pmid: "40140422"
title: "Ferroptose se espalha para células vizinhas através de contatos da membrana plasmática."
authors: "Roeck BF, Lotfipour Nasudivar S, Vorndran MRH, Schueller L, Yapici FI, Rübsam M, von Karstedt S, Niessen CM, Garcia-Saez AJ"
journal: "Nature communications"
pubdate: "2025 Mar 26"
doi: "10.1038/s41467-025-58175-w"
source: "PMC Full Text"
Ferroptose se espalha para células vizinhas através de contatos da membrana plasmática.
Autores
Roeck BF, Lotfipour Nasudivar S, Vorndran MRH, Schueller L, Yapici FI, Rübsam M, von Karstedt S, Niessen CM, Garcia-Saez AJ
Periodico
Nature communications (2025 Mar 26)
Conteudo
Ferroptose se espalha para células vizinhas através de contatos de membrana plasmática
A ferroptose é uma forma lítica e dependente de ferro de morte celular regulada, caracterizada por peroxidação lipídica excessiva e associada à propagação de necrose em tecidos doentes através de mecanismos desconhecidos. Usando um novo sistema optogenético para indução de ferroptose mediada por luz através da degradação da proteína anti-ferroptótica GPX4, mostramos que a peroxidação lipídica e a morte ferroptótica podem se espalhar para células vizinhas através de suas membranas plasmáticas intimamente adjacentes. A propagação da ferroptose depende da distância celular e é completamente abolida pela interrupção dos contatos intercelulares dependentes de α-catenina ou pela quelação do ferro extracelular. Notavelmente, a ponte entre células com uma bicamada lipídica ou o aumento dos contatos entre células vizinhas aumenta a propagação da ferroptose. A reconstituição da propagação dependente de ferro da peroxidação lipídica entre lipossomas de lipídios puros em contato fornece evidências para o mecanismo físico-químico envolvido. Nossas descobertas apoiam um modelo no qual a peroxidação lipídica dependente de ferro se propaga através das membranas plasmáticas proximais de células vizinhas, promovendo assim a transmissão da morte celular ferroptótica com consequências para a propagação patológica da necrose tecidual.
Roeck et al. mostram que a ferroptose se espalha entre células vizinhas via peroxidação lipídica através de membranas adjacentes. O contato celular e o ferro extracelular são fatores-chave, destacando um mecanismo potencial para a propagação da necrose tecidual.
Introdução
A ferroptose é uma forma dependente de ferro de morte celular regulada que é principalmente impulsionada pelo acúmulo de peróxidos de fosfolipídios nas membranas celulares. No entanto, a ferroptose difere de outras vias de morte celular regulada por ser desencadeada quando os sistemas de defesa redox celulares excedem sua capacidade tampão antioxidante. Em contraste com a apoptose, piroptose ou necroptose, a morte celular ferroptótica não possui uma proteína executora terminal. Embora a peroxidação lipídica tenha sido identificada como um evento-chave durante a ferroptose, os mecanismos moleculares que governam a regulação e execução da ferroptose permanecem pouco compreendidos. A ferroptose excessiva tem sido associada a uma variedade de doenças, incluindo neurodegeneração, insuficiência renal ou acidente vascular cerebral. Além disso, a indução de ferroptose tem potencial como estratégia de tratamento anticancerígeno para cânceres refratários. A elucidação dos mecanismos celulares que regulam a ferroptose é, portanto, de grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias para combater doenças humanas.
Diferenças em ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) em fosfolipídios mono- e diacil definem a suscetibilidade das células à ferroptose. Além disso, numerosos mecanismos de defesa contra a ferroptose foram identificados, que compartilham a propriedade comum de neutralizar direta ou indiretamente os peróxidos lipídicos, incluindo uma variedade de sistemas como GPX4-GSH, FSP1-CoQH, DHODH-CoQH2, MBOAT1/2 e GCH1-BH4. Outros metabólitos endógenos também foram descobertos como sequestradores de radicais que podem atuar como supressores da ferroptose, incluindo várias vitaminas (K, E, A), 7-desidrocolesterol ou tetraidrobiopterina. Dentre eles, o sistema GPX4-GSH é o sistema de defesa anti-ferroptose mais potente. A GPX4 é um membro da família das glutationa peroxidases (GPX) que converte fosfolipídios hidroperóxidos em álcoois fosfolipídicos. Este papel crítico é ressaltado pelo fato de que a depleção ou inibição da GPX4 desencadeia a ferroptose. O GSH é um tripeptídeo composto por glicina, glutamato e cisteína. A cisteína é o gargalo na síntese de GSH e é principalmente importada através do sistema xc- como cistina, a forma oxidada da cisteína, que é então reduzida a cisteína no citosol.
Para adicionar outra camada de complexidade, foi proposto que a ferroptose se propaga através de populações celulares in vitro, o que tem sido associado à disseminação de necrose em tecidos doentes. Consequentemente, a inibição da ferroptose preveniu a necrose síncrona dos túbulos renais, que foi exacerbada por Erastina. Além disso, a morte celular em células cultivadas tratadas com agentes indutores de ferroptose ocorreu em padrões ondulatórios com características espaço-temporais distintas de outras formas de morte celular. O fator de ativação plaquetária (PAF) e derivados têm sido implicados nesse processo. No entanto, o uso de drogas para induzir ou bloquear a ferroptose, potencialmente afetando todas as células da população, limitou o estudo da propagação da ferroptose entre as células. Como resultado, o fenômeno da propagação da ferroptose permanece controverso, com questões-chave em aberto incluindo seus mecanismos moleculares e contribuição para a ferroptose tecidual.
Aqui, desenvolvemos uma nova ferramenta capaz de indução controlada de ferroptose em células selecionadas, combinando a depleção de GPX4 com as vantagens da optogenética. Usando esta ferramenta, demonstramos que células ferroptóticas individuais são capazes de induzir peroxidação lipídica e ferroptose em células vizinhas não tratadas, que podem então se propagar ainda mais para suas células adjacentes de forma dependente da distância. Mostramos que a propagação da ferroptose pode ser bloqueada pela quelação do ferro extracelular ou pela inibição genética dos contatos célula-célula através do nocaute de α-catenina, que pode ser resgatado pela reconstituição com α-catenina exógena. Além disso, descobrimos que aumentar a área de contato entre células adjacentes ou conectar células através de uma bicamada lipídica promove a propagação da ferroptose. Importantemente, reconstituímos a propagação da peroxidação lipídica dependente de ferro em sistemas modelo de membrana mínima compostos por lipossomos justapostos feitos de lipídios puros, suportando um mecanismo físico-químico que não requer componentes celulares adicionais. Com base nessas descobertas, propomos que a peroxidação lipídica dependente de ferro e a morte celular ferroptótica podem se propagar entre células vizinhas através de suas membranas plasmáticas intimamente justapostas, dependendo da α-catenina. Nossos achados estabelecem a propagação da morte celular como uma característica da ferroptose e fornecem uma nova compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos.
Resultados
A degradação induzida por luz da GPX4 induz ferroptose com alta resolução espacial e temporal
Indução controlada por luz da ferroptose com Opto-GPX4Deg.
a Imagens da avaliação de morte celular por coloração com DRAQ7 (magenta) em células HeLa expressando Opto-GPX4Deg ou Opto-Ctrl (verde) 10 h após iluminação. Barra de escala, 30 µm. b Cinética da morte celular desencadeada pela iluminação ativadora em células HeLa e HEK293 transfectadas com Opto-GPX4Deg ou Opto-Ctrl e tratadas ou não com Fer-1. Células DRAQ7 positivas normalizadas para células GFP positivas. Análise estatística por ANOVA de três fatores bilateral corrigida para comparações múltiplas usando o teste de comparação múltipla de Tukey. Valores expressos como média ± DP. c Análise de Western blot (WB) dos níveis de proteína Opto-GPX4Deg, Opto-Ctrl e GPX4 endógena ativados ou não com os tempos de iluminação indicados. GAPDH, controle de carregamento. d Quantificação dos WBs em (c). Níveis de proteína normalizados para o controle de carregamento. Valores expressos como média ± DP. Os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3). e, f Quantificação da Intensidade Média de Fluorescência (GFP) em células individuais nos tempos indicados, como leitura da degradação do Opto-GPX4Deg (escala de cinza de 8 bits). Barra de escala, 50 µm. g, h Análise de espectrometria de massa de lipídios oxidados e ácidos graxos, respectivamente. Mudança de fold no mapa de calor calculada dividindo as espécies lipídicas após iluminação pelo controle não iluminado para as réplicas individuais (esquerda) e média (direita). Os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3) para Opto-Ctrl e duas réplicas biológicas independentes (n = 2) para Opto-GPX4Deg. Cada réplica biológica independente é representada pela média de três réplicas técnicas. Salvo indicação em contrário, análise estatística por ANOVA unidirecional bilateral corrigida para comparações múltiplas usando o teste de comparação múltipla de Tukey. Valores exatos de p são mostrados. Todos os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3), salvo indicação em contrário.
Para desenvolver uma ferramenta capaz de desencadear ferroptose pela depleção de GPX4 induzida por luz, geramos uma construção optogenética chamada Opto-GPX4Deg, na qual GPX4 é fusionada a GFP e LOVpepdegron. LOVpepdegron é um domínio LOV2 que muda sua conformação sob iluminação com luz azul, expondo uma sequência de degron RRRG para degradação proteassomal mediada por ubiquitina (Fig. Suplementar 1a). Como controle negativo, geramos uma construção sem a sequência de degron, denominada Opto-Ctrl. Após confirmar sua sensibilidade à ferroptose (Fig. Suplementar 1c–h), células HEK293 ou HeLa expressando Opto-GPX4Deg ou Opto-Ctrl foram iluminadas usando um optoPlate-96 (ver Métodos), e a cinética de morte celular na população foi monitorada por imagem de células vivas. Células HEK293 e HeLa expressando Opto-GPX4Deg mostraram significativamente mais morte celular em comparação com células expressando Opto-Ctrl (Fig. 1a, b). A indução de morte celular após ativação do Opto-GPX4Deg foi proporcional à intensidade de iluminação (Fig. Suplementar 1i, j) e pôde ser inibida por ferrostatin (Fer-1) de forma dose-dependente (Fig. 1b), corroborando a morte celular ferroptótica.
Validamos que a ativação da ferramenta Opto-GPX4Deg leva à degradação da proteína de fusão. A análise de Western blot (WB) mostrou que os níveis proteicos de Opto-GPX4Deg, mas não do constructo controle, foram significativamente reduzidos (Fig. 1c, d e Fig. Suplementar 2b, c). Curiosamente, essa tendência também foi observada para os níveis de GPX4 endógena, sugerindo a existência de mecanismos coordenados para a regulação dos níveis de GPX4 ou uma interação dominante-negativa do degron com a GPX4 endógena. Como evidência adicional, uma redução na intensidade de GFP em células únicas foi detectada após a iluminação de células expressando Opto-GPX4Deg, mas não no constructo controle (Fig. 1e, f, correspondendo aos experimentos na Fig. 1a). Embora provavelmente não necessário para sua capacidade de induzir ferroptose, verificamos que a fusão Opto-GPX4Deg manteve algum nível de atividade de GPX4 ao confirmar sua capacidade parcial de resgatar a morte celular induzida pela privação de Fer-1 em células knockout (KO) para GPX4 ou pela depleção de GPX4 induzida por tamoxifeno (Fig. Suplementar 1l–n). Em conjunto, esses resultados indicam que a ferramenta Opto-GPX4Deg induz morte celular por degradação induzida por luz tanto de GPX4 exógena quanto endógena.
Confirmamos que a morte celular induzida por Opto-GPX4Deg era ferroptótica por análise lipidômica. Células expressando Opto-GPX4Deg ou Opto-Ctrl foram expostas a iluminação ativadora e processadas para análise lipidômica (Fig. Suplementar 2a). A análise de WB confirmou a degradação de GPX4 endógena e Opto-GPX4Deg, mas não do constructo Opto-Ctrl (Fig. Suplementar 2b, c). Importante, a análise de espectrometria de massas revelou um aumento significativo em espécies lipídicas oxidadas nas amostras Opto-GPX4Deg, mas não nos controles negativos (Fig. 1g). Detectamos os maiores enriquecimentos em espécies de fosfatidilcolina (PC) oxidadas, consistente com trabalhos anteriores em células HeLa. Essas observações foram acompanhadas por uma redução global em espécies de ácidos graxos (Fig. 1h), em boa concordância com análises lipidômicas de células HT-1080 ferroptóticas tratadas com Erastina, onde numerosos ácidos graxos monoinsaturados foram depletados.
Análise de célula única da indução de ferroptose com Opto-GPX4Deg.
a Imagens de alterações morfológicas em células expressando Opto-GPX4Deg após ativação (seta branca). Barras de escala, 10 µm. b Quantificação do tempo até a formação de blebs como indicador de morte celular para as construções indicadas, tratadas com Fer-1 conforme indicado. Pontos grandes representam as médias das réplicas, pontos pequenos representam medições de células individuais em réplicas individuais. Barras de erro, ±DP. c, d A ativação optogenética de Opto-GPX4Deg aumenta a peroxidação lipídica avaliada pela oxidação do C11-Bodipy. (c) Aparecimento da fluorescência verde (oxidada) do C11-Bodipy após iluminação de células selecionadas. Setas brancas, células ativadas com Opto-GPX4Deg. Asterisco branco, células controle não transfectadas ativadas. Barra de escala, 50 µm. d Razão de oxidação do C11-Bodipy calculada pela normalização do sinal de fluorescência verde com verde + vermelho do C11-Bodipy. Pontos grandes representam as médias das réplicas, pontos de dados pequenos representam medições de células individuais em réplicas individuais. Valores apresentados como média ± DP. Análise estatística por ANOVA unidirecional bilateral corrigida para comparações múltiplas usando o teste de comparação múltipla de Tukey. Valores exatos de p são mostrados. Todos os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3).
Combinados com microscopia de células vivas, os sistemas optogenéticos permitem estudar as consequências da ativação de vias de sinalização com alta resolução temporal e espacial. Como esperado, a iluminação ativadora de células HEK293 individuais selecionadas expressando Opto-GPX4Deg, mas não Opto-Ctrl, induziu eficientemente a morte celular (Fig. 2a, b). Quantificamos o tempo até a morte (usando a formação de blebs na membrana plasmática como substituto) de células individuais após iluminação ativadora, que variou de 13 a 20 min, com uma média de 17 min em células expressando Opto-GPX4Deg, significativamente mais rápido do que nos controles negativos (Fig. 2b). Os controles negativos também forneceram uma estimativa da fototoxicidade pela iluminação ativadora, confirmando que o protocolo de iluminação não foi suficiente para induzir morte celular em células Opto-GPX4Deg. O tratamento com 3 µM de Fer-1 resgatou a morte celular para níveis de controle, apoiando novamente que células ativadas expressando Opto-GPX4Deg morrem por ferroptose. Em vez disso, o tratamento com Fer-1 não afetou o tempo até a morte devido à fototoxicidade nas amostras controle, nem afetou a indução de morte celular usando uma ferramenta optogenética estabelecida de apoptose.
Para validar ainda mais que a ativação controlada por luz do Opto-GPX4Deg induziu morte celular por ferroptose, medimos a peroxidação lipídica nas membranas celulares, uma característica marcante dessa forma de morte celular. Coramos as células com C11-Bodipy, um indicador fluorescente ligado à membrana que altera suas propriedades de emissão quando oxidado e que é comumente usado como um indicador para detectar a peroxidação lipídica induzida por ferroptose. A iluminação ativadora causou uma onda de oxidação do C11-Bodipy tanto em células não transfectadas quanto em células que expressam Opto-GPX4Deg, possivelmente como consequência da exposição à luz de alta intensidade. No entanto, a taxa de oxidação do C11-Bodipy foi reduzida a níveis normais após 1 hora em células não transfectadas, enquanto a taxa de oxidação foi mantida ou ligeiramente aumentada em células que expressam Opto-GPX4Deg (Fig. 2c, d). Além disso, as células não transfectadas não alteraram sua morfologia ao longo do tempo, enquanto as células que expressam Opto-GPX4Deg apresentaram características morfológicas típicas de morte lítica, como o balonamento da membrana plasmática (Fig. 2c). Resultados semelhantes foram obtidos ao medir a peroxidação lipídica com C11-Bodipy usando o optoPlate-96 (Fig. Suplementar 2d–f). Esses resultados sugerem que a iluminação ativadora pode contribuir para a oxidação lipídica, o que levaria à ferroptose especificamente após a ativação do Opto-GPX4Deg.
Em conjunto, esses dados indicam que a indução de morte celular por Opto-GPX4Deg está associada a níveis aumentados de peroxidação lipídica, fornecendo evidências adicionais para a indução de ferroptose.
Células ferroptóticas são capazes de induzir ferroptose em células vizinhas
a Imagens de morte celular (DRAQ7, magenta) em células HeLa espectadoras (GFP negativas) em 0 h e 24 h pós-iluminação em amostras Opto-GPX4Deg e Opto-Ctrl. Barra de escala, 100 µm.
b–d % de células DRAQ7 positivas ao longo do tempo para populações celulares indicadas de experimentos em (a). Valores expressos como média ± DP.
d Para expressar os resultados experimentais de uma forma que possa ser mais facilmente comparada estatisticamente, calculamos a % da Área sob a Curva (AUC) para os gráficos da cinética de morte celular das diferentes populações celulares. ANOVA unidirecional bicaudal corrigida para comparações múltiplas usando o teste de comparação múltipla de Tukey. Experimentos realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3).
e Análise estatística de Hopkins para avaliação da tendência de agrupamento dos dados. Análise estatística com teste t paramétrico bicaudal. Experimentos realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3). Valores expressos como média ± DP.
f Distribuição das distâncias entre células mortas que expressam Opto-GPX4Deg ou Opto-Ctrl e células espectadoras mortas de experimentos em (a–d). Análise estatística por teste t paramétrico bicaudal. Valores expressos como média ± DP.
g O mesmo que em (f), mas usando Opto-Casp9 para indução de apoptose mediada por luz e o respectivo construto controle. Análise estatística por teste t paramétrico bicaudal. Valores expressos como média ± DP.
h Série temporal da propagação da peroxidação lipídica. Opto-GPX4Deg, azul; C11-Bodipy oxidado, verde. Setas brancas, células com oxidação de C11-Bodipy. Asteriscos brancos, células mortas. Barras de escala, 100 µm para visão geral e 50 µm para zoom. % de células C11-Bodipy positivas (C11-Bodipy oxidado) (i) e % de morte celular (k) ao longo do tempo nas populações indicadas tratadas ou não com 5 µM de Fer-1. Valores expressos como média ± DP.
j, l %AUC das diferentes populações celulares em (h, i). Análise estatística por ANOVA unidirecional bicaudal corrigida para comparações múltiplas usando o teste de comparação múltipla de Tukey. Valores expressos como média ± DP. Experimentos realizados com cinco réplicas biológicas independentes (n = 5).
Distribuição das distâncias entre células mortas que expressam Opto-GPX4Deg e células espectadoras mortas (m), e distâncias entre células espectadoras mortas (n). Análise estatística por ANOVA unidirecional bicaudal corrigida para comparações múltiplas usando o teste de comparação múltipla de Tukey. Os valores exatos de p são mostrados. Todos os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3), exceto em (i–l) e (f), onde foram realizadas cinco réplicas biológicas independentes (n = 5).
Estudos anteriores relataram que a ferroptose pode se espalhar em populações celulares in vitro e contribuir para a propagação da necrose em tecidos doentes. No entanto, essa noção tem sido difícil de demonstrar diretamente porque a indução farmacológica convencional de ferroptose pode afetar todas as células da população. Raciocinamos que o sistema Opto-GPX4Deg poderia superar essas limitações e permitir o estudo da propagação da ferroptose. Surpreendentemente, descobrimos que, após a iluminação de uma população de células transfectadas com Opto-GPX4Deg, não apenas as células que expressam Opto-GPX4Deg, mas também as células não transfectadas, que chamamos aqui de células espectadoras, morreram, o que não ocorreu nas amostras transfectadas com Opto-Ctrl (Fig. 3a–d e Vídeo Suplementar 1). Como um controle adicional para excluir a contribuição potencial de células expressando Opto-GPX4Deg abaixo do limite de detecção de fluorescência, ativamos células aparentemente espectadoras no bulk expressando Opto-Ctrl e Opto-GPX4Deg. A porcentagem de células com blebbing foi semelhante em todas as condições, indicando que essas células não expressavam os construtos optogenéticos em níveis suficientes para permitir a morte celular induzida por luz (Fig. Suplementar 1k).
A inspeção da cinética de morte celular sugeriu que, após a ativação, as células que expressam a ferramenta Opto-GPX4Deg morreram primeiro, seguidas pelas células espectadoras (Fig. 3b–d). Se a morte das células espectadoras estivesse relacionada à ativação de Opto-GPX4Deg, esperar-se-ia uma distribuição heterogênea da morte celular dentro da população de células espectadoras. Consequentemente, a análise da tendência de agrupamento do nosso conjunto de dados usando a estatística de Hopkins (ver Métodos) revelou que as células nas amostras de Opto-GPX4Deg morreram preferencialmente em aglomerados (valor = 0.67), enquanto a morte celular na população de células transfectadas com Opto-Ctrl foi distribuída aleatoriamente (valor = 0,43) (Fig. 3e).
Para nossa surpresa, descobrimos que a distância das células espectadoras mortas às células transfectadas mortas era significativamente menor nas amostras que expressavam Opto-GPX4Deg em comparação com o controle (Fig. 3f). Essa distância estava em boa concordância com o diâmetro médio das células HeLa (~23 µm, Fig. Suplementar 2g, h), sugerindo que as células que morrem por ferroptose induzida por Opto-GPX4Deg foram capazes de induzir a morte celular em células espectadoras em sua vizinhança imediata. Esse comportamento não foi observado quando a apoptose foi induzida por optogenética (Fig. 3g), sugerindo que a propagação da morte celular para células vizinhas é uma característica específica da ferroptose.
Em seguida, investigamos o modo de morte celular experimentado por células espectadoras adjacentes a células mortas pela ativação do Opto-GPX4Deg. Quantificamos simultaneamente a cinética da oxidação da membrana e da morte celular em células transfectadas e espectadoras, bem como as distâncias entre células transfectadas e espectadoras mortas, usando uma construção Opto-GPX4Deg na qual GFP foi substituída por BFP2. Células que expressavam a ferramenta Opto-GPX4Deg ativada primeiro acumularam C11-Bodipy oxidado, seguido por ruptura da membrana plasmática e morte celular. Com um atraso, células diretamente adjacentes a essas células ferroptóticas também acumularam lipídios oxidados e eventualmente morreram. Curiosamente, isso foi seguido por aumento de ROS lipídico e morte celular em suas células vizinhas (Fig. 3h–l, Fig. Suplementar 3 e Movie Suplementar 2). A administração de Fer-1 às amostras especificamente após a ativação do Opto-GPX4Deg não bloqueou a ferroptose nas células que expressam Opto-GPX4Deg, mas reduziu grandemente a morte celular nas células espectadoras (Fig. 3k, l; Fig. Suplementar 3a). Nas amostras controle, apenas níveis menores de peroxidação lipídica foram detectados e nenhuma propagação de morte celular foi observada (Fig. Suplementar 3b e veja abaixo). Além disso, a distância entre células espectadoras mortas nas amostras de Opto-GPX4, mas não nas amostras controle, correspondia à de células vizinhas (Fig. 3m, n). Esses resultados indicam que as células espectadoras vizinhas de células que morreram pela ativação do Opto-GPX4Deg também sofreram ferroptose, e que elas foram capazes de espalhar a oxidação lipídica e a morte celular ferroptótica para outras células espectadoras em sua proximidade. Essa evidência coletiva demonstra claramente a capacidade da ferroptose de se propagar através de populações celulares.
A interrupção dos contatos célula-célula abole a propagação da ferroptose
Efeito do meio condicionado, cálcio e confluência celular na ferroptose.
a Sobrenadantes derivados de células ferroptóticas ou controle de células GPX4 knockout de câncer de pulmão de pequenas células (CPPC) murino sob retirada de Fer-1 (esquerda) ou MEFs com GPX4 knockout induzível tratados com 1 µM de 4-hidroxitamoxifeno por 72 h (direita) foram transferidos para MEFs WT e tratados ou não com 0,1 µM de RSL3 ou 1 µM de Erastina, e 1 µM de Fer-1. A morte celular foi avaliada por coloração com DRAQ7 e quantificada pela contagem de objetos DRAQ7 dividida pela confluência. Os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3), exceto em (a direita) foram realizadas cinco réplicas biológicas independentes (n = 5). b Imagens dos fluxos de Ca2+ citosólico em células HEK293 transfectadas com Opto-GPX4Deg (setas brancas) e coradas com 1 µM de Fluo4-AM (verde) antes e após iluminação. Barra de escala, 50 µm. c Quantificação em célula única da intensidade média de fluorescência do Fluo4-AM em (b). n = 5 células ferroptóticas e 40 células vizinhas. a.u., unidades arbitrárias. d % de células HeLa DRAQ7 positivas ao longo do tempo para as populações indicadas com (esquerda) ou sem Ca2+ (direita) no meio. e %AUC para as populações em (d). f % de células HeLa DRAQ7 positivas ao longo do tempo transfectadas com Opto-GPX4Deg e plaqueadas na confluência indicada, tratadas ou não com 5 µM de Fer-1. Os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3). g %AUC para as populações em (f). ANOVA unidirecional bilateral corrigida para comparações múltiplas usando o teste de comparação múltipla de Tukey. Os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3). Valores exatos de p são mostrados. Todos os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3), exceto em (a direita) foram realizadas cinco réplicas biológicas independentes (n = 5).
Uma vez que a propagação da morte celular requer proximidade celular, hipotetizamos que contatos físicos entre células vizinhas poderiam estar diretamente envolvidos na disseminação da ferroptose. Para refutar essa hipótese, testamos se o meio condicionado contendo moléculas liberadas de células ferroptóticas seria suficiente para promover ferroptose em células. Embora não possamos descartar problemas de instabilidade ou concentrações locais, descobrimos que a transferência de sobrenadantes ferroptóticos para células saudáveis não resultou em um sinal de morte nas células receptoras (Fig. 4a).
Uma vez que os fluxos de cálcio citosólico foram associados à execução da ferroptose, investigamos em seguida se o cálcio poderia atuar como um gatilho local para a propagação da ferroptose para células vizinhas. Consistente com nosso trabalho anterior, observamos que células Opto-GPX4Deg em ferroptose exibiram aumento de cálcio citosólico medido com o indicador de cálcio Fluo-4-AM. No entanto, nenhum influxo significativo de cálcio ocorreu em células vizinhas durante a janela de tempo em que mantiveram sua integridade, sugerindo que os fluxos parácrinos de cálcio não desempenham um papel na propagação da ferroptose (Fig. 4b, c). Curiosamente, a depleção de cálcio no meio extracelular bloqueou a propagação da ferroptose sem afetar a sensibilidade intrínseca das células à ferroptose (células que expressam Opto-GPX4Deg morreram da mesma forma). Esses resultados indicam que a presença de cálcio extracelular desempenha um papel na propagação da ferroptose (Fig. 4d, e e Fig. Suplementar 4a, b), o que é interessante porque o cálcio é necessário para ancorar moléculas de caderina extracelular entre as células, sugerindo que a depleção de cálcio extracelular poderia interromper a proximidade célula-célula mediada por caderinas (veja abaixo).
Consistente com a distância intercelular entre as células sendo um parâmetro relevante para a propagação da ferroptose, descobrimos que o aumento da densidade celular tornou as células HeLa espectadoras mais sensíveis à morte celular induzida por células vizinhas que morrem por ativação de Opto-GPX4Deg (Fig. 4f, g). Como controle adicional, células HeLa tratadas com RSL3 também apresentaram maior sensibilidade à ferroptose em maior confluência celular (Fig. Suplementar 4c, d). No entanto, células HeLa que atingiram 100% de confluência tornaram-se insensíveis à indução de ferroptose por Opto-GPX4Deg ou RSL3, consistente com relatos de que densidades celulares extremamente altas promovem a sobrevivência de células GPX4 (KO).
A interrupção dos contatos célula-célula pela depleção de α-catenina abole a propagação da ferroptose.
Opto-GPX4Deg and bystander HeLa (a–d), SCLC (e–h), or HT29 (i–l) cells transfected with either siRNA against α-catenin or scramble siRNA (control), and treated or not with 5 µM Fer-1. a, e, i Kinetics of cell death in α-catenin KD and control samples. b, f, j %AUC for indicated populations. Experiments were performed with three independent biological replicates (n = 3). c, g, k WB analysis of indicated protein levels in α-catenin KD and control cells. d, h, l Quantification of WB in (c, g, k). Protein levels normalized to loading control. Experiments were performed with three independent biological replicates (n = 3). m Kinetics of cell death in Opto-GPX4Deg and bystander HeLa cells transfected with RFP-tagged empty vector, WT E-cadherin, E-cadherin ΔCBD mutant, WT N-cadherin or WT P-cadherin. n %AUC for the cell populations in (m) Experiments were performed with three independent biological replicates (n = 3). Statistical analysis by two-sided one-way ANOVA corrected for multiple comparisons using Tukey’s multiple comparison test or by parametric t-test (d, h, l). Exact p values are shown. All experiments were performed with three independent biological replicates (n = 3). Values are displayed as mean ± SD.
Para investigar o papel dos contatos célula-célula na propagação da ferroptose, depletamos a α-catenina, um componente chave do complexo de caderina que medeia a adesão célula-célula dependente de Ca2+, em células HeLa e realizamos experimentos de ativação do Opto-GPX4Deg induzida por luz. Apesar da depleção parcial, a propagação da morte celular das células que expressam Opto-GPX4Deg para as células espectadoras foi completamente abolida nas células com knockdown (KD) de α-catenina, mas não nos controles transfectados com siRNA scramble (Fig. 5a–d e Fig. Suplementar 5). Resultados semelhantes foram reproduzidos em experimentos com KD de α-catenina em células SCLC. No entanto, as células WT HT-29 já exibiam apenas propagação limitada da ferroptose na presença de α-catenina (Fig. 5e–l Fig. Suplementar 5). Interessantemente, observamos que a capacidade dessas linhagens celulares de sustentar a propagação da ferroptose correlacionou-se com os níveis de expressão de E-caderina (Fig. Suplementar 6), em linha com o papel protetor atribuído a essa proteína na ferroptose [https://www.proteinatlas.org/ENSG00000039068-CDH1/cell+line]. De fato, as células HeLa não expressam E-caderina, mas apresentam N-caderina, que estabelece contatos célula-célula dependentes de caderina também dependentes de α-catenina. Essa aparente contradição entre a função anti-ferroptose da E-caderina e seu papel no estabelecimento de contatos célula-célula nos levou a investigar mais a fundo o mecanismo envolvido.
Em consonância com a literatura, a superexpressão transiente de E-caderina em células HeLa bloqueou eficientemente a propagação da ferroptose sem afetar a sensibilidade das células que expressam Opto-GPX4Deg à morte por ferroptose induzida por luz (Fig. 5m, n e Fig. Suplementar 6g–i). Em contraste, nem a superexpressão de P-caderina nem de N-caderina impediu a propagação da ferroptose para células vizinhas (Fig. 5m, n e Fig. Suplementar 6g–i). Esses resultados sugerem um papel específico para a E-caderina, mas não para outras caderinas, no bloqueio da disseminação da ferroptose sem interferir na sensibilidade intrínseca à ferroptose de células individuais.
Um estudo anterior propôs que a depleção de E-caderina promove a ferroptose ao interromper o complexo de adesão das caderinas, levando à ativação do fator de transcrição YAP, que por sua vez regularia positivamente fatores pró-ferroptose como ACSL4 e TFRC. No entanto, esse modelo não é totalmente consistente com nossos resultados. Descobrimos que a interrupção do complexo de adesão das caderinas via knockdown de α-catenina também ativou YAP, evidenciado por uma redução na YAP fosforilada e um aumento na YAP nuclear (Fig. 5c, g, k e Fig. Suplementar S6), mas resultou, em vez disso, na inibição da propagação da ferroptose. Isso foi acompanhado por um aumento nos níveis das proteínas protetoras contra ferroptose GPX4 e/ou FSP1 (Fig. 5c, d, g, h, k, l). Esses resultados indicam que a ativação de YAP induzida pela ruptura dos contatos célula-célula não pode explicar o papel anti-ferroptose da E-caderina. Curiosamente, descobrimos que a superexpressão de um mutante da E-caderina sem o domínio de ligação à catenina (CBD) ainda bloqueou a propagação da ferroptose (Fig. 5m, n). Esse mutante da E-caderina é incapaz de recrutar eficientemente a α-catenina para os sítios de contato célula-célula e, portanto, não se liga eficientemente ao citoesqueleto de actina, resultando em adesão célula-célula fraca. Esses resultados revelam que a função anti-ferroptótica da E-caderina é independente do recrutamento da α-catenina para o complexo e provavelmente mediada por outras funções de sinalização da proteína.
A reconstituição com α-catenina resgata a propagação da ferroptose em células HeLa com knockout de α-catenina.
a, c, e, g Cinética da morte celular para Opto-GPX4Deg ativado e células vizinhas de clones HeLa KO (sg1, sg2) ou controle CRISPR (sg vazio) reconstituídos com α-catenina WT ou mutante exógena, tratadas ou não com 5 µM de Fer-1. b, d, f, h %AUC para as populações celulares indicadas. Os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3). Análise estatística por ANOVA unidirecional bicaudal corrigida para comparações múltiplas usando o teste de comparação múltipla de Tukey. Os valores exatos de p são mostrados. Todos os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3). Os valores são apresentados como média ± DP.
Para confirmar esses achados e demonstrar que a α-catenina é necessária para a propagação da ferroptose, geramos células HeLa com nocaute (KO) da α-catenina e as reconstituímos com α-catenina WT ou mutante exógena. Utilizamos mutantes sem o sítio de ligação à vinculina (ΔVBS), à β-catenina (Δβ-catenina) ou à F-actina (ΔF-actina), que interrompem parcialmente (ΔVBS) ou completamente os contatos celulares dependentes de caderina. Como esperado, a propagação da ferroptose foi abolida nas células KO para α-catenina e completamente restaurada quando reconstituídas com α-catenina WT. Interessantemente, a reconstituição com os mutantes Δβ-catenina ou ΔF-actina não resgatou a propagação da ferroptose, mas a reconstituição com o mutante ΔVBS resultou em restauração parcial (Fig. 6, Fig. Suplementar 7). Controles negativos de toxicidade devido à iluminação nas diferentes condições são mostrados na Fig. Suplementar 8. Em concordância com isso, as células KO para α-catenina apresentaram sensibilidade reduzida ao tratamento com RSL3, que foi aumentada pela reconstituição com α-catenina WT e, em menor grau, pela reconstituição com o mutante ΔVBS (Fig. Suplementar 9). Embora não possamos descartar um papel adicional da α-catenina na ferroptose independente da adesão celular, já que, por exemplo, a α-catenina também modula a liberação de vesículas extracelulares e a formação de brotos na membrana, esses resultados indicam que a interferência genética na função da α-catenina nos contatos célula-célula bloqueia a propagação da ferroptose.
Transferência da peroxidação lipídica dependente de ferro entre membranas justapostas medeia a propagação da ferroptose
De acordo com nossa hipótese de que a propagação da peroxidação lipídica entre células vizinhas requer a proximidade de suas membranas plasmáticas, consideramos que o aumento químico do contato de membrana entre as células deveria promover a propagação da ferroptose em células depletadas de α-catenina. Dessa forma, a propagação da ferroptose em amostras Opto-GPX4Deg com KD de α-catenina foi resgatada pelo tratamento com concentrações não tóxicas de blebbistatina, uma droga que aumenta o volume celular ao inibir a contratilidade do córtex, promovendo assim contatos entre células vizinhas (Fig. Suplementar 10). A adição de blebbistatina também aumentou a propagação da ferroptose em células tratadas com siRNA scrambl e (Fig. Suplementar 10g–i), como resultado do aumento da proximidade célula-célula.
A ferroptose se propaga através da transferência de reações de peroxidação lipídica entre membranas plasmáticas proximais de células vizinhas.
a Esquema do desenho experimental em (b). Células Opto-Ctrl ou Opto-GPX4Deg e células HeLa espectadoras semeadas em uma bicamada lipídica suportada ou diretamente em vidro foram expostas à iluminação ativadora. A bicamada lipídica tem a função de atuar como uma ponte de membrana entre as células e facilitar a difusão de lipídios oxidados. Criado no BioRender. Garcia, A. (2025) https://BioRender.com/v39k921. b Cinética de morte celular para células Opto-GPX4Deg ativadas e HeLa espectadoras cultivadas ou não em uma bicamada lipídica e tratadas ou não com 5 µM de Fer-1. c %AUC para as populações celulares indicadas. Os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3). d Imagens da oxidação de C11-Bodipy e morte celular em células HeLa Opto-GPX4Deg ativadas e células vizinhas espectadoras cultivadas em uma bicamada lipídica. Opto-GPX4Deg, azul; Bodipy oxidado, verde; Bodipy reduzido, vermelho. Barra de escala, 30 µm. e Quantificação de C11-Bodipy oxidado ao longo do tempo em células e na bicamada lipídica (d). f–h Cinética de morte celular para células Opto-GPX4Deg ativadas e HeLa espectadoras tratadas com DMSO, 100 µM de DFO ou 100 µM de 2,2-dipiridila, conforme indicado. i %AUC para as populações celulares indicadas. Os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3). j Imagens da oxidação de C11-Bodipy (verde) em um GUV "doador" marcado com DiD (ciano) e contendo um lipídio fotossensibilizador (DMMB) antes e depois da iluminação ativadora. A peroxidação lipídica (medida como aumento na fluorescência do C11-Bodipy oxidado, verde) se espalha para um GUV "aceptor" anexado que não possui DMMB. C11-Bodipy reduzido mostrado em vermelho. Iluminação controlada em uma pequena região de membrana do GUV doador (caixa amarela) induziu oxidação lipídica ativada por luz no GUV doador e posteriormente no GUV aceptor. t = 0 min indica a primeira imagem após a ativação. Regiões de membrana nas quais a razão de oxidação do C11-Bodipy foi calculada são mostradas em caixas brancas (GUV aceptor) e rosa (GUV doador). Barra de escala, 5 µm. k, l Quantificação da razão entre C11-Bodipy oxidado e reduzido em GUVs doadores e aceptores ao longo do tempo na ausência ou presença de 10 mM de perclorato de ferro (II). Os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3). Análise estatística por ANOVA unidirecional bicaudal corrigida para comparações múltiplas usando o teste de comparação múltipla de Tukey. Valores de p exatos são mostrados. Todos os experimentos foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3). Os valores são apresentados como média ± DP.
Nossa hipótese também preveria que superar a distância entre células com uma membrana capaz de sustentar a propagação da peroxidação lipídica seria suficiente para aumentar a propagação da ferroptose (Fig. 7a). De fato, a indução da ferroptose controlada por luz com Opto-GPX4Deg em células semeadas em uma bicamada lipídica acelerou a propagação da peroxidação lipídica e da morte celular ferroptótica em comparação com células semeadas em vidro na mesma densidade, sem afetar a sensibilidade à ferroptose de células individuais, o que poderia ser bloqueado pela adição de Fer-1 (Fig. 7b–e, Fig. Suplementar 11a–h e Filmes Suplementares 3 e 4). Nesses experimentos, as bicamadas lipídicas sintéticas continham lipídios insaturados que poderiam oxidar ao entrar em contato com uma célula em ferroptose e então difundir através do plano da bicamada lipídica para alcançar uma nova célula que não havia sido induzida a sofrer ferroptose, e promover sua oxidação lipídica e morte celular. Consequentemente, também pudemos medir que a bicamada lipídica foi oxidada pela fotoativação de Opto-GPX4Deg, mas não pelas células controle (Fig. 7d, e e Fig. Suplementar 11g, h). Esses resultados, portanto, demonstram que a transferência de peroxidação lipídica pode se propagar à distância entre células, desde que haja uma membrana lipídica conectando-as.
Esses resultados também sugerem a existência de reações de oxidação lipídica dependentes de ferro no lado extracelular das membranas. Para testar sua relevância na propagação da ferroptose, tratamos células com deferoxamina (DFO). A DFO é um quelante de ferro extracelular clinicamente relevante (de fato, a síntese de derivados da DFO permeáveis às células tem sido objeto de considerável esforço). Curiosamente, descobrimos que o tratamento com DFO inibiu a propagação da ferroptose sem afetar a sensibilidade intrínseca de células individuais à ferroptose (Fig. 7f–i e Fig. Suplementar 11i–p). Em contraste, a quelação tanto do ferro extracelular quanto intracelular com 2,2-dipiridil bloqueou a ferroptose tanto em células espectadoras quanto em células expressando Opto-GPX4Deg. A DFO poderia se acumular ao longo do tempo nos lisossomos via captação endossomal, o que poderia interferir na ferroptose. No entanto, sob nossas condições experimentais, o pré-tratamento com DFO por 4 h ou 8 h não alterou os níveis de morte celular de células expressando Opto-GPX4Deg ativado em comparação com o controle DMSO (Fig. Suplementar 11k–p). Esses resultados sugeririam que as reações de peroxidação lipídica dependentes de ferro no folheto externo da membrana plasmática são necessárias para a propagação da ferroptose.
Finalmente, para fornecer evidências definitivas de que a peroxidação lipídica pode se espalhar entre membranas plasmáticas justapostas, usamos um sistema mínimo quimicamente controlado baseado em lipossomos feitos de membranas lipídicas puras e desprovidos de componentes celulares. Preparamos duas populações de Vesículas Unilamelares Gigantes (GUVs), que são lipossomos de tamanho micrométrico que podem ser visualizados por microscopia confocal, todas contendo C11-Bodipy para avaliar seu estado de oxidação. Incluímos uma sonda fotossensibilizadora, DMMB, em uma população de lipossomos que chamamos de GUVs “doadoras”, que também foram marcadas com DiD para distingui-las nas imagens de microscopia. DMMB é um lipídeo fotossensível que demonstrou induzir oxidação da membrana em GUVs após exposição a iluminação ativadora. A segunda população de GUVs não continha DMMB e DiD, e as chamamos de GUVs “receptoras”. Colocamos as membranas das GUVs doadoras e receptoras em contato ao incluir lipídeos biotinilados em sua composição e estreptavidina no meio externo (Fig. 7j e Fig. Suplementar 12). Confirmamos que, antes da iluminação, todas as membranas das GUVs estavam em estado reduzido com base na razão de fluorescência do C11-Bodipy. Em seguida, iluminamos uma pequena região da membrana da GUV doadora e quantificamos o aparecimento do sinal da forma oxidada do C11-Bodipy na membrana da GUV doadora ao longo do tempo (Fig. 7k e Fig. Suplementar 12a, b). Importante, em um estágio posterior, também conseguimos detectar um aumento na fluorescência do C11-Bodipy oxidado na GUV receptora aderida, que dependia da presença de ferro no meio externo, indicando propagação dependente de ferro da oxidação lipídica para a GUV receptora (Fig. 7l). Como controles, a imagem de GUVs sem fotoativação não resultou em oxidação lipídica medida pela fluorescência do C11-Bodipy (Fig. Suplementar 13). Além disso, a ausência de transferência de DiD da doadora para a receptora mostra que, apesar do contato, suas membranas não trocam lipídeos e mantêm sua identidade (Fig. 7j). Finalmente, a oxidação lipídica induzida por luz nas GUVs doadoras não se propagou para as GUVs receptoras se suas membranas não estivessem em contato próximo (Fig. Suplementar S12c). Esses resultados demonstram que a proximidade próxima é suficiente para a propagação da peroxidação lipídica dependente de ferro entre membranas, e que nenhum outro componente ou via celular é necessário.
Coletivamente, essas descobertas revelam um mecanismo para a propagação da ferroptose entre populações celulares baseado na transferência físico-química de reações de peroxidação lipídica dependente de ferro entre membranas adjacentes.
Discussão
Aqui, desenvolvemos uma nova ferramenta optogenética para a indução controlada por luz da ferroptose. Ao induzir seletivamente a ferroptose em algumas células de escolha, pudemos visualizar diretamente o aumento da oxidação lipídica seguido pela morte celular não apenas nas células ativadas, mas também a propagação ao longo do tempo para células espectadoras que não haviam sido expostas a um sinal indutor de ferroptose nem modificadas geneticamente de qualquer forma que pudesse alterar sua sensibilidade à ferroptose. Notavelmente, uma vez que as células se tornaram ferroptóticas, as células espectadoras também foram capazes de propagar ainda mais a oxidação lipídica e a subsequente morte celular para seus vizinhos. Assim, nossos resultados demonstram claramente que a ferroptose pode se propagar através de populações celulares, conforme proposto em estudos anteriores.
Importante, o Opto-GPX4Deg nos permitiu dissecar os mecanismos subjacentes à propagação da ferroptose. Descobrimos que a propagação da ferroptose induzida pelo Opto-GPX4Deg era dependente da distância entre as células. Em contraste com a apoptose desencadeada optogeneticamente, a indução de morte celular foi altamente prevalente em células adjacentes, identificando a proximidade como um parâmetro-chave na propagação da ferroptose. Importante, a propagação da ferroptose foi abolida após a depleção de α-catenina, sugerindo fortemente um papel do complexo de adesão das caderinas e dos contatos célula-célula nesse processo. A especificidade do papel da α-catenina na propagação da ferroptose foi confirmada por experimentos de reconstituição nos quais a α-catenina WT, mas não mutantes que interrompem a adesão celular eficiente, restaurou completamente a propagação da ferroptose em células HeLa KO para α-catenina espectadoras. Além disso, nossos dados apontam para um papel da peroxidação lipídica mediada por ferro na superfície celular na propagação da ferroptose, já que o DFO, um quelante de ferro majoritariamente extracelular, aboliu a propagação da ferroptose sem afetar a sensibilidade intrínseca à ferroptose de células individuais.
Vale ressaltar que a E-caderina, uma molécula de adesão que impulsiona os contatos célula-célula, tem um papel protetor na ferroptose, o que foi proposto depender da via Hippo e da sinalização YAP [https://www.proteinatlas.org/ENSG00000039068-CDH1/cell+line]. De acordo com essa função, descobrimos que a propagação da ferroptose era ineficiente em células HT-29, que apresentam altos níveis de expressão de E-caderina, e poderia ser bloqueada pela expressão exógena de E-caderina, mas não de P- ou N-caderina, em células HeLa. No entanto, nossos resultados combinados indicam que a inibição da atividade de YAP por si só não pode explicar o papel protetor da E-caderina na ferroptose. Primeiro, tanto a superexpressão de E-caderina quanto a depleção de α-catenina resultaram na ativação de YAP, como mostrado anteriormente, mas tiveram efeitos opostos na ferroptose. Além disso, a expressão de uma versão mutante da E-caderina, que é incapaz de se ligar à α-catenina e só pode mediar contatos célula-célula fracos, mas retém outras funções de sinalização da molécula, ainda inibiu a ferroptose enquanto também ativava a sinalização YAP. Dado que a E-caderina é regulada positivamente pelo aumento da densidade celular, é tentador especular que o papel anti-ferroptótico da E-caderina evoluiu para contrabalançar o aumento da sensibilidade à propagação da ferroptose em tecidos com contatos célula-célula muito altos.
Trabalhos anteriores de nós e de outros mostraram que a indução da ferroptose leva à peroxidação lipídica acompanhada por um aumento sustentado dos níveis de Ca2+ citosólico antes do rompimento celular. Nossas descobertas anteriores sugeriram que os fluxos de cálcio eram causados por danos à membrana na forma de pequenos poros na membrana plasmática a jusante da peroxidação lipídica. Consistente com isso, conseguimos recapitular essas descobertas com nosso sistema optogenético. No entanto, os resultados não apoiam um papel dos fluxos parácrinos de cálcio na propagação da ferroptose. Embora tenhamos conseguido observar aumento de cálcio citosólico em células que morrem pela ativação do Opto-GPX4Deg, não detectamos mudanças significativas no cálcio citosólico em células vizinhas durante a janela de tempo em que a morte celular ocorreu nas células opto-ativadas e uma vez que o conteúdo de cálcio dessa célula foi diluído no meio após o rompimento. Em vez disso, identificamos um papel do cálcio extracelular na propagação da ferroptose consistente com seu papel nos contatos célula-célula, uma vez que as caderinas são moléculas de adesão celular dependentes de cálcio, cujo domínio extracelular se desdobra na ausência de cálcio extracelular e se torna sensível à clivagem por protease.
Embora possa haver mecanismos adicionais baseados em fatores solúveis que contribuem para a propagação da ferroptose, nossas evidências coletivas mostram que a ferroptose pode se propagar para células vizinhas por meio da transferência de reações de peroxidação lipídica dependentes de ferro através da justaposição íntima das membranas plasmáticas possibilitada pelos contatos célula-célula. Além da manipulação genética da adesão celular, aproximar as membranas celulares com blebbistatina é suficiente para resgatar a propagação da ferroptose em células depletadas de α-catenina. Além disso, preencher a distância entre as células com uma bicamada lipídica artificial que conecta suas membranas e pode espalhar a peroxidação lipídica foi suficiente para aumentar significativamente a propagação da ferroptose. Finalmente, usando sistemas reconstituídos mínimos baseados em modelos de membrana puramente sintéticos, mostramos que a peroxidação lipídica pode se propagar entre membranas lipídicas em contato, dependendo da presença de ferro. Esses experimentos demonstram diretamente que a peroxidação lipídica pode se espalhar entre membranas justapostas na ausência de quaisquer outros componentes celulares, fortalecendo assim as evidências do mecanismo físico-químico de propagação da ferroptose aqui descoberto.
Um estudo recente descreveu que a ferroptose pode se propagar através de ondas desencadeadoras de ROS, que foram iniciadas usando luz laser azul combinada com supressão subletal da captação de cistina em populações celulares inteiras, permitindo a propagação independente de contato celular. No entanto, nessas condições, as células foram artificialmente pré-condicionadas para ferroptose e estressadas próximas ao limiar de morte celular. Em contraste, nossa abordagem optogenética induz seletivamente a ferroptose em um subconjunto de células sem alterar a sensibilidade à ferroptose das células espectadoras. Sob nossas condições experimentais, não observamos propagação da ferroptose independente de contato celular. Nossos resultados indicam que os contatos célula-célula diretos e a transferência de peroxidação lipídica dependente de ferro provavelmente desempenham um papel predominante na propagação da ferroptose em condições mais fisiológicas, sem o priming ferroptótico.
A propagação da ferroptose tem sido proposta como desempenhando um papel na formação de tecido necrótico no epitélio intestinal, no tecido cardíaco, na excitotoxicidade no cérebro e nos túbulos renais, destacando sua relevância fisiopatológica. Notavelmente, nossos resultados demonstram que a propagação da ferroptose pode ser bloqueada tanto geneticamente quanto com fármacos e, portanto, pode ser alvo para terapia. O tratamento com DFO, um fármaco aprovado clinicamente para o tratamento de sobrecarga de ferro que aqui mostramos bloquear especificamente a propagação da ferroptose, demonstrou mitigar lesões cardíacas e cerebrais isquêmicas em roedores. Em estudos clínicos, o DFO amenizou o estresse oxidativo sem reduzir o tamanho do infarto cardíaco, protegeu o miocárdio contra lesão de reperfusão durante a cirurgia de revascularização do miocárdio e retardou a progressão da demência associada à doença de Alzheimer. O papel protetor do DFO nesses contextos também destaca a contribuição específica da propagação da ferroptose para a doença. Assim, ao lançar nova luz sobre o mecanismo molecular da propagação da ferroptose, nossos resultados podem orientar novas estratégias terapêuticas contra doenças associadas à ferroptose. Além disso, a ferramenta Opto-GPX4Deg aqui apresentada oferece novas oportunidades para abordar a relevância fisiológica da propagação da ferroptose em diferentes contextos fisiológicos e patológicos in vivo e para aprofundar nossa compreensão de como moduladores da ferroptose podem ser explorados para tratamentos futuros.
Em conclusão, usando uma nova ferramenta optogenética para indução controlada por luz da ferroptose, demonstramos que a peroxidação lipídica e a morte celular ferroptótica podem se propagar para células vizinhas em contato próximo. Também mostramos que a propagação da ferroptose pode ocorrer através da transferência de reações de peroxidação lipídica dependentes de ferro entre as membranas plasmáticas intimamente justapostas nos contatos célula-célula. A capacidade de abolir a propagação da ferroptose geneticamente ou com quelantes de ferro extracelular abre novas vias para alvejar especificamente a disseminação da ferroptose na terapia.
Métodos
Correspondência e materiais devem ser solicitados ao autor correspondente.
Reagentes
Erastina-1, RSL3, Nec-2 e Fer-1 foram adquiridos da Biomol (Alemanha). zVAD foi obtido da APEXBIO (Houston, TX, EUA) e C11-BODIPY 581/591, bem como Fluo-4-AM, da Thermo Fisher. FINO2 foi adquirido da MedChemExpress (EUA). Tamoxifeno foi comprado da Sigma-Aldrich. DRAQ7 foi obtido da Invitrogen. Blebbistatina foi adquirida da Cayman Chemicals. Tanto DFO quanto 2,2-Bipiridila foram obtidos da Sigma-Aldrich. Padrões lipídicos ou corantes foram adquiridos da Sigma Aldrich (St. Louis, EUA) ou Avanti Polar Lipids (Alabaster, EUA). Solventes orgânicos foram adquiridos da Supelco/Merck KGaA (Darmstadt, Alemanha).
Plasmídeos
Plasmids were cloned via restriction digest cloning as follows: The pMTG02-Amp-FRT plasmid (Addgene #128271) was used as template for amplifying the LOVpep (without the RRRG degron) and LOVpepdegron fragments, which was cloned into the pcDNA™3.1 (+) backbone from Invitrogen using the ApaI and XhoI restrictions sites (primers: Lovpep_xhoI_fwd sequence = tggtatcCTCGAGtttttggctactacacttgaac-gtattgag; LOVpep_apaI_rev sequence = atattaaGGGCCCttagccgcggcggcggg; LOVpepwo_apaI_rev sequence = tattaTAAGGGCCCggcggcctcgtcgatgttctc). Subsequently, the cDNA of GPX4 was amplified from the GPX4 plasmid (Addgene #38797) and inserted in the before generated pcDNA3.1_LOVpepdegron and pcDNA3.1_LOVpep plasmids using the EcoRI and NotI restriction sites. The cDNA of the EGFP was amplified from the pGFP-Cytochrome C (Addgene #41181) and inserted in the pcDNA3.1_GPX4_LOVpepdegron, pcDNA3.1_GPX4_LOVpep and the pcDNA3.1_LOVpepdegron to generate in the paper used GFP_GPX4_LOVpepdegron (Opto-GPX4Deg), GFP_GPX4_LOVpep and GFP_LOVpepdegron plasmids (Opto-Ctrl) (primers: EGFP_HindIII_fwd sequence = atattacAAGCTTCACCAT-GGTGAGCAAGGGCGAGGAGC; EGFP_EcoRI_rev sequence = atattacaGAAT-TCGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA). To generate the BFP_GPX4 _LOVpepdegron plasmid the mTagBFP2-TOMM20-N-10 (Plasmid #55328) was used as a template to amplify BFP2 and inserted into the GFP_GPX4_LOVpepdegron using the HindIII and EcoRI restriction sites (primers: mTagBFP2_HindIII_fwd sequence = atattaAAGCTTcaccatggtgtctaagggcgaa; mTagBFP2_EcoRI_rev sequence = atattaG-AATTCgcattaagtttgtgccccagtttgcta. The GFP_Cry2 plasmid was generated by amplifying Cry2 from the Cry2(1-531)-mCh-BAXS184E plasmid (see below), which was then inserted into the GFP_LOVpepdegron using the NotI and ApaI restriction sites (primers: Cry2_NotI_fwd sequence = attaGCGGCCGCatgaaga-tggacaaaaagactatagt; Cry2_ApaI_rev sequence = tattaTAAGGGCCCtac-ttgttggtcattagaagaca). The following plasmids were obtained from Addgene: Cry2(1-531)-mCh-BAXS184E (#117238), Tom20-CIB-GFP (#117242), pcDNA-NLS-PhoCl-mCherry (#87691), pmcherry α-catenin WT (#178646) and pmcherry α-catenin ΔVBS (#178649).
ΔF-actina foi gerado amplificando α-catenina WT 1-864 e Δß-catenina amplificando α-catenina WT 259-906 e subsequentemente inserindo as amplificações em pmcherry α-catenina WT usando os sítios de restrição SacI e MfeI (primers: sequência deltaf_SacI_fwd = atattaGAGCTCatgactgctgtccatgcaggc; sequência deltaf_MfeI_rev = atattaCAATTGTTAaccctgtgacttttggtatttggtagaggc; sequência deltab_SacI_fwd = atattaGAGCTCATGttgaggaatgctggcaat; sequência deltab_MfeI_rev = atatta-CAATTGttagatgctgtccatagctttg). pcDNA3-mRFP (Plasmídeo #13032) foi usado como controle e o pCS2+mEcadRFP e pCS2+mEcad ΔCBD-RFP foram uma gentil doação de C. Niessen, Univ. de Colônia. N-caderina em pCCL-c-MNDU3c-PGK-EGFP (Plasmídeo #38153) e pcDNA3 P-cad (Plasmídeo #47502) foram usados para amplificar N- e P-caderina em pCS2+mEcadRFP usando os sítios de restrição HindIII/XbaI (primers: sequência N-caderina_HindIII_fwd = atattaAAGCTTcaccatgagggacaattggagaagtg; sequência N-caderina_XbaI_rev = tattaTCTAGAGATCCtcgataccgtcgagatccg; sequência P-caderina_HindIII_fwd = tattaAAGCTTatggggctccctcgtggacctctc; sequência P-caderina_XbaI_rev = tattaTCTAGAGGATCCgtcgtcctccccgccaccg). As sequências dos insertos foram validadas por sequenciamento Sanger.
Cultura de células
Todas as linhagens celulares foram cultivadas a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. As células HEK293 e HT-29 (gentilmente cedidas por F. Essmann, Univ. de Tübingen), células HeLa (gentilmente cedidas por A. Villunger, Univ. Med. de Innsbruck) e as células GPX4 KO Pfa1 induzíveis por tamoxifeno (gentilmente cedidas por M. Conrad, Centro Helmholtz de Munique) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco com baixa glicose (DMEM) (Sigma-Aldrich) e suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina–estreptomicina (P/S) (Thermo Fisher Scientific). As células RP285.5 de SCLC GPX4 KO murinas (gentilmente cedidas por S. von Karstedt, Univ. de Colônia) foram cultivadas em RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) e suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina–estreptomicina (P/S) (Thermo Fisher Scientific).
Transfecção celular
Para transfecções, foi utilizado Polietilenimina (PEI; Polyscience, Warrington, PA) com concentração de 1 mg/mL em uma proporção de 5:1 (PEI: DNA) para os experimentos de confocal e de 3:1 para os experimentos optogenéticos de alto rendimento. A seguir, o procedimento de transfecção é descrito para as câmaras de 8 poços: 25 µl de Opti-MEM (Thermo Fisher) por poço foram misturados com 1,2 µl de PEI e incubados por 2 min à temperatura ambiente. 240 ng de plasmídeo foram misturados com 25 µl de Opti-MEM e subsequentemente adicionados à mistura PEI/Opti-MEM. Em seguida, a mistura foi ressuspendida e incubada por 20 min à temperatura ambiente. Depois, o meio das câmaras de 8 poços foi aspirado e substituído por 200 µl de meio DMEM sem vermelho de fenol, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina–estreptomicina (P/S) (Thermo Fisher). Após isso, a mistura de transfecção foi adicionada gota a gota aos poços. Para transfectar células, por exemplo, em formato de placa de 6 poços ou placa de 96 poços, os volumes dos reagentes mencionados acima foram proporcionalmente adaptados e, nesses formatos, o meio de cultura celular não foi substituído no dia seguinte, mas após o meio fresco transfectado ser suplementado com os respectivos fármacos e/ou marcadores de morte celular e adicionado aos poços.
Experimentos de silenciamento
A transfecção de siRNA foi realizada em placas de seis poços. Para cada poço, 20 pmol de siRNA de α-catenina (GGAGCCAGCUAGAUAUUAA, SiTools Biotech) ou siRNA controle/não direcionado (D-001810-0120, SiTools Biotech) foram pré-misturados em 100 µl de Opti-MEM (Thermo Fisher) e misturados 1:1 com 5-μl de Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) ou PEI (consulte transfecções celulares) diluídos em 100 μl de Opti-MEM. A mistura foi incubada por 25 min à temperatura ambiente e, em seguida, adicionada gota a gota às células. A transfecção de siRNA foi realizada por 48 h antes da transfecção com as ferramentas optogenéticas ou por 72 h antes da coleta das células para immunoblotting. Os níveis da proteína endógena foram verificados por immunoblotting.
Geração de linhagem celular por CRISPR/Cas9
α-Catenina CRISPR/Cas9 knockout foram gerados em células HeLa WT. Para a transfecção CRISPR, 7 × 105 células foram semeadas em uma placa de seis poços, onde em seguida foi realizada uma transfecção reversa com 1,5 µg de constructo CRISPR e 6 µl de PEI. Dezesseis horas após a transfecção, células únicas expressando CRISPR (GFP positivas) foram separadas em placas de 96 poços e cultivadas para validação. O sucesso do knockout foi validado por western blotting.
Plasmídeos e constructos: as seguintes sequências de RNA guia foram usadas para a geração das linhagens celulares HeLa com knockout de α-Catenina por CRISPR/Cas9:
hCTNNA1_sgRNA#1FWD CACCGTTTATCGATGCTTCCCGCC hCTNNA1_sgRNA#1REV AAACGGCGGGAAGCATCGATAAAC
hCTNNA1_sgRNA#2FWD CACCGTCACGTAGTCACCTCAGAGA
hCTNNA1_sgRNA#2REV AAACTCTCTGAGGTGACTACGTGAC
Pares de oligonucleotídeos contendo a sequência de gRNA foram clonados no vetor pU6-(BbsI)sgRNA_CAG-Cas9-venus-bpA (Addgene #86986) usando o sítio de restrição BbsI.
Imagem de células vivas por confocal
De acordo com o fluxo de trabalho na Fig. S1b, 5.000 células foram semeadas em câmaras removíveis de 8 poços (Cat.No: 80841 ibidi) em combinação com uma lamínula de vidro adequada para microscopia confocal (VWR). Todos os experimentos confocais foram realizados usando um Microscópio Confocal de Varredura a Laser LSM 980 com Airyscan 2 e multiplex, GaAsP (4x), PMT (2x), T-PMT, detector externo BiG.2 Typ B 980 (Carl Zeiss Microscopy). (Carl Zeiss Microscopy). Para imageamento, uma objetiva 40x/1,2 W C-Apochromat, lasers de diodo com comprimentos de onda de 405 nm, 455 nm, 488 nm e 561 nm (todos 30 mW), detectores GaAsP e de luz transmitida (T-PMT), bem como divisores de feixe principais do LSM (MBS 405 e MBS 488/561/633) foram usados. Os experimentos foram realizados a 37 °C e 5% CO2 usando um módulo de incubação integrado (Carl Zeiss Microscopy). O software de análise de imagem ZEN (Carl Zeiss Microscopy) foi usado. Para aquisição de imagens confocais, as seguintes configurações foram usadas: Aquisição sequencial para os diferentes canais foi usada. O campo de visão foi definido para 512 × 512 pixels. Para a aquisição, a velocidade foi definida como máxima, usando varredura bidirecional linha a linha, onde foi realizada média de 4x no modo Repetir por Linha. Para aquisição do sinal fluorescente de GFP, mCherry e BFP2, as seguintes configurações de laser foram usadas: 6.5 µW para o laser de 488 nm (GFP), 79 µW para o laser de 561 nm (mCherry) e 13.8 µW para o laser de 445 nm (BFP2). Imagens de campo claro foram adquiridas usando o laser de 561 nm com 79 µW e um detector de luz transmitida (T-PMT).
Ativação optogenética em microscopia confocal
ROIs foram desenhados cobrindo toda a área celular de células que expressam ferramentas de optogenética, bem como controles bystander, usando a função de branqueamento de ROI do software do microscópio. Para controlar a ativação indesejada, nem todas as células que expressam as ferramentas de optogenética dentro do campo de visão foram ativadas. Para ativar as ferramentas de optogenética, o laser de 405 nm foi usado na intensidade de 456 µW, configurando uma série temporal adquirindo uma imagem de pré-ativação, antes de ativar ROIs selecionados com 100 iterações a cada 7 imagens ou com as rodadas de ativação indicadas do respectivo experimento. Para a quantificação de C11-Bodipy, imagens confocais foram adquiridas 5 e 65 min após 3 rodadas de ativação das ferramentas de optogenética. Para os experimentos de Ca2+, imagens foram adquiridas a cada 45 s após quatro rodadas de ativação das ferramentas de optogenética. Experimentos foram considerados para análise apenas se todos os controles funcionassem, usando a formação de blebs (blebbing) nas células como proxy para indução de morte celular ao longo dos experimentos. (1) Iluminação de células bystander para descartar fototoxicidade das condições de iluminação. (2) Não iluminação de células transfectadas para verificar potencial autoativação ou toxicidade do construto. (3) Não iluminação de células bystander para verificar fototoxicidade da aquisição de séries temporais de imageamento de células vivas (morte celular de fundo). Se um desses controles falhasse, ou seja, se alguma das células de controle começasse a formar blebs (indicativo de indução de morte celular) durante um experimento, o experimento era excluído de análises posteriores.
Experimentos de optogenética de alto rendimento
Os experimentos foram realizados de acordo com o fluxo de trabalho mostrado na Fig. S1b, salvo indicação em contrário. Quando indicado, DRAQ7 foi adicionado antes da captura de uma imagem de pré-ativação para avaliar a morte celular. Para ativação da ferramenta optogenética, foi utilizado um optoPlate-96. Para programar o optoPlate-96, foi utilizado optoConfig-96. A seguinte iluminação a 465 nm foi usada: 5 mW/cm2 100%, 4 mW/cm2 para 80%, 3 mW/cm2 para 60%, 2 mW/cm2 para 40% e 1 mW/cm2 para 20% de intensidade de LED. A cinética de morte celular e os experimentos de C11-Bodipy foram avaliados usando uma plataforma de bioimagem IncuCyte S3 (Essen). As imagens de pré-ativação e pós-ativação foram adquiridas com as seguintes configurações: Por poço, pelo menos três imagens foram capturadas com exposição de 400 ms para o canal verde e vermelho. Para avaliar C11-Bodipy 581/591, foi utilizado um ImageXpress Micro 4 (MD). Uma objetiva Plan Fluor 10x com NA 0,3, uma câmera Andor Cycla 5.5 (CMOS) e os seguintes canais foram utilizados: Tl-20 (2 ms), DAPI (50 ms), FITC (200 ms) e TRITC (100 ms) com autocorreção. Os experimentos foram realizados a 37 °C e 5% de CO2 utilizando a câmara de incubação fornecida. Para o experimento, foram utilizadas placas µ-Plate 24 Black ID 14 mm (Ibidi).
Experimentos com bicamada lipídica
Todos os lipídios utilizados foram adquiridos da Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Para a formação de bicamada, os lipossomos foram preparados como vesículas unilamelares pequenas. As composições lipídicas foram preparadas como filme seco. Os lipídios L-α-fosfatidilcolina (Ovo, Galinha)(EggPC) e 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (sal cloreto)(DOTAP) foram dissolvidos em clorofórmio e misturados na proporção 70:30. O clorofórmio foi evaporado sob vácuo por pelo menos 4 h e no máximo 14 h e adicionalmente exposto a um fluxo de argônio para armazenamento de longo prazo a −20 °C. O filme seco foi hidratado até uma concentração final de 10 mg/ml usando solução salina tamponada com fosfato (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4 e 137 mM NaCl, pH 7,2), alíquotas de 10 a 40 μl foram armazenadas a −20 °C. Alíquotas foram diluídas com 140 μl de solução tampão (20 mM HEPES, 140 mM NaCl, pH 7,0) por 10 μl de volume de solução lipossômica e sonicadas em banho ultrassônico por 20 min ou até clarear para formar vesículas unilamelares pequenas.
Câmaras de imagem foram preparadas com lâmina de vidro limpa por plasma (comprimento 75 mm, espessura 1,5) e uma câmara de silicone de 8 poços (Ibidi). Ambas as lâminas e câmaras foram lavadas previamente com etanol 70% e secas. Um volume de 150 μl de solução lipossômica (SUV) foi depositado em um poço e preenchido com tampão até um volume total de 500 μl e CaCl2 até uma concentração total de 3 mM. Após uma incubação de 10 min a 37 °C, as vesículas flutuantes e o CaCl2 foram removidos por lavagem, adicionando e removendo 150 μl de solução tampão por pelo menos 10 vezes. Em seguida, 400 µl da solução tampão foram removidos e substituídos por 300 µl de suspensão celular contendo 2,5 × 10^4 células. Então, uma transfecção reversa foi realizada e no dia seguinte 1 µM de C11-Bodipy ou 1:500 de DRAQ7 foi adicionado antes da ativação optogenética. Experimentos Incucyte foram realizados em uma placa de 96 poços. Um volume de 75 μl de solução lipossômica (SUV) foi depositado por poço e preenchido com tampão até um volume total de 200 μl e CaCl2 até uma concentração total de 3 mM. Após uma incubação de 10 min a 37 °C, as vesículas flutuantes e o CaCl2 foram removidos por lavagem, adicionando e removendo 100 μl de solução tampão por pelo menos 10 vezes. Todas as etapas foram idênticas em comparação com a configuração confocal, exceto que aqui 150 µl de solução tampão foram removidos e reabastecidos com 100 µl de suspensão celular contendo 1,5 × 10^4 células.
Preparação e oxidação de vesículas unilamelares gigantes
GUVs foram produzidos pelo método de eletroformação. Para isso, 3 µl de uma mistura lipídica de 2,5 mg/mL dissolvida em clorofórmio foram espalhados sobre fios de platina da câmara de eletroformação e deixados secar, antes de serem imersos em 300 µL de sacarose 300 mM. A eletroformação foi realizada usando um gerador de potência alternada a 10 Hz, 1,4 V por 2 h, seguido por 45 min a 2 Hz, 1,4 V. A mistura lipídica é composta por L-α-fosfatidilcolina de gema de ovo (egg-PC), 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-fosfatidilcolina (PAPC), 1-oleoil-2-(12 biotinil(aminododecanoil))-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (biotina-PE) na proporção 90:5:5. A oxidação foi induzida pela adição do fotossensibilizador 1,9-dimetil azul de metileno (DMMB) a 5 mol% (DMMB foi dissolvido em etanol (5 mM), perclorato de ferro (II) em água deionizada (10 mM), e rastreado com Bodipy C11 a 2 mol%, e adicionalmente corado com 1,1’-Dioctadecil-3,3,3’,3’-Tetrametilindodicarbocianina, Sal de 4-Clorobenzenossulfonato (DiD) a 0,05 mol% para diferenciação (doador), a uma segunda preparação de GUV com a mesma mistura lipídica suplementada com C11-Bodipy a 2 mol%, mas sem o fotossensibilizador e DiD (aceptor). Tampão PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, pH 7,2) foi misturado com 0,75 µmol de estreptavidina para ancoragem à biotina-PE e 80 µmol de perclorato de ferro (II) para produção contínua de radicais lipídicos. 50 µl da suspensão de GUV aceptor e doador foram adicionados para obter um volume final de 250 µl. A microscopia confocal de fluorescência foi realizada usando um microscópio de varredura de linha infinita (Abberior Instruments) equipado com uma objetiva UPlanX APO 60x Óleo/1.42 NA com linhas de laser para excitar a 488, 561 ou 640 nm. GUVs doadores foram ativados usando 20% de potência do laser a 640 nm por um intervalo de tempo de 1 min (30 x cada 2 s) seguido por uma aquisição de imagem de 20 min para adquirir a propagação da oxidação (cada 60 s, potência do laser 488 nm 2%, 561 nm 1% e 640 nm 0,5%). Controles negativos sem a presença de ferro ou na presença de ferro, mas sem ativação do fotossensibilizador a 640 nm, foram adicionalmente realizados.
Análise de imagem
Para avaliar o tempo até o blebbing nos experimentos de confocal, a série temporal de ativação e a série temporal pós-ativação foram importadas para o Fiji e concentradas em uma única série temporal. Em seguida, os canais foram separados para ajustar Brilho e Contraste em todos os canais. Após o ajuste, os canais foram mesclados novamente para avaliar manualmente o tempo até o blebbing de células transfectadas iluminadas, de células bystander iluminadas, de células transfectadas não iluminadas e de células bystander não iluminadas.
Para determinar a porcentagem de células transfectadas, espectadoras ou positivas para C11-Bodipy oxidado dos experimentos de optogenética de alto rendimento, foi utilizado um software customizado. Com isso, o número total de células transfectadas, espectadoras, bem como células positivas para marcadores de morte celular, foi calculado e normalizado tomando-se o número absoluto de células transfectadas/espectadoras como 100% dividido pelo número de células duplo-positivas. Para avaliar a posição e o nível de fluorescência de células individuais, a segmentação de imagens foi realizada utilizando nosso software customizado. Para avaliar a distância entre as células, as coordenadas das células individuais foram utilizadas por meio do cálculo dos comprimentos individuais dos vetores.
Experimentos de peroxidação lipídica
As células foram transfectadas com Opto-GPX4Deg e incubadas por 16 h. No dia seguinte, as células foram coradas com 1 µM de C11-Bodipy por uma hora e tratadas com 10 µM de zVAD. Em seguida, as células expressando Opto-GPX4Deg e os controles espectadores foram ativados 3 vezes (ver Ativação optogenética em microscopia confocal) e o nível de fluorescência de C11-Bodipy para células individuais (vermelho e verde) foi avaliado 5 e 65 minutos após a ativação e corrigido pelo tamanho celular e subtração de fundo local. A razão de oxidação de C11-Bodipy foi calculada como um indicador de peroxidação lipídica de acordo com a seguinte fórmula: razão de oxidação = fluorescência vermelha + verde / fluorescência verde. Com isso, a fluorescência vermelha corresponde à fração reduzida da sonda e foi estimada com base na intensidade de fluorescência por pixel da imagem vermelha, e a fluorescência verde corresponde à fração oxidada e foi calculada com base na intensidade de fluorescência por pixel das imagens de fluorescência do canal verde. Esses valores foram estimados com base na intensidade de fluorescência por pixel dos canais vermelho e verde das imagens de fluorescência usando o Fiji ou nosso software customizado.
Medidas de onda de Ca2+
Para avaliar os fluxos de Ca2+ nos experimentos confocais, as séries temporais de ativação e pós-ativação foram importadas para o Fiji e concentradas em uma única série temporal. Em seguida, foram desenhadas ROIs das células em ferroptose (células ativadas e expressando Opto-GPX4Deg), bem como de suas células vizinhas na primeira à terceira fileira. Depois, os canais foram separados e o sinal de fluorescência verde foi medido para cada ponto temporal utilizando a função de medida múltipla do Fiji.
Coloração de imunofluorescência
3 × 104 células foram semeadas em uma lamínula de 12 mm e no dia seguinte, transfectadas com um respectivo siRNA ou plasmídeo de expressão. As células foram incubadas por 48 h antes da fixação em formaldeído a 4% por 15 min a 25 °C. As amostras foram lavadas três vezes em PBS antes do bloqueio em tampão 1X PBS/BSA/Triton™ X-100 0,3% por 60 min. Em seguida, o tampão de bloqueio foi aspirado e as amostras foram incubadas durante a noite a 4 °C em Anti-YAP D8H1X (Cell Signaling) na diluição de 1:1000, diluído em tampão 1X PBS/BSA 1%/Triton™ X-100 0,3% (Tampão de Diluição de Anticorpos). Em seguida, as amostras foram lavadas 3 vezes em PBS por 5 min antes de incubá-las com Anticorpo Secundário Goat anti-Rabbit IgG (H + L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor™ 488 (Thermo Fisher Scientific, A-11008, policlonal, Lote-2420730) na diluição de 1:1000 em Tampão de Diluição de Anticorpos por 1 h protegido da luz. Posteriormente, as amostras foram lavadas 3 vezes em PBS e a contracoloração com Hoechst33342 (Thermo Fisher) foi realizada por 5 min (1 µg/ml). Em seguida, as amostras foram lavadas 3 vezes em PBS, após o que foram montadas para imageamento.
Imunotransferência (Western Blot)
As células foram lisadas em tampão RIPA suplementado com inibidor de protease (Roche). Para carregar quantidades iguais de proteínas em um SDS-PAGE a 12%, foi realizado um ensaio de Bradford. A transferência para uma membrana de nitrocelulose (Merck Millipore) foi realizada usando o sistema Turboblot (BioRad) ou um sistema de transferência úmida (BioRad). A membrana foi bloqueada com leite a 5% em PBS-T (Tween 0,1%) por 1 h à temperatura ambiente e incubada durante a noite com os respectivos anticorpos primários: 1:1000 ß-tubulina (Santa Cruz Biotechnology, # sc-55529, clone G8, Lote-F2812), 1:1000 Anti-Glutationa Peroxidase 4 (# ab125066, clone EPNCIR144, Lote-GR3369574-7) (Abcam), 1:1000 Anticorpo Anti-GFP (# ab290, policlonal) (Abcam) e 1:1000 α-catenina (Sigma-Aldrich, # C2081, policlonal, Lote-0000145845), 1:1000 α-E-Catenina (D9R5E, #36611, Lote-2) (Cell Signaling), 1:1000 Anti-FSP1 (PTG Lab, # 20886-1-AP, policlonal, Lote-00101489), 1:1000 Anti-YAP (Cell Signaling, #14074, clone D8H1X, Lote-5), 1:1000 Anti-fosfo-YAP (Ser127) (Cell Signaling, #13008, clone D9W2I, Lote-6), 1:200 Anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, sc-47724, clone 0411, Lote-12420), 1:1000 Anti-VDAC2 (PTG Lab, 11663-1-AP, policlonal), 1:1000 Anti-ß-Actina (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778, clone C4, Lote-E0720), Anti-mCherry E5D8F (Cell Signaling). A membrana foi então lavada cinco vezes por 5 min em PBS-T à temperatura ambiente e incubada com o anticorpo secundário à temperatura ambiente por uma hora no escuro. Os seguintes anticorpos secundários foram usados: 1:5000 IRDye 800CW Anticorpo Secundário Donkey anti-Mouse IgG (LI-COR, # 926-32212), 1:10000 IRDye 680RD Anticorpo Donkey-anti-Rabbit (LI-COR, # 926-68023). A membrana foi lavada cinco vezes por 5 min com PBS-T e os sinais de fluorescência foram capturados por um Odyssey DLx (LI-COR). Os Western Blots foram quantificados usando o software Image Studio Lite.
Ativação optogenética para lipidômica
No dia 0, 1 × 10⁵ células HeLa/poço foram semeadas em placas de 6 poços. No dia 2, as células HeLa foram transfectadas (veja acima) com Opto-Ctrl, Opto-GPX4Deg ou não transfectadas. Os conjuntos foram iluminados ou não por 60 min com 100% de intensidade de LED a 465 nm usando um optoPlate-96. Após 48 h, as células foram colhidas por tripsinização e as amostras foram preparadas para lipidômica (veja abaixo).
Quantificação de glicerofosfolipídios oxidados
Os níveis de espécies de fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE) oxidadas foram determinados por Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas em Tandem com Ionização por Eletrospray (LC-ESI-MS/MS). 1–2 milhões de células foram ressuspensas em 300 µl de uma solução gelada de 100 µM de ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA) em PBS. Uma alíquota da suspensão celular foi utilizada para a determinação do conteúdo proteico usando ácido bicinconínico. A 100 µl da suspensão celular, foram adicionados 2,4 ml de uma solução gelada de 1,5 mg/ml de trifenilfosfina e 0,005% de hidroxitolueno butilado em metanol. A mistura foi incubada por 20 min em banho com agitação à temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados 1 ml da solução de 100 µM de DTPA em PBS, 1,25 ml de clorofórmio e padrões internos (10 pmol de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) e 10 pmol de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DMPE)). As amostras foram agitadas em vórtex por 1 min e incubadas a −20 °C por 15 min. Após adicionar 1,25 ml de clorofórmio e 1,25 ml de água, a mistura foi agitada vigorosamente em vórtex por 30 s e então centrifugada (4000 × g, 5 min, 4 °C) para separar as fases. A fase inferior (orgânica) foi transferida para um novo tubo e seca sob fluxo de nitrogênio. Os resíduos foram dissolvidos em 150 µl de metanol e transferidos para frascos de autoinjetor.
Transições MRM e parâmetros específicos dos compostos de espécies oxidadas de PC e PE
Massa Q1 (Da) Massa Q3 (Da) Tempo (ms) ID DP (volts) EP (volts) CE (volts) CXP (volts) 634.5 227.2 50 PE(14:0_14:0) −50 −10 −38 −11 662.5 227.2 50 PC(14:0_14:0) −50 −10 −38 −11 810.6 347.2 50 PC(16:0a_22:4(O)) −50 −10 −38 −11 764.6 317.2 50 PC(16:0p_20:5(O)) −50 −10 −38 −11 808.7 361.2 50 PC(16:0p_22:5(2 O)) −50 −10 −38 −11 790.6 343.2 50 PC(16:0p_HDoHE) −50 −10 −38 −11 766.6 319.2 50 PC(16:0p_HETE) −50 −10 −38 −11 782.6 347.2 50 PE(16:0a_22:4(O)) −50 −10 −38 −11 804.7 343.2 50 PE(16:0a_HDoHE) −50 −10 −38 −11 736.6 317.2 50 PE(16:0p_20:5(O)) −50 −10 −38 −11 766.6 347.2 50 PE(16:0p_22:4(O)) −50 −10 −38 −11 780.6 361.2 50 PE(16:0p_22:5(2 O)) −50 −10 −38 −11 762.6 343.2 50 PE(16:0p_HDoHE) −50 −10 −38 −11 738.6 319.2 50 PE(16:0p_HETE) −50 −10 −38 −11 782.6 319.2 50 PE(18:0a_HETE) −50 −10 −38 −11 808.7 347.2 50 PE(18:1a_22:4(O)) −50 −10 −38 −11 778.6 343.2 50 PE(18:1a_HDoHE) −50 −10 −38 −11 792.6 347.2 50 PE(18:1p_22:4(O)) −50 −10 −38 −11 788.6 343.2 50 PE(18:1p_HDoHE) −50 −10 −38 −11 764.6 319.2 50 PE(18:1p_HETE) −50 −10 −38 −11
A análise por LC-MS/MS foi realizada utilizando um sistema UHPLC Shimazdu Nexera, com injeção de 20 µl de amostra em uma coluna Core-Shell Kinetex C18 (150 mm × 2,1 mm DI, 2,6 µm de tamanho de partícula, 100 Å de tamanho de poro, Phenomenex) a 30 °C e detecção com um espectrômetro de massas triplo quadrupolo/armadilha de íons linear QTRAP 6500 (SCIEX). O LC (Sistema UHPLC Nexera X2, Shimadzu) foi operado a uma vazão de 0,2 ml/min com fase móvel de 1 mM de acetato de amônio em metanol/acetonitrila/água 60:20:20 (v/v/v) (solvente A) e 1 mM de acetato de amônio em metanol (solvente B). As espécies oxidadas de PC e PE foram eluídas com o seguinte gradiente: inicial, 50% B; 10 min, 100% B; 40 min, 100% B; 40,1 min, 50% B; 45 min, 50% B. As espécies lipídicas foram monitoradas no modo de íons negativos com suas transições específicas de Monitoramento de Reação Múltipla (MRM) (Tabela 1). As configurações do instrumento para gás nebulizador (Gás 1), turbogás (Gás 2), gás de cortina e gás de colisão foram 40 psi, 30 psi, 35 psi e médio, respectivamente. O aquecedor da interface estava ligado, a temperatura da fonte Turbo V ESI era de 500 °C e a voltagem do ionspray era de −4,5 kV. Os valores de potencial de declustering (DP), potencial de entrada (EP), energia de colisão (CE) e potencial de saída da célula (CXP) das diferentes transições MRM estão listados na Tabela 1.
Os picos do cromatograma LC das espécies oxidadas de PC e PE e dos padrões internos foram integrados utilizando o software MultiQuant 3.0.2 (SCIEX). As espécies oxidadas de PC e PE foram quantificadas normalizando suas áreas de pico em relação às áreas dos padrões internos. As áreas de pico normalizadas foram então normalizadas para o conteúdo de proteína da suspensão celular. A mudança de vezes (fold change) no mapa de calor foi calculada dividindo as razões de área/µg de proteína das diferentes espécies lipídicas oxidadas após iluminação pelo controle não iluminado, para as réplicas individuais e a média.
Quantificação de ácidos graxos
A 50 µl da suspensão celular mencionada acima, foram adicionados 50 µl de água, 500 µl de metanol, 250 µl de clorofórmio e padrão interno (1 µg de ácido palmítico-d31). A mistura foi sonicada por 5 min, e os lipídios foram extraídos em banho de agitação a 48 °C por 1 h. Os glicerolipídios foram degradados por hidrólise alcalina, adicionando 75 µl de hidróxido de potássio 1 M em metanol. Após 5 min de sonicação, o extrato foi incubado por 1,5 h a 37 °C e, em seguida, neutralizado com 6 µl de ácido acético glacial. Foram adicionados 2 ml de clorofórmio e 4 ml de água ao extrato, que foi vortexado vigorosamente por 30 s e depois centrifugado (4000 × g, 5 min, 4 °C) para separar as fases. A fase inferior (orgânica) foi transferida para um novo tubo, e a fase superior foi extraída com mais 2 ml de clorofórmio. As fases orgânicas combinadas foram secas sob uma corrente de nitrogênio. Os resíduos foram dissolvidos em 300 µl de acetonitrila/água 2:1 (v/v) e sonicados por 5 min. Após centrifugação (12.000 × g, 2 min, 4 °C), 40 µl dos sobrenadantes claros foram transferidos para frascos de autoinjetor.
Os níveis de ácidos graxos foram determinados por LC-ESI-MS/MS. 10 µl de amostra foram carregados em uma coluna Core-Shell Kinetex Biphenyl (100 mm × 3,0 mm ID, 2,6 µm de tamanho de partícula, 100 Å de tamanho de poro, Phenomenex), e os ácidos graxos foram detectados usando um espectrômetro de massa triplo quadrupolo/trap de íons linear QTRAP 6500 (SCIEX). O LC (Sistema UHPLC Nexera X2, Shimadzu) foi operado a 40 °C e a uma vazão de 0,7 ml/min com uma fase móvel de 5 mM de acetato de amônio e 0,012% de ácido acético em água (solvente A) e acetonitrila/isopropanol 80:20 (v/v) (solvente B). Os ácidos graxos foram eluídos com o seguinte gradiente: inicial, 55% B; 4 min, 95% B; 7 min, 95% B; 7,1 min, 55% B; 10 min, 55% B.
Transições MRM e parâmetros específicos dos compostos dos ácidos graxos
Massa Q1 (Da) Massa Q3 (Da) Tempo (mseg) ID DP (volts) EP (volts) CE (volts) CXP (volts) Quantificador 227,0 227,0 5 FA 14:0 −75 −10 −25 −13 X 227,0 227,1 5 FA 14:0 −75 −10 −30 −13 225,0 225,0 5 FA 14:1 −75 −10 −8 −13 X 225,0 225,1 5 FA 14:1 −75 −10 −23 −13 255,0 255,0 5 FA 16:0 −80 −10 −35 −13 X 255,0 255,1 5 FA 16:0 −80 −10 −37 −13 253,0 253,0 5 FA 16:1 −78 −10 −30 −13 X 253,0 253,1 5 FA 16:1 −78 −10 −34 −13 283,1 283,1 5 FA 18:0 −87 −10 −35 −7 X 283,1 283,2 5 FA 18:0 −87 −10 −37 −7 281,1 281,1 5 FA 18:1 −80 −10 −37 −7 X 281,1 281,0 5 FA 18:1 −80 −10 −39 −7 279,0 279,1 5 FA 18:2 −80 −10 −32 −7 X 279,0 279,0 5 FA 18:2 −80 −10 −34 −7 277,1 277,1 5 FA 18:3 −75 −10 −10 −7 X 277,1 277,0 5 FA 18:3 −75 −10 −23 −7 309,1 309,1 5 FA 20:1 −90 −10 −8 −9 X 309,1 309,0 5 FA 20:1 −90 −10 −30 −9 307,1 307,2 5 FA 20:2 −85 −10 −8 −9 X 307,1 307,1 5 FA 20:2 −85 −10 −29 −9 305,1 305,1 5 FA 20:3 −80 −10 −8 −9 X 305,1 305,0 5 FA 20:3 −80 −10 −26 −9 303,1 303,1 5 FA 20:4 −70 −10 −10 −9 X 303,1 303,0 5 FA 20:4 −70 −10 −21 −9 337,1 337,1 5 FA 22:1 −80 −10 −8 −9 X 337,1 337,0 5 FA 22:1 −80 −10 −30 −9 335,1 335,1 5 FA 22:2 −80 −10 −8 −11 X 335,1 335,0 5 FA 22:2 −80 −10 −30 −11 327,1 327,0 5 FA 22:6 −40 −10 −6 −13 X 327,1 327,1 5 FA 22:6 −40 −10 −15 −13 365,1 365,1 5 FA 24:1 −97 −10 −8 −11 X 365,1 365,0 5 FA 24:1 −97 −10 −33 −11 286,1 286,1 5 d31_FA 16:0 −80 −10 −10 −7 X 286,1 286,2 5 d31_FA 16:0 −80 −10 −27 −7
Os ácidos graxos foram monitorados no modo de íons negativos usando transições de "pseudo" Monitoramento de Reação Múltipla (MRM) (Tabela 2). As configurações do instrumento para gás nebulizador (Gás 1), turbogás (Gás 2), gás de cortina e gás de colisão foram 60 psi, 90 psi, 40 psi e médio, respectivamente. O aquecedor da interface estava ligado, a temperatura da fonte Turbo V ESI era de 650 °C, e a voltagem do ionspray era de −4 kV. Os valores para potencial de declustering (DP), potencial de entrada (EP), energia de colisão (CE) e potencial de saída da célula (CXP) das diferentes transições MRM estão listados na Tabela 2.
Os picos quantificadores do cromatograma LC dos ácidos graxos endógenos e do padrão interno ácido palmítico-d31 foram integrados usando o software MultiQuant 3.0.2 (SCIEX). Os ácidos graxos endógenos foram quantificados normalizando suas áreas de pico em relação às do padrão interno. A mudança de fold no mapa de calor foi calculada dividindo as razões de área dos diferentes ácidos graxos sob iluminação pelo controle não iluminado para as réplicas individuais e a média.
Co-cultura de MEF com sobrenadantes ferroptóticos
Sobrenadantes de cultura celular provenientes de células ferroptóticas ou controle foram primeiro produzidos em dois sistemas genéticos independentes: (i) fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) com knockout induzível de GPX4 foram tratados com 1 µM de 4-hidroxitamoxifeno ou DMSO por 72 h; (ii) células de câncer de pulmão de pequenas células murino (SCLC) knockout para GPX4 ou células controle foram submetidas à retirada de ferrostatin por 16 h. Os sobrenadantes foram coletados, centrifugados a 1200 rpm por 5 min e transferidos para MEFs do tipo selvagem (WT) semeadas um dia antes com ou sem 0,1 μM de RSL3 ou 1 μM de Erastin +/-1 μM de ferrostatin.
Análise estatística
Para avaliar diferenças significativas, diferentes testes estatísticos foram realizados dependendo do número de grupos comparados, bem como dos fatores considerados no experimento. Para comparar dois grupos ou condições, testes t não paramétricos foram realizados. Quando mais de um teste t foi realizado dentro de um gráfico, eles foram corrigidos para comparações múltiplas usando um teste t múltiplo. Quando mais de dois grupos ou condições foram analisados, uma ANOVA de uma via foi realizada, quando um fator foi comparado, enquanto uma ANOVA de três vias foi realizada, quando três fatores foram comparados. Para corrigir para comparações múltiplas, o teste de comparação múltipla de Tukey foi realizado. Para realizar os testes estatísticos, o GraphPad Prism 7.03 foi utilizado. Para avaliar a tendência de agrupamento do conjunto de dados, a estatística de Hopkins foi realizada usando código disponível gratuitamente no Github.
Resumo do relatório
Mais informações sobre o delineamento da pesquisa estão disponíveis no Resumo do Relatório do Nature Portfolio vinculado a este artigo.
Informações complementares
Dados de origem
Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Informações complementares
A versão online contém material complementar disponível em 10.1038/s41467-025-58175-w.
B.F.R. realizou experimentos e analisou dados. M.R.H.V. construiu software personalizado e analisou experimentos. S.L.N. e B.F.R. projetaram e realizaram o experimento de bicamada lipídica. S.L.N. realizou os experimentos com GUVs. L.S. gerou as células HeLa α-Catenina KO. F.I.Y. e S.v.K. projetaram e conduziram o experimento de sobrenadante. M.R. e C.M.N. projetaram os experimentos de contato célula-célula relacionados à α-catenina e blebbistatina, bem como os experimentos de superexpressão de E-caderina, N-caderina e P-caderina. Eles também contribuíram para a interpretação dos dados adquiridos. Todos os autores contribuíram para o desenho experimental e a redação do manuscrito. A.J.G.-S. concebeu o projeto, supervisionou a pesquisa e escreveu o manuscrito em conjunto com B.F.R.
Revisão por pares
Informações de revisão por pares
A Nature Communications agradece aos revisores anônimos por sua contribuição à revisão por pares deste trabalho. Um arquivo de revisão por pares está disponível.
Financiamento
Financiamento de Acesso Aberto habilitado e organizado pelo Projekt DEAL.
Disponibilidade de dados
Os dados de origem são fornecidos com este artigo. Os dados de lipidômica foram depositados no repositório de dados Zenodo e podem ser baixados via 10.5281/zenodo.14905646. Todos os outros dados que suportam os resultados aqui relatados estão disponíveis mediante solicitação. O acesso aos dados será concedido mediante solicitação para fins de pesquisa acadêmica ou não comercial, desde que o solicitante concorde em manter a confidencialidade (se aplicável), citar adequadamente a fonte, cumprir quaisquer restrições legais ou éticas, e que o atendimento da solicitação não imponha um ônus indevido aos autores. Os dados de origem são fornecidos com este artigo.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Referências
Ferroptose: uma forma dependente de ferro de morte celular não apoptótica
Ferroptose: mecanismos, biologia e papel na doença
GTP ciclo-hidrolase 1/tetra-hidrobiopterina contrapõem a ferroptose através da remodelação lipídica
FSP1 é um supressor de ferroptose independente de glutationa
Regulação da morte celular cancerosa ferroptótica por GPX4
Mecanismos moleculares de morte celular: recomendações do Comitê de Nomenclatura sobre Morte Celular 2018
Ferroptose: um nexo de morte celular regulado ligando metabolismo, biologia redox e doença
Ferroptose: morte por peroxidação lipídica
Ferroptose e seu papel potencial nas doenças do sistema nervoso
Ferroptose e seu papel nas doenças crônicas
Ferroptose: um alvo potencial em doenças cardiovasculares
Ou, M. et al. Papel e mecanismo da ferroptose em doenças neurológicas. Mol. Metab.61, 101502 (2022).
O papel multifacetado da ferroptose em doenças renais
Qiu, B. et al. Fosfolipídios com duas caudas de acil graxo poli-insaturado promovem ferroptose. Cell187, 1177–1190 (2024).
Morgan, P. K. et al. Um atlas lipídico de células imunes humanas e de camundongos fornece insights sobre a suscetibilidade à ferroptose. Nat. Cell Biol.26, 645–659 (2024).
Lei, G., Zhuang, L. & Gan, B. Visando a ferroptose como uma vulnerabilidade no câncer. Nat. Rev. Cancer22, 381–396 (2022).
Ferroptose vigilância independente de GPX4 e regulada diferencialmente por hormônios sexuais
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Dixon, S. J. & Olzmann, J. A. A biologia celular da ferroptose. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.25, 424–442 (2024).
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Co, H. K. C., Wu, C.-C., Lee, Y.-C. & Chen, S. Emergência de morte celular em larga escala através de ondas-gatilho ferroptóticas. Nature631, 654–662 (2024).
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DeGregorio-Rocasolano, N., Martí-Sistac, O. & Gasull, T. Decifrando o lado do ferro no acidente vascular cerebral: neurodegeneração na encruzilhada entre a desregulação homeostática do ferro, excitotoxicidade e ferroptose. Front. Neurosci.13, 85 (2019).
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Combinação de ponatinibe com desferoxamina mitiga sinergicamente a lesão cardíaca isquêmica através da prevenção simultânea de necroptose e ferroptose
O tratamento com desferoxamina combinado com o pós-condicionamento com sevoflurano atenua a lesão de isquemia-reperfusão miocárdica restaurando a autofagia mitocondrial mediada por HIF-1/BNIP3 em ratos GK
A administração tardia de desferoxamina reduz o dano cerebral e promove a recuperação funcional após isquemia cerebral focal transitória em ratos
A desferoxamina intranasal proporciona maior exposição cerebral e proteção significativa no acidente vascular cerebral isquêmico em ratos
Efeito da quelação de ferro no tamanho do infarto do miocárdio e no estresse oxidativo no infarto do miocárdio com supradesnivelamento do segmento ST
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Vorndran, M. R. H. & Roeck, B. F. Máscaras de inconsistência: removendo a incerteza de pares pseudo-rótulo de entrada. arXiv preprint arXiv:2401.14387 (2024).
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Determinação de ácidos graxos não esterificados para lipidômica funcional: quantificação, qualificação e previsão de parâmetros abrangentes por cromatografia líquida de ultra alto desempenho acoplada à espectrometria de massas em tandem
prathmachowksey. https://github.com/prathmachowksey/Hopkins-Statistic-Clustering-Tendency.