2 espectros de MS s⁻¹ e 3 espectros de MS/MS s⁻¹ (ver Material Suplementar).
Identificação e quantificação de lipídios
A identificação de lipídios oxidados foi realizada pelo padrão de fragmentação (MS/MS) e tempo de retenção (ver Material Suplementar). Devido à natureza dos fosfolipídios que formam os lipossomas, apenas os espectros de MS/MS contendo os fragmentos relativos ao resíduo estearoil [283.26]- e à cabeça polar da fosfatidiletanolamina [140.01]- ou da fosfatidilcolina [168.04]- foram considerados. A triagem dos espectros de MS/MS foi realizada tanto manualmente quanto por uma função dedicada para identificação de lipídios oxidados implementada no LIPOSTAR, um software recentemente desenvolvido pelo grupo de Cruciani. Ambas as abordagens levaram à identificação do mesmo padrão de espécies oxidadas a partir de 1-estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (SLPC) ou 1-estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (SLPE). Os limites de detecção, calculados por padrões deuterados calibrados (PC(15:0/18:1(d7)); PE (15:0/18:1(d7)), Avanti Polar Lipids), foram de 0.6 e 0.4 fmoles injetados para SLPC e SLPE, respectivamente, correspondendo a cerca de 1/1000 da quantidade total de fosfolipídios injetados. Devido à falta de padrões de lipídios oxidados, os rendimentos de ionização das espécies oxidadas foram assumidos como iguais aos de seus precursores (SLPC e SLPE). Diferenças mínimas, devidas às preparações de lipossomas, foram minimizadas expressando a quantidade de cada espécie oxidada como uma porcentagem do total (precursor mais oxidado).
Análise de ferrostatin por LC/MS
A suspensão de lipossomas foi extraída conforme acima, então 200 μL foram secos a vácuo (Speedvac) e dissolvidos em 100 μl de acetonitrila aquosa a 33%.
Cada amostra (0,8 μL) foi submetida a uma separação isocrática de 10 min, as fases móveis consistiam em acetonitrila/água: 90/10, contendo 0,1% de ácido fórmico. O fluxo foi mantido a 0,3 μL min-1.
O Q-TOF opera em modo MS a 2 GHz de faixa dinâmica estendida, com três íons de referência. A tensão capilar foi ajustada para 1600 V (polaridade positiva) com nitrogênio como gás de dessolvatação a 325 °C e 4,8 L/min; fragmentor, skimmer e octapolo foram ajustados para 140, 65 e 750 V, respectivamente.
Os espectros de massa foram adquiridos em modo dependente de dados: espectros de MS/MS dos 6 íons mais intensos foram adquiridos para cada varredura de MS na faixa de 100–1700 Da. A velocidade de varredura foi ajustada para 2 espectros de MS s-1 e 3 espectros de MS/MS s-1.
A ferrostatin foi identificada pela massa exata [263.175]+ e pelo padrão de fragmentação do padrão (ver Material Suplementar). O limite de detecção foi de 1 femtomol injetado.
Todos os cálculos de teoria do funcional da densidade (DFT) foram realizados utilizando Gaussian16. As otimizações completas da geometria foram realizadas em fase gasosa usando o funcional M06-L combinado com o conjunto de base 6-31G(d,p) para todos os átomos, exceto Fe para o qual LanL2DZ foi usado com um potencial efetivo de caroço. O formalismo de camada aberta irrestrito foi adotado para todas as espécies com elétrons desemparelhados; assim, a contaminação de spin foi verificada para avaliar a confiabilidade da função de onda. Cálculos de frequência foram realizados no mesmo nível de teoria (M06-L/6-311+G(d,p),Lanl2DZ) para confirmar os pontos estacionários (todas as frequências positivas). Posteriormente, cálculos de energia de ponto único foram realizados em SMD-M06-L/6-311+G(d,p),LanL2DZ//M06-L/6-31G(d,p),LanL2DZ em fase gasosa para obter valores de energia mais precisos e, subsequentemente, no mesmo nível de teoria, em benzeno e água usando o modelo de contínuo SMD. Este nível de teoria, denominado SMD-M06-L/6-311+G(d,p)//M06-L/6-31G(d,p), permite estimar energias livres em fase condensada e benzeno e água foram escolhidos para imitar um ambiente apolar e polar, respectivamente. As coordenadas cartesianas das estruturas moleculares otimizadas são relatadas no Material Suplementar.
Métodos eletroquímicos
Experimentos de voltametria de pulso diferencial (DPV) foram realizados utilizando um Autolab PGSTAT conectado a um sensor de tira de três eletrodos (G-Sensor da Ecobioservice & Researches s.r.l., Florença, Itália) e em uma microcélula de 700 μL. Os eletrodos no G-Sensor eram: um eletrodo de carbono vítreo de 3 mm de diâmetro (como eletrodo de trabalho), Ag (como pseudo-eletrodo de referência) e carbono (como contra-eletrodo). Este sensor de tira foi escolhido porque fer-1 foi facilmente adsorvido em eletrodos de carbono vítreo (conforme relatado também para outros compostos redox) e consequentemente o uso dessas tiras permitiu a renovação da superfície do eletrodo de trabalho (sem polir a superfície do eletrodo).
Experimentos de DPV foram realizados a 25 °C com a seguinte configuração: taxa de varredura 10 mVs-1, potencial de degrau 50 mV, amplitude de modulação 20 mV, tempo de modulação 0,07 ms e tempo de intervalo de 200 ms. O potencial de varredura foi de -800 a +1000 mV. A solução estoque de FeSO4 foi de 5 mM em HCl 10 mM, e FeCl3 foi de 10 mM em HCl 25 mM. A solução estoque de Fer-1 foi de 40 mM em DMSO. O meio dos experimentos eletroquímicos foi MetOH 90%, LiClO4 0,1 M (como eletrólito de suporte). Outros tampões foram testados, como Tris/HCl 0,1 M, KCl 0,15 M pH 6,8 na ausência e presença de 25% de metanol, mas uma adsorção significativa na superfície do eletrodo foi encontrada. Nenhum sinal significativo de Fe2+ ou Fe3+ (na concentração máxima de 160 μM) ou da solução de HCl foi encontrado no DPV da solução branco (na ausência de fer-1) e na faixa de potencial explorada para fer-1. A análise dos dados foi realizada com o software Sigma Plot 9.0, Jandel Scientific, San Rafael, CA EUA.
Medição do Pool de Ferro Lábil Celular (LIP)
Células HEK293T subconfluentes, semeadas no dia anterior, foram incubadas por 210 min em DMEM, sem SFB, com concentração crescente de ferrostatin-1. Calceína-AM 50 nM foi adicionada 45 min antes do término da incubação. Após tripsinização, as células foram suspensas em solução tampão fosfato (PBS) e analisadas rapidamente por citometria de fluxo (BD-FACSCanto II, equipado com um laser de argônio de 488 nm). A emissão de 20.000 células foi registrada a 530 nm e a intensidade média de fluorescência (MFI) foi calculada pelo software FACS DIVA (Becton-Dickinson). O LIP relativo foi expresso como porcentagem da calceína-MFI das células tratadas versus controle. Células incubadas com Deferasirox 100 μM serviram como linha de base. Os valores são a média ± desvio padrão (DP) de 2 experimentos independentes em triplicata (GraphPad Prism).
Resultados
Ferrostatin-1 e trolox têm uma eficiência de inibição de peroxidação lipídica marcadamente diferente, embora compartilhem o mesmo efeito antioxidante de quebra de cadeia
Comparamos a capacidade antioxidante do trolox e do fer-1 usando: i) um composto diazo gerador de radicais hidroperoxila lipídicos; e ii) ferro ferroso - ascorbato iniciando a peroxidação a partir de traços de hidroperóxidos lipídicos presentes em lipossomos. A dispersão de lipossomos extrudados contendo 0,1 mM de fosfolipídios (SLPC 18:0/18:2 e SLPE 18:0/18:2, razão 1:1), foi introduzida em uma célula oxigráfica e equilibrada com ar na presença de fer-1 ou trolox. A peroxidação foi iniciada pela adição de: ABIP ou FeSO4 – ácido ascórbico (ver Materiais e Métodos para detalhes). A dependência da taxa inicial de consumo de oxigênio na ausência e na presença de concentrações de trolox ou fer-1 foi calculada (ver Materiais e Métodos).
Inibição da peroxidação lipídica induzida por ferro ou diazo em lipossomo. A dependência da razão da taxa inicial de consumo de oxigênio R/R0 da concentração de trolox (círculo aberto azul) e fer-1 (círculo cheio vermelho, também expandido no inserto) foi ajustada à Eq (1) (Ver Materiais e Métodos). Solução de lipossomos contendo 0,1 mM de fosfolipídios (SLPC:SLPE/1:1), diferentes quantidades de trolox ou fer-1 foi oxidada por 8 mM de ABIP (painel A) ou 30 μM de ácido ascórbico e 4 μM de FeSO4 (painel B) em 0,1 M Tris, 0,15 M KCl a pH 7,0, a 37 °C. Em (C) os valores de IC50 calculados a partir dos painéis A e B são relatados. (Para interpretação das referências à cor nesta legenda de figura, o leitor é remetido à versão Web deste artigo.)
Fig. 1
Os resultados reportados na Fig. 1 A mostram claramente que fer-1 e trolox têm a mesma capacidade de quebra de cadeia na presença de ABIP (IC50 = 1,66 μM e 1,86 μM, respectivamente, Fig. 1C). Fer-1 foi, em vez disso, muito mais eficiente que trolox quando a peroxidação foi iniciada por Fe2+ (IC50 = 0,017 μM e 7,2 μM, respectivamente, Fig. 1B e C).
O resultado apoia a conclusão de que a eficiência de sequestro de radicais hidroperoxila lipídicos não reflete a capacidade antiperoxidante em um modelo que imita a peroxidação lipídica, ocorrendo no FTP.
Análise lipidômica dos produtos de oxidação lipídica
Para estes experimentos, utilizamos lipossomos unilamelares extrudados contendo SLPC, SLPE, PLPC, PLPE. As dispersões de lipossomos continham 100 μM de fosfolipídios na proporção 1:1 de SLPC:SLPE ou PLPC:PLPE.
Aproximadamente 1% de derivado de hidroperóxido do ácido linoleico gerado por autoxidação e quantidade traço de todas as outras espécies peroxidadas (veja abaixo) estavam presentes nas preparações de fosfolipídios. A peroxidação lipídica foi induzida por 8 mM de ABIP ou 0,1 μM de FeSO4- 30 μM de Ascorbato e registrada por 30 min. Os lipídios foram extraídos por um procedimento de extração monofásica e analisados por HPLC-MS/MS.
Em uma série de experimentos preliminares, confirmamos a suposição de que apenas produtos de peroxidação do ácido linoleico são gerados e que o padrão é o mesmo em diferentes espécies de fosfolipídios. Como esperado, de fato, a presença de ácido esteárico ou palmítico, bem como a cabeça polar, colina ou etanolamina, não afeta o padrão final dos produtos de oxidação do linoleato ligado ao fosfolipídio inserido na bicamada. Assim, por simplicidade, relatamos apenas os resultados gerados a partir de SLPC.
Espécies oxidadas de SLPC identificadas por oxi-lipidômica. Todas as espécies foram geradas a partir do ácido linoleico. As mesmas espécies foram detectadas em PLPC, SLPC e PLPE. A identificação foi obtida por tempo de retenção e MS/MS.
Tabela 1
Espécies oxidadas Acrônimo Estrutura R = C8H15O2 m/z 1[O] epóxi 1O 296.2351 1[O] hidróxi 1[O] 296.2351 1O ceto 1O 294.2195 2[O] hidroperóxi 2O 312.2301 2[O] epóxi-hidróxi 2[O] 312.2301 2O epóxi-ceto 2O 310.2144 3[O] hidroperóxi-epóxi 3O 328.225 3[O] epóxi-hidróxi 3[O] 328.225 3O ceto - epóxi 3O 326.2093 Espécies truncadas Acrônimo Estrutura R=H m/z 9-oxo-nonanoíla 172.1099 azeloíla 188.1049 8-oxo-octanoíla 158.0943 8-OH-octanoíla 160,1099
A identificação foi baseada em espectros de MS/MS, integrados com o tempo de retenção. Como compostos de referência básicos, utilizamos hidroperóxidos produzidos por ALOX 15 e reduzidos por GPx4-GSH. A lista das espécies oxidadas mais relevantes (>0,1%) detectadas é relatada na Tabela 1.
Padrão de oxidação lipídica induzida por compostos diazo ou Fe2+/ascorbato. O padrão de lipídios oxidados, em relação à 1-estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (SLPC), de uma suspensão fresca de lipossomos contendo 0,1 mM de fosfolipídios (SLPC:SLPE/1:1), foi medido no tempo 0 (T0) e após 30 min de incubação com ABIP 8 mM ou Fe2+ 4 μM mais Ascorbato 30 μM. No gráfico inset são resumidos a porcentagem de espécies oxidadas totais em relação à quantidade total de SPLC (esquerda) e a porcentagem de lipo-hidroperóxidos em relação à soma das espécies oxidadas (direita). Os valores representam a média ± desvio padrão de 20 experimentos independentes.
O padrão de produtos de peroxidação lipídica é bastante diferente quando os lipossomas são peroxidados pelo composto diazo ou pelo Fe2+. Quando, após 30 min, aproximadamente 20% dos fosfolipídios são modificados oxidativamente, os hidroperóxidos representam 70% das espécies oxidadas geradas pelo composto diazo, enquanto não mais que 30% quando a peroxidação é iniciada pelo ferro (Fig. 2).
O padrão de produtos de peroxidação lipídica, produzidos pelo iniciador diazo, está de acordo com o mecanismo reconhecido onde os radicais hidroperoxil lipídicos evoluem para hidroperóxidos lipídicos e espécies menores geradas pela interação radical-radical, levando à terminação da cadeia de peroxidação. Neste modelo de peroxidação lipídica, onde o radical hidroperoxil lipídico é a espécie motriz da peroxidação, a capacidade de sequestro do anel cromanol (trolox) é semelhante à da fer-1 (ver Fig. 1 A).
Curso temporal do padrão de oxidação de SLPC induzida por Fe2+ e efeito da fer-1. Suspensão de lipossomas, contendo 0,1 mM de fosfolipídios (SLPC:SLPE/1:1), foi incubada por 30 min com Fe2+ 4 μM e Ascorbato 30 μM na ausência (A) ou na presença (B) de 0,5 μM de fer-1. Amostras foram retiradas antes das adições (T0) e aos 0,5, 2, 10, 30 min após as adições. Nos insets, a porcentagem do total de espécies oxidadas em relação à quantidade total de SPLC (esquerda) e a porcentagem de lipo-hidroperóxidos em relação à soma das espécies oxidadas (direita) estão resumidas. Os valores representam a média ± desvio padrão de 3 experimentos independentes.
Fig. 3
Quando a peroxidação é iniciada por Fe2+, os hidroperóxidos lipídicos ainda são o principal produto de peroxidação lipídica após 30 min, mas também são produzidas quantidades substanciais de epoxy-ceto, epoxy-hidroxi, ceto, hidroxi, epoxy-hidroperoxi. O curso temporal da peroxidação lipídica induzida por Fe2+ (Fig. 3A) mostra o aumento progressivo de todos os produtos de peroxidação, enquanto os hidroperóxidos lipídicos inicialmente presentes na preparação de lipossomas (t = 0) diminuem abruptamente após a exposição ao Fe2+ e depois aumentam progressivamente. O resultado está totalmente de acordo com o mecanismo proposto de iniciação da peroxidação lipídica pelo radical alcoxil lipídico.
Esboço esquemático do mecanismo de peroxidação lipídica induzida por Fe2+.
Fig. 4
O esboço esquemático (Fig. 4) do mecanismo que está de acordo com nossa evidência experimental (Fig. 3A) está em concordância com mecanismos reconhecidos revisados nas Refs..
A partir dos hidroperóxidos lipídicos, 2O, Fe2+ gera radicais alcoxil lipídicos PL-O•;
PL-O• evolui para: i) o hidroxi 1[O] gerando um novo radical de carbono central lipídico, PL•, que adiciona oxigênio reversivelmente e forma PL-OO•, por sua vez estabilizado como hidroperóxido 2O por transferência de H; ii) o radical de carbono central alílico epoxi, Ep-PL•, que também adiciona oxigênio formando Ep-PL-OO• estabilizado como hidroperóxido, 3O, por transferência de H.
PL-OO• e Ep-PL-OO• podem sofrer dismutação via mecanismo de Russell, produzindo oxigênio singlete e 1[O] mais 1[O]-H2 a partir de PL-OO• e 2[O] mais 2[O]-H2 a partir de Ep-PL-OO•.
PL-OO• (e Ep-PL-OO•) podem também reagir com LH com a formação de outro radical alcoxila PL-O• e o epóxi 1[O] (isobárico com a espécie hidroxi).
A partir de 3O, Fe2+ gera um radical alcoxila epóxi Ep-PL-O• que, por sua vez, evolui de forma semelhante ao PL-O• e inicia uma nova reação em cadeia.
Em resumo (para siglas, veja também Tabela 1):
Diferentes espécies radicais oxigenadas podem também gerar fosfolipídios truncados e compostos de baixo peso molecular que, sendo produzidos em quantidade mínima, não foram investigados mais a fundo para o objetivo específico deste estudo.
Quando a peroxidação lipídica dependente de ferro é inibida por fer-1 (Fig. 3B), os hidroperóxidos lipídicos presentes em lipossomos desaparecem, dando origem à série de espécies oxidadas cujo padrão é idêntico ao observado quando a peroxidação não é inibida (Fig. 3A). Essa evidência está de acordo com a noção de que a reação mais relevante do fer-1 é a eliminação do PL-O• competente para iniciar a peroxidação lipídica.
Em vez disso, a eliminação de um PL-OO•, ou seja, o efeito de quebra de cadeia, compete com a propagação, mas também estabiliza a adição reversível de oxigênio gerando um novo hidroperóxido a partir do qual o ferro inicia novas reações peroxidativas em cadeia.
Ferrostatin-1 inibe a peroxidação sem ser consumido
Decomposição de hidroperóxido lipídico e consumo de fer-1 na presença de ferro. Uma solução contendo 0,1 mM de fosfolipídios (SLPC:SLPE/1:1) em Tris 0,1 M, KCl 0,15 M a pH 7,4, enriquecida com hidroperóxidos por um pré-tratamento com Alox15 por 60 min, foi tratada com 0,5 μM de fer-1, 30 μM de ácido ascórbico e 4 μM de FeSO4, a 37 °C. O curso temporal de PL-OOH total (quadrado ■) e fer-1 (triângulo ▼) foram quantificados por Espectrometria de Massas. O branco foi fer-1 em tampão (círculo ●).
Fig. 5
Surpreendentemente, observamos que o fer-1 não é consumido enquanto inibe a peroxidação induzida por ferro. Essa evidência notável é exemplificada na Fig. 5, onde é relatado que 0,5 μM de fer-1 não é consumido durante a decomposição de hidroperóxido impulsionada por ferro, mesmo na presença de 15 μM de hidroperóxidos lipídicos (Fig. 5). Vale a pena notar que a eficiência superestequiométrica do fer-1 foi previamente relatada para diarilaminas, embora em uma condição experimental profundamente diferente. Por outro lado, quando a peroxidação foi induzida pelo composto diazo, o fer-1 desaparece (ver Material Suplementar tabela S1), aparentemente formando produtos que não foram investigados mais a fundo.
Esses resultados estimularam a hipótese de que o radical do fer-1, produzido pela interação com o radical alcoxila, poderia ser reduzido de volta. Evidências convincentes sugeriram a hipótese de que o próprio ferro ferroso é o doador de elétrons nessa reação. A hipótese foi testada buscando evidências, primeiramente, da interação do fer-1 com o ferro por meio de medidas eletroanalíticas e, em seguida, por cálculos de mecânica quântica da energética do processo redox. Em segundo lugar, a formação de um complexo entre fer-1 e ferro foi demonstrada em células pela fluorescência da calceína.
Análise eletroanalítica da interação entre fer-1 e ferro
Efeito dos íons férrico e ferroso nos valores de potencial de pico anódico do fer-1. Voltamogramas de pulso diferencial do fer-1 na ausência e presença de diferentes concentrações de íons ferroso (A) e férrico (B) mostram o deslocamento anódico dos valores de potencial de pico do fer-1 induzido pelo ferro. Gráficos dos deslocamentos dos potenciais de pico (ΔVp = VpFer-1+Fe – VpFer-1) nas razões Fe2+/fer-1 (C) e Fe3+/fer-1 (D) são mostrados; as linhas contínuas são os resultados do melhor ajuste da equação da hipérbole para os dados experimentais, por análise de regressão não linear.
Fig. 6
Medidas de voltametria de pulso diferencial (DPV) foram realizadas em metanol 90% e tampão LiClO4 (0,1 M). Fe2+ ou Fe3+ foi adicionado passo a passo (de 10 a 100 μM, concentração final) a 100 μM de fer-1, e a corrente gerada foi registrada. Ambos os picos de oxidação do fer-1 foram deslocados para potenciais mais positivos (deslocamento anódico) na presença de ferro (Fig. 6 A e B). Esses deslocamentos dos potenciais de pico (ΔVp = VpFer-1+Fe – VpFer-1) dependentes da razão fer-1/Fe preencheram a cinética de saturação esperada (Fig. 6C e D). A equação da hipérbole mostrou-se adequada para ajustar os dados experimentais.
O melhor ajuste indica que os máximos foram alcançados aproximadamente no valor de 1 para ambas as razões Fe2+/fer-1 e Fe3+/fer-1, indicando que a saturação é atingida em uma razão fer-1:ferro de cerca de 1:1. Esses resultados apoiam a noção de que o ferro interage com o fer-1, formando um complexo, conforme já relatado para outros antioxidantes ou moléculas complexantes.
Mecanismo de Transferência de Átomo de Hidrogênio (HAT) na ferrostatin-1
Estruturas moleculares dos complexos de ferro com ferrostatin-1 totalmente otimizadas no nível de teoria M06-L/6–31G(d,p), LanL2DZ. Os complexos fer-1/FeII (A) e fer-1/FeIII (B) são mostrados em (A) e (B), respectivamente. Em (C) é representada uma visão esquemática da eliminação dos radicais alcoxila lipídicos (PL-O·) pelo fer-1 e da redução do radical fer-1 pelo ferro ferroso.
Fig. 7
A análise de DFT indica que a fer-1 pode se ligar ao ferro através dos pares isolados do N. Em nosso modelo, a esfera de coordenação é saturada por três ânions Cl, de modo que a carga molecular total é -1. Notavelmente, como apenas o N da amina secundária se liga ao ferro, o complexo é tetracoordenado (Fig. 7A). Seu estado fundamental eletrônico é um quinteto, caracterizado por quatro elétrons com spin paralelo no centro metálico. A estrutura eletrônica, calculada em fase gasosa no nível de teoria M06-L/6-311+G(d,p),LanL2DZ//M06-L/6-31G(d,p),Lan2DZ, é consistente com isso, uma vez que um valor de densidade de spin de Mulliken de 3,69 é obtido para o núcleo de ferro. Este complexo pode reduzir radicais via mecanismo HAT (Transferência de Átomo de Hidrogênio). Consideramos as aminas primária e secundária como os sítios mais reativos da fer-1, por analogia com a fer-1 livre e sistemas orgânicos semelhantes. Inicialmente, um complexo radicalar é formado, com quatro elétrons desemparelhados no ferro e um elétron desemparelhado no N, no qual o ferro mantém o estado de oxidação inicial.
Etapas elementares da redução radicalar via HAT a partir da fer-1.
Esquema 1
Na análise computacional, usamos CH3O• e CH3OO• como modelos de radicais alcóxido e hidroperoxil lipídicos (PL-O• e PL-OO•), respectivamente. A formação do radical no sítio N da amina secundária é mais estável em 23,2 kcal mol-1 (valor calculado em fase gasosa) do que no sítio N da amina primária. Posteriormente, através de uma transferência eletrônica intramolecular, o ferro(II) é oxidado a ferro(III) e o átomo de N torna-se carregado negativamente. Neste complexo, a multiplicidade total é um sexteto e os cinco elétrons desemparelhados estão localizados no centro férrico. A fer-1 é subsequentemente protonada após reação com uma molécula de água, formando o complexo pentacoordenado (Fig. 7B); a densidade de spin de Mulliken no ferro é 3,92, mas ao considerar os três átomos de Cl, o valor total é 4,84. No Esquema 1, as três etapas descritas acima estão resumidas.
Ao combinar as três reações do Esquema 1, podemos escrever o processo global (Eq. (2)), bem como o mesmo processo na presença do radical alcóxido (Eq. (3)):
As energias livres de reação de Gibbs, representando a força termodinâmica que impulsiona o processo global de redução radicalar por HAT a partir da fer-1, calculadas em benzeno e água, para mimetizar um ambiente apolar e um polar, respectivamente, são 48,3 e 10,9 kcal mol-1 referentes ao radical CH3OO• e 28,3 e -9,1 kcal mol-1 referentes ao radical CH3O•. Isso denota a capacidade de sequestro da fer-1 e sua preferência pelo radical alcóxido em vez do hidroperoxil (Fig. 7C).
Ferrostatina-1 reduz o pool de ferro lábil nas células
A fer-1 se liga ao ferro do Pool de Ferro Lábil (LIP, do inglês Labile Iron Pool). O LIP relativo foi expresso como Intensidade Média de Fluorescência (MFI, do inglês Mean Fluorescence Intensity) da calceína em células tratadas versus controle. Células incubadas com Deferasirox 100 μM serviram como linha de base. Os valores são a média ± desvio padrão (DP) de 2 experimentos em triplicata.
Fig. 8
O procedimento baseado no calceína-AM (éster acetoximetílico de calceína) citoquímico foi utilizado para avaliar a dimensão do "pool de ferro lábil" (LIP) celular. Concentrações crescentes de fer-1 foram adicionadas aos ensaios usando DMSO como controle. Para demonstrar a validade do procedimento, 100 μM de deferasirox foi usado como controle positivo. Diferentemente do quelante de ferro, que abole completamente o LIP celular, 20 μM de fer-1 foi eficaz em reduzir a concentração do pool de ferro lábil em não mais de 50% (Fig. 8). Esse resultado, juntamente com as evidências obtidas por DVP e DFT, apoia a noção de que fer-1 pode interagir com pelo menos parte do LIP celular. Isso valida ainda mais a conclusão de que fer-1 forma um complexo com o ferro e, indiretamente, sustenta a evidência mecanística teórica de que Fe2+ reduz o radical fer-1.
Conclusões
A ferroptose é uma forma recentemente descrita de MCR dependente de ferro, não apoptótica, operada por peroxidação lipídica (LPO) e desafiada pela "proteína inibidora da peroxidação" GPx4. Em particular, a LPO é iniciada pela decomposição dependente de ferro da ligação O–O em hidroperóxidos de fosfolipídeos (PL-OOH), gerando assim o PL-O• iniciador. A adição de oxigênio gera o PL-OO•, que propaga a reação radicalar em competição com a terminação por interação radical-radical, por meio da interação com novos PL contendo um ácido graxo poli-insaturado; isso produz outro PL-OOH e um novo PL•. Nas últimas décadas, iniciadores azo foram amplamente utilizados para estudos mecanísticos e cinéticos de LPO. Esses compostos produzem um radical centrado em carbono que evolui para um radical hidroperoxila e foram explorados para a avaliação da "capacidade antioxidante" de moléculas naturais e sintéticas. No entanto, ensaios que utilizam compostos azo, embora meçam a eficiência de "quebra de cadeia" do antioxidante, um evento que representa a inibição da etapa de propagação da reação em cadeia, não podem ser considerados totalmente sobrepostos ao conceito de "antioxidante captador de radicais livres". De fato, no caso da peroxidação lipídica dependente de ferro, o papel do iniciador PL-O• é criticamente mais relevante, uma vez que a etapa de propagação gera novos PL-OOH a partir dos quais o Fe2+ continua regenerando radicais iniciadores por reação tipo Fenton.
Fer-1 é um composto sintético isolado por triagem de alto rendimento de bibliotecas de pequenas moléculas como um potente inibidor de FTP. Embora fer-1 atue como um captador clássico de radicais hidroperoxila, esse mecanismo de quebra de cadeia não pode explicar a inibição observada de FTP.
Nossos resultados demonstraram que, quando fer-1 inibe a peroxidação, iniciada por ferro e traços de hidroperóxidos lipídicos em lipossomas, o padrão dos produtos oxidados foi sobreponível ao observado após peroxidação lipídica não inibida exaustiva. Isso apoiou a noção de que a atividade anti-ferroptótica de fer-1 se deve, na verdade, à captura de radicais alcoxila iniciadores produzidos pelo ferro ferroso a partir de hidroperóxidos lipídicos.
Notavelmente, o fer-1 atua de forma para-catalítica, não sendo consumido enquanto inibe a peroxidação lipídica dependente de ferro. Apoiados por evidências eletroanalíticas de que o fer-1 forma um complexo com o ferro, propomos que é o próprio ferro ferroso que reduz o radical fer-1. Esse mecanismo foi corroborado por cálculos de DFT mostrando: i) a redução do radical alcoxila pelo fer-1; e ii) a redução do radical fer-1 pelo ferro ferroso. A evidência de que em células HEK293T o fer-1 diminui o pool de ferro lábil celular é consistente com nossas conclusões.
Em resumo, o fer-1, na presença de ferro reduzido, elimina hidroperóxidos lipídicos, produzindo o mesmo efeito anti-ferroptótico que a GPx4, embora gere uma série de espécies oxidadas, mas não apenas derivados de ácidos graxos hidroxilados como a enzima faz.
Financiamento
Este trabalho foi apoiado por bolsas institucionais da (COZZ_SID18_01 para G.C. e MIOT_SID17_01 para G.M), pela Organização (RGP0013/2014) para F.U. e pela Bolsa REBEL2 (REdox state role in Bio-inspired ELementary reactions 2) para L.O.
Referências
Ferroptose: uma forma dependente de ferro de morte celular não apoptótica
Ferroptose e mecanismos de morte celular na doença de Parkinson
Necrose regulada: relevância para doenças e oportunidades terapêuticas
Ferroptose e lesão cerebral
GPx4 na infecção bacteriana e sepse polimicrobiana: envolvimento da ferroptose e piroptose
Um papel importante para a ferroptose na morte celular induzida por Mycobacterium tuberculosis e necrose tecidual
Medindo o potencial redox da glutationa em macrófagos infectados por HIV-1
GPx4, peroxidação lipídica e morte celular: descobertas, redescobertas e questões em aberto
Purificação a partir de fígado de porco de uma proteína que protege lipossomas e biomembranas da degradação peroxidativa e exibe atividade de glutationa peroxidase em hidroperóxidos de fosfatidilcolina
A selenoenzima glutationa peroxidase hidroperóxido de fosfolipídeo
Peroxidação lipídica microssomal: efeito da vitamina E e sua interação funcional com a glutationa peroxidase hidroperóxido de fosfolipídeo
Lipoxigenases de mamíferos e sua relevância biológica
Transformando lipoxigenases: enzimas específicas para PE disfarçadas
A selenoenzima glutationa peroxidase hidroperóxido de fosfolipídeo controla a atividade da 15-lipoxigenase com substratos complexos e preserva a especificidade dos produtos de oxigenação
Constantes de velocidade para as reações de radicais livres com oxigênio em solução
Peroxidação lipídica por radicais livres: mecanismos e análise
O que é responsável pela química iniciadora da peroxidação lipídica mediada por ferro: uma atualização
Invenção do primeiro composto azo a servir como fonte térmica de superóxido sob condições fisiológicas: conceito, síntese e propriedades químicas
Projeto de iniciadores azo assimétricos para aumentar a eficiência de geração de radicais em lipoproteínas de baixa densidade
Caracterização do efeito antioxidante das procianidinas
Inativação do regulador da ferroptose Gpx4 desencadeia insuficiência renal aguda em camundongos
Ferroestatinas inibem danos lipídicos oxidativos e morte celular em diversos modelos de doenças
Sobre o mecanismo de citoproteção pela ferrostatin-1 e liproxstatin-1 e o papel da peroxidação lipídica na morte celular ferroptótica
Purificação e caracterização da glutationa peroxidase de hidroperóxido fosfolipídico de membranas mitocondriais de testículo de rato
Base molecular para a inatividade catalítica de uma variante quase nula de ocorrência natural da ALOX15 humana
Redução de hidroperóxidos lipídicos catalisada pela glutationa peroxidase 4 em membranas: a cabeça polar dos fosfolipídios de membrana liga a enzima e direciona o grupo hidroperóxido do ácido graxo para o centro redox
Medição quantitativa da capacidade antioxidante total de captura de radicais peroxila do plasma sanguíneo humano por peroxidação controlada. A importante contribuição feita pelas proteínas plasmáticas
Contribuição das proantocianidinas para a capacidade de captura de radicais peroxila de alguns vinhos tintos italianos
Perfil lipídico por LC/MS a partir de soro humano: um novo método para extração global de lipídios
Lipostar, uma ferramenta abrangente de quimioinformática neutra em plataforma para lipidômica
Frisch MJ, Trucks GW, Schlegel HB, Scuseria GE, Robb MA, Cheeseman JR, et al Gaussian 16 Rev. B.01. Wallingford, CT2016.
O conjunto de funcionais de densidade M06 para termoquímica de grupo principal, cinética termoquímica, interações não covalentes, estados excitados e elementos de transição: dois novos funcionais e teste sistemático de quatro funcionais da classe M06 e 12 outros funcionais
Modelo de solvatação universal baseado na densidade eletrônica do soluto e em um modelo contínuo do solvente definido pela constante dielétrica do bulk e tensões superficiais atômicas
Transtornos psiquiátricos e lesão oxidativa: efeitos antioxidantes da terapia com zolpidem revelados in silico
Quelação de ferro e química redox do ácido antranílico e do ácido 3-hidroxiantranílico: uma comparação de dois metabólitos estruturalmente relacionados da via da quinurenina para obter melhores insights sobre seu papel potencial no desenvolvimento de doenças neurológicas
Oxidação eletroquímica de derivados dos ácidos cafeico e ferúlico em meio aprótico
Radicais oxiranilcarbinila a partir da ciclização do radical aliloxila: caracterização e informações cinéticas via espectroscopia de RSE
Efeitos isotópicos de deutério na autooxidação de hidrocarbonetos aralquílicos. Mecanismo da interação de radicais peroxila
Formação enzimática e por radicais livres de ácidos cis- e trans- epoxieicosatrienoicos in vitro e in vivo
O mecanismo catalítico de antioxidantes de captura de radicais do tipo diarilamina
Insights teóricos sobre o mecanismo de supressão da ferroptose via inativação de um radical de peróxido lipídico pela liproxstatin-1
O-Fenilenodiamina: um farmacóforo privilegiado de ferroestatinas para reatividade de captura de radicais no bloqueio da ferroptose
O ferro adquirido da transferrina por células K562 é entregue a um pool citoplasmático de ferro(II) quelável
Dados suplementares
A seguir estão os Dados Suplementares deste artigo:
Dados complementares deste artigo podem ser encontrados online em https://doi.org/10.1016/j.redox.2019.101328.