pmid: "19203585"
title: "O transporte bidirecional de aminoácidos regula o mTOR e a autofagia."
authors: "Nicklin P, Bergman P, Zhang B, Triantafellow E, Wang H, Nyfeler B, Yang H, Hild M, Kung C, Wilson C, Myer VE, MacKeigan JP, Porter JA, Wang YK, Cantley LC, Finan PM, Murphy LO"
journal: "Cell"
pubdate: "2009 Feb 06"
doi: "10.1016/j.cell.2008.11.044"
source: "PMC Full Text"

O transporte bidirecional de aminoácidos regula o mTOR e a autofagia.

Autores

Nicklin P, Bergman P, Zhang B, Triantafellow E, Wang H, Nyfeler B, Yang H, Hild M, Kung C, Wilson C, Myer VE, MacKeigan JP, Porter JA, Wang YK, Cantley LC, Finan PM, Murphy LO

Periodico

Cell (2009 Feb 06)

Conteudo

Transporte Bidirecional de Aminoácidos Regula mTOR e Autofagia
RESUMO
Os aminoácidos são necessários para a ativação da quinase alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), que regula a tradução de proteínas, o crescimento celular e a autofagia. Os transportadores de superfície celular que permitem que os aminoácidos entrem na célula e sinalizem para o mTOR são desconhecidos. Mostramos que a captação celular de L-glutamina e sua subsequente efluxo rápida na presença de aminoácidos essenciais (AAE) é a etapa limitante que ativa o mTOR. A captação de L-glutamina é regulada por SLC1A5 e a perda da função de SLC1A5 inibe o crescimento celular e ativa a autofagia. A base molecular para a sensibilidade à L-glutamina se deve ao SLC7A5/SLC3A2, um transportador bidirecional que regula o efluxo simultâneo de L-glutamina para fora das células e o transporte de L-leucina/AAE para dentro das células. Certas linhagens de células tumorais com altos níveis basais celulares de L-glutamina contornam a necessidade de captação de L-glutamina e estão preparadas para a ativação do mTOR. Assim, o fluxo de L-glutamina regula mTOR, tradução e autofagia para coordenar o crescimento e a proliferação celular.

INTRODUÇÃO
A quinase Ser/Thr alvo da rapamicina (TOR) foi conservada ao longo da evolução eucariótica para mediar respostas celulares a aminoácidos extracelulares e fatores de crescimento. Em um ambiente rico em aminoácidos, o TOR está ativo e regula a tradução de proteínas, mas também inibe a macroautofagia (doravante referida como autofagia). Quando os aminoácidos extracelulares são limitantes, a autofagia recicla constituintes intracelulares como forma de fornecer uma fonte alternativa de aminoácidos. Estudos com S. cerevisiae forneceram insights importantes sobre o papel do TOR como integrador de sinais para aminoácidos. Por exemplo, a rapamicina, um inibidor do TOR, mimetiza o efeito que a privação de aminoácidos tem sobre a tradução de proteínas, parada do ciclo celular, biogênese ribossômica e autofagia. A atividade do TOR é particularmente sensível à disponibilidade de fontes de nitrogênio preferenciais, como L-glutamina ou L-asparagina, de modo que, na sua ausência, as permeases necessárias para a captação desses aminoácidos são reguladas negativamente e os genes necessários para a utilização de fontes alternativas de nitrogênio, como ureia e amônia, são regulados positivamente. O TOR controla essa mudança metabólica regulando a distribuição celular de fatores de transcrição (Gln3 e Rtg1/Rtg2) necessários para o crescimento dependente de nitrogênio. A privação de nitrogênio também é conhecida por ativar a autofagia em S. cerevisiae, consistente com o TOR funcionando como um supressor da autofagia. Como a L-glutamina regula a atividade do TOR atualmente não está claro.
Em todos os eucariotos estudados até o momento, o TOR é particionado em pelo menos dois complexos de sinalização distintos. Em células de mamíferos, o complexo mTOR sensível à rapamicina (mTORC) 1 é essencial para a fosforilação e ativação das proteínas quinase S6 (S6K) 1 e 2 de 70 kDa. A S6K1 impacta diretamente o crescimento celular ao regular a rodada primária de tradução proteica e o complexo de tradução do fator de iniciação eucariótico 3 (eIF3). O mTORC1 também controla a tradução de mRNAs com cap 5' ao fosforilar diretamente e inibir a proteína de ligação ao fator de iniciação da tradução eucariótica 4E (eIF4E) (4EBP1), resultando em sua dissociação do eIF4E. O mTORC2 é insensível à rapamicina, regula a ativação da quinase AKT Ser/Thr e pode alterar o citoesqueleto de actina (, 2005).

Dois sinais principais de fatores de crescimento que regulam a via mTORC1 emanam das vias da insulina/fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) 1/fosfatidil inositol-3-OH quinase (PI(3)K) e da quinase regulada por sinal extracelular-p90 proteína ribossômica S6 quinase (ERK-RSK). Essas vias convergem em proteínas codificadas pelos genes supressores de tumor TSC1 e TSC2, que são mutados na síndrome tumoral do complexo de esclerose tuberosa (TSC). As proteínas TSC1 e TSC2 se associam fisicamente e suprimem o homólogo RAS enriquecido no cérebro (Rheb), uma pequena proteína G necessária para a ativação do mTORC1. O complexo proteico TSC1/TSC2 pode ser fosforilado e, portanto, inativado pela sinalização PI(3)K e ERKRSK, permitindo que Rheb ative o mTORC1. Na ausência de aminoácidos, os sinais de fatores de crescimento têm pouco ou nenhum impacto na sinalização do mTORC1, indicando a presença de um mecanismo de controle chave a montante do mTOR. Aminoácidos essenciais (AAE) como L-leucina, L-triptofano, L-fenilalanina e L-arginina ativam a via mTORC1. Observações recentes indicam que as GTPases Rag podem interagir fisicamente com o mTORC1 e regular sua redistribuição subcelular em resposta à L-leucina. Como os aminoácidos entram na célula para regular a ativação do mTORC1 é atualmente desconhecido.

No presente estudo, identificamos o mecanismo pelo qual a L-glutamina exerce controle sobre a sinalização mTOR. A captação celular de L-glutamina é a etapa limitante para a regulação do mTORC1 por AAE e fatores de crescimento. Após a captação, a L-glutamina é efluxada dentro de 1–2 min após a adição de AAE às células, levando à captação recíproca de L-leucina e à rápida ativação da S6K1. O membro 5 da família 1 de transportadores de solutos (SLC1A5) é um transportador de L-glutamina de alta afinidade e sua inibição bloqueia a captação de L-glutamina, levando à inibição da sinalização mTORC1 e à ativação da autofagia. O membro 5 da família 7 de transportadores de solutos (SLC7A5)/SLC3A2 é um antiportador bidirecional heterodimérico que regula a troca de L-glutamina intracelular por L-leucina extracelular. Juntos, esses dados mostram que o contra-transporte de L-glutamina e AAE controla o mTORC1 e a autofagia.

RESULTADOS
L-Glutamina é Necessária para a Sinalização mTOR Sensível à Rapamicina
A sinalização de mTORC1 é inibida após a privação de fatores de crescimento e aminoácidos. A adição de DMEM sem soro a células HeLa em privação reativa a S6K1 e resulta na fosforilação de S6K1 (causando uma alteração de mobilidade em SDS-PAGE), bem como da proteína ribossômica S6, um alvo downstream chave da S6K1 (Figura 1A). Em contraste, a incubação de células com EAA na mesma concentração encontrada no DMEM não regula a S6K1, indicando que um componente presente no DMEM é necessário para a ativação de mTORC1. Os componentes restantes encontrados no DMEM incluem piruvato de sódio, bicarbonato de sódio, nitrato férrico, aminoácidos não essenciais (NEAA) e L-glutamina. Utilizando um ensaio de fosfo-S6 por in-cell western (Figura S1A disponível online com este artigo), observamos que a adição de piruvato de sódio, bicarbonato de sódio, nitrato férrico ou NEAA aos EAA não reconstitui o efeito do DMEM na ativação de mTORC1 (dados não mostrados e veja abaixo). Em contraste, a adição de L-glutamina aos EAA aumenta a sinalização mTOR-S6K-S6 sensível à rapamicina (Figuras 1B, 1E e S1). É importante ressaltar que a L-glutamina e os EAA isoladamente têm pouco efeito, mas juntos eles sinergizam para ativar mTOR (Figura 1B). Efeitos máximos ocorrem com 1 mM de L-glutamina, comparável aos níveis circulantes que variam de 0,5 a 0,7 mM. Para determinar se a L-glutamina no DMEM é responsável por ativar a via mTOR, DMEM sem esse aminoácido foi adicionado a células em privação. Notavelmente, apesar da presença de EAA e outros nutrientes no meio sem L-glutamina, a fosforilação regulada de S6 é reduzida em 85% (Figura 1C). O efeito da L-glutamina sobre mTORC1 também é estereosseletivo (Figura 1D). Como o DMEM contém 4,5 g/L de D-glicose e as soluções de privação e estimulação contêm 1 g/L, confirmamos que essa variação não estava contribuindo para a incapacidade dos EAA de regular a ativação de mTORC1-S6K1 (Figura S1B). A fosforilação de 4EBP1 e o subsequente recrutamento do fator de iniciação da tradução eucariótica 4G (eIF4G) para o complexo cap eIF4E também são sensíveis à L-glutamina (Figura 1F, compare as faixas 3 e 4). Essas observações em células HeLa se estendem a outras linhagens celulares de mamíferos nas quais a atividade de mTOR sensível à rapamicina depende de L-glutamina (Figura S2), bem como em células S2 de Drosophila (Figura 1G), indicando que este é um processo evolutivamente conservado.
A L-Glutamina é Limitante para a Ativação de mTORC1
Para entender a relação entre EAA e L-glutamina, células HeLa em privação foram tratadas com L-glutamina por 60 min (pré-carga), a L-glutamina extracelular foi lavada e, em seguida, EAA foi adicionada por diferentes tempos (Figura 2A). Nessas condições, a cinética de ativação da S6K1 é significativamente acelerada em comparação com a adição simultânea de EAA e L-glutamina, onde a fosforilação da S6K1 é observada após 60 min (Figura 2A). O pré-tratamento de células em privação com EAA e depois L-glutamina não ativa a S6K1 (Figura 2B), confirmando que a L-glutamina está a montante da entrada de EAA. Essas observações revelam que a L-glutamina é limitante para a ativação de S6K1 mediada por EAA. Em seguida, avaliamos se a L-glutamina é necessária para integrar sinais de fatores de crescimento a montante do mTORC1. A regulação da ativação de AKT pela insulina e a regulação da ativação de ERK1/2 pelo EGF não são afetadas pelo pré-tratamento com L-glutamina (Figura 2C). No entanto, o pré-tratamento com L-glutamina sensibiliza a S6K1 à insulina e ao EGF, indicando um papel importante na integração de sinais (Figura 2C).

Embora o pré-tratamento de células com L-glutamina suporte uma fosforilação robusta da S6K1 em minutos após a adição de EAA (Figuras 2A-2C), a ativação da S6K1 diminui por volta de 60 min (Figura 2A). Células tratadas dessa forma exibem ativação transitória da S6K1 em comparação com células tratadas com EAA e L-glutamina juntas, onde a fosforilação da S6K1 persiste por várias horas (Figuras 2D e S3A). Interessantemente, a adição de L-glutamina após 3 h reativa a S6K1 (Figura S3A), indicando que a cinética de ativação transitória se deve à limitação de L-glutamina, e não ao consumo de EAA ou à dessensibilização da via. Em certas linhagens de células tumorais, a L-glutamina pode aumentar o fluxo metabólico por meio do processo de glutaminólise, que gera intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Para determinar se o efeito da L-glutamina sobre a S6K1 se deve ao aumento de energia celular, perguntamos se o ácido L-glutâmico e o α-cetoglutarato (produtos da glutaminólise) podem sensibilizar o mTOR ao EAA. Em contraste com a L-glutamina, o ácido L-glutâmico e o α-cetoglutarato são incapazes de regular a ativação da S6K1 (Figura 2E). A L-glutamina também pode contribuir para a biossíntese de certos NEAA, como L-asparagina e L-arginina. Os NEAA são incapazes de regular a ativação da S6K1, seja no modo de pré-tratamento (Figura 2F) ou quando adicionados em combinação com EAA e/ou L-glutamina (Figura 2G). Em conjunto, esses dados mostram que a ativação regulada por L-glutamina de mTOR-S6K1-S6 é um evento proximal e não deriva do aumento da glutaminólise e/ou síntese de NEAA.

A inibição de SLC1A5 e SLC7A5/SLC3A2 Antagoniza mTORC1
Buscamos identificar um mecanismo molecular que pudesse explicar por que a L-glutamina é limitante para a ativação do mTORC1. O influxo de L-glutamina em células de mamíferos pode ser regulado por pelo menos quatro transportadores diferentes; sistemas dependentes de Na+ A, ASC, N e o sistema independente de Na+ L, composto por transportadores de L-glutamina de baixa afinidade. Curiosamente, foi proposta uma relação entre SLC1A5 (também conhecido como ASCT2) e SLC7A5 (também conhecido como LAT1) que explica a interação entre L-glutamina e EAA a montante do mTORC1 (Figuras 2A-2C). SLC1A5 é um transportador de alta afinidade e dependente de Na+ para L-glutamina. SLC7A5 transporta aminoácidos de cadeia lateral ramificada, como L-leucina, para dentro das células em troca do efluxo de aminoácidos intracelulares, como L-glutamina. SLC7A5 funciona como parte de um complexo heterodimérico ligado por dissulfeto com SLC3A2 e reside na membrana plasmática. Assim, hipotetizamos que a L-glutamina intracelular, transportada para a célula por SLC1A5, serve como substrato de efluxo para SLC7A5/SLC3A2, permitindo o contratransporte de EAA. L-γ-glutamil-p-nitroanilida (GPNA), um inibidor do transporte regulado por SLC1A5, inibe de forma dose-dependente a fosforilação de S6 e o complexo cap eIF4E (Figuras 3A e 3B). Para avaliar a especificidade do GPNA em suprimir a entrada de L-glutamina, as células foram pré-tratadas com L-glutamina na presença ou ausência de GPNA por 60 min, e então expostas a EAA na presença ou ausência de GPNA por 15 min (Figura 3C). A presença de GPNA durante o período de pré-tratamento, mas não com EAA, inibe completamente a ativação de S6K1 (Figura 3C). Coletivamente, esses dados indicam que o inibidor de SLC1A5, GPNA, antagoniza a sinalização do mTORC1 ao limitar a captação celular de L-glutamina.
Para interrogar a necessidade de SLC7A5/SLC3A2, um transportador candidato para EAA, foi utilizado o ácido 2-aminobiciclo-(2,2,1)heptanocarboxílico (BCH). O BCH, um inibidor de SLC7A5, suprime a fosforilação de S6K-S6 (Figuras 3D, 3E, S3B e S3C). O BCH não inibe a fosforilação de AKT (Figura 3D) ou a regulação do éster de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) da fosforilação de S6 em células HeLa em jejum (Figura S3D), consistente com a capacidade da RSK de fosforilar diretamente S6 de maneira independente de mTORC1. Assim, o BCH inibe especificamente a entrada de aminoácidos para o mTORC1. Como uma forma alternativa de modular a função de SLC7A5/SLC3A2, foi utilizada a D-fenilalanina. Diferentemente da L-fenilalanina, um substrato de alta afinidade de SLC7A5 que regula a ativação de S6K1, a D-fenilalanina inibe o transporte mediado por SLC7A5/SLC3A2. A D-fenilalanina inibe a fosforilação de S6 sensível à rapamicina (Figura 3F) e o complexo de tradução cap (Figura 3G). Em contraste com o modo de ação do GPNA, a D-fenilalanina inibe especificamente a entrada de EAA e não a entrada de L-glutamina (Figura 3H). Coletivamente, esses resultados mostram que uma atividade sensível a BCH e D-fenilalanina é responsável pela regulação de EAA do mTORC1 e são consistentes com estudos anteriores que mostram que eles inibem o transportador bidirecional SLC7A5/SLC3A2.

Efluxo de L-Glutamina e Captação de L-Leucina Precedem a Ativação de S6K1

Os dados acima suportam um modelo no qual a captação de L-glutamina mediada por SLC1A5 fornece um sinal para EAA regular a sinalização de mTOR. Como o SLC7A5/SLC3A2 é capaz de usar a L-glutamina como substrato de efluxo, testamos a hipótese de que EAA regula o efluxo de L-glutamina intracelular quantificando sua presença no meio após o tratamento com EAA. Células em jejum foram pré-tratadas com L-glutamina por 1 hora e lavadas conforme descrito acima (Figura 2A). Após tratar com EAA por 15 min, o meio condicionado foi coletado e transferido para células em jejum ingênuas (Figura 4A, linha 3). Este meio condicionado suporta a ativação de S6K1, embora não na mesma extensão que a adição direta de EAA a células pré-carregadas com L-glutamina (Figura 4A, compare linhas 3 e 6). O meio condicionado retirado de células não-primadas tratadas com EAA não ativa S6K1 (Figura 4A, linha 5), provando que o efeito do meio condicionado é dependente de L-glutamina. Esses resultados indicam que um fator celular, provavelmente L-glutamina, é liberado na presença de EAA e que é capaz de regular a atividade de mTOR-S6K1. Este fator é liberado após apenas 2,5 min na presença de EAA (Figura 4B).
Para provar que a L-glutamina é efluiída da célula em resposta ao tratamento com EAA, o meio condicionado foi analisado usando espectrometria de massas triplo quadrupolo acoplada a HPLC (LC/MS/MS).
A L-glutamina é indetectável no meio condicionado obtido de células tratadas com EAA por 2,5 min (Figura 4C, traço à esquerda); no entanto, um aumento de 10 vezes na concentração de L-glutamina é detectado no meio condicionado obtido de células tratadas com EAA e pré-tratadas com L-glutamina em comparação com células controle (Figura 4C e 4E).
A concentração absoluta de L-glutamina nesse meio foi aproximadamente 100 vezes menor do que a necessária para regular maximamente a atividade da via mTORC1 (Figura 1), consistente com o efeito submáximo associado ao meio condicionado em células ingênuas (Figura 4A).
Usando um análogo de L-glutamina marcado com isótopo estável, observamos que o efluxo de L-glutamina ao longo do tempo se correlaciona com a depleção de L-glutamina celular (Figura 4D).
Importante, o tratamento com insulina não leva ao efluxo de L-glutamina, indicando que os efeitos acima são específicos para EAA (Figura 4E).
Essas observações provam que a L-glutamina é rapidamente efluiída da célula em resposta ao EAA.
Se SLC7A5/SLC3A2 regula a troca de L-glutamina por EAA, então a L-glutamina deve aumentar a captação de L-leucina.
De fato, usando análogos marcados de L-glutamina e L-leucina, ocorre troca recíproca desses aminoácidos (Figura 4F).
O ácido L-glutâmico não é capaz de regular a captação de L-leucina (Figura 4G) e, ao contrário da L-glutamina, seus níveis celulares não são depletados após o tratamento com EAA (Fig. S5A e B).
Isso fornece evidência clara de que os metabólitos da L-glutamina não estão envolvidos na ativação de mTORC1.
Finalmente, a captação de L-glutamina marcada nas células é inibida por GPNA (Figura 4H) e tanto a captação basal quanto a captação de L-leucina regulada por L-glutamina são inibidas por BCH e D-fenilalanina (Figura 4I).
SLC1A5 e SLC7A5/SLC3A2 São Necessários para a Troca de Aminoácidos, Sinalização mTORC1 e Crescimento Celular
Para determinar se SLC1A5 e SLC7A5/SLC3A2 são necessários para a regulação de mTORC1 por aminoácidos, identificamos dois siRNAs para cada gene que reduziram o mRNA alvo em 80%–90% (Figuras S4A-S4C). Como esperado, a regulação da fosforilação de S6 por aminoácidos é inibida com siRNA de mTOR e aumentada com siRNA de TSC2 (Figura 5A). Cada um dos siRNAs direcionados a SLC inibe a fosforilação de S6-S6K1 de forma semelhante ao siRNA de mTOR (Figuras 5A e 5B). Em seguida, examinamos o efeito desses reagentes de RNAi na regulação do complexo cap. Como esperado, a regulação negativa de mTOR impede a dissociação de 4EBP1 do complexo cap eIF4E e até aumenta a associação basal de 4EBP1 (Figura 5C, compare as faixas 2 e 4, 1 e 3). O knockdown de SLC1A5, SLC7A5 ou SLC3A2 também aumenta a associação basal de 4EBP1 com o complexo cap e restaura 4EBP1 ao complexo na presença de L-glutamina e EAA (Figura 5C, compare as faixas 2, 6, 8 e 10). Efeitos semelhantes ocorrem em células em ciclo assíncrono, privadas de soro ou tratadas com insulina (Figura S4D). Após a regulação negativa de SLC3A2, o recrutamento de eIF4G não foi inibido por BCH (Figura S3E), confirmando que BCH tem como alvo SLC7A5/SLC3A2. Observe que a expressão de SLC3A2 e SLC7A5 é codependente, explicando a expressão reduzida de SLC3A2 e SLC7A5 quando um deles é alvo de RNAi (Figura 5C e S4D). A captação de L-glutamina é significativamente reduzida quando SLC1A5 é regulado negativamente, resultando em efluxo diminuído após a adição de EAA (Figura 5D). A regulação negativa de SLC3A2 ou SLC7A5 bloqueia a captação de L-leucina regulada por L-glutamina (Figura 5E). Esses dados provam que SLC1A5 e SLC7A5/SLC3A2 suportam a troca de aminoácidos em células HeLa e que isso é necessário para a ativação de mTORC1.
A capacidade do mTOR de regular a tradução é responsável pelo crescimento celular e do organismo. Portanto, quantificamos o tamanho celular relativo após a regulação negativa de SLC1A5, SLC7A5 ou SLC3A2. Em comparação com um siRNA não silenciador, a regulação negativa do mTOR resulta em aproximadamente 10% de redução no tamanho celular (Figuras 5F e 5G), consistente com relatos anteriores em células de mamíferos. Para fins de controle, a regulação negativa de TSC2 foi utilizada para mostrar que, sob essas condições experimentais, as células HeLa também podem crescer em tamanho (Figura S6A). A transfecção com siRNAs de SLC1A5, SLC3A2 ou SLC7A5 reduz o tamanho celular em 10%-20% abaixo do das células controle transfectadas (Figuras 5F, 5G e S6A). Duas abordagens separadas foram adotadas para demonstrar que os fenótipos de tamanho celular eram devidos a (1) inibição específica da via mTOR e (2) RNAi direcionado ao alvo. Primeiro, determinamos se a regulação negativa de TSC2 restauraria o crescimento celular na presença de siRNA de SLC1A5 ou SLC7A5. Sob esse paradigma experimental, a regulação negativa do mTOR suprime o fenótipo de crescimento celular de TSC2 e reduz ainda mais o tamanho celular em comparação com células transfectadas simuladamente (Figura 5H), consistente com o mTOR atuando a jusante de TSC2. Em contraste, a regulação negativa de SLC1A5 ou SLC7A5 na presença de siRNA de TSC2 resulta em aumento do crescimento celular (Figura 5H). Isso indica que SLC1A5 e SLC7A5 podem atuar a montante de TSC2 para mediar um sinal de aminoácido para o mTOR. No entanto, deve-se notar que, nesses experimentos, o crescimento celular não foi resgatado ao mesmo nível da regulação negativa isolada de TSC2 (ou seja, 75% de resgate para SLC1A5 e 50% para SLC7A5). Isso pode ser devido ao knockdown incompleto de TSC2 ou ao fato de que SLC1A5 e SLC7A5/SLC3A2 podem sinalizar para o mTOR independentemente de TSC2. A última possibilidade é apoiada por outros relatos, bem como por observações atuais de que L-glutamina e EAA aumentam significativamente a fosforilação de S6 em células transfectadas com siRNA de TSC2 (Figura 5A). Finalmente, experimentos de resgate fenotípico de tamanho celular foram realizados para provar que o fenótipo de RNAi de SLC1A5 é direcionado ao alvo. Células HeLa expressando de forma estável um alelo GFP-SLC1A5 insensível ao siRNA SLC1A5_1, mas não ao SLC1A5_2, foram geradas (Figura S6B). A redução no tamanho celular associada a SLC1A5_1 foi completamente suprimida nessas células (Figura 5I), provando que os fenótipos observados são devidos a SLC1A5. Observe, no entanto, que os clones HeLa estáveis ainda são sensíveis ao siRNA SLC1A5_2 (Figura 5I), que regula negativamente tanto o SLC1A5 exógeno quanto o endógeno (Figura S6B).
Níveis Elevados de L-Glutamina Endógena Preparam a Ativação de mTORC1
Ao rastrear linhagens celulares para sinalização de mTOR dependente de L-glutamina, foram identificadas linhagens que mostraram indiferença à L-glutamina exógena. Por exemplo, em células MCF7, apenas EAA é suficiente para regular a fosforilação sensível à D-fenilalanina de S6K1 e S6 (Figuras 6A e 6B). Curiosamente, a cinética de ativação de S6K1 (Figura 6B) reflete o que ocorre em células HeLa pré-carregadas com L-glutamina (Figura 2A), sugerindo que as células MCF7 estão preparadas para o input de EAA. Adicionar EAA às células MCF7 aumenta a concentração de L-glutamina no meio em 3 a 4 vezes (Figura 6C), indicando que essas células sintetizam L-glutamina, que pode regular a captação de EAA. A L-glutamina é prontamente detectada em células MCF7 e diminui rapidamente após o tratamento com L-leucina/EAA, consistente com seu efluxo da célula (Figura 6D). O transporte bidirecional de L-glutamina e L-leucina marcada em células MCF7 diminui após 30-60 min (Figuras 6C e 6D), de acordo com a inativação de S6K1 (Figura 6B). Para determinar se a concentração celular de L-glutamina limita a atividade sustentada de S6K1, L-glutamina exógena foi adicionada em combinação com EAA. Nessas condições, os níveis totais de L-glutamina celular são elevados (dados não mostrados) e S6K1 é continuamente ativado por até 2 h (Figura 6E). Esses dados ilustram que o fluxo bidirecional de L-glutamina e L-leucina ocorre em múltiplos tipos celulares e revelam a possibilidade de que certas linhagens tumorais com níveis elevados de L-glutamina celular estão preparadas para a regulação de mTORC1 por EAA.
L-Glutamina e SLC1A5 Suprimem a Autofagia
A inibição da sinalização de mTOR pela retirada de aminoácidos ou adição de rapamicina ativa a autofagia. Nós levantamos a hipótese de que a ausência de L-glutamina ou a regulação negativa de SLC1A5 também ativariam a autofagia. Para testar isso, desenvolvemos um sistema baseado em imagem fluorescente em tandem para quantificar a redistribuição da proteína de membrana autofagossômica LC3. Células RT112 exibem ativação de S6K1 dependente de L-glutamina (Figura S6C) e foram modificadas para expressar mCherry-eGFP-LC3. Como o eGFP é instável em compartimentos celulares com pH < 6,0, um aumento na razão de pontos mCherry:eGFP indica fluxo autofágico aumentado e permite a discriminação entre a distribuição de LC3 antes e após a fusão lisossomal. Em meio livre de soro, LC3 se codistribui em pontos positivos para mCherry e eGFP (Figura 7A, pontos amarelos), mas também é observada codistribuição citoplasmática de mCherry- e eGFP-LC3, indicando que a autofagia não está maximamente ativada. Após a remoção da L-glutamina extracelular, a localização citoplasmática desaparece e a codistribuição de LC3 em pontos positivos para mCherry e eGFP é inibida (Figura 7A). Isso indica uma mudança de LC3 para compartimentos ácidos sensíveis ao GFP, como lisossomos. Esses efeitos foram quantificados usando análise de imagem de alto conteúdo de pontos individuais de mCherry e eGFP LC3 (Figura 7B). Como controles, rapamicina e bafilomicina A foram usados como ativadores e inibidores da autofagia, respectivamente (Figura 7B). A incubação de células em DMEM livre de soro (contendo L-glutamina) aumenta o nível basal de autofagia, consistente com a capacidade dos fatores de crescimento de regular mTOR. Importante, a incubação com DMEM livre de soro e L-glutamina resulta em uma ativação muito maior da autofagia, quase atingindo o nível alcançado pela rapamicina (Figura 7B). Como os EAA ainda estão presentes no meio livre de L-glutamina, essa observação prova que a L-glutamina é essencial para a supressão da autofagia e é consistente com a incapacidade dos EAA isoladamente de ativar mTOR e suprimir a autofagia. Finalmente, a regulação negativa de SLC1A5 usando RNAi aumenta o fluxo autofágico na mesma extensão que a rapamicina ou a inibição de mTOR (Figuras 7C e S6D). Esses dados mostram que o transporte de L-glutamina para dentro das células via SLC1A5 é necessário para a supressão da autofagia.
DISCUSSÃO
A capacidade dos aminoácidos de regular a sinalização TOR é funcionalmente conservada entre eucariotos e é essencial para que o mTORC1 integre sinais de fatores de crescimento. Presumivelmente, os transportadores de aminoácidos funcionam a montante do mTORC1 para permitir que a célula detecte a disponibilidade de aminoácidos e inicie uma resposta anabólica (aumento da tradução e crescimento) ou, quando os aminoácidos são limitantes, uma resposta catabólica como a autofagia. Transportadores de aminoácidos que desempenham tal função não foram identificados. Aqui, mostramos que (1) a L-glutamina é um fator sensibilizante essencial e limitante da taxa que permite que aminoácidos essenciais (EAAs) e fatores de crescimento ativem o mTOR, (2) o transportador de L-glutamina de alta afinidade SLC1A5 e o transportador bidirecional heterodimérico SLC7A5/SLC3A2 são necessários para o transporte de aminoácidos, atividade da via mTORC1 e crescimento celular, e (3) a L-glutamina e a função do SLC1A5 são necessárias para suprimir a autofagia.
Um Mecanismo de Transporte de Aminoácidos em Duas Etapas Regula o mTORC1
Os achados apresentados aqui são consistentes com um processo de duas etapas que define como os aminoácidos ativam o mTOR (Figura 7D). Primeiro, o SLC1A5 regula um aumento na concentração intracelular de L-glutamina. Segundo, o SLC7A5/SLC3A2 utiliza a L-glutamina intracelular como substrato de efluxo para regular a captação de L-leucina extracelular, o que subsequentemente leva à ativação do mTORC1. Esse modelo é apoiado pelo fato de que o SLC7A5/SLC3A2 é um trocador obrigatório e a captação de aminoácidos requer um substrato de efluxo intracelular, como a L-glutamina. A descoberta de que a reativação do mTORC1 em células em privação depende da captação celular de L-glutamina é consistente com seu papel como substrato de efluxo para o SLC7A5/SLC3A2. Além disso, a análise por LC/MS/MS identificou a troca recíproca de L-glutamina intracelular por L-leucina extracelular em células de mamíferos minutos antes da ativação do mTORC1.
Alguns dos substratos preferenciais do SLC7A5 são conhecidos por contribuírem para a ativação do S6K1, de acordo com a observação de que o BCH e a supressão mediada por RNAi do SLC7A5 inibiram a atividade do mTORC1 e o crescimento celular. A regulação negativa do SLC3A2 desestabilizou o SLC7A5, o que está alinhado com relatos de que a expressão na superfície celular do heterodímero requer ambas as subunidades. O SLC3A2 também pode heterodimerizar com outros transportadores relacionados ao SLC7A5, como o SLC7A8 (também conhecido como LAT2). Assim como o SLC7A5, o SLC7A8 requer o SLC3A2 para a distribuição celular adequada, sendo possível que as observações associadas ao RNAi de SLC7A5 ou SLC3A2 possam ser mediadas indiretamente por efeitos na expressão e/ou localização do SLC7A8. Isso é improvável, uma vez que a D-fenilalanina, que antagoniza potentemente o mTORC1, inibe o transporte via SLC7A5, mas não via SLC7A8. Portanto, SLC7A5/SLC3A2 é o principal transportador de EAA a montante do mTORC1. O SLC7A5 é superexpresso em muitos tumores e linhagens celulares cancerígenas, indicando que pode estar envolvido no suporte às necessidades anabólicas aumentadas dos tumores. Além disso, a expressão do SLC7A5 é induzida por ésteres de forbol e PDGF, e sua região 3' UTR contém elementos AU-rich desestabilizadores, uma característica associada a vários produtos de proto-oncogenes.
Em Drosophila melanogaster, transportadores de aminoácidos distintos, conhecidos como minidiscs e slimfast, orquestram o crescimento celular e organismal. minidiscs e slimfast funcionam no corpo gorduroso para detectar a disponibilidade de nutrientes e controlar o tamanho corporal, sendo que o último faz isso via dTOR. Curiosamente, ambos os transportadores apresentam alta homologia com membros da família SLC7, com minidiscs compartilhando 48% de identidade de sequência especificamente com SLC7A5. Juntamente com a descoberta atual de que a L-glutamina é necessária para a ativação do dS6K em células S2, é provável que o fluxo bidirecional de aminoácidos tenha sido conservado ao longo da evolução eucariótica para regular o TOR e o crescimento celular.
A L-Glutamina Regula a Dinâmica Temporal da Sinalização mTORC1-S6K1
A sensibilização mediada por L-glutamina da ativação do mTORC1 foi nitidamente dose-dependente, sugerindo que um aumento na concentração intracelular de L-glutamina fornece um interruptor para a captação de EAA, levando à sinalização do mTORC1. O pré-carregamento de células com L-glutamina antes do tratamento com EAA ou fatores de crescimento acelerou a ativação de S6K1, indicando que a captação de L-glutamina regulada por SLC1A5 é limitante para a ativação da via mTORC1. Essa observação impressionante provavelmente explica o atraso de 30-60 min que normalmente precede a ativação de mTOR-S6K1 em resposta a aminoácidos e fatores de crescimento. Importante, após a depleção de L-glutamina intracelular, a captação de L-leucina para e o mTORC1 é inativado. Essas observações, feitas em vários tipos celulares, levam à previsão de que a L-glutamina é necessária para sustentar os sinais de mTORC1-S6K1 durante a progressão do ciclo celular. Isso provavelmente é de fundamental importância, pois as respostas proliferativas normais exigem coordenação da divisão celular e do controle do tamanho celular dependente de mTOR. Além disso, observações feitas em células MCF7 levantam a possibilidade de que linhagens de células tumorais com níveis elevados de L-glutamina estão preparadas para a regulação do mTORC1 por EAA (Figura 7D). Um possível mecanismo que explica os níveis elevados de L-glutamina poderia ser a regulação positiva aberrante da glutamina sintetase. Embora estudos adicionais sejam necessários para determinar em quais condições isso pode ocorrer, a superexpressão da glutamina sintetase em tumores foi relatada.
L-Glutamina: No Centro do Crescimento e Metabolismo Celular
A L-glutamina é o aminoácido não essencial mais abundante e regula a proliferação de diversos tipos celulares. Curiosamente, o músculo esquelético é um dos maiores reservatórios de L-glutamina no corpo, com concentrações intramusculares em torno de 20 mM, e é um tipo de tecido que depende do mTORC1 para o crescimento celular. A demanda por L-glutamina pode frequentemente exceder a capacidade das células individuais de sintetizá-la de novo, tornando-a um aminoácido "condicionalmente essencial". Isso é particularmente importante em células tumorais, onde foi demonstrado que a glutaminólise é usada para reabastecer intermediários do ciclo TCA e gerar poder redutor na forma de NADPH. Importante, as observações feitas usando ácido L-glutâmico e α-cetoglutarato fornecem evidências de que a glutaminólise não está contribuindo para a ativação do mTORC1. Em vez disso, nossos dados são consistentes com um modelo no qual a L-glutamina intracelular atua a montante do mTORC1 para regular a captação de EAA, atuando como um substrato de efluxo para SLC7A5/SLC3A2.
Os modelos atuais que descrevem como o mTORC1 é ativado por nutrientes mostram que EAA são necessários para a integração dos sinais de fatores de crescimento. Os dados atuais sugerem uma atualização desses modelos, reconhecendo que a L-glutamina é limitante para a ativação do mTORC1 por EAA e fatores de crescimento. Por que a L-glutamina tem esse papel crítico? A homeostase tecidual depende da coordenação da tradução proteica, do fluxo metabólico e do balanço de nitrogênio, processos que dependem da L-glutamina. Não surpreendentemente, as células tumorais têm uma demanda aumentada por L-glutamina e, durante a caquexia, os níveis circulantes e no músculo esquelético de L-glutamina são bastante reduzidos. Como o mTORC1 é um importante regulador do tamanho celular e da massa tecidual tanto em estados normais quanto patológicos, talvez seja apropriado que sua atividade seja sensível tanto aos níveis intracelulares quanto circulantes de L-glutamina.
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Cultura de Células de Mamíferos, Tratamentos e Preparação de Extratos
Células HeLa e MCF7 foram cultivadas conforme descrito nas informações suplementares. A privação de aminoácidos foi realizada privando as células de FBS por 20 h e, em seguida, incubação com D-PBS contendo CaCl2, MgCl2, 15 mg/L de vermelho de fenol, 20 mM de HEPES e 1 g/L de D-glicose (meio de privação) por 3 h. Células privadas foram cultivadas com uma mistura de EAA na concentração encontrada em DMEM (aminoácidos MEM) na presença ou ausência de 1 ou 10 mM de L-glutamina. Ácido L-glutâmico, α-cetoglutarato e uma solução de aminoácidos não essenciais (NEAA) (Sigma, St. Louis, MO) foram diluídos em meio de privação e as soluções resultantes ajustadas para pH 7,2. GPNA (cloridrato de gama-L-glutamil-p-nitroanilida, (MP Biomedicals, Solon, OH) e BCH (ácido 2-aminobiciclo-(2,2,1)-heptano-2-carboxílico, (Sigma, St. Louis, MO) foram dissolvidos em meio de estimulação e o pH ajustado para 7,2. Para experimentos de pré-incubação com L-glutamina, células privadas de aminoácidos foram cultivadas na presença de 10 mM de L-glutamina por 1 h a 37°C. O meio foi então removido e as monocamadas celulares lavadas duas vezes com meio de privação antes de adicionar o meio de teste pelos tempos indicados. Detalhes do tampão de lise celular, cultura de células de Drosophila e estimulações, anticorpos, ensaio do complexo cap-eIF4E e o ensaio western in-cell são fornecidos nas informações suplementares.
Medição por LC/MS/MS de L-Glutamina e Análogos de Aminoácidos Marcados com Isótopos Estáveis
A concentração de L-glutamina no meio de cultura foi quantificada utilizando LC/MS/MS com um sistema MS API4000 triple quadruple (Applied Biosystems Inc, Framingham, MA) acoplado a um HPLC Agilent 1200 (Santa Clara, CA) e um Leap CTC Autosampler (Carrboro, NC). As condições de LC e os detalhes dos aminoácidos marcados com isótopos estáveis são fornecidos nas informações suplementares. Os padrões de calibração foram preparados em mistura de solvente acetonitrila/água (50/50 v/v) contendo 0,5% de meio de cultura em branco. Amostras de meio de cultura condicionado, coletadas em diferentes pontos de tempo após incubação com as células, foram diluídas 1:200 (v/v) com a mistura de solvente acetonitrila/água contendo o padrão interno. Amostras diluídas (5 μL) foram injetadas e analisadas por LC/MS/MS. Para quantificação de L-glutamina e aminoácidos marcados em extratos celulares, monocamadas celulares foram lavadas duas vezes com PBS gelado, raspadas em PBS (200 μL), congeladas três vezes em nitrogênio líquido e centrifugadas (14.000 rpm, 10 min) para remover detritos celulares. Após a normalização das amostras com base nos níveis de proteína total, a proteína nos lisados foi removida por precipitação e centrifugação após a adição de duas alíquotas equivalentes de acetonitrila. Os níveis absolutos de aminoácidos nos sobrenadantes foram determinados conforme descrito acima para as amostras de meio.

Ensaios de RNAi e Tamanho Celular
As informações da sequência do siRNA e o design do cDNA SLC1A5 insensível a RNAi estão descritos nas informações suplementares. A concentração final de siRNA em cada experimento foi de 25 nM. TSC2 ou siRNAs scramble foram transfectados 24 h antes da transfecção com siRNA scramble, mTOR, SLC1A5 ou SLC7A5 (Figura 5H). A quantificação de tamanho celular baseada em FACS foi realizada conforme descrito anteriormente, com detalhes específicos descritos nas informações suplementares.

Quantificação de Autofagia
Células RT112 expressando de forma estável mCherry-eGFP-LC3a foram cultivadas em placas de 384 poços com fundo transparente (24 h). As células foram realimentadas com meio rico (DMEM/10% FBS), 30 nM rapamicina, 100 nM bafilomicina A, DMEM sem soro (contendo 4 mM de L-glutamina) ou DMEM sem soro e sem L-glutamina. Após 18 h, as células foram fixadas, coradas com Hoechst e os pontos de LC3a foram analisados usando um IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Cada ponto de dado mostrado nas Figuras 7B e 7C representa a média de 8 campos de visão com 50-100 células/campo. O fluxo autofágico é calculado com base na razão de intensidade dos pontos mCherry-GFP e expresso como porcentagem da autofagia induzida por rapamicina. Imagens representativas (Figura 7A) foram coletadas usando um microscópio confocal LSM 510 META (Carl Zeiss MicroImaging, Inc, Thornwood, NY).

Material Suplementar
Os Dados Suplementares incluem Procedimentos Experimentais Suplementares e seis figuras e podem ser encontrados online com este artigo em http://www.cell.com/supplemental/S0092-8674(08)01519-5.

REFERÊNCIAS
A família de quinases RSK: papéis emergentes na sinalização celular
Pensando globalmente e agindo localmente com TOR
A fosforilação da proteína ribossômica S6 é inibitória para a autofagia em hepatócitos de rato isolados
Expressão seletiva do transportador de aminoácidos neutros grandes na barreira hematoencefálica
A via Akt/mTOR é um regulador crucial da hipertrofia do músculo esquelético e pode prevenir a atrofia muscular in vivo
A cascata de sinalização TOR regula a expressão gênica em resposta a nutrientes
Superexpressão da glutamina sintetase no câncer hepático primário humano
Um mecanismo sensor de nutrientes controla o crescimento de Drosophila
Elucidando a sinalização TOR e a ação da rapamicina: lições de Saccharomyces cerevisiae
O complexo da esclerose tuberosa
A via TOR sensível a aminoácidos de leveduras a mamíferos
Além da glicólise aeróbica: células transformadas podem se envolver no metabolismo da glutamina que excede a necessidade para a síntese de proteínas e nucleotídeos
Absorção e efeitos metabólicos da glutamina administrada por via enteral em humanos
A resposta de crescimento de células de mamíferos em cultura de tecidos à L-glutamina e ao ácido L-glutâmico
Akt mantém o tamanho e a sobrevivência celular aumentando a captação de nutrientes dependente de mTOR
Análogos de N-gama-aril glutamina como sondas do sítio de ligação do transportador de aminoácidos neutros ASCT2
O tamanho da célula de mamífero é controlado por mTOR e seus alvos a jusante S6K1 e 4EBP1/eIF4E
Transportadores de aminoácidos ASCT2 e LAT1 no câncer: parceiros no crime? Semin
Estressando-se pela sobrevivência: a glutamina como moduladora apoptótica
Uma nova proteína integrada de membrana transitoriamente expressa ligada à ativação celular. Clonagem molecular via sinal de degradação rápida AUUUA
Glutamina sintetase e hepatocarcinogênese
Sinalização mTOR para tradução
A suficiência de aminoácidos e mTOR regulam a quinase p70 S6 e eIF-4E BP1 através de um mecanismo efetor comum
A transcrição modulada pela rapamicina define o subconjunto de vias de sinalização sensíveis a nutrientes diretamente controladas pelas proteínas Tor
Relação entre glutamina, aminoácidos de cadeia ramificada e metabolismo proteico
mTOR e S6K1 medeiam a montagem do complexo de pré-iniciação da tradução através de intercâmbio dinâmico de proteínas e eventos de fosforilação ordenados
O complexo TSC1-TSC2: um quadro de comutação molecular controlando o crescimento celular
O complexo 2 de TOR de mamífero controla o citoesqueleto de actina e é insensível à rapamicina
Regulação TOR das quinases AGC em leveduras e mamíferos
Clonagem por expressão e caracterização de um transportador de aminoácidos neutros grandes ativado pela cadeia pesada do antígeno 4F2 (CD98)
mTOR interage com raptor para formar um complexo sensível a nutrientes que sinaliza para a maquinaria de crescimento celular
Regulação de TORC1 por GTPases Rag na resposta a nutrientes
Dissecção do processo de maturação do autofagossomo por uma nova proteína repórter, LC3 marcada com fluorescência em tandem
O papel da glutamina no metabolismo oxidativo de células malignas
O fator de crescimento derivado de plaquetas estimula a expressão do gene LAT1 no músculo liso vascular: papel no crescimento celular
SKAR liga o splicing de pré-mRNA ao aumento da eficiência de tradução de mRNAs processados mediado por mTOR/S6K1
minidiscs codifica uma subunidade putativa de transportador de aminoácidos necessária não autonomamente para a proliferação celular imaginal
Regulação coordenada da tradução pelas vias da PI 3-quinase e mTOR
Transporte de aminoácidos por heterodímeros de 4F2hc/CD98 e membros de uma família de permeases
O transporte de glutamina para dentro de células de mamíferos
Ativação de trocadores heterodiméricos de aminoácidos do sistema L por substratos intracelulares
Metabolismo da glutamina em corpo inteiro e músculo esquelético em indivíduos saudáveis
A autofagia combate doenças através da autodigestão celular
Eventos moleculares envolvidos na regulação positiva do transportador humano de aminoácidos neutros independente de Na+ LAT1 durante a ativação de células T
Atrofia de células musculares esqueléticas S6K1(-/-) revela efetores distintos de mTOR para controle do ciclo celular e tamanho
Evidência de que a glutamina, e não o açúcar, é a principal fonte de energia para células HeLa cultivadas
As GTPases Rag se ligam ao Raptor e medeiam a sinalização de aminoácidos para mTORC1
Rictor, um novo parceiro de ligação do mTOR, define uma via insensível à rapamicina e independente de raptor que regula o citoesqueleto
Papéis crescentes para a via do mTOR
Identificação e caracterização funcional de um transportador de aminoácidos neutros independente de Na+ com ampla seletividade de substrato
A sinalização de Ras, PI(3)K e mTOR controla o crescimento de células tumorais
A proteína TSC2 da esclerose tuberosa não é necessária para a regulação do alvo mamífero da rapamicina por aminoácidos e certos estresses celulares
Autofagia em levedura demonstrada com mutantes deficientes em proteinase e condições para sua indução
Clonagem e caracterização funcional de um transportador de aminoácidos neutros dependente de Na+ semelhante ao sistema ASC
Sistema L: trocadores heteroméricos de aminoácidos neutros grandes envolvidos no transporte direcional
A disponibilidade de aminoácidos regula a quinase p70 S6 e múltiplos fatores de tradução
Expressão de um gene oncofetal altamente conservado, TA1/E16, em carcinoma de cólon humano e outros cânceres primários: homologia com a permease de aminoácidos de Schistosoma mansoni e produtos gênicos de Caenorhabditis elegans
Sinalização TOR no crescimento e metabolismo
Transportador humano de aminoácidos tipo L 1 (LAT1): caracterização da função e expressão em linhagens de células tumorais
Regulação dependente de glutamina da sinalização efetora de mTORC1
(A) Células HeLa privadas de fatores de crescimento e nutrientes (jejum) foram tratadas com DMEM ou EAA por 60 min. A fosforilação de S6K1Thr389 e S6Ser235/236 e S6240/244, e os níveis totais de S6K1 (isoformas citoplasmática de 70 kDa e nuclear de 85 kDa estão indicadas) foram avaliados usando western blotting.
(B) Células HeLa foram submetidas a jejum como em (A) e então tratadas com as concentrações indicadas de EAA e/ou L-glutamina por 60 min. A concentração de EAA (x vezes) foi baseada na concentração final em DMEM (1×). A fosforilação de S6Ser235/236 foi quantificada usando o ensaio de western in-cell e expressa como aumento em vezes em comparação com células em jejum.
(C) Células HeLa em privação foram incubadas com DMEM ou DMEM deficiente em L-glutamina (DMEM-GLN) por 60 min e a fosforilação de S6Ser235/236 foi quantificada.
(D) Células HeLa em privação foram tratadas por 60 min conforme indicado e a fosforilação de S6Ser235/236 foi quantificada. Foi utilizada 1 mM de L- ou D-glutamina.
(E) Células HeLa em privação foram tratadas conforme indicado e a fosforilação de S6K1Thr389 foi quantificada conforme descrito no suplemento.
(F) Células HeLa em privação foram tratadas conforme indicado por 60 min e os níveis de 4EBP1 e eIF4G associados a contas de m7 GTP foram analisados por western blotting.
(G) Células S2 ou S2-R de Drosophila em privação de soro e aminoácidos foram então tratadas com aminoácidos na presença ou ausência de L-glutamina.
Os dados apresentados são representativos de três experimentos independentes. Dados com barras de erro representam média ± DP.
L-Glutamina Integra a Sinalização de EAA e Fatores de Crescimento para mTORC1 e Regula a Dinâmica Temporal de S6K1
(A) Células HeLa em privação foram pré-incubadas com L-glutamina (pré-carga de GLN) ou meio de privação (–) por 1 h antes de adicionar EAA ou EAA/GLN pelos tempos indicados. A fosforilação de S6K1 foi analisada por western blotting.
(B) Células foram pré-tratadas com L-glutamina (G) ou EAA (E) por 1 h e incubadas com EAA, L-glutamina ou EAA/GLN por 15 min antes da lise.
(C) Células foram tratadas como em (A), exceto que insulina (100 nM) ou EGF (25 ng/mL) foram incluídas conforme indicado.
(D) Células pré-tratadas com L-glutamina ou meio de privação por 1 h foram então incubadas com EAA ou EAA/GLN, respectivamente, pelos tempos indicados.
(E) Células pré-tratadas por 1 h com 10 mM de L-glutamina, ácido L-glutâmico (GLU) ou ácido α-cetoglutárico (αKG), foram lavadas e então incubadas com meio de privação ou contendo EAA por 15 min.
(F) Células pré-tratadas com 10 mM de L-glutamina ou 13 aminoácidos não essenciais (NEAA) por 1 h, foram lavadas e então incubadas com meio de privação ou contendo EAA por 15 min.
(G) Células HeLa em privação foram tratadas conforme indicado por 1 h e lisadas.
Todos os dados são representativos de pelo menos três experimentos independentes.
Modulação Farmacológica de SLC1A5 e SLC7A5 Inibe a Regulação de mTOR
(A) Células HeLa em privação foram tratadas conforme indicado na presença de concentrações crescentes de GPNA (1 h).
(B) Células em privação foram tratadas por 60 min e o complexo de tradução cap foi analisado. Foi utilizado 10 mM de GPNA.
(C) Células foram pré-tratadas (pré-carga) por 60 min com L-glutamina na presença ou ausência de GPNA antes do tratamento com EAA por 15 min na presença ou ausência de GPNA.
(D e E) Células HeLa em privação foram tratadas com EAA contendo 1 mM de L-glutamina (EAA/GLN) e 100 nM de insulina na ausência ou presença de BCH por 60 min. Uma banda reativa inespecífica (*) é indicada.
(F) A fosforilação de S6Ser235/236 foi quantificada após tratamento com as concentrações indicadas (X) de EAA na presença de 1 mM de L-glutamina e D-fenilalanina.
(G) Células HeLa em privação foram tratadas conforme indicado na presença e ausência de 50 mM de D-fenilalanina (D-Phe).
(H) As células foram pré-tratadas por 60 min conforme indicado e depois tratadas com EAA por 15 min na presença ou ausência de D-Phe.
Os dados com barras de erro representam média ± DP.

O Transporte Bidirecional de L-Glutamina e EAA Está a Montante da Ativação do mTOR
(A) Células em privação foram pré-incubadas com L-glutamina ou meio de privação (–) por 1 h antes da adição de EAA ou meio de privação (15 min). O meio condicionado (CM) foi removido e adicionado a células em privação ingênuas por 1 h (linhas 1-5) e a fosforilação de S6K1 foi analisada. A fosforilação de S6K1 em um extrato de células primadas com L-glutamina tratadas com EAA é mostrada (linha 6).
(B) O meio condicionado foi preparado como em (A), exceto que a coleta foi feita 2,5, 5, 10 e 15 min após a adição de EAA.
(C) Cromatogramas de íons de LC/MS/MS de L-glutamina no meio condicionado coletado em 2,5 min de células pré-tratadas com meio de privação (PBS) antes de EAA (traço esquerdo), pré-tratadas com L-glutamina antes de PBS (traço do meio) ou pré-tratadas com L-glutamina antes de EAA (traço direito).
(D) Células HeLa em privação foram pré-tratadas com L-glutamina marcada por 1 h, lavadas e depois tratadas com EAA contendo 0,4 mM de L-leucina marcada (L-Leu/EAA) por vários tempos (minutos). Os níveis absolutos de L-glutamina marcada no meio condicionado (símbolos pretos) e extratos celulares (símbolos vermelhos) foram quantificados por LC/MS/MS.
(E) Células em privação foram tratadas como em (C) e o efluxo de L-glutamina (mudança na concentração do meio) após tratamento com PBS, EAA ou insulina por 2,5 min foi quantificado.
(F) As células foram tratadas como em (D) e após 2,5 min os níveis absolutos de L-glutamina marcada efluída (preto) e L-leucina marcada nas células (vermelho) foram quantificados.
(G) Células pré-tratadas com 10 mM de L-glutamina marcada ou ácido L-glutâmico marcado por 1 h foram lavadas, tratadas com EAA contendo L-leucina marcada por 2,5 min e extraídas.
(H) Células em privação foram tratadas com L-glutamina marcada por 1 h na ausência ou presença de 10 mM de GPNA. Os níveis absolutos de L-glutamina nos extratos celulares foram quantificados.
(I) As células foram tratadas com L-glutamina marcada por 1 h, lavadas e incubadas com 0,4 mM de L-leucina marcada na ausência e presença de BCH ou D-Phe por 2,5 min.
Os dados com barras de erro representam média ± DP.

A Regulação Negativa Mediada por RNAi de SLC1A5, SLC3A2 ou SLC7A5 Inibe o Transporte de Aminoácidos e a Atividade da Via mTOR
(A) Células HeLa transfectadas com os siRNAs indicados foram submetidas a privação de aminoácidos (barras abertas) e tratadas por 60 min com EAA contendo 1 mM de L-glutamina (barras vermelhas). A fosforilação de S6Ser235/236 foi quantificada usando a leitura Delfia.
(B) Após a transfecção de siRNA (96 h), a fosforilação de S6K1 foi analisada.
(C) Células transfectadas com siRNAs foram tratadas conforme indicado (1 h) e o complexo de tradução cap foi analisado.
(D) Células transfectadas com scramble ou siRNA SLC1A5_1 foram privadas de nutrientes e pré-incubadas com L-glutamina marcada (1 h). As células foram extraídas para quantificação da captação de L-glutamina marcada (barras abertas) ou tratadas com L-leucina/EAA marcada (2,5 min) para quantificação de L-glutamina marcada efluída (barras preenchidas).
(E) Células foram transfectadas com os siRNAs indicados, privadas de nutrientes e pré-tratadas com L-glutamina marcada (barras hachuradas) ou meio de privação (barras preenchidas) por 1 h, lavadas e então tratadas com 0,4 mM de L-leucina marcada por 2,5 min. Os extratos celulares foram processados para quantificação absoluta de L-leucina.
(F) Células HeLa foram transfectadas com siRNAs (não silenciador, NS) por 72 h e coletadas para quantificação do tamanho celular.
(G) Dados de tamanho celular de três experimentos independentes (média ± EPM) são mostrados.
(H) Células HeLa foram transfectadas com siRNAs scramble, mTOR, SLC1A5 ou SLC7A5 na presença ou ausência de um siRNA TSC2 e processadas para quantificação do tamanho celular.
(I) Células HeLa expressando vetor (mock) ou GFP-SLC1A5 insensível a RNAi (clones L1 e L2) foram transfectadas com siRNAs e processadas para quantificação do tamanho celular.
Os dados mostrados (média ± DP) representam três experimentos independentes.
Efluxo de L-Glutamina Endógena Regula a Ativação de S6K1 em Células MCF7
(A) Células MCF7 foram privadas de aminoácidos, tratadas conforme indicado (1 h) e processadas para quantificação da fosforilação de S6.
(B) Células MCF7 privadas de nutrientes foram tratadas com EAA na ausência ou presença de 50 mM de D-Fe por vários períodos.
(C) Células MCF7 privadas de nutrientes foram tratadas com L-leucina/EAA marcada (círculos preenchidos) ou meio de privação (estrelas) por vários períodos, e o meio condicionado foi processado para quantificação de L-glutamina.
(D) Células MCF7 foram tratadas como em (C) e extraídas nos tempos indicados para quantificação de L-glutamina (círculos pretos) ou L-leucina marcada (círculos vermelhos).
(E) Células MCF7 privadas de nutrientes foram tratadas conforme indicado e a ativação de S6K1 analisada por western blotting.
Dados com barras de erro representam média ± DP.
L-Glutamina e SLC1A5 Regulam a Autofagia
(A) Imagens de confocal da distribuição de mCherry-eGFP-LC3a antes (+) e após (−) privação de L-glutamina são mostradas.
(B) Quantificação do fluxo autofágico em células RT112.
(C) Células RT112 transfectadas com os siRNAs individuais por 72 h foram privadas de soro por 24 h e processadas para quantificação do fluxo autofágico. Rapamicina foi adicionada a células transfectadas com siRNA scramble durante o período de privação.
(D) A regulação da sinalização de mTOR, crescimento celular e supressão da autofagia por EAA requer a captação intracelular e subsequente efluxo de L-glutamina (SLC3A2 dimerizado com SLC7A5 é mostrado em amarelo).
Todos os dados (média ± DP) são representativos de pelo menos três experimentos independentes.