pmid: "33526970"
title: "Efeitos regulatórios de"
authors: "Tsai WH, Chou CH, Chiang YJ, Lin CG, Lee CH"
journal: "International journal of medical sciences"
pubdate: "2021"
doi: "10.7150/ijms.51545"
source: "PMC Full Text"

Efeitos regulatórios de

Autores

Tsai WH, Chou CH, Chiang YJ, Lin CG, Lee CH

Periodico

International journal of medical sciences (2021)

Conteudo

Efeitos regulatórios do Lactobacillus plantarum-GMNL6 na saúde da pele humana por meio da melhora do microbioma cutâneo

As bactérias respondem ao seu ambiente produzindo alguns compostos que são utilizados em aplicações cosméticas e farmacêuticas. Alguns probióticos podem regular a resposta imune e modular os sintomas de várias doenças. As bactérias afetam a resposta da pele aos produtos de cuidados com a pele. Acredita-se que as bactérias desempenhem um papel importante na incidência de acne, na hidratação da pele e no metabolismo de nutrientes, mas apenas alguns estudos se concentraram nos extratos de Lactobacillus plantarum em cuidados com a pele. Neste estudo, identificamos que o L. plantarum-GMNL6 aumentou a síntese de colágeno e a expressão gênica da subunidade A da serina palmitoiltransferase. Enquanto isso, o L. plantarum-GMNL6 reduziu a síntese de melanina, o biofilme de Staphylococcus aureus e a proliferação de Cutibacterium acnes. As informações da observação clínica durante o uso de pomada facial externa em pessoas mostraram que as síndromes de hidratação da pele, cor da pele, manchas, rugas, manchas UV e porfirinas foram melhoradas. A diversificação dos microbiomas da pele humana foi afetada pela aplicação do L. plantarum-GMNL6 no rosto dos voluntários. Compreender os mecanismos potenciais de ação do L. plantarum-GMNL6 em condições dermatológicas promove o desenvolvimento de produtos de cuidado.
Alguns produtos bacterianos com atividade antioxidante demonstraram desempenhar um papel importante nos cuidados com a pele. As bactérias podem produzir alguns compostos em resposta ao estresse ambiental. Esses compostos bacterianos são geralmente utilizados em medicina, cosméticos e até mesmo em esportes. Alguns probióticos possuem atividades imunomoduladoras e modulam os sintomas de diversas doenças. Anteriormente, os extratos de Rhodobacter sphaeroides inibiram a expressão da óxido nítrico sintase induzível em macrófagos ativados e reduziram a inflamação em modelo de colite. Os probióticos são medicamentos complementares e alternativos e são utilizados para promover a saúde. Algumas cepas probióticas específicas, incluindo Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus, Bacillus e Lactobacillus, demonstraram benefícios à saúde. Recentemente, Lactobacillus foi relatado como capaz de amenizar os sintomas do diabetes em estudos humanos. Lactobacillus também reduziu distúrbios neuropsiquiátricos, regulou a pressão arterial, proporcionou benefícios fisiológicos e exerceu efeitos anti-inflamatórios. Os distúrbios pigmentares e o melanoma são uma melanogênese anormal, característica de muitas doenças de pele humanas. Rugas, melasma e manchas senis são frequentemente observados em pessoas de pele mais clara na Europa. Na Ásia, os produtos de cuidados são utilizados para deixar a pele mais branca e hidratada. Alguns probióticos são capazes de atuar como potenciais produtos de cuidado. Probióticos como Lactobacillus demonstraram modular os sintomas da pele. L. plantarum é eficaz para aliviar os sintomas da dermatite atópica em adultos devido aos seus efeitos imunomoduladores. L. plantarum atua contra o fotoenvelhecimento induzido por UVB em fibroblastos dérmicos humanos e camundongos sem pelos. Enquanto isso, L. plantarum possui várias propriedades farmacológicas, como anticancerígena e anticolite.
Focamos na triagem da função de cuidado com a pele a partir de vários probióticos para aumentar a síntese de colágeno e a expressão gênica da subunidade A pequena da serina palmitoiltransferase (SPTSSA). Neste estudo, procuramos investigar se L. plantarum-GMNL6 desempenha um papel na manutenção da pele e desejamos desenvolver L. plantarum-GMNL6 como produto de cuidado com a pele para o manejo de condições cutâneas.

Materiais e Métodos

Células, bactérias e reagentes
As células de fibroblasto de pele humana HS68 e as células de melanoma de camundongo B16F10 foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 50μg/ml de gentamicina e 10% de soro fetal bovino, a 37°C em 5% de CO2. Staphylococcus aureus, Propionibacterium acnes, Enterococcus faecium, L. plantarum-2, L. plantarum-GMNL6, L. rhamnosus, L. paracasei-2, L. paracasei-1, L. fermentum-3, L. fermentum-2, L. fermentum-1 e L. acidophilus estão disponíveis na GenMont Biotech Inc. (Tainan, Taiwan).

Ensaio de síntese de colágeno

Células HS68 foram semeadas em placa de 6 poços (2×10⁵ células/poço), lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e substituídas por meio livre de soro, e tratadas com várias bactérias mortas por calor (5×10⁸ células/ml) após 24 h. O sobrenadante foi coletado e então analisado usando um kit EIA de peptídeo C do procolágeno tipo I (TAKARA Bio, Inc, #MK101, Kusatsu, Japão).

Detecção do gene da sintase de amina neural

Células HS68 foram semeadas em placa de 6 poços (2×10⁵ células/poço) e tratadas com várias bactérias mortas por calor (5×10⁸ células/ml) após 24 h. Os extratos celulares foram coletados, o RNA foi extraído e convertido em cDNA, e a subunidade pequena A da serina palmitoiltransferase (SPTSSA) e a β-actina foram quantificadas por análise de PCR em tempo real.

Purificação do Ácido Lipoteicoico (LTA) e Peptideoglicano (PGN)

L. plantarum-GMNL6 foi incubado durante a noite a 37°C. As células foram rompidas usando um disruptor ultrassônico (instrumento ultrassônico modelo W-220F) e então centrifugadas. Após a centrifugação, as bactérias foram reconstituídas com uma mistura de clorofórmio-metanol-água (1:1:0,9), e a fase aquosa contendo LTA foi coletada. A solução foi então injetada em uma coluna Octil-Sepharose CL-4B (Sigma) e uma coluna Q-Sepharose. O LTA foi purificado e armazenado a -20°C.

As bactérias do ácido lático foram coletadas por centrifugação. Após lavagem três vezes com PBS, 50 g de bactérias do ácido lático (peso úmido) foram rompidas por um rompedor ultrassônico para preparar um extrato bruto. Após centrifugação a 8.000 rpm por 30 minutos, o sobrenadante foi coletado e então lavado três vezes com PBS, e centrifugado (8.000 rpm, 30 minutos, 4°C), e este procedimento foi repetido três vezes. Finalmente, os precipitados foram reagidos com 100 mg/ml de RNase e 50 mg/ml de DNase por 18 h, e então 200 mg/ml de tripsina foi adicionada, e então reagido a 37°C por 18 h. Os precipitados foram tratados com ácido tricloroacético (TCA) a 5%. O extrato de TCA foi seco para preparar um pó de peptideoglicano.

Determinação do teor de melanina

As células B16F10 foram coletadas e lavadas duas vezes com PBS. As células sedimentadas foram lisadas em tampão de lise frio (fosfato de sódio 20 mM pH 6,8, Triton X-100 a 1%, PMSF 1 mM e EDTA 1 mM). Após centrifugação a 15.000 g por 15 min, os sedimentos de melanina foram dissolvidos em Soluene-350 (Perkin-Elmer, Waltham, MA, EUA) por 15 min a 100°C. A absorbância a 400 nm foi medida. O teor de proteína em cada amostra foi determinado pelo ensaio de proteína do ácido bicinconínico (BCA) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA).

O ensaio de formação de biofilme

S. aureus foi incubado durante a noite a 37°C. As diferentes concentrações de LTA foram tratadas em placa de 96 poços que havia sido incubada com S. aureus (2 ×10⁷ ufc/poço) por 24 horas. O sobrenadante foi removido e lavado duas vezes com PBS. O biofilme foi fixado com etanol por 15 min e corado com violeta cristal a 0,1%. Em seguida, os violetas cristal foram dissolvidos em ácido acético. A absorbância a 590 nm foi medida.

Desenho do estudo

Um estudo de 2 meses foi realizado. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Pingtung Antai e realizado de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes. O ensaio foi registrado no Clinical Trial.gov com o número de aprovação NCT03350893. Um total de 15 mulheres (com idade entre 25 e 50 anos) foram recrutadas. Na primeira visita, as participantes foram submetidas a um exame inicial, incluindo diagnóstico de qualidade facial, teste de hidratação e teste de cor da pele. O lado esquerdo do rosto das participantes usou creme base e o lado direito do rosto das participantes usou creme base contendo L. plantarum-GMNL6 inativado por calor (1×10⁹ células/g de creme). O teste foi usado uma vez pela manhã e à noite durante 2 meses e, a cada mês, a qualidade facial (Análise de Complexão Visia, Canfield, EUA), o teste de hidratação e o teste de cor da pele foram medidos. Corneometer® CM 825 (Courage+Khazaka electronic GmbH, Köln, Alemanha) e Skicon 200 EX® (IBS Co., Hamamatsu, Japão) foram usados para determinar o nível de hidratação da superfície da pele. Derma-Spectrometer (Cortex Technology, Hadsund, Dinamarca) foi usado para determinar o índice E (eritema) e o índice M (melanina) da superfície da pele. O DNA foi extraído das cabeças dos cotonetes usando o Quick-DNA Fungal/Bacterial Kit (Zymo Research, D6005, CA, EUA). O 16S rDNA de comprimento total foi amplificado usando os primers diretos 27F contendo a sequência "AGRGTTYGATYMTGGCTCAG" e os primers reversos 1492R contendo a sequência "RGYTACCTTGTTACGACTT". Ao mesmo tempo, adaptadores indexados foram adicionados às extremidades dos amplicons de 16S rDNA usando o kit SMRT cell Template Prep Kit (Pacific Biosciences of California, Inc., CA, EUA) para gerar bibliotecas indexadas prontas para o sequenciamento downstream em Sequal SMRT cell. As bibliotecas de DNA foram validadas pelo Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA) e quantificadas pelo Qubit 2.0 Fluorometer. As bibliotecas de DNA foram multiplexadas e carregadas no instrumento PacBio Sequal de acordo com as instruções do fabricante (Pacific Biosciences of California, Inc., CA, EUA). As leituras de PacBio 16S foram processadas usando SMRT Analysis.
Análise estatística
Todos os dados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). O teste t de Student bicaudal não pareado foi usado para determinar diferenças entre os grupos. Qualquer valor de P menor que 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

Resultados

L. plantarum-GMNL6 exibiu efeitos benéficos no cuidado da pele
Para descobrir os probióticos ideais, vários probióticos potenciais foram tratados com células HS68 usando ensaios de síntese de colágeno e expressão gênica da subunidade A pequena da serina palmitoiltransferase (SPTSSA). Conforme mostrado na Figura 1A, a síntese de colágeno aumentou significativamente após o tratamento com E. faecium e L. plantarum-GMNL6. O colágeno e a ceramida estão envolvidos no rejuvenescimento da pele. A ceramida é um lipídio que existe no espaço intercelular das células da pele. A esfingosina e o ácido graxo constituem a ceramida, que é o lipídio mais importante e de maior proporção da pele, com um teor total de cerca de 40-50% dos lipídios intercelulares. A ceramida distribuída no espaço intercelular mantém de perto a integridade lipídica para formar uma membrana impermeável natural. A ceramida impede a evaporação da água, permitindo que os queratinócitos retenham a umidade. A serina palmitoiltransferase é a etapa limitante da biossíntese de ceramidas. L. plantarum-GMNL6 teve a melhor capacidade de estimular a expressão gênica de SPTSSA em comparação com outros probióticos (Fig. 1B). Com base nesses dois ensaios, L. plantarum-GMNL6 foi selecionado para as análises subsequentes.

Os componentes potenciais de L. plantarum-GMNL6 envolvidos nos efeitos benéficos para o cuidado da pele

Como usamos bactérias mortas para tratar as células, propusemos que os componentes da parede celular desempenhavam um papel importante na síntese de colágeno e na expressão gênica de SPTSSA. O ácido lipoteicóico (LTA) e o peptidoglicano (PGN) são os principais componentes da parede celular de Lactobacillus que foram demonstrados como componentes essenciais para os efeitos benéficos no hospedeiro. Primeiro, a síntese de colágeno e a expressão gênica de SPTSSA foram usadas para avaliar a função dos componentes da parede celular (LTA e PGN). Embora o PGN tenha aumentado ligeiramente a síntese de colágeno e a expressão gênica de SPTSSA em células HS68, o LTA de L. plantarum-GMNL6 teve efeitos significativos na síntese de colágeno e na expressão gênica de SPTSSA (Fig 2 A e B). Aqui, os resultados sugerem que o LTA de L. plantarum-GMNL6 está envolvido na saúde da pele. Enquanto isso, células de melanoma B16F10 de camundongo foram usadas para investigar a atividade antimelanogênica do LTA de L. plantarum-GMNL6. O teor de melanina após células B16F10 tratadas com várias concentrações de LTA é mostrado na Fig 2 C. Staphylococcus aureus é comumente encontrado na superfície da pele. O LTA de L. plantarum-GMNL6 inibiu significativamente a formação de biofilme de S. aureus de forma dose-dependente (Fig. 2D).

Um L. plantarum-GMNL6 morto por calor em ensaio clínico

O desenho do estudo é mostrado na Fig. 3. Um total de 15 mulheres (idade entre 25 e 50 anos) foram recrutadas. Na primeira visita, as participantes passaram por um exame inicial, incluindo diagnóstico de qualidade facial, teste de hidratação e teste de cor da pele. O lado esquerdo do rosto das participantes usou creme base e o lado direito do rosto das participantes usou creme base contendo L. plantarum-GMNL6 inativado por calor (1×109 células/g de creme). Hipotetizamos que o L. plantarum-GMNL6 inativado por calor poderia interagir com a microbiota da pele e adquirir diferentes comunidades microbianas que poderiam, finalmente, resultar em uma saúde da pele bem-sucedida. Para examinar a relação entre a microbiota da pele e o tratamento com L. plantarum-GMNL6 inativado por calor, realizamos sequenciamento baseado em 16S rDNA para analisar a abundância e composição bacteriana na pele humana. Propionibacterium foi significativamente reduzida no tratamento com L. plantarum-GMNL6. Streptococcus e Staphylococcus também apresentaram maior abundância em comparação com o não tratamento. Além disso, o teste foi usado uma vez pela manhã e à noite durante 2 meses, e a cada mês a qualidade facial, o teste de hidratação e o teste de cor da pele foram medidos. Corneometer® CM 825 e Skicon 200 EX® foram usados para determinar o nível de hidratação da superfície da pele. Derma-Spectrometer foi usado para determinar o índice E (eritema) e o índice M (melanina) da superfície da pele. Conforme mostrado na Tabela 1, os níveis de hidratação da superfície da pele tratada com L. plantarum-GMNL6 inativado por calor foram significativamente maiores do que os do grupo controle. Os níveis de hidratação da superfície da pele foram semelhantes ao usar diferentes instrumentos. Enquanto isso, o L. plantarum-GMNL6 inativado por calor teve a capacidade de reduzir o eritema e a melanina (Tabela 1). Além disso, usando Visia para detectar a qualidade facial, as rugas, a textura e as manchas UV foram significativamente melhoradas após o tratamento com L. plantarum-GMNL6 inativado por calor (Tabela 2). As porfirinas do rosto tratado foram reduzidas em comparação com o rosto não tratado. Em conjunto, o creme que adicionou L. plantarum-GMNL6 inativado por calor pode melhorar a qualidade facial.

Discussão

Os probióticos são considerados papéis importantes na saúde da pele, bem-estar e doenças de pele associadas ao microbioma. Portanto, exploramos a possibilidade de que probióticos estejam associados à saúde da pele. A suplementação de L. plantarum-GMNL6 em células melhorou a síntese de colágeno e a hidratação. Embora os componentes da parede celular dos probióticos tenham demonstrado estar relacionados à função probiótica, muito poucas evidências propõem que eles contribuam para o cuidado da pele. No presente estudo, o LTA de L. plantarum-GMNL6 esteve envolvido na melhora da condição da pele, incluindo síntese de colágeno, hidratação, melanogênese e formação de anti-biofilme. Em estudos humanos, algumas pessoas têm enfrentado muitas dificuldades na condição da pele. Após dois meses de tratamento com L. plantarum-GMNL6, observamos que algumas condições da pele foram melhoradas em humanos.
Diferente do LTA de outras bactérias Gram-positivas, o LTA de L. plantarum-GMNL6 atua como substância reguladora cosmética. De acordo com observações anteriores, o LTA de Lactobacillus tem múltiplas funções, incluindo anti-inflamatória, melhora da diarreia e controle da glicemia. Anteriormente, descobrimos que um extrato de R. sphaeroides inibia citocinas pró-inflamatórias e melhorava o equilíbrio imune da mucosa em um modelo de colite induzida por sulfato de sódio dextrano (DSS). Também demonstramos o extrato de R. sphaeroides como um agente antimelanogênico com capacidade de melhorar a hiperpigmentação induzida por α-MSH.

As bactérias produzem compostos que são amplamente utilizados em aplicações cosméticas e farmacêuticas. Terapias cosméticas baseadas em micróbios têm sido notadas. A via de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPKs) está envolvida na melanogênese. A ativação da proteína quinase B (AKT) é responsável pela supressão da síntese de melanina. O LTA de L. plantarum-GMNL6 pode afetar a sinalização para reduzir a melanogênese. As pessoas que usaram L. plantarum-GMNL6 apresentaram melhores condições de pele após 1 mês de tratamento com L. plantarum-GMNL6 (Fig. S1). Mais trabalhos são necessários para elucidar o mecanismo molecular de L. plantarum-GMNL6 na hipopigmentação. Essas descobertas indicam que o LTA de L. plantarum-GMNL6 pode contribuir para seu efeito terapêutico na antimelanogênese.

Material Suplementar

Os efeitos benéficos do Lactobacillus plantarum PS128 no estresse oxidativo induzido por exercício de alta intensidade, inflamação e desempenho em triatletas
Fator de competência e esporulação derivado de Bacillus subtilis melhora a lesão de células epiteliais na inflamação intestinal por meio de imunomodulação e citoproteção
Melhora da colite induzida por sulfato de sódio dextrano em camundongos pelo extrato de Rhodobacter sphaeroides
Suplementação de probióticos triplos viáveis combinada com intervenção dietética está associada à melhora microbiana intestinal em humanos em dieta rica em gordura
Probióticos, prebióticos e melhora de doenças
Os efeitos benéficos do consumo de Lactobacillus reuteri ADR-1 ou ADR-3 no diabetes mellitus tipo 2: um ensaio clínico randomizado, duplo-cego, controlado por placebo
Probióticos de próxima geração na melhora de doenças
Efeito fisiológico de um probiótico na pele
Efeito benéfico da suplementação de Lactobacillus plantarum IS-10506 em adultos com dermatite atópica: um ensaio clínico randomizado
Administração oral de Lactobacillus plantarum HY7714 protege camundongos sem pelos contra o fotoenvelhecimento induzido por UVB
Lactobacillus plantarum tratado por calor aumenta as respostas imunes por meio da ativação de células natural killer e macrófagos em modelos in vivo e in vitro
Efeito de extratos de casca de banana Sucrier na inibição da melanogênese por meio da via de sinalização ERK
Influência da pressão de aplicação da sonda nas medições de capacitância (Corneometer CM 825(®)) e condutância (Skicon 200 EX(®)) in vitro e in vivo
A busca por moléculas efetoras probióticas – desvendando a especificidade de cepas em nível molecular
O ácido lipoteicoico do probiótico Lactobacillus plantarum atenua a produção de IL-8 induzida por Poly I:C em células epiteliais intestinais porcinas
Um extrato de Rhodobacter sphaeroides reduz a nefrotoxicidade induzida por cisplatina em camundongos
O extrato de Rhodobacter sphaeroides inibe a melanogênese através da via de sinalização MEK/ERK
O Hinokitiol inibe a melanogênese via sinalização AKT/mTOR em células de melanoma murino B16F10
Efeitos de diversos probióticos na saúde da pele. Células HS68 foram tratadas com diversos probióticos (5× 108 células/ml) após 24 h. (A) O sobrenadante foi coletado e então analisado quanto ao colágeno. (B) Os extratos celulares foram coletados, o RNA foi extraído e convertido em cDNA, e a subunidade A pequena da serina palmitoiltransferase (SPTSSA) e a β-actina foram quantificadas por análise de PCR em tempo real.
A síntese de colágeno, a expressão gênica de SPTSSA, a melanogênese e a formação de biofilme foram medidas após o tratamento com ácido lipoteicoico (LTA) e peptidoglicano (PGN) de L. plantarum-GMNL6. Efeito do LTA e PGN sobre (A) a síntese celular de colágeno e (B) a expressão gênica de SPTSSA. (C) Efeito do ácido lipoteicoico (LTA) e do peptidoglicano (PGN) no conteúdo celular de melanina. (D) A inibição da formação de biofilme de S. aureus foi medida após o tratamento com LTA e PGN. (n = 6, dados são média ± DP. *P < 0,05, #P < 0,01).
Recrutamento dos participantes e desenho do estudo. O creme contendo ou não probióticos foi aplicado por um total de 2 meses. Todos os participantes foram solicitados a coletar dados utilizando Corneometer® CM 825, Skicon 200 EX® Derma-Spectrometer e VISIA®.
Comparação dos microbiomas da pele antes e após o uso do tratamento com L. plantarum-GMNL6. A abundância relativa de cinco gêneros principais nos microbiomas da pele é comparada antes e após o uso do tratamento com L. plantarum-GMNL6. Os valores de P estatisticamente significativos são mostrados em vermelho.
Os efeitos do Lactobacillus plantarum-GMNL6 na saúde da pele humana.
a: comparado com a linha de base na face esquerda; P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
b: comparado com a linha de base na face direita; P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
c: comparado com a face esquerda no mesmo período; P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Os efeitos do Lactobacillus plantarum-GMNL6 na saúde da pele humana.
a: comparado com a linha de base na face direita; P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.