pmid: "37033942"
title: "psicobiótico"
authors: "Zhu R, Fang Y, Li H, Liu Y, Wei J, Zhang S, Wang L, Fan R, Wang L, Li S, Chen T"
journal: "Frontiers in immunology"
pubdate: "2023"
doi: "10.3389/fimmu.2023.1158137"
source: "PMC Full Text"
psicobiótico
Autores
Zhu R, Fang Y, Li H, Liu Y, Wei J, Zhang S, Wang L, Fan R, Wang L, Li S, Chen T
Periodico
Frontiers in immunology (2023)
Conteudo
Probiótico psicobiótico Lactobacillus plantarum JYLP-326 alivia sintomas de ansiedade, depressão e insônia em universitários com ansiedade de teste através da modulação da microbiota intestinal e seu metabolismo
Introdução
A ansiedade de teste é um problema comum entre universitários, que pode afetar sua saúde física e psicológica. No entanto, ainda faltam intervenções ou estratégias terapêuticas eficazes. Este estudo tem como objetivo avaliar os potenciais efeitos do Lactobacillus plantarum JYLP-326 em universitários com ansiedade de teste.
Métodos
Sessenta alunos ansiosos foram recrutados e alocados aleatoriamente no grupo placebo e no grupo probiótico. Ambos os grupos foram instruídos a tomar placebo e produtos JYLP-326 duas vezes ao dia durante três semanas, respectivamente. Trinta alunos não ansiosos, sem tratamentos, foram designados para um grupo controle regular. Os questionários de ansiedade, depressão e insônia foram usados para medir os estados mentais dos alunos no início e no final deste estudo. Sequenciamento do 16S rRNA e metabolômica não direcionada foram realizados para analisar as mudanças na microbiota intestinal e no metabolismo fecal.
Resultados
Os resultados dos questionários sugeriram que a administração de JYLP-326 poderia aliviar os sintomas de ansiedade, depressão e insônia em alunos com ansiedade de teste. Os microbiomas intestinais do grupo placebo mostraram um índice de diversidade significativamente maior do que o grupo controle (p < 0,05). Um aumento na abundância de Bacteroides e Roseburia no nível de gênero foi observado no grupo placebo, e a abundância relativa de Prevotella e Bifidobacterium diminuiu. Enquanto isso, a administração de JYLP-326 pôde restaurar parcialmente a microbiota intestinal perturbada. Além disso, a ansiedade de teste foi correlacionada com metabolômica fecal desordenada, como um maior Sulfato de etila e uma menor Ciclohexilamina, que puderam ser revertidos após a ingestão de JYLP-326. Além disso, a microbiota e os metabólitos fecais alterados foram significativamente associados aos sintomas relacionados à ansiedade.
Conclusão
Os resultados indicam que a intervenção de L. plantarum JYLP-326 pode ser uma estratégia eficaz para aliviar a ansiedade, depressão e insônia em universitários com ansiedade de teste. O mecanismo potencial subjacente a esse efeito pode estar relacionado à regulação da microbiota intestinal e dos metabólitos fecais.
Ansiedade de testes, caracterizada por sentimentos de fracasso, tensão e preocupação quando um indivíduo enfrenta um exame vital para promoção, ocorre predominantemente entre estudantes universitários. Relatamos que cerca de 20% a 40% dos universitários sofrem de ansiedade de testes em nosso estudo anterior, e a ansiedade de testes prolongada é frequentemente acompanhada por depressão e insônia, prejudicando a saúde física e psicológica dos estudantes e podendo até levar ao suicídio. Vários exames podem representar uma fonte frequente e significativa de ansiedade para os alunos. Por exemplo, o Exame Nacional Unificado de Pós-Graduação na China (UNGEE) é uma oportunidade importante para graduandos se candidatarem a estudos de pós-graduação e mestrado, mas tem reputação de competição acirrada. Em particular, mais alunos prestam este exame para escapar do mercado de trabalho instável durante o período pós-pandemia da COVID-19, agravando a intensidade da involução deste exame e o grau de sintomas relacionados ao estresse, como ansiedade, depressão e insônia entre os examinandos.
A questão de como os alunos ansiosos processam essas ameaças à saúde induzidas pelo estresse dos exames é de grande interesse. Embora muitas estratégias de enfrentamento tenham sido sugeridas para lidar com a ansiedade dos alunos, incluindo fornecer nutrição adequada, praticar mais exercícios e tomar medicamentos, a maioria dos estudantes tende a negligenciar a necessidade de nutrição alimentar e exercício físico devido à urgência da preparação para o UNGEE. E tomar medicamentos pode levar à dependência de substâncias e induzir efeitos adversos graves, de acordo com relatos da FDA e de estudiosos. Portanto, explorar intervenções práticas e moderadas ou estratégias terapêuticas é necessário para que os alunos aliviem a ansiedade durante a preparação para os exames.
Recentemente, vários probióticos foram relatados por possuírem efeitos eficazes de modulação do estresse e ansiolíticos em indivíduos estressados, através da manutenção da homeostase intestinal, melhora da imunidade mucosa e sistêmica e regulação do metabolismo da microbiota intestinal, o que torna esses probióticos os próximos psicobióticos vivos promissores para aliviar distúrbios psicológicos. Além disso, a forte correlação entre numerosos transtornos emocionais (por exemplo, ansiedade e depressão) e disbiose da microbiota intestinal ou alterações metabólicas intestinais tem sido amplamente discutida, indicando uma ligação cruzada intrínseca entre a microbiota intestinal e as regiões cerebrais, que tem sido relatada como o eixo microbiota-intestino-cérebro. Assim, visar a microbiota intestinal por meio da suplementação de probióticos e/ou transplante de microbiota fecal pode ser um método de tratamento alternativo para estudantes cronicamente estressados com transtornos mentais como ansiedade, depressão e insônia. Dos probióticos relatados, Lactobacillus é uma das espécies probióticas mais frequentemente pesquisadas devido à sua abundância relativa ter sido regulada negativamente pelo estresse e os sintomas induzidos pelo estresse poderem ser melhorados pela administração de Lactobacilos únicos ou múltiplos.
Lactobacillus plantarum, um Lactobacillus comumente utilizado que exibe adaptabilidade ecológica e metabólica no nicho do trato gastrointestinal de mamíferos, tornou-se cada vez mais popular na redução da gravidade da ansiedade e depressão em modelos animais estressados e em populações humanas. Entre eles, L. plantarum JYLP-326 é um isolado que pode aderir eficientemente a células Caco-2 e melhorar distúrbios do sono em um modelo de rato com insônia (Patente chinesa nº: CN 110791451 A). No entanto, ainda não se sabe se ele pode aliviar sintomas de ansiedade, depressão e insônia em populações com ansiedade de teste. Aqui, recrutamos 60 universitários ansiosos e 30 não ansiosos que se preparavam para o próximo ENEM (Exame Nacional do Ensino Médio) para avaliar os efeitos psicológicos do JYLP-326 em comportamentos induzidos pelo estresse do exame, como ansiedade, depressão e insônia. Além disso, as alterações na microbiota intestinal e nos metabólitos fecais entre os grupos foram medidas por sequenciamento de alto rendimento do gene 16S rRNA e metabolômica não direcionada, respectivamente. Esses resultados demonstraram que a intervenção com L. plantarum JYLP-326 é eficaz no alívio dos sintomas induzidos pelo estresse do exame em estudantes universitários.
Materiais e métodos
L. plantarum JYLP-326 e produtos placebo
L. plantarum JYLP-326 foi isolado de arroz glutinoso tradicionalmente fermentado na região de Bama, província de Guangxi, China, e foi preservado como cepa probiótica patenteada no Centro de Coleção de Culturas Microbiológicas Gerais da China (CGMCC, nº 18038) em 27 de junho de 2019. Demonstramos que ele poderia aderir a células Caco-2 de forma mais eficiente in vitro do que outras cepas de L. plantarum (Figura Suplementar 1A, Figura S1A), bem como a administração de JYLP-326 diminuiu eficientemente o tempo de latência do sono e aumentou o tempo total de sono em um modelo de rato com insônia induzida por 4-Cloro-DL-fenilalanina (Figuras S1B, C). Além disso, a ingestão de JYLP-326 restaurou o conteúdo de GABA no hipotálamo dos ratos ao nível padrão (Figuras S1D). Os produtos probiótico e placebo (maltodextrina) foram fabricados pela Zhongke Jiayi Bio Engineering Company, Shandong, China. O produto probiótico contém 1 g de pó liofilizado de JYLP-326 em uma dosagem fixa de 1,5 × 10¹⁰ UFC por sachê, com maltodextrina como excipiente. Cada dose é embalada em um sachê composto de alumínio de alta barreira, e todos os sachês apresentam-se como pó amarelo-claro com sabor idêntico. Todos os produtos foram fabricados sob a norma ISO9001 na China e aprovados como suplemento alimentar pela Administração de Alimentos e Medicamentos da China (nº SC10637078101504). Os sachês foram armazenados a 4 °C, sem exposição direta à luz solar. As qualidades do produto foram ainda avaliadas pelo método de contagem total de viáveis e sequenciamento do gene 16S rDNA antes do início do estudo.
Participantes e desenho experimental
Conduzimos este estudo para avaliar os efeitos da suplementação de JYLP-326 por 3 semanas nos comportamentos induzidos pelo estresse de exames em estudantes universitários do último ano. Alunos que estudavam nervosamente para o ENEM durante setembro a dezembro de 2020, um período crítico para os estudantes se prepararem para o exame, foram recrutados da Universidade de Nanchang. Todos os procedimentos foram aprovados e cumpridos pelo Comitê de Ética Institucional em pesquisa médica do Segundo Hospital Afiliado da Universidade de Nanchang (Número de aprovação e exame é Revisão [2020] nº (038)). Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
Em seguida, um total de 230 alunos foram inscritos para entrevista e preencheram a Escala de Ansiedade de Hamilton de 14 itens (HAMA-14), a Escala de Insônia de Atenas de 8 itens (AIS-8) e a Escala de Avaliação de Depressão de Hamilton de 17 itens (HDRS-17); dos 230, 60 com HAMA-14 basal para escore de ansiedade de 8 ou superior e HDRS-17 para escore de depressão de 8 ou superior foram triados, e 30 alunos não ansiosos com escore de escala de 8 ou menos também foram triados (Figura 1). Os critérios de inclusão foram os seguintes: estudantes universitários do último ano que estavam se preparando para o próximo teste do ENEM; índice de massa corporal (IMC) dentro da faixa saudável; nenhuma doença grave relatada (por exemplo, câncer, distúrbios cardíacos e hepáticos); mulheres sem uso de anticoncepcionais hormonais; e disposição para cooperar na conclusão deste estudo. Os critérios de exclusão foram os seguintes: sofrer de obesidade e diabetes; tomar qualquer medicação regularmente para certas doenças; tabagismo e consumo de álcool a longo prazo; tomar qualquer antibiótico ou probiótico (exceto iogurtes) no mês anterior; e outros motivos que tornassem os indivíduos improváveis de concluir este estudo. Além disso, indivíduos que estavam passando por relacionamentos fracassados, conflitos familiares, pressões econômicas e, especialmente, transtorno de ansiedade social, também foram excluídos.
Fluxograma do estudo mostrando recrutamento e alocação dos grupos.
Dentre esses 60 estudantes com ansiedade e depressão enfrentando o UNGEE, 30 foram selecionados aleatoriamente como grupo PB para receber o produto probiótico; outros 30 receberam o produto placebo e foram considerados como grupo P. Os 30 estudantes não ansiosos foram designados como grupo de controle saudável (grupo HP). Os sujeitos em cada grupo tinham a mesma idade e a proporção entre homens e mulheres era de 1:1. Os sujeitos nos grupos PB e P foram instruídos a tomar o probiótico e o produto placebo duas vezes ao dia por 3 semanas consecutivas, com um intervalo de 12 horas entre as duas ingestões, respectivamente. Enquanto os estudantes do grupo HP foram orientados a manter seu estilo de vida normal e hábitos alimentares. Todos os tratamentos foram interrompidos 2 semanas antes do início do UNGEE. Os questionários validados (ou seja, HAMA-14, HDRS-17 e AIS-8) foram fornecidos para determinar suas condições mentais no início do estudo (Semana 0) e ao final da intervenção (Semana 3). Os sujeitos foram instruídos a coletar amostras fecais por conta própria em casa, usando um tubo de amostragem de fezes de acordo com as instruções do fabricante. A primeira amostra fecal evacuada em um dia foi coletada durante 3 dias após os pontos de tempo indicados e armazenada a -80 °C imediatamente para pesquisas futuras.
Questionários
A gravidade dos sintomas de insônia foi medida usando a versão chinesa do AIS-8. Ela abrange uma pontuação total variando de 0 (indicando ausência de qualquer problema relacionado ao sono) a 24 (representando o grau mais grave de insônia), com uma pontuação de corte de 6 sendo sugerida como insônia. Os sintomas depressivos dos estudantes foram avaliados usando a versão chinesa do HDRS-17. A gravidade dos sintomas depressivos foi classificada de acordo com a seguinte faixa de gravidade da pontuação do HDRS: normal (0–7), depressão leve (8–16), depressão moderada (17–23) e depressão grave (> 23). Os sintomas de ansiedade foram medidos usando a versão chinesa do HAMA-14, e a gravidade dos sintomas de ansiedade foi classificada de acordo com a seguinte faixa de gravidade da pontuação do HAMA: normal (0–7), ansiedade leve ou provável (8–14), ansiedade moderada ou definitiva (15–21) e ansiedade grave (≥ 22).
Extração de DNA e sequenciamento do 16S rRNA
O DNA genômico total das amostras de fezes dos alunos foi extraído dos filtros de fibra de vidro usando o TIANamp Bacteria DNA Kit (QIAGEN) seguindo as instruções do fabricante. A concentração e a qualidade do DNA genômico extraído foram determinadas usando espectrofotômetro (NanoDrop, Thermo Fisher Scientific, Inc., EUA). O DNA extraído foi submetido ao sequenciamento 16S na Shanghai Personal Biotechnology Cp. Ltd. Os seguintes primers universais de rRNA 16S foram usados para a reação de PCR: 520F (5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′) e 802R (5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′) para a região V4, e esses produtos de PCR foram sequenciados com uma plataforma Illumina HiSeq 2000. O FLASH foi aplicado para mesclar as leituras sobrepostas, e a análise de sequências foi realizada usando o pacote de software UPARSE. Leituras com pontuações de qualidade inferiores a 20, bases ambíguas e primers inadequados foram descartadas antes do agrupamento. Simultaneamente, quimeras foram verificadas e eliminadas durante o agrupamento. As sequências de alta qualidade resultantes foram agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com 97% de similaridade. De acordo com a anotação de táxons, a abundância relativa de bactérias totais em cada amostra foi categorizada em diferentes níveis de classificação (Filo, Classe, Ordem, Família e Gênero). O índice de diversidade alfa (índice de Shannon e índice de Chao1) foi calculado, e o índice de diversidade beta (análise de componentes principais, PCoA) foi mapeado no software QIIME2. As leituras brutas foram depositadas no banco de dados Sequence Read Archive (SRA) do NCBI (PRJNA883039).
Análise de metabólitos fecais
Metabolômica em fezes foi analisada na Shanghai Personal Biotechnology Cp. Ltd usando um UHPLC (1290 Infinity LC, Agilent Technologies) acoplado a um quadrupolo tempo-de-voo (AB Sciex TripleTOF 6600). Amostras de fezes pesando 100 mg foram adicionadas a 400 ml de extrato de metanol-acetonitrila-água (2:2:1, vol/vol/vol), agitadas em vórtex e centrifugadas a 14,000 g por 20 min, e o sobrenadante foi coletado para medição adicional. Para separação HILIC, as amostras foram analisadas usando uma coluna ACQUIY UPLC BEH de 2.1 mm × 100 mm, 1.7 µm (waters, Irlanda). Em ambos os modos ESI positivo e negativo, a fase móvel continha A = 25 mM de acetato de amônio e 25 mM de hidróxido de amônio em água e B = acetonitrila. Para separação RPLC, uma coluna ACQUIY UPLC HSS T3 de 2.1 mm × 100 mm, 1.8 µm (waters, Irlanda) foi usada. No modo ESI positivo, a fase móvel continha A = água com 0.1% de ácido fórmico e B = acetonitrila com 0.1% de ácido fórmico; e no modo ESI negativo, a fase móvel continha A = 0.5 mM de fluoreto de amônio em água e B = acetonitrila. Os dados brutos de EM (arquivos wiff.scan) foram convertidos em arquivos MzXML usando o ProteoWizard MSConvert antes de serem importados para o software XCMS, disponível gratuitamente. Para a detecção de picos, os seguintes parâmetros foram usados: centWave m/z = 10 ppm, largura de pico = c (10, 60), pré-filtro = c (10, 100). Para o agrupamento de picos, bw = 5, mzwid = 0.025, minfrac = 0.5 foram usados. O CAMERA (Collection of Algorithms of MEtabolite pRofile Annotation) foi usado para anotação de isótopos e adutos.
Após normalização pela intensidade total de pico, os dados processados foram analisados pelo pacote R, onde foram submetidos à análise multivariada de dados, incluindo análise de componentes principais escalada por Pareto (PCA) e análise discriminante por mínimos quadrados parciais ortogonais (OPLS-DA). A validação cruzada de 7 vezes e o teste de permutação de resposta foram usados para avaliar a robustez do modelo. O valor de importância da variável na projeção (VIP) de cada variável no modelo OPLS-DA foi calculado para indicar sua contribuição para a classificação. Metabólitos com valor de VIP > 1 foram submetidos adicionalmente ao teste t de Student no nível univariado para medir a significância de cada metabólito. Valores de p menores que 0.05 foram considerados estatisticamente significativos. Os dados brutos da metabolômica fecal foram depositados nos bancos de dados públicos Metabolomics Workbench (ST002475) e Metabolights (MTBLS7119).
Análise estatística
A análise de correlação de Spearman foi realizada pelo pacote R e usada para determinar a correlação entre os escores de ansiedade/depressão e os principais micróbios alterados, bem como a correlação entre micróbios e os metabólitos diferenciais. A análise estatística foi realizada usando o software Prism versão 8.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). Os dados foram apresentados como média ± DP. A significância estatística foi analisada usando uma análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Probabilidades de erro de p <0.05 foram consideradas estatisticamente significativas.
Resultados
JYLP-326 alivia sintomas de ansiedade, depressão e insônia em estudantes
Não houve diferenças significativas nas características de base de idade e IMC entre os estudantes matriculados nesses grupos (p > 0,05, Tabela 1). Os questionários HAMA-14, HDRS-17 e AIS-8 foram utilizados para avaliar os estados mentais dos participantes no início (Semana 0) e ao final do tratamento (Semana 3). Em comparação com os estudantes saudáveis, os participantes dos grupos PB e P apresentaram ansiedade e depressão evidentes no início do estudo (p < 0,001, Tabela 1). No grupo HP, os escores das escalas de ansiedade HAMA-14 e depressão HDRS-17 aumentaram drasticamente de 4,07 ± 1,51 e 2,83 ± 1,39 na Semana 0 para 7,63 ± 2,40 e 6,83 ± 2,97 na Semana 3, respectivamente, indicando que o humor dos estudantes saudáveis gradualmente se transformou em ansiedade leve e depressão à medida que o exame se aproximava (Tabela 1). Esses dois indicadores no grupo P foram marginalmente aumentados ao final do tratamento, enquanto foram significativamente diminuídos no grupo PB. Além disso, a gravidade da insônia nos participantes foi positivamente correlacionada com o nível de ansiedade e depressão. Em conjunto, esses resultados sugerem que o suplemento probiótico JYLP-326 pode aliviar os distúrbios fisiológicos e os estados dos participantes que enfrentam estresse crônico, incluindo ansiedade, depressão e insônia.
Características dos participantes incluídos neste estudo e resultados de eficácia dos testes avaliados por meio dessas escalas.
Grupo HP (n=30) valor p* Grupo P (n=30) valor p* Grupo PB (n=30) valor p* Semana 0 Semana 3 Semana 0 Semana 3 Semana 0 Semana 3 Idade 22,25 ± 0,11 / 22,50 ± 0,25 / 22,30 ± 0,25 / IMC 21,20 ± 2,48 / 20,83 ± 2,31 / 21,07 ± 2,67 / Feminino: masculino (n: n) 1: 1 (15,00: 15,00) / 1: 1 (15,00: 15,00) / 1: 1 (15,00: 15,00) / HAMA-14a 4,07 ± 1,51A 7,63 ± 2,40A < 0,0001 13,27 ± 3,64B 15,30 ± 3,71*B 0,0362 13,93 ± 5,01B 10,57 ± 3,43C 0,0036 HDRS-17b 2,83 ± 1,39A 6,83 ± 2,97**A < 0,0001 12,23 ± 4,59B 14,07 ± 2,07nsB 0,1083 12,37 ± 5,41B 8,17 ± 4,13A 0,0003 AIS-8c 2,33 ± 1,06A 5,07 ± 1,93A 0,0002 8,27 ± 3,19B 9,53 ± 3,45nsB 0,1455 8,07 ± 2,85B 6,47 ± 2,15*A 0,0171
Os dados foram apresentados como média ± DP; n refere-se ao número; IMC, índice de massa corporal basal.
A Escala de Ansiedade de Hamilton de 14 itens (HAMA-14) foi utilizada para avaliar os sintomas de ansiedade.
A Escala de Avaliação de Depressão de Hamilton de 17 itens (HDRS-17) foi utilizada para avaliar os sintomas depressivos.
A Escala de Insônia de Atenas de 8 itens (AIS-8) foi utilizada para avaliar os sintomas de insônia.
*Intragrupo, comparado ao basal (Semana 0), *p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. ns refere-se a não significância.
Letras maiúsculas referem-se ao teste de comparações múltiplas de Tukey entre grupos, p < 0,001.
JYLP-326 tem impactos na diversidade microbiana intestinal
Todos os sujeitos foram convidados a fornecer amostras fecais voluntariamente. Mas no final coletamos 25 amostras fecais do grupo HP, 20 do grupo P e 20 do grupo PB para realizar a análise de sequenciamento de alto rendimento do 16S rRNA. E 2 amostras no grupo P e 1 amostra no grupo PB falharam ao estabelecer a biblioteca de sequenciamento. Houve uma diferença nos índices de diversidade α da microbiota intestinal entre esses três grupos, conforme apresentado pelos índices Chao 1 e Shannon, sugerindo que a ansiedade de teste pode perturbar o equilíbrio da microbiota intestinal humana ( Figura 2A ). Em particular, os índices Chao 1 e Shannon no grupo P foram marginalmente maiores do que no grupo HP, enquanto JYLP-326 pôde restaurar a diversidade da microbiota intestinal que foi perturbada pela ansiedade de teste ( Figura 2A ). Além disso, a análise de PCoA demonstrou que a diversidade β da microbiota intestinal humana no grupo PB foi semelhante à do grupo HP, mas ligeiramente diferente da do grupo P, o que sugeriu ainda que a ansiedade de teste teve impacto na estrutura da microbiota intestinal humana e que o probiótico JYLP-326 pôde remodelar o perfil microbiano intestinal ( Figura 2B ). Além disso, um total de 10.471 OTUs foram identificados em todas as amostras, mas menos de 10% (964/10.471) dos OTUs eram comuns aos três grupos, e apenas 32,37% dos OTUs no grupo P e 28,51% dos OTUs no grupo PB foram compartilhados pelo grupo HP, indicando que a ansiedade de teste pode afetar os tipos de espécies que habitam o intestino e que o tratamento apenas com JYLP-326 dificilmente pode remodelar essa mudança ( Figura 2C ).
Efeitos de L. plantarum JYLP-326 na diversidade microbiana intestinal. (A) Índices Chao1 e Shannon da microbiota intestinal. (B) Análise de PCoA da microbiota intestinal. (C) Diagrama de Venn das espécies microbianas intestinais. HP, grupo controle normal sem qualquer tratamento; P, grupo P tomando placebo; PB, grupo PB tomando probiótico L. plantarum JYLP-326. ∗ p < 0,05.
Efeitos de JYLP-326 na composição microbiana fecal
No nível de filo, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria e Proteobacteria foram as populações mais comuns nesses grupos, e elas representaram 99,76%, 99,53% e 99,30% do total de resultados de sequenciamento nesses três grupos, respectivamente ( Figura 3A ). Notavelmente, a abundância relativa de Firmicutes foi de 45,28% no grupo P, que foi significativamente maior do que no grupo HP (32,51%, p = 0,041), enquanto pôde ser ligeiramente restaurada pela administração de JYLP-326. Em contraste, a abundância relativa de Actinobacteria e Proteobacteria no grupo P (10,96% e 5,45%) foi menor do que no grupo HP (15,26% e 13,83%) e no grupo PB (12,44% e 16,76%). Além disso, o conteúdo de Bacteroidetes não foi influenciado pela ansiedade de teste, pois sua abundância relativa foi muito semelhante entre os grupos P e HP (38,04% vs 37,13%), porém pôde ser reduzido pelo tratamento com JYLP-326.
Efeitos do JYLP-326 na composição microbiana intestinal. (A) Abundância relativa de bactérias intestinais no nível de filos. (B) Abundância relativa de bactérias intestinais no nível de gênero. HP, grupo controle normal sem qualquer tratamento; P, grupo P tomando placebo; PB, grupo PB tomando JYLP-326. ∗ p < 0,05.
No nível de gênero (Figura 3B), o espectro microbiano fecal dos estudantes do grupo P era menos rico em Prevotella (11,80%) e Bifidobacterium (9,98%) do que o do grupo HP (16,89% e 14,05%), mas era relativamente rico em Bacteroides (19,90%) e Roseburia (6,47%) do que o do grupo HP (16,61% e 2,73%). E suas abundâncias relativas no grupo PB foram de 12,12%, 11,69%, 11,73% e 3,25%, respectivamente. Esses resultados ilustraram que o tratamento com JYLP-326 poderia reverter parcialmente a tendência de mudança no microbioma intestinal para o estado padrão. Vale ressaltar que a abundância de Roseburia no grupo P foi dramaticamente maior (p = 0,0397) do que a do grupo HP, enquanto a ingestão do probiótico JYLP-326 poderia eliminar a tendência de mudança desse gênero. Coletivamente, esses resultados indicaram que a administração de JYLP-326 poderia remodelar as mudanças induzidas pela ansiedade de teste na composição da microbiota intestinal, particularmente na diminuição de Bacteroides e Roseburia e no aumento de Prevotella e Bifidobacterium.
Identificação de metabólitos fecais alterados entre cada grupo
As amostras de controle de qualidade (QC) foram inseridas nas coortes de amostras para monitorar e avaliar a estabilidade do sistema de teste e a confiabilidade dos dados experimentais. A intensidade de resposta e o tempo de retenção de cada pico cromatográfico de todas as amostras de QC estavam quase sobrepostos em seus cromatogramas de íons totais (Figura S2), e todas as amostras de QC se agruparam nos modos ESI- e ESI+ (Figuras 4A, B), sugerindo que os dados obtidos para análise eram confiáveis e o sistema analítico estava estável. Além disso, não houve separação óbvia entre esses três grupos com base na análise de PCA, indicando que a ansiedade de teste e o probiótico JYLP-326 pareciam não ter impactos significativos nas mudanças dos perfis metabólicos fecais. Um banco de dados local de produtos padrão construído internamente foi adotado para pesquisar e combinar as informações detalhadas dos metabólitos nas amostras, e um total de 2.791 metabólitos (1.818 no modo ESI+ e 1.153 no modo ESI-) foram identificados no nível 2 do novo nível de confiança das anotações de compostos. De acordo com suas informações de taxonomia química, 28,04% dos metabólitos foram classificados na superclasse de lipídios e moléculas semelhantes a lipídios, 20,09% eram ácidos orgânicos e derivados, e 13,36% pertenciam ao indefinido (Figura 4C).
Perfil do metaboloma fecal entre os grupos. (A) Gráficos de PCA no modelo ESI+. (B) Gráficos de PCA no modelo ESI-. (C) Superclasse dos metabólitos fecais identificados. HP, amostras do grupo controle normal (n=25, caixa verde); P, amostras do grupo P (n=20, círculo roxo); PB, amostras do grupo PB (n=20, triângulo rosa); QC, as amostras de controle de qualidade (n=7, losango amarelo).
JYLP-326 promove o rearranjo metabólico fecal em estudantes ansiosos
Para explorar os metabólitos diferenciais entre esses grupos, usamos modelos OPLS-DA para comparar as variáveis diferenciais entre os grupos, e o valor de importância da variável para a projeção (VIP) obtido pelo OPLS-DA (VIP > 1) e valor de p (p < 0,05) como critérios para selecionar os metabólitos alterados entre dois grupos. Uma separação distinta entre os grupos sob os modos ESI- (Figuras S3A–C) e ESI+ (Figuras S3D–F) foi observada, sugerindo que os modelos OPLS-DA poderiam distinguir efetivamente entre as amostras. Além disso, selecionamos as variáveis com o valor de fold change (FC > 1 ou < 1) e valor de p < 0,05 para selecionar os metabólitos potenciais. O diagrama de Venn mostrou que um total de 95 variáveis de metabólitos no modo ESI- e 105 no modo ESI+ foram selecionadas (Figuras 5A, B). As informações detalhadas desses metabólitos foram listadas nas Tabelas Suplementares 1, 2. O diagrama de dispersão analítico de enriquecimento KEGG mostrou que essas variáveis foram significativamente enriquecidas nas principais vias do metabolismo de Carbono ou energia, resistência à insulina, interação neuroativo-receptor de ligante e digestão e absorção de vitaminas (Figura 5C).
Análise de enriquecimento de vias dos metabólitos diferenciais. (A, B) Diagrama de Venn dos metabólitos diferenciais nos modos ESI+ e ESI-. Um total de duzentos metabólitos diferenciais foram mostrados nos diagramas de Venn. (C) Análise de enriquecimento KEGG desses metabólitos alterados. O diagrama de dispersão mostra o enriquecimento de metabólitos diferenciais em várias vias.
Enquanto isso, havia 13 variáveis na interseção entre P vs. HP e PB vs. P (Tabela 2), que formaram um subconjunto de variáveis relacionadas ao probiótico JYLP-326. Em comparação com o grupo HP, os níveis relativos de 8 variáveis (isto é, L-gulono-1,4-lactona, Sulfato de etila, Quinate, D-glucarato, 1,2-propanodiol, 3-(1,3-benzodioxol-5-il)-, 3-Metoxi-4-Hidroxifenilglicol Sulfato, Betaina e Trigonelina) aumentaram significativamente no grupo P (FC > 1 e p < 0,05), e os níveis relativos de 5 variáveis (isto é, Fenpropidina, Palmitoil 3-carbacíclico ácido fosfatídico, 5 beta-androstan-3 alfa-ol-17-ona Sulfato, Biocitina e Ciclohexilamina) diminuíram obviamente (FC < 1 e p < 0,05). No entanto, essas variáveis puderam ser revertidas ao nível padrão após o tratamento com JYLP-326, com exceção do metabólito Fenpropidina. Esses resultados nos levaram a concluir que essas variáveis poderiam ser os marcadores metabólicos do probiótico JYLP-326 contra a ansiedade de teste em estudantes.
As informações detalhadas de 13 metabólitos significativamente alterados entre os grupos HP, P e PB *.
Modelo Nome Específico m/z a rt(s) b P vs HP PB vs P VIP c FC d valor-p VIP c FC d valor-p ESI- L-gulono-1,4-lactona 195.05081 387.357 4.27301971 7.979424421 0.017582821 3.906341727 0.113596458 0.029565625 ESI- Sulfato de etila 124.99066 38.071 1.882300315 7.075238951 0.013742364 1.292556755 0.136934342 0.025845551 ESI- Quinato 191.05593 345.186 3.173086907 5.276268253 0.002457568 1.455844085 0.362811164 0.039252262 ESI- D-glucarato 191.01949 263.965 2.369376541 3.646624883 0.008140489 2.386902382 0.172475162 0.027773458 ESI- 1,2-propanodiol, 3-(1,3-benzodioxol-5-il)- 195.05076 424.711 1.835589385 3.597884209 0.030419397 1.721596256 0.205156794 0.024078796 ESI- Sulfato de 3-Metoxi-4-Hidroxifenilglicol 263.02291 50.099 2.906884199 3.453605621 0.003080449 3.174853095 0.259107401 0.003582272 ESI+ Betaína 118.086 264.934 17.57192332 2.739920259 0.001233787 15.37404912 0.503744169 0.014949984 ESI+ Trigonelina 138.05419 283.845 2.373539161 2.186249216 0.019879179 3.007366424 0.378027272 0.00426738 ESI+ Fenpropidina 274.27371 60.342 4.551799883 0.692642154 0.007369509 2.088344672 0.703853494 0.019033832 ESI+ Ácido fosfatídico palmitoil 3-carbacíclico 413.26432 116.372 3.758160942 0.418147894 0.017807482 3.366001471 1.936188022 0.038522023 ESI- Sulfato de 5 beta-androstan-3alpha-ol-17-ona 369.17338 33.0335 5.632922694 0.399757525 0.038920948 6.557939453 2.900713193 0.004282649 ESI- Biocitina 371.18864 35.274 2.481678326 0.343132465 0.027963888 3.599344931 3.172244195 0.001949106 ESI+ Ciclohexilamina 100.11085 71.223 4.009630411 0.289296434 0.040504798 5.697031322 3.784354688 0.03088384
- A abundância relativa desses metabólitos em cada grupo foi depositada nos bancos de dados públicos do Metabolomics Workbench (ST002475) e Metabolights (MTBLS7119).
m/z significa a razão massa-carga de cada metabólito.
rt(s) refere-se ao tempo de retenção do metabólito na cromatografia, ou seja, o tempo de pico, que é expresso em segundos.
VIP, a importância da variável para a projeção; quanto maior o valor, mais importante.
FC significa mudanças de dobra do metabólito nos grupos comparados.
Análise de correlação entre metaboloma, microbioma e fenótipos
Em seguida, foram realizadas correlações de Spearman para investigar a associação entre os gêneros da microbiota intestinal (top 6), 13 metabólitos diferenciais e o sintoma de ansiedade ( Figura 6 ). Observamos que Bacteroides, Faecalibacterium, Roseburia e Blautia foram positivamente correlacionados com a ansiedade de teste induzida pelo estresse do exame nos estudantes. Notavelmente, os gêneros Faecalibacterium e Roseburia foram significativamente associados entre si e positivamente correlacionados com Bacteroides, que foi negativamente correlacionado com Prevotella. E o gênero Prevotella também foi negativamente correlacionado com Bifidobacterium e Faecalibacterium. Entre os 13 metabólitos, oito foram positivamente correlacionados entre si, mas negativamente correlacionados com os cinco restantes. Notavelmente, houve uma correlação negativa marcante entre a Ciclohexilamina e o sintoma de ansiedade, e uma correlação positiva significativa entre o Sulfato de etila e a ansiedade induzida pelo estresse do exame. Além disso, os 13 metabólitos pareciam estar negativamente correlacionados com Roseburia e Blautia. Adicionalmente, as correlações entre depressão/insônia, os 13 metabólitos e 6 micróbios intestinais alterados foram semelhantes às da ansiedade ( Figuras S4A, B ). Esses resultados sugeriram que as alterações na microbiota intestinal e seu metabolismo estavam associadas à ansiedade de teste, depressão e insônia induzidas pelo estresse do exame em estudantes.
Análise de correlação de Spearman entre comportamento de ansiedade, microbiota intestinal e metabólitos fecais. Coeficiente de correlação de postos de Spearman entre os escores de sintomas de ansiedade, 13 metabólitos na
Tabela 2
e os 6 maiores gêneros de microbiota intestinal em abundância relativa. Os valores de P são representados em vermelho e azul, onde vermelho se refere a uma correlação negativa e azul a uma correlação positiva. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001.
Discussão
O exame acadêmico é a principal fonte de estresse naturalístico breve para estudantes universitários, tendo sido frequentemente utilizado como modelo de estresse para investigar as respostas de estresse psicológico juntamente com as alterações na microbiota intestinal e para avaliar as influências de probióticos ou prebióticos nas complicações induzidas pelo estresse. Neste estudo, estudantes universitários saudáveis submetidos ao UNGEE, caracterizado por sua involução feroz, foram recrutados para avaliar os efeitos potenciais do probiótico L. plantarum JYLP-326 nos sintomas relacionados ao estresse. Os resultados mostraram que a suplementação diária do probiótico JYLP-326 (duas vezes ao dia) por três semanas aliviou significativamente a ansiedade/depressão e a insônia dos estudantes universitários. Mecanisticamente, o tratamento probiótico pôde conduzir mudanças na diversidade e composição da microbiota intestinal perturbada pelo evento estressante, o que foi acompanhado por suas alterações metabólicas funcionais. Os dados atuais indicaram ainda uma via de comunicação bidirecional entre a microbiota intestinal e o cérebro [ou seja, eixo intestino-cérebro ], bem como validaram os efeitos psicológicos benéficos dos probióticos em indivíduos ansiosos.
Os níveis de ansiedade, depressão e insônia foram medidos pelos questionários de saúde mental mais comumente utilizados, como HAMA-14, HDRS-17 e AIS-8. Os alunos dos grupos P e PB apresentaram ansiedade e depressão moderadas acompanhadas de distúrbio leve do sono na linha de base. Os escores das escalas aumentaram notavelmente ao final deste estudo nos grupos HP e P, sugerindo que os níveis desses indicadores estavam se intensificando e que iriam piorar ainda mais durante a aproximação do exame UNGEE. Notavelmente, o tratamento com o probiótico JYLP-326 reduziu significativamente a depressão e a qualidade do sono para um limite entre regular e moderado, e protegeu contra o progresso da ansiedade para pior ( Tabela 1 ). Esses dados corroboraram bem com resultados anteriores de que a cepa única de L. plantarum (por exemplo, P8, PS128, DR7) reduziu o estresse, a ansiedade e a insônia em indivíduos estressados. Outras espécies de Lactobacillus como L. casei (Shirota), L. rhamnosus e produtos multi-cepas contendo L. plantarum [por exemplo, UBLP40, R1012, SK321] também foram relatadas como moduladoras de transtornos psiquiátricos e comportamentos induzidos pelo estresse. Essas descobertas indicaram que probióticos como Lactobacillus tinham impactos potenciais na redução da ansiedade de teste e seus sintomas relacionados.
Considerando que evidências sugeriram que intervenções probióticas poderiam equilibrar populações microbianas, criando assim uma homeostase intestinal saudável para sustentar o sistema de vida. Existe a suposição de que uma maior diversidade da microbiota intestinal geralmente significa um melhor ambiente intestinal, o que foi comprovado por várias condições (por exemplo, cânceres, distúrbios gastrointestinais e condições relacionadas ao estresse) acompanhadas por uma diversidade microbiana intestinal reduzida. No entanto, os dados aqui apresentados foram incongruentes com essas descobertas observadas, porque encontramos um aumento significativo na α-diversidade da microbiota intestinal (ou seja, os índices de Shannon e Chao1) e uma alteração menor na β-diversidade (análise de PCA) no grupo placebo em comparação com o grupo controle saudável ( Figura 2 ). Outro estudioso também pensou que a medição da diversidade não está necessariamente relacionada à resposta dos resultados da comunidade, mas é um ponto de partida para uma investigação mais aprofundada dos mecanismos ecológicos.
Nossos resultados mostraram que o conteúdo dos gêneros Bacteroides, Faecalibacterium e Roseburia aumentou de forma evidente com a exacerbação de doenças relacionadas ao estresse, enquanto os gêneros Prevotella e Bifidobacterium diminuíram; já o tratamento com JYLP-326 reverteu parcialmente as alterações dessas bactérias (Figura 3). Algumas espécies específicas de Bifidobacterium e Faecalibacterium, como B. adolescentis, B. longum e F. prausnitzii, mostraram-se aumentadas, e R. faecis diminuída, após a administração de L. plantarum em indivíduos estressados. Lactobacillus, um gênero importante na microbiota intestinal, também foi relatado como tendo correlação significativa com a saúde mental e possuindo propriedades ansiolíticas e antidepressivas. No entanto, a abundância relativa de Lactobacillus era tão extremamente baixa que dificilmente encontramos sua alteração entre os grupos. A explicação possível para essa observação foi que os procedimentos de redundância do sequenciamento 16S perderam as informações sobre Lactobacillus, e até mesmo a cepa isolada L. plantarum JYLP-326 não conseguiu colonizar o intestino. Notavelmente, os dados de análise de correlação apresentados aqui mostraram ainda que Roseburia estava positivamente correlacionada com sintomas relacionados ao estresse (Figura 6), semelhante aos resultados de outro estudo. Esses resultados apoiaram que espécies microbianas intestinais específicas e sua riqueza relativa desempenham papéis vitais na proteção contra o progresso de distúrbios induzidos pelo estresse.
Além disso, as ações metabólicas da microbiota intestinal ou os metabólitos originados de microrganismos intestinais são as principais vias que promovem a comunicação entre o intestino e o cérebro por meio do eixo microbiota-intestino-cérebro. Ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs), ácidos biliares e alguns neurotransmissores, como o ácido gama-aminobutírico (GABA) e a dopamina, foram comumente metabólitos potencialmente envolvidos nessa comunicação. Aqui, duzentos metabólitos fecais diferenciais foram identificados por análise metabolômica não direcionada entre esses grupos, os quais foram enriquecidos em vias como Digestão e absorção de vitaminas, Interação ligante-receptor neuroativo, Resistência à insulina e Metabolismo de carbono ou energia (Figura 5). A vitamina sintetizada pela microbiota intestinal (nomeadamente a vitamina K2) poderia ser um agente neuroprotetor para restaurar defeitos mitocondriais associados à doença de Parkinson (DP) em drosófilas. Outros pesquisadores e nós sugerimos que a resistência à insulina está intimamente ligada a doenças neurodegenerativas como a DP, e a sinalização prejudicada da insulina no cérebro é uma característica que contribui para a disfunção neuronal nesses distúrbios. Esses resultados sugeriram ainda que os distúrbios induzidos pelo estresse estavam associados a perturbações na metabolômica fecal.
Dentre eles, 13 variáveis formaram um subconjunto relacionado ao tratamento com o probiótico JYLP-326 (Tabela 2), que pareciam estar negativamente correlacionadas com o microbioma intestinal perturbado, exceto pela Ciclohexilamina, que estava positivamente relacionada à Prevotella (Figura 6). Além disso, constatou-se que a Ciclohexilamina estava negativamente associada aos sintomas de ansiedade/depressão. Em contraste, o Sulfato de etila estava positivamente relacionado a esses transtornos. Os fragmentos heterocíclicos contendo nitrogênio e seus derivados, como a Ciclohexilamina, demonstraram sucesso no tratamento da depressão. E o Sulfato de etila tem sido considerado um biomarcador no soro de dependentes de álcool, o que causará uma série de transtornos psicóticos. Embora as alterações dos frequentemente mencionados SCFAs e GABA nos metabólitos fecais não tenham sido observadas neste estudo, nossos resultados forneceram alguns novos compostos implicados no desenvolvimento de sintomas relacionados ao estresse, que poderiam ser modulados pela administração de probióticos como o L. plantarum JYLP-326. Mais estudos devem ser conduzidos para ilustrar as funções precisas dessas variáveis envolvidas na eficácia dos probióticos sobre sintomas relacionados ao estresse, como ansiedade e depressão.
Embora o papel potencial do JYLP-326 na remodelagem da microbiota intestinal perturbada tenha sido ilustrado neste estudo, ainda não está claro se essa eficácia foi causada pela administração do probiótico ou por diferenças individuais entre os sujeitos. Seria melhor levar em conta o impacto da heterogeneidade do microbioma intestinal nos resultados da microbiota intestinal e seu metabolismo, coletando amostras fecais antes dos tratamentos como grupos de controle adicionais para uma análise comparativa posterior. Além disso, os mecanismos subjacentes do JYLP-326 no alívio dos transtornos mentais relacionados à ansiedade de teste também devem ser explorados profundamente utilizando modelos animais de ansiedade/depressão e técnicas moleculares avançadas, particularmente em como ligar o eixo microbiota-intestino-cérebro às funções biológicas do probiótico JYLP-326 no futuro, uma questão crítica sobre a aplicação de probióticos na clínica.
Conclusões
Em conclusão, o presente estudo observou que a administração do probiótico JYLP-326 poderia aliviar significativamente os sintomas de ansiedade/depressão e insônia em estudantes universitários com ansiedade de teste. A estrutura e composição da microbiota intestinal foram alteradas pela pressão de passar em um exame vital com involução acirrada, assim como as alterações nos metabólitos fecais. Especificamente, o tratamento com JYLP-326 protegeu contra essa disbiose induzida pelo estresse do exame da microbiota intestinal e as perturbações da metabolômica fecal. Além disso, os gêneros alterados da microbiota intestinal e os metabólitos fecais estavam intimamente associados a sintomas relacionados ao estresse, como ansiedade/depressão e insônia, indicando que poderiam ser considerados biomarcadores para o diagnóstico e tratamento de transtornos de estresse e ansiedade.
Declaração de disponibilidade de dados
Os conjuntos de dados apresentados neste estudo podem ser encontrados em repositórios online. Os nomes do(s) repositório(s) e número(s) de acesso podem ser encontrados abaixo: PRJNA883039 (SRA) e ST002475 ().
Declaração de ética
O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (ou Comitê de Ética) em pesquisa médica do Segundo Hospital Afiliado da Universidade de Nanchang (Número de exame e aprovação é Parecer [2020] nº (038)). Os pacientes/participantes forneceram seu consentimento informado por escrito para participar deste estudo.
Contribuições dos autores
Conceituação, TC. Metodologia, RZ e SL. Software, RZ. Validação, TC e SL. Análise formal, SL. Investigação, YF, HL, SZ, RF e YL. Recursos, JW. Curadoria de dados, RZ. Redação—preparação do rascunho original, SL e RZ. Redação—revisão e edição, SL, TC, SZ e LWW. Visualização, RZ e SL. Supervisão, TC e JW. Administração do projeto, TC. Aquisição de financiamento, TC, SL e LFW. Todos os autores contribuíram para o artigo e aprovaram a versão submetida.
Conflito de interesse
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Nota do editor
Todas as alegações expressas neste artigo são de responsabilidade exclusiva dos autores e não representam necessariamente as de suas organizações afiliadas, nem as do editor, dos editores e dos revisores. Qualquer produto que possa ser avaliado neste artigo, ou alegação que possa ser feita por seu fabricante, não é garantido ou endossado pelo editor.
Material suplementar
O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1158137/full#supplementary-material
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