pmid: "39506790"
title: "Dissecando o metabolismo da L-glutamina na leucemia mieloide aguda: insights de célula única e implicações terapêuticas."
authors: "Chen Y"
journal: "Journal of translational medicine"
pubdate: "2024 Nov 06"
doi: "10.1186/s12967-024-05779-3"
source: "PMC Full Text"

Dissecando o metabolismo da L-glutamina na leucemia mieloide aguda: insights de célula única e implicações terapêuticas.

Autores

Chen Y

Periodico

Journal of translational medicine (2024 Nov 06)

Conteudo

Dissecando o metabolismo da L-glutamina na leucemia mieloide aguda: insights de células únicas e implicações terapêuticas
Background
A leucemia mieloide aguda (LMA) é um câncer do sangue de rápida progressão. O prognóstico da LMA pode ser desafiador, enfatizando a necessidade de pesquisa contínua e abordagens inovadoras para melhorar os resultados em indivíduos afetados por essa formidável neoplasia hematológica.
Methods
Neste estudo, utilizamos sequenciamento de RNA de células únicas (scRNA-seq) de pacientes com LMA para investigar o impacto dos genes relacionados ao metabolismo da L-glutamina na progressão da doença.
Results
Nossa análise revelou aumento da atividade relacionada à glutamina em células pré-B CD34+, sugerindo um potencial papel regulador na tumorigênese e na progressão da LMA. Além disso, a análise de comunicação intercelular revelou uma via de sinalização significativa envolvendo a sinalização do fator inibidor da migração de macrófagos através de CD74+CD44 nas células pré-B CD34+, que transmitem sinais para células pré-dendríticas e monócitos. Os ligantes para essa via foram predominantemente expressos em células estromais, células T ingênuas e células pré-B CD34+. O CD74, o receptor pertinente, foi predominantemente detectado em uma variedade de componentes celulares, incluindo células estromais, células pré-dendríticas, células dendríticas plasmocitoides e progenitores hematopoiéticos. Os resultados do estudo fornecem insights sobre a possível interação entre esses tipos celulares e sua contribuição coletiva para a patogênese da LMA. Além disso, identificamos 10 genes associados ao prognóstico da LMA, incluindo CCL5, CD52, CFD, FABP5, LGALS1, NUCB2, PSAP, S100A4, SPINK2 e VCAN. Entre estes, CCL5 e CD52 foram implicados na progressão da LMA e são potenciais alvos terapêuticos.
Conclusions
Esta análise aprofundada da biologia da LMA aprofunda significativamente nossa compreensão da doença e apresenta informações fundamentais que podem orientar a criação de estratégias de tratamento inovadoras para pacientes com LMA.
Supplementary Information
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1186/s12967-024-05779-3.
Introdução
A leucemia mieloide aguda (LMA) é um câncer originado na medula óssea, caracterizado pela rápida proliferação de células mieloides anormais. A patogênese da LMA é complexa e envolve múltiplos fatores. Estudos recentes destacaram o papel significativo que as vias metabólicas desempenham na sobrevivência e expansão das células leucêmicas. Entre essas alterações metabólicas, a via de utilização da glutamina (Gln) emergiu como um potencial alvo terapêutico devido à sua importância no suporte às demandas biossintéticas de células cancerígenas que se dividem rapidamente. A glutamina, prevalente no sangue, é fundamental no metabolismo celular, servindo como fornecedora de nitrogênio para a síntese de nucleotídeos e proteínas e como fonte essencial de energia, especialmente durante o estresse metabólico. Apesar de sua importância, ainda existe uma lacuna significativa na compreensão de como essas vias metabólicas contribuem para a patogênese da LMA e seu potencial para intervenção terapêutica. Embora estudos sugiram que direcionar o metabolismo da glutamina possa ser benéfico, identificar e direcionar precisamente essas vias para melhorar a eficácia do tratamento apresenta desafios substanciais. Além disso, a complexidade do metabolismo da glutamina e suas interações com outros processos biológicos nas células de LMA adicionam camadas de complexidade tanto à pesquisa quanto ao tratamento.
O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) e seus métodos analíticos forneceram novas oportunidades para entender os perfis moleculares de diversas células imunes. Estudos anteriores sugeriram que a análise da expressão gênica de células imunes por scRNA-seq pode prever efetivamente os desfechos dos pacientes com câncer e as respostas à imunoterapia. Nesta pesquisa, nosso objetivo foi analisar dados de scRNA-seq de pacientes com LMA para identificar genes relacionados à glutamina. Em seguida, usamos esses genes para desenvolver um modelo de escore de risco para predizer o prognóstico de pacientes com LMA.
Materiais e métodos
Aquisição e pré-processamento de dados de transcriptoma em massa
Os dados deste estudo foram obtidos dos bancos de dados do The Cancer Genome Atlas (TCGA) e do Gene Expression Omnibus (GEO). Perfis abrangentes de expressão de todo o genoma para LMA, anotações clínicas e dados sobre variações simples de nucleotídeos (SNVs) no formato "transcripts per kilobase per million" foram adquiridos retrospectivamente. A estimativa de SNV foi facilitada pela ferramenta "VarScan2 Variant Aggregation and Masking". O processo de recuperação envolveu o uso de pacotes R, especificamente "TCGAbiolinks (versão 2.25.0)" para TCGA e "GEOquery" para GEO. No total, 134 genes ligados ao metabolismo da glutamina foram identificados a partir do banco de dados GSEA. (Tabela S1)
Download e processamento de dados de sequenciamento de célula única
Utilizamos o pacote R “Seurat” (versão 4.2.0) para processar os dados brutos de célula única do conjunto de dados GSE116256, que inclui um total de 41 amostras. A etapa inicial da análise envolveu a filtragem de células e genes usando critérios específicos: (1) Eliminação de células com níveis de expressão gênica abaixo de 200 genes; (2) Eliminação de genes detectados em menos de uma célula; (3) Preservação de células com expressão de 500 ou mais genes; (4) Preservação de células com expressão de genes mitocondriais abaixo de 20%.
Após a normalização dos dados utilizando a função “NormalizeData” do pacote R “Seurat”, a identificação de genes altamente variáveis (HVGs) foi determinada pela correlação das médias de expressão gênica com sua dispersão. A análise de componentes principais (PCA) com componentes principais significativos foi realizada para agrupamento. O algoritmo Harmony foi empregado para corrigir efeitos de lote entre várias amostras. A identificação de clusters utilizou a função “FindClusters” com o algoritmo de otimização modularidade de vizinho mais próximo compartilhado (SNN) em 25 componentes principais com resolução de 0,5, resultando em 24 clusters. A Aproximação e Projeção de Variedade Uniforme (UMAP) foi usada através de “RunUMAP” para visualizar o agrupamento nas dimensões UMAP-1 e UMAP-2. A função “FindAllMarkers”, com suas configurações padrão, foi utilizada nos dados de expressão gênica normalizados para identificar marcadores significativos para cada cluster celular. Esses clusters foram ainda caracterizados usando biomarcadores específicos para diferentes tipos celulares. A distribuição dos tipos celulares entre os clusters foi quantificada e analisada para uma compreensão mais profunda da composição celular em amostras de LMA.
Escore de genes relacionados à glutamina
O pacote R “AUCell” foi utilizado para Análise de Enriquecimento de Conjuntos Gênicos (GSEA), pontuando vias para células individuais. A análise utilizou a área sob a curva (AUC) de 134 genes relacionados à glutamina obtidos do Molecular Signatures Database (MSigDB) (Tabela S1). Este método gerou classificações de expressão gênica específicas para cada célula, estimando a prevalência de genes altamente expressos dentro do conjunto de genes selecionado. Células exibindo valores de AUC mais altos indicaram um maior número de genes do conjunto. Para identificar células com conjuntos de genes ativos, a função “AUCell_exploreThresholds” foi utilizada para definir o limiar. Posteriormente, os valores de AUC foram plotados utilizando o pacote R “ggplot2”.
Análise de comunicação celular e expressão ligante-receptor
O CellChat foi utilizado para explorar os padrões de comunicação de entrada e saída para cada tipo celular. Uma revisão minuciosa da comunicação intercelular dentro das amostras de LMA foi realizada, com os parâmetros de análise do CellChat definidos como padrão e um limiar de significância de P ≤ 0,05.
Análise de enriquecimento de vias Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)
As análises de enriquecimento de vias GO e KEGG envolvem a avaliação de processos biológicos (BP), funções moleculares (MF) e componentes celulares (CC) no GO, e a identificação de vias metabólicas significativamente alteradas no KEGG. O pacote R “clusterProfiler” foi utilizado para realizar a análise de enriquecimento em genes diferencialmente expressos relacionados à glutamina (GRDEGs) com P < 0,05.
Construção e validação do modelo prognóstico
A análise de Cox univariada foi usada para avaliar a correlação entre cada gene e a sobrevida global em coortes tumorais. O conjunto de dados tumorais com dados clínicos foi dividido em um conjunto de treinamento (n = 93) e um conjunto de validação (n = 39). O modelo de regressão de Cox LASSO refinou os genes candidatos para desenvolver o modelo prognóstico, escolhendo o parâmetro de penalidade (λ) com base em critérios mínimos. Posteriormente, os escores de risco foram calculados usando uma fórmula definida:
(Coef (gene); coeficientes, Expression (gene): nível de expressão do gene)
Os pacientes do grupo de treinamento foram divididos em grupos de baixo e alto risco com base no escore de risco mediano. A análise de sobrevida foi realizada usando curvas de Kaplan-Meier, com o teste de log-rank avaliando a significância estatística. A eficácia do modelo preditivo foi avaliada por meio de curvas ROC, onde uma AUC acima de 0,6 indica bom desempenho diagnóstico.
GSEA
A GSEA avaliou diferenças significativas e consistentes em um conjunto de genes específico entre dois estados biológicos, usando o pacote R “clusterProfiler” em uma lista de genes classificados pelos valores de log2FC. Para confiabilidade, 1.000 permutações de conjuntos de genes foram realizadas por análise, com o conjunto c2.cp.kegg.v7.5.1.symbols do MSigDB como referência. A significância do enriquecimento foi definida em um valor de P ajustado < 0,05.
Análise de variação de conjuntos de genes (GSVA)
O conjunto de dados “c2.cp.kegg.v7.5.1.symbols” com o pacote R “GSVA” (v1.42.0) foi utilizado para realizar a GSVA, com visualização através do pacote R “pheatmap” (v1.0.12).
Análise de infiltração imune
O ssGSEA produz escores de enriquecimento distintos para cada par amostra-conjunto de genes e avalia cada combinação amostra-conjunto de genes individualmente. Usando o TISIDB, que abrange dados de 28 tipos de células imunes, quantificamos escores de enriquecimento relativos para cada tipo celular a partir de perfis de expressão gênica de amostras tumorais. O pacote R “ggplot2” foi então empregado para representar graficamente as variações na infiltração de células imunes.
Construção e verificação do nomograma
Os dados dos pacientes do banco de dados TCGA, incluindo informações clínicas, foram integrados ao escore de risco no modelo de regressão. Um nomograma foi então criado usando o pacote R “RMS” para prever probabilidades de sobrevida em 1, 2 e 3 anos, com o escore de risco servindo como um fator prognóstico crucial. Curvas de calibração foram empregadas para avaliar a precisão do nomograma em incorporar características prognósticas e clínicas.
Análise de mutação somática
Variações genômicas foram examinadas utilizando dados de mutação, visualizadas com o pacote R "maftools" para representar variantes somáticas dentro de diferentes clusters. Isso incluiu análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), inserção e deleção (INDEL), carga mutacional tumoral (TMB) e frequência de mutação. Em tumores malignos, os genes condutores primários foram identificados como os 20 mais frequentemente mutados.

Avaliação da suscetibilidade a medicamentos
Os dados de concentração inibitória média (IC50) foram obtidos do Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC), juntamente com dados de expressão gênica clínica. O pacote R "oncoPredict" foi utilizado para prever a responsividade a potenciais drogas terapêuticas para pacientes com LMA.

Análise estatística
Os dados foram analisados utilizando R. Curvas de Kaplan-Meier e testes de log-rank compararam as taxas de sobrevida entre grupos. A análise de regressão de Cox, incluindo métodos univariados e multivariados, avaliou variáveis prognósticas. A visualização foi feita com os pacotes "ggplot2" e "survival", e mapas de calor foram criados com "Pheatmap". Para variáveis com distribuição normal, testes t bicaudais ou ANOVA de uma via identificaram diferenças significativas. Dados que não apresentavam distribuição normal foram analisados com testes de Wilcoxon ou Kruskal-Wallis, estabelecendo significância estatística em P < 0,05.

Resultados
Identificação dos subgrupos reativos de genes relacionados à glutamina
Para investigar a origem dos genes que exibem expressão elevada, a população celular da LMA foi examinada utilizando o conjunto de dados de sequenciamento de célula única, GSE116256. Após uma avaliação inicial de controle de qualidade, transcriptomas de célula única foram derivados de um conjunto abrangente de 38.410 células. Este estudo abrangeu 41 amostras, com uma uniformidade distinta na distribuição de células entre os grupos. Essa distribuição uniforme sugeriu a ausência de efeitos de lote discerníveis entre os grupos, estabelecendo assim uma base para procedimentos analíticos subsequentes (Fig. 1A). Após a análise de agrupamento, todas as entidades celulares foram segregadas em 24 clusters distintos (Fig. 1B). Com base nas características genéticas únicas inerentes a cada cluster, tipos celulares específicos foram identificados usando biomarcadores específicos de tipo celular (Fig. 1F). Identificamos 16 tipos celulares únicos, incluindo células T CD8+ ingênuas, células natural killer e monócitos (Fig. 1C). Também analisamos a distribuição dos diversos tipos celulares dentro de cada grupo (Fig. 1D). E nos concentramos em subgrupos celulares ativos para detectar os padrões de expressão de genes relacionados à glutamina no nível de célula única. O exame do diagrama UMAP das células ativas revelou que as células pré-B CD34+ eram células ativas dentro do espectro de tipos celulares imunes, com significância estatística (Fig. 1E).
Identificação de subgrupos a partir do conjunto de dados de scRNA-seq. (A) Um gráfico UMAP ilustrando a distribuição celular entre as coortes de LMA e controle. (B) Um gráfico UMAP delineando a distribuição dos subgrupos de LMA. (C) Um gráfico UMAP apresentando os resultados de anotação para os subgrupos de LMA. (D) Um histograma exibindo a distribuição dos tipos celulares entre os pacientes com LMA e o grupo controle. (E) Um gráfico UMAP cromático indicando os escores de atividade das células; quanto mais brilhante a cor, maior a atividade. (F) Perfis de expressão dos genes marcadores em cada tipo celular.

Padrões de comunicação celular do microambiente da LMA

Para esclarecer a função coletiva das células, realizamos uma análise da comunicação célula-célula, quantificando as interações e suas intensidades entre vários tipos celulares (Fig. 2A e B). Uma investigação mais aprofundada sobre os potenciais sinais e pares moleculares entre os 16 tipos celulares revelou que células estromais, células mieloides, progenitores hematopoiéticos, células T CD8+ e células pré-B CD34+ eram fontes primárias de sinal. Além disso, eritrócitos, plasmócitos, células Th0 ingênuas, monócitos e células pré-B CD34+ foram identificados como principais receptores de sinal (Fig. 2C). As vias de sinalização potencialmente envolvidas entre esses tipos celulares incluíram MIF, MK, RESISTINA e BAFF (Fig. 2D). Posteriormente, foram explorados pares de sinalização envolvendo células pré-B CD34+. Os achados indicaram que as células pré-B CD34+ apresentaram a comunicação mais robusta com células pré-dendríticas através da via MIF-(CD74+CD44) e com monócitos através da mesma via MIF-(CD74+CD44) (Fig. 2E e F). Esses achados começaram a esclarecer interações potenciais entre esses tipos celulares, oferecendo insights para estudos adicionais sobre o papel coletivo das células pré-B CD34+, células pré-dendríticas e monócitos em pacientes com LMA. Além disso, observou-se que o ligante era altamente expresso em células estromais, células T ingênuas (Th0) e células pré-B CD34+, com o receptor CD74 presente em uma variedade de tipos celulares (Fig. 2G).

Os resultados da análise de comunicação célula-célula. (A) Interações entre diferentes tipos celulares. (B) Intensidades das interações entre diferentes tipos celulares. (C) Mapa de calor mostrando as possíveis vias de sinalização emissoras entre diferentes tipos celulares. (D) Mapa de calor mostrando as possíveis vias de sinalização receptoras entre diferentes tipos celulares. (E) Gráfico de pontos mostrando os possíveis pares de sinalização emissores ou receptores. (F) Diagrama de cordas mostrando a possibilidade de pares de sinalização emissores ou receptores. (G) Distribuição da expressão dos genes de sinalização MIF.

Análise de enriquecimento funcional
Da comparação de células pré-B CD34+ e outros tipos celulares, foram identificados 329 genes diferencialmente expressos (DEGs) entre os dois grupos (P < 0,05, |Log2 Fold Change| > 0,5). Entre esses genes, os 36 principais foram regulados positivamente, coincidindo com os cinco principais DEGs regulados negativamente nas células pré-B CD34+ (Fig. 3A). Foram identificados 185 DEGs a partir da comparação entre amostras de LMA e normais. Além disso, identificamos seis genes regulados positivamente juntamente com 35 DEGs regulados negativamente na LMA (Fig. 3B). No total, 113 DEGs-chave foram identificados a partir da interseção dos DEGs nas células pré-B CD34+ e aqueles na LMA (Fig. 3C).

Para investigar as funções biológicas dos DEGs-chave, realizamos análises de enriquecimento GO e KEGG. Os resultados de GO mostraram que esses genes estavam significativamente enriquecidos em vias de processo biológico (BP), incluindo processamento e apresentação de antígeno peptídico (GO: 0048002), processamento e apresentação de antígeno peptídico exógeno (GO: 0002478), processamento e apresentação de antígeno (GO: 0019882) e processamento e apresentação de antígeno exógeno (GO: 0019884) (Fig. 3D, G). Esses genes também foram enriquecidos nas vias de componentes celulares (CC), como membranas de vesículas endocíticas (GO: 0030666), complexos proteicos MHC (GO: 0042611), vesículas endocíticas (GO: 0030139), membrana de vesícula de transporte do RE para o Golgi (GO: 0012507) e componente integral do lado luminal da membrana do retículo endoplasmático (GO: 0071556) (Fig. 3D, H). Nas vias de função molecular (MF), envolvendo ligação de peptídeo (GO: 0042277), ligação de antígeno peptídico (GO: 0042605), ligação de amida (GO: 0033218), ligação ao complexo proteico MHC classe II (GO: 0023026) e ligação ao complexo proteico MHC (GO: 0023023), esses genes também foram enriquecidos (Fig. 3D, F).

Além das análises de enriquecimento GO, as análises de enriquecimento KEGG indicaram que as vias significativamente associadas aos DEGs-chave estavam relacionadas ao processamento e apresentação de antígeno (hsa04612), função do fagossomo (hsa04145), diabetes tipo I (hsa04940), moléculas de adesão celular (hsa04514), miocardite viral (hsa05416), rejeição de aloenxerto (hsa05330), doença do enxerto contra hospedeiro (hsa05332), citotoxicidade de células NK (has04650) e infecção pelo vírus Epstein-Barr (hsa05169) (Fig. 3E, I).
Identificação e enriquecimento funcional de DEGs. (A) Heatmap dos 36 DEGs mais regulados positivamente e dos 5 mais regulados negativamente em células pré-B CD34+ em comparação com outros tipos celulares. (B) Heatmap dos 6 DEGs mais regulados positivamente e dos 35 mais regulados negativamente entre grupos AML e controle. (C) Diagrama de Venn ilustrando a sobreposição de DEGs em células pré-B CD34+ e AML. (D) Análise GO para os DEGs mostra as 3 principais vias de enriquecimento significativo em termos de processo biológico (BP), componentes celulares (CC) e função molecular (MF). (E) Análise KEGG para os DEGs mostra as vias de enriquecimento significativo. (F) As 5 principais vias de função molecular (MF) enriquecidas pelos DEGs. (G) Gráfico de bolhas mostrando as 4 principais vias de processo biológico (BP) enriquecidas. (H) Um gráfico circular mostrando as vias de componente celular (CC) enriquecidas por GO. (I) Análises de enriquecimento KEGG dos DEGs. (J) Tabela dos IDs de vias GO e nomes de vias correspondentes para F, G e H

Construção e verificação do modelo de risco prognóstico
Identificamos genes de assinatura em células pré-B CD34+ com P<0,05, levando à descoberta de 33 genes prognósticos de AML (Tabela S2). A regressão LASSO no conjunto de treinamento eliminou genes redundantes, identificando 10 genes prognósticos para pacientes com AML (Fig. 4A e B). Para avaliar a robustez do modelo, dividimos as amostras com base em suas pontuações de risco mediana em categorias de alto e baixo risco. Avaliamos a distribuição das pontuações de risco, durações de sobrevida e perfis de expressão gênica para cada grupo. Notavelmente, o NUCB2 foi predominantemente expresso no grupo de alto risco, conforme mostrado na Fig. 4C. As curvas de sobrevida de Kaplan-Meier para a coorte de treinamento (Fig. 4E) e a coorte de validação (Fig. 4G) demonstraram piores desfechos para aqueles na categoria de alto risco. A eficácia do modelo em prever o prognóstico foi avaliada usando curvas ROC, com AUCs de 0,836, 0,808 e 0,830 para sobrevida de 1, 2 e 3 anos na coorte de treinamento (Fig. 4D), e 0,866, 0,807 e 0,823 na coorte de validação (Fig. 4F), respectivamente.

Análises de regressão Cox e LASSO foram realizadas no conjunto de dados de AML da seguinte forma: (A) Gráfico de regressão LASSO mostrando o caminho da variável independente, com lambda (escala logarítmica) no eixo x e os coeficientes no eixo y. (B) Intervalos de confiança da regressão LASSO para cada valor de lambda. (C) Distribuição das pontuações de risco, resumo de sobrevida de AML e heatmap para genes-chave. (D) Curvas ROC dependentes do tempo para previsões do modelo de 1, 2 e 3 anos no conjunto de treinamento. (E) Curvas de sobrevida para grupos de alto e baixo risco do conjunto de treinamento, com verde indicando o grupo de alto risco e vermelho o grupo de baixo risco. (F) Curvas ROC dependentes do tempo para previsões do modelo de 1, 2 e 3 anos no conjunto de validação. (G) Curvas de sobrevida para grupos de alto e baixo risco do conjunto de validação

Resultados de GSEA e GSVA
Realizamos GSEA, com foco nas vias significativamente enriquecidas pelos escores de enriquecimento normalizados (NES) para aprofundar os mecanismos por trás dos DEGs. As vias notavelmente enriquecidas incluíram infecção por Leishmania (NES = 2,4426, P ajustado = 0,0188, FDR = 0,0124, Fig. 5A), processamento e apresentação de antígenos (NES = 2,3283, P ajustado = 0,0188, FDR = 0,0124, Fig. 5B), doença tireoidiana autoimune (NES = 2,2449, P ajustado = 0,0188, FDR = 0,0124, Fig. 5C), metabolismo de pirimidina (NES = 1,4124, P ajustado = 0,0438, FDR = 0,029, Fig. 5D), sinalização do receptor de células T (NES = 1,3881, P ajustado = 0,0438, FDR = 0,029, Fig. 5E) e a via de sinalização da insulina (NES = 1,3513, P ajustado = 0,0457, FDR = 0,0302, Fig. 5F).
Além disso, a GSVA identificou sete vias com diferenças significativas, incluindo as vias de Biossíntese_de_O_Glicano, Fosforilação_oxidativa, Doença_de_Alzheimer, Doença_de_Huntington, Biossíntese_de_Pantotenato_e_CoA, Infecção_por_Escherichia_coli_patogênica e Fagocitose_mediada_por_receptor_FC_Gamma (Fig. 5G).
As análises de GSEA e GSVA identificaram vias de enriquecimento significativas. (A) Enriquecimento da via de infecção por Leishmania. (B) Enriquecimento da via de processamento e apresentação de antígenos. (C) Enriquecimento da via de doença tireoidiana autoimune. (D) Enriquecimento da via de metabolismo de pirimidina. (E) Enriquecimento da via de sinalização do receptor de células T. (F) Enriquecimento da via de sinalização da insulina. (G) Enriquecimento de vias adicionais significativamente enriquecidas conforme determinado pela GSVA
Análise de infiltração imune
Avaliamos os níveis de infiltração de 28 tipos de células imunes (Fig. 6A) e observamos diferenças notáveis entre eles, incluindo células T CD4 ativadas, células supressoras derivadas de mieloides, células T CD8 ativadas, células T CD4 de memória central, células T CD4 de memória efetora, células NK CD56 bright, células T gama delta, células dendríticas imaturas, macrófagos, mastócitos, células NK, neutrófilos, células dendríticas plasmacitoides, células T auxiliares tipo 1 e células T auxiliares tipo 17 (P < 0,05; Fig. 6B). Também encontramos correlações notáveis entre genes específicos e células imunes (Fig. 6C e E). PSAP foi notavelmente associado a células natural killer CD56bright (R=-0,7481, P < 0,001, Fig. 6C). Da mesma forma, S100A4 (R=-0,6964, P < 0,001) e VCAN (R=-0,8397, P < 0,001) foram significativamente correlacionados com células T CD4 de memória central (Fig. 6D e E), respectivamente.
Diferenças nas infiltrações imunes entre os grupos de alto e baixo risco. (A) Mapa de calor ilustrando as diferenças na infiltração de células imunes. (B) Proporções estimadas de células imunes infiltrantes de tumor. (C) Análise de correlação entre PSAP e células natural killer CD56bright. (D) Análise de correlação entre S100A4 e células T CD4 de memória central. (E) Análise de correlação entre VCAN e células T CD4 de memória central
Validação da pontuação de risco poderia ser usada como um fator prognóstico independente
Para estabelecer o escore de risco como um indicador prognóstico independente, ele foi avaliado por meio de análises de regressão de Cox univariada e multivariada que incluíram idade, sexo e tempo de sobrevida como variáveis clínicas. A análise multivariada foi crucial para o desenvolvimento do nomograma, que previu eficazmente os desfechos clínicos (Figura S1A). As curvas de calibração do nomograma confirmaram sua precisão e confiabilidade ao longo de 1, 2 e 3 anos (Figura S1B).
Carga mutacional tumoral (TMB) e análise de suscetibilidade a medicamentos
Identificamos os 20 genes mais frequentemente mutados na LMA. No grupo de alto risco, o NPM1 foi o gene mais comumente mutado, seguido por IDH2 e TTN (Fig. 7A). Por outro lado, o DNMT3A apresentou a maior frequência de mutação no grupo de baixo risco, seguido por NPM1, IDH2, IDH1 e KDM6A (Fig. 7B). Nossa análise mostrou que a TMB diferiu significativamente entre os grupos de baixo e alto risco, sendo a TMB notavelmente maior no grupo de baixo risco.(Fig. 7C).
Além disso, examinamos a capacidade do escore de risco de prever a suscetibilidade a medicamentos em pacientes com LMA. A eficácia clínica de vários tratamentos para LMA foi investigada, incluindo 5-Fluorouracil_1073, ABT737_1910, Acetalax_1804, Alisertib_1051, AT13148_2170, AZ960_1250, AZ6102_2109, AZD1208_1449 e AZD6482_2169 (Fig. 7D-L). Pacientes com escore de risco alto apresentaram maior sensibilidade ao 5-Fluorouracil_1073 (Fig. 7D) e ao AZD6482_2169 (Fig. 7G), indicando que os dois agentes podem ser opções viáveis para este grupo de pacientes. Em contraste, pacientes com escore de risco baixo apresentaram maior sensibilidade ao ABT737_1910 (Fig. 7E), Alisertib_1051 (Fig. 7H), AT13148_2170 (Fig. 7I), AZ960_1250 (Fig. 7J), sugerindo que os pacientes na coorte de baixo risco podem se beneficiar desses agentes.
Diferenças na TMB e na suscetibilidade a medicamentos entre os grupos de alto e baixo risco. (A) Os 20 principais genes com maior frequência de mutação estavam no grupo de alto risco. (B) Os 20 principais genes com maior frequência de mutação estavam no grupo de baixo risco. (C) Diferenças na TMB. (D_L) Diferenças nos valores de IC50 de 5-Fluorouracil_1073 (D), ABT737_1910 (E), Acetalax_1804 (F), AZD6482_2169 (G), Alisertib_1051 (H), AT13148_2170 (I), AZ960_1250 (J), AZ6102_2109 (K), AZD1208_1449 (L) entre os grupos de alto e baixo risco
Avanços na tecnologia de scRNA-seq fornecem insights valiosos sobre as características moleculares das células imunes que infiltram tumores no microambiente tumoral (TME). Neste estudo, utilizamos um conjunto de dados de scRNA-seq de LMA para investigar a expressão e os papéis dos genes relacionados ao metabolismo da glutamina (Gln) na LMA. Notavelmente, as células pré-B CD34+ mostraram alta atividade relacionada à glutamina, sugerindo um papel regulador da glutamina nessas células e potenciais efeitos no desenvolvimento tumoral. Nossa análise do conjunto de dados de células únicas GSE116256 forneceu um exame detalhado da composição celular da LMA e dos padrões de expressão de genes relacionados ao metabolismo da Gln em vários tipos celulares. Após rigoroso controle de qualidade e análise, discernimos 16 tipos celulares únicos em amostras de LMA, incluindo células T CD8+ naive, células natural killer e monócitos. Esse mapeamento abrangente elucidou a heterogeneidade celular e a complexidade da LMA. Análises adicionais identificaram subgrupos celulares ativos com base na expressão de genes do metabolismo da Gln, com as células pré-B CD34+ como um subgrupo-chave com atividade metabólica significativa no microambiente da LMA. Essa descoberta deslocou nosso foco de pesquisa para a compreensão do papel das células pré-B CD34+ na patogênese e progressão da LMA.
Além disso, nosso estudo destaca a importância da via de sinalização MIF-(CD74 + CD44) na comunicação iniciada por células pré-B CD34 + no microambiente da LMA. A potencialidade dessa via como um ponto-chave na influência do metabolismo da glutamina na progressão da LMA é particularmente notável, dado seu papel na mediação da comunicação das células pré-B CD34 + para as células pré-dendríticas. Pesquisas anteriores reconheceram a via MIF como um fator significativo na imunomodulação, com implicações em uma série de condições, incluindo doenças autoimunes e cânceres. Nossas descobertas se baseiam nesses estudos ao implicar especificamente a via MIF na LMA, sugerindo uma nova potencial via para intervenção terapêutica. O complexo receptor-ligante CD74 + CD44 tem sido um tema de interesse no contexto da regulação da resposta imune. Nossos dados sugerem que esse complexo pode ser um mediador central na sinalização aberrante observada na LMA. Além disso, a interação entre o metabolismo da Gln e a resposta imune na progressão da LMA está ganhando reconhecimento crescente. A expressão gênica diferencial que observamos, enriquecendo vias relacionadas à apresentação de antígenos e resposta imune, está alinhada com a noção de que a Gln pode exercer seus efeitos na LMA não apenas por meio de suporte metabólico direto, mas também via modulação das funções das células imunes. Essa interação metabólico-imunológica é de particular interesse, pois aponta para um papel multifacetado da Gln na biologia do câncer. Estudos recentes mostraram que a inibição da glutaminase, uma enzima-chave no metabolismo da glutamina, pode ser uma abordagem terapêutica eficaz para a LMA e outros cânceres. O estudo sugere que a interrupção do metabolismo da Gln pode prejudicar a sobrevivência e proliferação das células cancerígenas, o que é de interesse significativo dado o reprogramação metabólica conhecida na LMA. Integrando esses insights com nossas observações, é concebível que terapias direcionadas à via MIF-(CD74 + CD44) em conjunto com intervenções metabólicas possam oferecer uma abordagem sinérgica para interromper a intrincada rede que sustenta a patogênese da LMA.
Além disso, identificamos 10 genes prognósticos associados a pacientes com LMA, que incluíram CCL5, CD52, CFD, FABP5, LGALS1, NUCB2, PSAP, S100A4, SPINK2 e VCAN. O CCL5 é superexpresso na LMA e promove sua progressão. Um estudo anterior mostrou que o CD52 foi significativamente expresso em células-tronco neoplásicas entre pacientes com LMA. Ele emergiu como um novo marcador prognóstico e alvo terapêutico em um subconjunto específico de pacientes com LMA. Em um estudo recente, o realinhamento da maturação linhagem com proliferação foi alcançado em células de LMA que não exibiam o subtipo de leucemia promielocítica aguda, mas expressavam níveis elevados do transportador de ácido retinoico FABP5. Isso pode ser realizado pela inibição do FABP5 usando pequenas moléculas. É crucial notar que essa abordagem terapêutica é diferente da quimioterapia citotóxica convencional e tem a vantagem significativa de preservar a hematopoiese normal. Embora não existam estudos anteriores sobre os papéis do CFD, PSAP e VCAN na LMA, esses genes podem servir como potenciais novos alvos para a terapia da LMA.

A análise de enriquecimento revelou enriquecimento em processos relacionados ao processamento e apresentação de antígenos, membranas de vesículas endocíticas e ligação a peptídeos. Além disso, a análise de vias KEGG mostrou envolvimento em vias como fagossomos e diabetes mellitus tipo I, destacando sua importância na regulação imunológica e na patologia da doença. Os DEGs foram enriquecidos em vias de processamento e apresentação de antígenos, enfatizando seu papel na vigilância e resposta imunes.

No total, 33 genes de assinatura foram identificados como significativamente associados ao prognóstico da LMA em células pré-B CD34+. Variações distintas na distribuição do escore de risco, na duração da sobrevida e nos níveis de expressão de 10 genes entre os grupos indicam seu valor na estratificação de risco. Notavelmente, a maior expressão de NUCB2 no grupo de alto risco sugere seu potencial como biomarcador prognóstico para LMA. As curvas de sobrevida de Kaplan-Meier validaram a significância prognóstica da assinatura genética, indicando piores desfechos para pacientes de alto risco nas coortes de treinamento e validação.

Nossa análise de infiltração imune mostrou correlações significativas incluindo os genes S100A4 e VCAN com células T CD4 de memória central, o gene PSAP com células natural killer CD56bright. As células natural killer CD56bright são notavelmente ativas na LMA, particularmente nas respostas imunes contra as células de LMA. As células T CD4 de memória central, um subconjunto de células T de memória com memória imunológica robusta, são cruciais para iniciar respostas imunes fortes e específicas. Na LMA, as células T CD4 de memória central contribuem para a vigilância imune e defesa contra células leucêmicas ao reconhecer antígenos específicos associados à LMA. Essas células T são cruciais na coordenação das respostas imunes através da liberação de citocinas e da ativação de outras células imunológicas.
Este estudo apresentou algumas limitações. A construção da assinatura de risco, baseada nos genes do metabolismo da Gln, dependeu de uma pequena coorte de pacientes com LMA proveniente do banco de dados TCGA. No entanto, investigações clínicas prospectivas mais extensas são necessárias para determinar a validade prognóstica desses genes-chave. Além disso, a dependência de metodologias bioinformáticas para o desenvolvimento da assinatura de risco dependente de genes do metabolismo da Gln ressalta a necessidade de pesquisas fundamentais subsequentes para validar e fortalecer essas conclusões.
Conclusões
O presente estudo fez avanços significativos na compreensão dos mecanismos moleculares e da dinâmica das células imunes no TME na LMA por meio da análise bioinformática do conjunto de dados scRNA-seq. A pesquisa identificou com sucesso genes-chave e vias metabólicas associadas à progressão da LMA, focando particularmente no papel do metabolismo da glutamina nas células CD34+ pré-B, o que pode ter implicações significativas para a tumorigênese. As análises de enriquecimento e de vias destacaram os papéis-chave desses genes em processos como processamento e apresentação de antígenos, membranas de vesículas endocíticas e ligação de peptídeos, que são vitais para a regulação imunológica e o desenvolvimento da doença. Essas descobertas são significativas para o desenvolvimento de terapias-alvo, modelos prognósticos e estratégias imunoterapêuticas, potencialmente melhorando os resultados dos pacientes e aprofundando nossa compreensão dos mecanismos complexos da patogênese da LMA.
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Nota do editor
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Contribuições dos autores
Contribuições substanciais para concepção e design, Aquisição de dados, análise e interpretação de dados, Elaboração do artigo ou revisão crítica do conteúdo intelectual importante, Aprovação final da versão a ser publicada: Yanli Chen.
Financiamento
Fundo de início de pesquisa de doutorado do hospital.
Disponibilidade de dados
Todos os dados neste artigo estavam disponíveis.
Declarações
Aprovação ética e consentimento para participar
Não aplicável.
Consentimento para publicação
Não aplicável.
Interesses concorrentes
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Abreviaturas
LMA
Leucemia mieloide aguda
Gln
Glutamina
TCA
Ácido tricarboxílico
TAMs
Macrófagos associados a tumores
scRNA-seq
Sequenciamento de RNA de célula única
SNV
Variações simples de nucleotídeos
TCGA
The Cancer Genome Atlas
GEO
Gene Expression Omnibus
UMAP
Aproximação e projeção de manifold uniforme
AUC
Área sob a curva
MSigDB
Molecular Signatures Database
GO
Ontologia genética
KEGG
Enciclopédia de genes e genomas de Kyoto
GSVA
Análise de variação de conjuntos de genes
GSEA
Análise de enriquecimento de conjuntos de genes
ssGSEA
Análise de enriquecimento de conjuntos de genes de amostra única
SNPs
Polimorfismos de nucleotídeo único
INDELs
Inserções e deleções
TMB
Carga mutacional tumoral
UMAP
Aproximação e projeção de manifold uniforme
DEGs
Genes diferencialmente expressos
TME
Microambiente tumoral
Referências
A importância das vias metabólicas celulares na patogênese e nos tratamentos seletivos de neoplasias hematológicas
Dependências metabólicas e vulnerabilidades na leucemia
Interação entre autofagia e metabolismo: implicações para a sobrevivência celular na leucemia mieloide aguda
A asparaginase Erwinia chrysanthemi depleta efetivamente a glutamina plasmática em pacientes adultos com leucemia mieloide aguda recidivada/refratária
A variação genética no XPD prediz o resultado do tratamento e o risco de leucemia mieloide aguda após quimioterapia
Interação TIM-3/Galectina-9 e metabolismo da glutamina em linhagens celulares de LMA, HL-60 e THP-1
Inibindo a glutaminase na leucemia mieloide aguda: dependência metabólica de subtipos selecionados de LMA
Dependência da glutamina no metabolismo celular
O bloqueio da glutamina induz programas metabólicos divergentes para superar a evasão imune tumoral
Glutaminólise: uma marca do metabolismo do câncer
Metabolismo alterado da glutamina e oportunidades terapêuticas para o câncer de pulmão
Cruzat V, Macedo Rogero M, Noel Keane K, Curi R, Newsholme P. Glutamina: metabolismo e função imune, suplementação e tradução clínica. Nutrients 2018, 10(11).
Revolucionando a imunologia com sequenciamento de RNA de célula única
Liang LL, Yu J, Li J, Li N, Liu J, Xiu L, Zeng J, Wang TT, Wu LY. Integração de scRNA-Seq e bulk RNA-Seq para analisar a heterogeneidade das células imunes do câncer de ovário e estabelecer um modelo de risco molecular. Front Oncol 2021, 11.
Bioinformática revela assinatura de genes marcadores de macrófagos no câncer de mama para predizer prognóstico
TCGAbiolinks: um pacote R/Bioconductor para análise integrativa de dados do TCGA
Banco de dados de assinaturas moleculares (MSigDB) 3.0
Análise de enriquecimento de conjuntos de genes: uma abordagem baseada em conhecimento para interpretar perfis de expressão genômica
Integrando dados transcriptômicos de célula única em diferentes condições, tecnologias e espécies
Um fluxo de trabalho escalável do SCENIC para análise de redes regulatórias gênicas de célula única
Transcriptômica de célula única do endométrio em fase proliferativa: análise sistêmica da rede de comunicação célula-célula usando CellChat
clusterProfiler: um pacote R para comparar temas biológicos entre grupos de genes
Secreção de insulina durante o envelhecimento
Wu S, Lv X, Li Y, Gao X, Ma Z, Fu X, Li Y. Aprendizado de máquina integrado e análise de enriquecimento de conjuntos de genes de amostra única identificam um escore derivado da via de sinalização TGF-Beta no carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço. J Oncol 2022, 2022:3140263.
TISIDB: um portal de repositório integrado para interações entre tumor e sistema imunológico
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Maeser D, Gruener RF, Huang RS. oncoPredict: um pacote R para predizer resposta a medicamentos in vivo ou em pacientes com câncer e biomarcadores a partir de dados de triagem de linhagens celulares. Brief Bioinform 2021, 22(6).
Compreendendo a iniciação e progressão do carcinoma hepatocelular através do sequenciamento de célula única
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Ciciarello M, Corradi G, Forte D, Cavo M, Curti A. Mecanismos emergentes de resistência a medicamentos orientados pelo microambiente da medula óssea na leucemia mieloide aguda: Emaranhado ou Acaso? Cancers (Basel) 2021, 13(21).
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