pmid: "27782086"
title: "Laurus nobilis, Zingiber officinale e Anethum graveolens Óleos Essenciais: Composição, Atividades Antioxidantes e Antibacterianas contra Bactérias Isoladas de Peixes e Frutos do Mar."
authors: "Snuossi M, Trabelsi N, Ben Taleb S, Dehmeni A, Flamini G, De Feo V"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2016 Oct 22"
doi: ""
source: "PMC Full Text"
Laurus nobilis, Zingiber officinale e Anethum graveolens Óleos Essenciais: Composição, Atividades Antioxidantes e Antibacterianas contra Bactérias Isoladas de Peixes e Frutos do Mar.
Autores
Snuossi M, Trabelsi N, Ben Taleb S, Dehmeni A, Flamini G, De Feo V
Periodico
Molecules (Basel, Switzerland) (2016 Oct 22)
Conteudo
Óleos Essenciais de Laurus nobilis, Zingiber officinale e Anethum graveolens: Composição, Atividades Antioxidante e Antibacteriana contra Bactérias Isoladas de Peixes e Mariscos
Diversas cepas bacterianas foram isoladas de peixes e mariscos selvagens e cultivados. A identificação dessas cepas revelou o predomínio da espécie Aeromonas hydrophila em todas as amostras de frutos do mar, seguida por Staphylococcus spp., Vibrio alginolyticus, Enterobacter cloacae, Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella oxytoca e Serratia odorifera. Os isolados foram estudados quanto à capacidade de produzir exoenzimas e biofilmes. A composição química dos óleos essenciais de folhas de Laurus nobilis, rizomas de Zingiber officinale e partes aéreas de Anethum graveolens foi analisada por CG e CG/EM. As atividades antioxidante e antibacteriana dos óleos essenciais contra os microrganismos isolados foram estudadas. Concentrações baixas dos três óleos essenciais foram necessárias para inibir o crescimento das bactérias selecionadas, e os menores valores de CMB foram obtidos para o óleo essencial de louro. Os óleos essenciais selecionados podem ser usados como um bom conservante natural em alimentos de peixe devido às suas atividades antioxidante e antibacteriana.
- Introdução
Peixes e mariscos são excelentes fontes de proteína para consumo humano devido ao seu alto teor de vitaminas, minerais e ácidos graxos poli-insaturados. A qualidade organoléptica dos produtos marinhos pode deteriorar-se rapidamente post mortem como consequência de vários processos microbianos e bioquímicos de deterioração. De fato, o grau de alteração depende da contagem bacteriana inicial no peixe e marisco frescos, que também é afetada pela qualidade microbiológica da água, sua temperatura e salinidade. A flora bacteriana em peixes inclui aquelas naturalmente presentes em ambientes de água doce e aquelas associadas à poluição do ambiente aquático. Um terceiro grupo inclui bactérias introduzidas nos peixes e produtos pesqueiros durante a manipulação e processamento pós-colheita. Na verdade, os procedimentos de manuseio, colheita, processamento (por exemplo, descabeçamento, evisceração e corte) e temperatura de armazenamento são os principais fatores que afetam a qualidade microbiológica dos produtos de peixe e marisco post mortem. Os frutos do mar podem ser veículo para a maioria dos patógenos bacterianos conhecidos, como cepas de Salmonella, Edwardsiella tarda, Plesiomonas shigelloides, Aeromonas móveis e Vibrio spp. Organismos filtradores, como mexilhões e ostras, concentram todas as bactérias e vírus que vivem na água circundante em seus sistemas de filtração. Recentemente, o sequenciamento do rDNA 16S revelou Shewanella baltica como a principal espécie isolada como produtora de sulfeto de hidrogênio de peixes marinhos, seguida por Serratia spp. e outras espécies de Shewanella.
Óleos essenciais são líquidos oleosos aromáticos e voláteis contendo uma mistura de compostos resultantes do metabolismo secundário das plantas, formados em células especiais encontradas em folhas e caules, e comumente concentrados em uma região específica, como folhas, casca ou fruto. Alguns óleos essenciais têm demonstrado potencial como intervenções de segurança alimentar quando adicionados a alimentos processados e crus. Extratos/óleos essenciais de espécies de ervas dietéticas têm sido usados como fontes de medicamentos e conservantes de alimentos há mais de 4000 anos. Recentemente, algumas das substâncias bioativas responsáveis por essas atividades medicinais e conservantes foram identificadas como compostos fenólicos, como timol e ácido rosmarínico. Muitas especiarias e ervas aromáticas/medicinais são geralmente utilizadas na bacia do Mediterrâneo para temperar preparações de peixes e frutos do mar. Essas plantas e seus derivados também são usados como agentes de conservação para evitar contaminação bacteriana de frutos do mar. Óleos essenciais de orégano e hortelã são eficazes contra o organismo deteriorante Photobacterium phosphoreum, mesmo em peixes gordurosos como o bacalhau, e espalhar o óleo essencial na superfície de peixes inteiros ou em um filme de revestimento para camarões parece eficaz na inibição da flora deteriorante natural respectiva. A dieta de alevinos de Oreochromis niloticus (L.) suplementada com óleos essenciais de gengibre, cominho preto, tomilho, cravo-da-índia, agrião, erva-doce ou alho melhora o desempenho dos alevinos. Os óleos essenciais são reconhecidos como seguros de acordo com a Food and Drug Administration. Na indústria de processamento de alimentos, aditivos e outros ingredientes são utilizados durante o processo tecnológico de produção. Atualmente, as tendências mais importantes na indústria alimentícia são a aplicação de sabores naturais, especiarias, antioxidantes e pigmentos. Extratos de ervas medicinais e óleos essenciais são adicionados em diferentes tipos de produtos alimentícios como conservantes naturais. Sua função básica é melhorar o sabor, o cheiro e o efeito organoléptico na produção de alimentos, a digestão dos produtos alimentícios, aumentar o frescor dos produtos e, pelo menos, conservar os produtos de maneira adequada. Na Tunísia, pó de gengibre, partes aéreas de endro e folhas secas de louro são comumente adicionados a pratos de peixes e frutos do mar. Considerando o grande número de diferentes grupos de compostos químicos presentes nos óleos essenciais extraídos dessas plantas, sabe-se que eles possuem diversas atividades biológicas, incluindo atividades antibacteriana, antifúngica e antioxidante, e são utilizados em várias indústrias, incluindo medicina, alimentos e cosméticos.
As folhas de L. nobilis L. (Lauraceae) são geralmente usadas para tratar distúrbios gastrointestinais e, nas indústrias cosmética e alimentícia, como componente de fragrância. O óleo essencial de louro é geralmente dominado pelo composto monoterpênico 1,8-cineol. Esta espécie é utilizada como agente flavorizante de alimentos e na indústria farmacêutica para formulações de medicamentos. Os óleos essenciais de louro são reconhecidos por sua atividade antimicrobiana contra um amplo painel de bactérias e fungos patogênicos e deteriorantes de alimentos testados, além de atividades antivirais e antibiofilme. Comumente conhecidas como endro, as sementes de Anethum graveolens (Umbelliferae) são amplamente utilizadas nas indústrias alimentícia e farmacêutica para tratar problemas gastrointestinais (carminativo, estomacal) e reumatismo. A carvona é o odorante predominante da semente de endro, e α-felandreno, limoneno, éter de endro e miristicina são os odorantes mais importantes da erva de endro. O óleo essencial desta erva aromática anual é reconhecido por exibir uma ampla gama de atividades biológicas, incluindo efeitos antibacterianos, antifúngicos, antioxidantes, anti-inflamatórios, anti-hiperlipidêmicos e anti-hipercolesterolêmicos. A planta Zingiber officinale, pertencente à família Zingiberaceae, é nativa de climas tropicais quentes, particularmente do sudeste da Ásia, e é cultivada na Índia, China, África, Jamaica, México e Havaí. Tanto o óleo essencial quanto as oleorresinas extraídas dos rizomas (especiaria comercial) são utilizados em muitas preparações alimentícias, refrigerantes e bebidas. A análise dos óleos voláteis do rizoma de endro mostrou canfeno, p-cineol, α-terpineol, zingibereno e ácido pentadecanoico como componentes principais. Este óleo possui diferentes propriedades biológicas, incluindo propriedades antibacterianas, antifúngicas, antioxidantes, anticancerígenas, larvicidas, antidiabéticas, anti-inflamatórias e nefro/hepatoprotetoras.
Os principais objetivos do presente trabalho foram estudar as atividades antibacterianas dos óleos essenciais de Laurus nobilis (louro), Anethum graveolens (endro) e Zingiber officinale (gengibre) contra bactérias isoladas de peixes e frutos do mar frequentemente consumidos na Tunísia. A composição química e as atividades antioxidantes dos três óleos essenciais também foram estudadas.
2. Resultados
2.1. Identificação e Caracterização dos Isolados
Setenta e três cepas foram identificadas de todas as amostras de peixes, moluscos e crustáceos analisadas com base em caracteres bioquímicos obtidos nas galerias API (20E, 20NE, Staph) e a interpretação dos resultados foi realizada utilizando o software API (bio Mérieux SA, Marcy l’Etoile, França). Dez espécies pertencentes ao gênero Staphylococcus foram identificadas em todas as amostras testadas: S. lentus, S. xylosus, S. sciuri, S. lugdunensis, S. saprophyticus, S. epidermidis, S. aureus, S. hominis e S. cohnii spp. cohnii, com dominância das duas espécies S. lugdunensis e S. sciuri. Apenas uma cepa isolada da pele de dourada foi identificada como Micrococcus spp.
Utilizando as galerias API20E, as colônias que cresceram em placas de ágar CHROMagar™ E. coli foram identificadas como Enterobacter cloacae, Klebsiella ornithinolytica, K. oxytoca e Serratia odorifera. Além disso, as 44 cepas isoladas de placas de ágar CHROMagar™ Vibrio e identificadas com tiras API20NE pertenciam aos gêneros Aeromonas, Vibrio e Chromobacterium. Apenas uma cepa isolada da pele de dourada (V36) não foi identificada pelo sistema API 20NE. Aeromonas hydrophila é a espécie dominante em todas as amostras de peixes, moluscos e crustáceos analisados. As cepas selecionadas neste estudo produziram várias enzimas hidrolíticas, como amilase (100%), caseinase (100%), lecitinase (12/34: 35,29%) e DNase (24/34: 70,58%). A maioria das cepas era beta-hemolítica (24/34: 70,58%). Todos esses dados estão resumidos na Tabela 1. Usando a técnica de Cristal Violeta, todas as cepas foram interpretadas como bactérias não formadoras de biofilme em placa de microtitulação de 96 poços de poliestireno com fundo em U, pois as densidades ópticas estimadas a 595 nm foram menores que 1. Todas as cepas testadas cresceram em meio de ágar Vermelho Congo (Figura 1), produzindo cinco morfotipos com diferentes cores (vermelho, vermelho-rosado, vinho, colônias rosa com escurecimento no centro, preto). Entre as cepas isoladas, três A. hydrophila e uma S. lentus (11,76%) foram produtoras de limo, caracterizadas por colônias pretas, e as 31 cepas restantes foram não produtoras de limo.
2.2. Composição Química dos Óleos Essenciais
A análise por GC/MS permitiu a identificação de 29, 24 e 60 componentes nos óleos essenciais de louro, endro e gengibre, respectivamente. O óleo essencial de louro é rico em hidrocarbonetos monoterpênicos (26,9%) e monoterpenos oxigenados (64,8%). Os principais constituintes deste óleo foram 1,8-cineol (56%), acetato de α-terpinila (9,0%), 4-terpineol (5,2%), metileugenol (3,6%), sabineno (3,5%) e α-pineno (3,2%). Carvona (27%), piperitona (25,7%), limoneno (20,6%), apiol de endro (8%), trans-diidrocarvona (4,9%) e cânfora (4,4%) foram os componentes-chave no óleo essencial de endro. Monoterpenos hidrocarbonetos (32%), monoterpenos oxigenados (31%) e sesquiterpenos hidrocarbonetos (22,2%) foram as principais classes químicas no óleo essencial de gengibre. Este óleo é bastante rico em canfeno (11,5%), β-felandreno (10,7%), 1,8-cineol (10,4%), α-zingibereno (6,9%), borneol (6,4%), ar-curcumeno (4,6%) e sesquifelandreno (4,1%). As composições quali-quantitativas dos três óleos são apresentadas na Tabela 2.
2.3. Atividades Antioxidantes
A avaliação da atividade antioxidante por um único método subestima o potencial antioxidante de um extrato ou molécula e reflete apenas a capacidade de inibir uma classe precisa de oxidantes presentes. A combinação de diferentes ensaios complementares pode fornecer uma ideia mais clara da atividade antioxidante. Para isso, avaliamos neste estudo a atividade antioxidante dos três óleos essenciais utilizando quatro testes antioxidantes (ensaio DPPH, poder redutor férrico, capacidade de inibir o branqueamento do β-caroteno e de neutralizar o ânion superóxido). Os resultados são apresentados na Tabela 3.
O ensaio DPPH é considerado um ensaio válido e fácil para avaliar a atividade de sequestro de radicais de antioxidantes, uma vez que o composto radical é estável e não precisa ser gerado como em outros ensaios de sequestro de radicais. Os efeitos de sequestro sobre o radical DPPH expressos como valores de IC50 foram mais altos para o óleo essencial de L. nobilis (135 µg/mL), seguido pelos óleos essenciais de Z. officinalis (470 µg/mL) e A. graveolens (3000 µg/mL), mostrando uma atividade de sequestro de radicais claramente menos importante do que o controle positivo BHT (IC50 11,5 µg/mL).
A inibição do branqueamento do β-caroteno é outro tipo de ensaio antioxidante associado à peroxidação lipídica. Em um sistema baseado em emulsão óleo-água, o ácido linoleico sofre oxidação induzida termicamente, produzindo assim radicais livres que atacam o cromóforo do β-caroteno resultando em um efeito de branqueamento. O valor de IC50 registrado no ensaio de branqueamento do β-caroteno foi menor para o óleo essencial de Z. officinalis (1900 mg/mL), seguido pelos óleos essenciais de L. nobilis (3600 mg/mL) e A. graveolens (3000 mg/mL). Com relação ao ensaio do ânion radical superóxido, nossos resultados indicaram uma alta capacidade de sequestro para o óleo essencial de gengibre (IC50 320 µg/mL) em comparação com os óleos essenciais de louro e endro, embora menor do que o padrão, BHT (IC50 1,5 µg/mL).
Conforme mostrado na Tabela 3, o poder redutor dos três óleos essenciais, expresso como EC50, foi claramente menos importante do que o do controle positivo, ácido ascórbico (37,3 µg/mL), e a maior atividade foi registrada para o óleo essencial de L. nobilis (1850 mg/mL), seguido pelo óleo essencial de Z. officinalis (1900 mg/mL) e A. graveolens (1900 mg/mL).
2.4. Atividades Antibacterianas
As atividades antimicrobianas dos três óleos essenciais contra os microrganismos isolados de produtos de frutos do mar foram avaliadas qualitativa e quantitativamente pela presença ou ausência do diâmetro do halo de inibição, valores de CIM e CBM. Os resultados foram apresentados na Tabela 4.
Com base nas médias observadas comparadas usando os testes de Duncan de amplitude múltipla para médias, três grupos foram observados e o óleo essencial de L. nobilis apresentou a maior atividade, independentemente da bactéria testada (média = 14,25 mm), seguido pelos óleos essenciais de A. graveolens (média = 12,31 mm) e Z. officinale (média = 11,36 mm). Os resultados mostraram que os três óleos essenciais tiveram atividade antimicrobiana substancial contra as 34 bactérias testadas em comparação com os resultados obtidos com os compostos padrão eritromicina e canamicina. De fato, os dados obtidos em termos de zonas de inibição do crescimento (mm) em ágar Mueller-Hinton demonstraram que o óleo essencial de Z. officinale produziu os maiores diâmetros de inibição do crescimento (entre 6–22,33 mm). Este óleo foi ativo contra todas as bactérias Gram-negativas, especialmente A. hydrophila com um diâmetro de inibição variando de 10,33 a 22,33 mm e o Gram-negativo Staphylococcus spp. com um diâmetro de inibição variando de 6 a 15,33 mm. O maior diâmetro de inibição (cerca de 25,33 mm) foi obtido quando o óleo essencial de A. graveolens foi testado contra A. hydrophila (R5) isolada do mexilhão azul Mytilus galloprovincialis.
Os valores de CIM e CBM indicam que os óleos essenciais testados foram ativos contra cepas de A. hydrophila, Enterococcus spp., Klebsiella spp., Staphylococcus spp., S. odorifera e V. alginolyticus, com baixos valores de CIM variando de 0,05 a 0,39 mg/mL, enquanto altas concentrações de óleos essenciais foram necessárias para inibir o crescimento de quase todas as bactérias isoladas. Os menores valores de CBM foram obtidos com o óleo de louro e as concentrações necessárias para inibir o crescimento das cepas de A. hydrophila variaram de 6,25 a 50 mg/mL.
3. Discussão
3.1. Identificação e Caracterização dos Isolados
Os resultados da identificação das cepas bacterianas isoladas de peixes e mariscos amostrados obtidos neste estudo concordam com aqueles previamente relatados por Boulares e colaboradores, que descreveram Pseudomonas fluorescens, P. putida, A. hydrophila e Photobacterium damselae como as espécies psicrófilas dominantes isoladas de peixes selvagens e cultivados na Tunísia. De fato, a maioria das cepas psicrófilas isoladas foi capaz de produzir várias exoenzimas (gelatinase, protease, lipase e lecitinase). Além disso, vários trabalhos relataram o isolamento de cepas de Vibrio spp. e A. hydrophila de peixes cultivados (D. labrax, S. aurata) e moluscos (M. galloprovincialis, Tapes decussatus e Crassostrea virginica) capazes de produzir várias exoenzimas e multirresistentes a vários antibióticos. Recentemente, Saidi e colaboradores utilizaram as galerias API 20 NE para identificar cepas de A. hydrophila de biótopos aquáticos tunisianos e de peixes ornamentais, as quais foram capazes de produzir várias exoenzimas, incluindo lipase, caseinase, amilase, proteases e lecitinase. Além disso, outros, Khouadja e colegas, relataram o isolamento de P. damselae subsp. damselae de diferentes surtos que afetaram S. aurata e D. labrax cultivados. Os moluscos lamelibrânquios comestíveis são frequentemente a causa de surtos muito graves de intoxicação alimentar devido à presença de várias bactérias patogênicas, como os dois contaminantes fecais E. coli e Salmonella sp., e especialmente membros da família Vibrionaceae.
As espécies de Staphylococcus spp. também são uma das bactérias oportunistas de origem alimentar mais importantes isoladas de amostras de peixe, e a alta população dessas bactérias indica a qualidade geral do peixe. No presente trabalho, a maioria das cepas de Staphylococcus spp. isoladas (S. saprophyticus, S. epidermidis, S. hyicus, S. aureus e S. intermedius) foi previamente relatada como as principais bactérias isoladas da pele, músculo e órgãos internos de peixes Cyprinus carpio e Silurus glanis.
Em trabalhos anteriores, relatamos o isolamento e a caracterização de cepas de Vibrio spp. capazes de utilizar o muco de peixes como única fonte de carbono e de produzir biofilme em várias superfícies abióticas. Essas propriedades podem permitir que persistam no biótopo aquático em estado planctônico de vida livre ou aderidas a superfícies bióticas e abióticas. Sechi e colaboradores estudaram as propriedades de virulência de Aeromonas spp. isoladas de águas costeiras e fontes clínicas na Sardenha (Itália) e relataram uma alta capacidade de adesão entre cepas isoladas de pacientes com diarreia. De fato, 35,3% das A. hydrophila ambientais testadas foram positivas no teste de limo, caracterizadas por colônias negras. Saidi e colaboradores estudaram as propriedades adesivas de cepas de A. hydrophila isoladas de peixes ornamentais e relataram que a maioria das cepas era capaz de aderir ao muco da pele e a células (Hep-2 e Caco-2). Além disso, em ágar Vermelho Congo, apenas 65% das cepas de A. hydrophila produziram limo, 65% das cepas foram capazes de formar biofilme em tubo de vidro com cristal violeta e 85% com safranina. A maioria das cepas de A. hydrophila (95%) foi adesiva ao poliestireno com altos valores de densidade óptica. Mais recentemente, Thenmozhi e colaboradores relataram que 76,2% das cepas de A. hydrophila isoladas de peixes carpa produziram colônias pigmentadas (pretas) em placas de ágar Vermelho Congo. Para a espécie V. alginolyticus, caracterizamos vários morfotipos com diferentes cores (vermelho, rosa-avermelhado, preto) isolados de S. aurata, D. labrax e de biótopos aquáticos. As cepas também foram capazes de formar biofilme em várias superfícies abióticas, incluindo aquelas comumente usadas em instalações de aquicultura de peixes (vidro, poliestireno, polietileno e policloreto de vinila). Ben Abdallah e colaboradores relataram que o patógeno transmitido por alimentos V. alginolyticus isolado de órgãos internos de dourada (S. aurata) e robalo (D. labrax) doentes cultivados em aquicultura produziu colônias brancas em placa de CRA. Para a espécie Staphylococcus spp., atenção especial foi focada no S. aureus clínico. Poucos estudos relataram as propriedades de virulência, incluindo a formação de biofilme, por cepas de estafilococos coagulase-negativos isoladas de produtos do mar. Vázquez-Sánchez e colaboradores relataram o isolamento de cepas de S. aureus de frutos do mar comercializados na Galícia (Noroeste da Espanha) capazes de desenvolver biofilmes em superfícies de processamento de alimentos.
3.2. Composição Química dos Óleos Essenciais
O quimiotipo estudado do óleo essencial de louro colhido da Tunísia foi semelhante aos observados anteriormente em Marrocos, Turquia, Argélia e Tunísia, Argentina e Itália, com alto teor de 1,8-cineol. De fato, nossos resultados concordam com os relatados por Marzouki e colaboradores para o óleo essencial de louro da Tunísia e Argélia, que apresentaram como componentes principais 1,8-cineol, linalol, acetato de α-terpinila, eugenol metílico, sabineno e (E)-cariofileno. Recentemente, Ben Jemâa e colaboradores relataram que 1,8-cineol, linalol e isovaleraldeído foram os constituintes comuns no óleo essencial de louro argelino, marroquino e tunisiano. Essas variações nos principais constituintes relatados na literatura podem ser explicadas pela influência de fatores ambientais e metodológicos. Além disso, para o óleo essencial de endro, nossos resultados concordam com os relatados por Peerakam e colaboradores, que constataram que hidrocarbonetos monoterpênicos (38,83%), monoterpenos oxigenados (38,83%) e éteres aromáticos (16,67%) foram os principais grupos de componentes no óleo essencial de sementes de A. graveolens da Tailândia. Este óleo era particularmente rico em d-carvona (32,94%), carvona (20,73%), apiol de endro (19,64%) e limoneno (18,08%). Óleos essenciais de outros países são relatados como possuindo um padrão químico semelhante, mas com diferenças na quantidade relativa de compostos químicos no OE. De fato, carvona (45,9%–75,2%) e limoneno (18,4%–21,6%) foram descritos como componentes principais no óleo essencial de endro da Romênia e Estônia e da Bulgária. Bailer e colaboradores indicaram carvona e limoneno como os principais constituintes dos óleos de sementes de endro, e α-felandreno é o principal constituinte do óleo de erva de endro. As diferenças nos perfis químicos também podem ser atribuídas ao cultivo da planta, estágio de crescimento, condições climáticas, cultivar, densidade de plantio, aplicação de nutrientes, métodos de extração.
Na literatura, muitas variações foram encontradas na composição química do óleo de rizoma de gengibre. De fato, o curcumeno foi relatado como o principal constituinte nos rizomas de gengibre fresco, enquanto Menut e colaboradores identificaram o citral como o principal constituinte do óleo de gengibre. Além disso, geranial (25,9%), α-zingibereno (9,5%), (E,E)-α-farneseno (7,6%), neral (7,6%) e ar-curcumeno (6,6%) foram identificados como os principais componentes no óleo essencial dos rizomas de Gorakhpur, Índia, com o α-zingibereno como principal componente. Sivasothy e colegas estudaram a composição química dos óleos essenciais de Z. officinale var. rubrum Theilade e relataram o isolamento de 54 componentes dos rizomas e 46 das folhas. O óleo essencial das folhas era particularmente rico em β-cariofileno (31,7%), enquanto canfeno (14,5%), geranial (14,3%) e acetato de geranila (13,7%) foram os três compostos dominantes no óleo do rizoma. Yeh e colaboradores identificaram os componentes bioativos de duas variedades de rizomas de gengibre (GG: Guangdong-gengibre e CG: Chu-gengibre) de Mingjian (Taiwan) e relataram que gingeróis, shogaol e curcumina são os principais compostos. As duas variedades exibiram perfis voláteis semelhantes, e 60 e 65 compostos foram identificados para GG e CG, respectivamente. Monoterpenoides, sesquiterpenoides e aldeídos foram as principais classes de compostos nos dois óleos essenciais. Além disso, oito componentes principais foram identificados como canfeno (6,27% e 9,14%), sabineno (8,16% e 10,67%), α-curcumeno (8,42% e 6,66%), zingibereno (20,85% e 17,55%), α-farneseno (7,42% e 4,77%), β-sesquifelandreno (8,13% e 7,32%), neral (8% e 6,74%) e geranial (8,7% e 7,2%) para GG e CG, respectivamente. As diferenças nos perfis químicos podem ser devidas a fatores ambientais, de desenvolvimento e genéticos, condições de produção, variedade, cultivares ou população e fatores climáticos e de solo.
3.3. Atividades Antioxidantes
Nossos resultados mostraram que o óleo essencial de louro possui atividade antioxidante eficaz usando as técnicas de DPPH e branqueamento do β-caroteno, o que pode ser atribuído à presença de compostos fenólicos. Cherrat e colaboradores relataram que um óleo essencial de louro marroquino possuía atividade de sequestro de DPPH eficaz em baixas concentrações (1,25 µL/mL), forte potencial redutor que aumenta com o aumento das concentrações (na faixa de 2,5–10 µL/mL) e também foi capaz de inibir a oxidação do ácido linoleico, atingindo uma inibição de 53,3% em 1,25 µL/mL e 90,7% em 10 µL/mL. Recentemente, Basak e colaboradores relataram que um óleo essencial de louro turco possuía atividades de sequestro de DPPH, hidroxila, radical superóxido e peróxido de hidrogênio maiores do que os controles (curcumina, ácido ascórbico, BHT).
Muitos pesquisadores relataram as atividades antioxidantes dos óleos essenciais de endro. De fato, Peerakam e colaboradores mostraram que o óleo essencial de endro da Tailândia possuía alto teor de fenólicos totais (4,5746 mg EAG/mL) e maiores atividades antioxidantes nos ensaios DPPH, seguido por ABTS e FRAP (capacidade antioxidante equivalente ao Trolox = 52,5391 mg/mL, 1,5936 mg/mL, 0,5469 mg/mL; respectivamente). Essas atividades podem ser atribuídas ao alto teor de hidrocarbonetos monoterpênicos e monoterpenos oxigenados no óleo essencial. Além disso, o gengibre é uma das ervas mais amplamente utilizadas que contém vários constituintes bioativos interessantes e possui propriedades promotoras de saúde. Resultados anteriores mostraram as atividades antioxidantes do óleo essencial de gengibre e seus componentes bioativos. De fato, Rehman e colaboradores descobriram que o óleo essencial de gengibre possui boa estabilidade térmica e exibiu 85,2% de inibição da peroxidação do ácido linoleico quando aquecido a 185 °C por 120 min, e capacidade de sequestro de ABTS (989,7 ± 44,2 µmol·trolox/g). Portanto, o uso do óleo essencial de gengibre é recomendado como um antioxidante natural para suprimir a oxidação lipídica em alimentos processados.
Tais atividades antioxidantes podem inibir de várias maneiras a interação dos radicais livres na forma de ROS ou NOS com várias biomoléculas (proteínas, aminoácidos, lipídios e DNA) e levar à diminuição da morte e danos celulares.
3.4. Atividades Antibacterianas
Resultados anteriores relataram a eficácia dos óleos essenciais de louro, endro e gengibre de diferentes origens contra um amplo painel de bactérias patogênicas e deteriorantes de alimentos testadas, Gram positivas e Gram negativas. De fato, o óleo essencial de louro foi ativo contra S. aureus, S. epidermidis, E. faecalis e P. aeruginosa, S. aureus, S. intermedius e K. pneumoniae, E. coli O157:H7, L. monocytogenes e S. Typhimurium. Foi demonstrado que o óleo de endro exibiu atividade antimicrobiana contra cepas de S. aureus, E. coli, C. albicans e A. flavus com um diâmetro de inibição variando de 16 a 30 mm. De fato, Lopez e colaboradores relataram a atividade antimicrobiana do óleo essencial de endro contra cepas bacterianas e fúngicas transmitidas por alimentos, incluindo quatro bactérias Gram positivas (S. aureus, B. cereus, E. faecalis e L. monocytogenes), quatro bactérias Gram negativas (E. coli, Y. enterocolitica, S. choleraesuis e P. aeruginosa) e três fungos (uma levedura, C. albicans, e dois bolores, P. islandicum e A. flavus). Em muitas amostras de gengibre, vários compostos bioativos (gingeróis e shogaóis) com atividade antibacteriana foram encontrados. O óleo essencial de gengibre possui efeitos inibitórios contra S. aureus, L. monocytogenes, P. aeruginosa, S. Typhimurium, Shigella flexineri e E. coli, com um diâmetro de zona de inibição variando de 1,16 a 8,66 mm.
Usando o esquema proposto para a classificação dos óleos essenciais por Aligiannis e colaboradores (atividade forte para valores de CIM entre 0,05–0,5 mg/mL, atividade moderada para valores de CIM entre 0,6–1,5 mg/mL e atividade fraca acima de 1,5 mg/mL), parece que os três óleos essenciais testados apresentaram atividade forte contra os diferentes microrganismos testados, uma vez que os valores de CIM para todos os óleos voláteis variaram de 0,05 a 0,2 mg/mL para os óleos de gengibre e louro e de 0,05 a 0,39 mg/mL para o óleo de endro. Nos ensaios CIM/CBM, o óleo essencial de louro apresentou atividade forte a moderada (CIM ≤ 5 mg·mL⁻¹) contra Lactobacillus plantarum, L. monocytogenes, E. faecalis, B. cereus, B. subtilis, E. coli, S. Typhimurium, P. vulgaris, E. aerogenes, P. aeruginosa e Y. enterocolitica, exceto para S. aureus. Em 2008, Erkmen e Özcan avaliaram a atividade antimicrobiana de um óleo essencial de louro, contendo aproximadamente 60% de 1,8-cineol e apenas traços de linalol, e relataram um CIM de 0,02% e efeito bactericida a 0,2% contra S. aureus, E. faecalis e L. monocytogenes. O CIM e a CB (concentração bactericida) foram de 0,2% e 1,0% contra B. cereus e B. subtilis, respectivamente. Os mesmos autores relataram que este óleo foi ineficaz contra E. coli e S. Typhimurium, enquanto bactericida contra Y. enterocolitica a 2,5%. Para o óleo de louro tunisiano, Bouzouita e colegas relataram que o óleo de louro (42,3% de 1,8-cineol, 25% de linalol e 11,2% de α-terpinil acetato) exibiu atividades antimicrobianas contra E. coli com uma concentração celular final variando de 1011 a < 102 UFC/mL a 2,5% (v/v). Recentemente, Merghni e coautores relataram que óleos essenciais de louro tunisiano colhidos na localidade de Sousse (Centro da Tunísia) exibiram graus variados de atividades contra estafilococos orais com valores de CIM variando de 3,91 a 62,50 mg/mL.
Para o óleo de Z. officinale, Hamad e colegas relataram que os valores de CIM do óleo de gengibre indonésio avaliados pelo método de diluição em caldo contra bactérias de origem alimentar B. subtilis, E. coli, S. aureus, S. Typhimurium e V. cholerae variaram de 0,5 a 1 mg/mL. Recentemente, Sivasothy e colegas relataram que tanto os óleos essenciais de folha quanto de rizoma de Z. officinale var. rubrum Theilade foram moderadamente ativos contra as bactérias Gram-positivas Bacillus licheniformis, B. spizizenii e S. aureus, e as bactérias Gram-negativas E. coli, K. pneumoniae e P. stutzeri, com valores de CIM variando de 0,16–0,63 mg/mL. Também foi relatado que compostos como α-pineno, α-terpineol e geraniol, presentes em baixas concentrações no óleo essencial de gengibre, afetaram a eficiência geral da atividade antibacteriana do óleo, indicando um efeito sinérgico de todos os componentes. Usando o método de incorporação, Bellik e coautores relataram que os valores de CIM do óleo essencial de gengibre variaram de 8,69 mg/mL para S. aureus, 86,92 mg/mL para B. subtilis e 173,84 mg/mL para cepas de E. coli.
O óleo essencial de endro também foi ativo contra as cepas de S. aureus, E. coli, C. albicans e A. flavus, com valores de CIM variando de 5,99 a 59,47 mg/mL. Além disso, Peerakam e colaboradores constataram que o óleo essencial das partes aéreas de A. graveolens apresentou forte inibição na concentração mais baixa (2,66 µg/mL) contra S. aureus e (85,77 µg/mL) contra E. coli. Pesquisas anteriores explicaram a atividade antimicrobiana do óleo essencial de endro pela presença de componentes, como d-carvona e limoneno, caracterizados por uma forte atividade antifúngica. De fato, Ruangamnart e colaboradores relataram que d-limoneno e d-carvona exibiram atividade antibacteriana contra S. aureus resistente à meticilina ATCC 43300 (MRSA) com valores de CIM de 0,3125 e 1,25 mg/mL, respectivamente, e valores de CBM de 1,25 e 2,5 mg/mL, respectivamente. As cepas de S. aureus ATCC 25923, S. sobrinus ATCC 33478, B. subtilis ATCC 6633, E. coli ATCC 8739 e S. Typhimurium ATCC 14028 foram mais sensíveis ao d-limoneno do que à d-carvona e aos óleos de endro, com valores de CIM de 1,25–5 mg/mL e valores de CBM de 1,25-10 mg/mL, enquanto S. aureus ATCC 6538, S. aureus ATCC 29213 e K. pneumoniae ATCC 700603 apresentaram valores de CIM e CBM bastante semelhantes, com intervalo de 5-10 mg/mL tanto para d-limoneno quanto para d-carvona. P. aeruginosa ATCC 27853 e P. aeruginosa ATCC 9027 não foram eliminadas a 10 mg/mL de óleo essencial.
4. Materiais e Métodos
4.1. Amostragem e Isolamento de Cepas
Cepas de origem alimentar, utilizadas neste trabalho, foram isoladas de peixe fresco de aquicultura (D. labrax: robalo, S. aurata: dourada) e de mariscos (Parapenaeus longirostris: camarão-rosa, Mytilus galloprovincialis: mexilhão-azul). Essas amostras foram obtidas de um mercado local (Souk El Blat, Tunísia), acondicionadas em caixas térmicas e transportadas ao laboratório dentro de 2 h para análises. Ao chegar, os peixes foram imediatamente eviscerados, decapitados, lavados e filetados. Os mexilhões foram lavados, esfregados para remover sujeira, abertos com uma faca estéril. Vinte e cinco gramas de carne e líquido do músculo do mexilhão-azul e de cada espécie de peixe foram transferidos assepticamente e diluídos em saco Stomacher, cada um contendo 225 mL de água peptonada alcalina suplementada com 1% de NaCl. A mistura foi homogeneizada por 3 min usando um homogeneizador de laboratório Stomacher, em seguida incubada a 37 °C por 18–24 h. Os enriquecimentos (100 μL) foram então estriados em ágar tiossulfato-citrato-bile-sacarose (ágar TCBS, Tulip Diagnostics. (P) LTD, Verna Industrial Estate, Índia), CHROMagar™ Vibrio e CHROMagar™ S. aureus (CHROMagar Microbiology, Paris, França) e incubados por 18–24 h a 37 °C.
4.2. Identificação e Caracterização Bioquímica das Cepas Bacterianas
As cepas bacterianas que cresceram nas placas de meios seletivos (colônias verdes e amarelas crescendo em placas TCBS, colônias lilás, verde-azuladas/turquesa e brancas de placas CHROMagar™ Vibrio) foram purificadas em placas de ágar triptona de soja suplementado com 1% de NaCl (HiMedia Laboratories Pvt, Ltd., Mumbai, Índia), enquanto as colônias rosa a lilás em meio CHROMagar™ S. aureus foram purificadas em ágar triptona de soja. Todas as colônias puras foram submetidas a testes padrão morfológicos, fisiológicos e bioquímicos em placa e tubo. Um sistema comercial miniaturizado Api 20E e Api 20NE (Bio Mérieux SA, Marcy l’Etoile, França) foi utilizado para identificar todas as cepas isoladas dos meios TCBS e CHROMagar™ Vibrio. As tiras Api Staph (Bio Mérieux) foram utilizadas para identificar as cepas bacterianas isoladas das placas CHROMagar™ S. aureus.
Para a produção de exoenzimas, todas as cepas foram testadas quanto à hemolisina (ágar sangue humano, Pronadisa Laboratories Coda, S.A) e hidrólise de DNA (ágar DNase, Biolife, S.r.l., Milano, Itália). As enzimas amilase, caseinase e lecitinase foram detectadas em meios preparados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementada com 0,5% de peptona de caseína, 5% de leite em pó desnatado e 5% de emulsão de gema de ovo, respectivamente.
4.3. Propriedades Adesivas das Cepas Selecionadas
As propriedades adesivas das cepas selecionadas foram testadas qualitativamente usando a técnica do vermelho Congo e quantitativamente usando a técnica do violeta cristal.
Para o meio de vermelho Congo, foi preparado adicionando 0,8 g/L de vermelho Congo (QualiKems Fine Chem Pvt. Ltd., Nandesari, Vadodara, Índia) e 36 g de sacarose (Labosi, França), ambos previamente autoclavados separadamente, a 1 L de ágar infusão de cérebro e coração (Scharlau Microbiology, Pronadisa, Madrid, Espanha). O corante vermelho Congo foi preparado como uma solução aquosa concentrada e autoclavado separadamente a 121 °C por 15 min e foi adicionado quando o ágar havia resfriado a 55 °C. As placas foram incubadas à temperatura ambiente a 37 °C por 24 h em condições aeróbicas e seguidas durante a noite à temperatura ambiente. Após a incubação, colônias pigmentadas (geralmente de cor preta) foram consideradas como positivas para slime, enquanto bactérias não pigmentadas (formaram colônias lisas, vermelho-rosadas, com um escurecimento no centro) foram interpretadas como cepas negativas para slime.
A capacidade das 34 cepas identificadas de formar biofilme em superfície abiótica foi quantificada utilizando o protocolo descrito por Toledo-Arana e colaboradores. Todas as cepas foram cultivadas durante a noite em Caldo Infusão de Cérebro (BHI-0,25% de glicose a 37 °C). A cultura foi diluída 1:20 em BHI fresco com (0,25%) de glicose a 37 °C. 200 µL desta suspensão foram utilizados para inocular placas de microtitulação estéreis de 96 poços em poliestireno (Nunc, Roskilde, Dinamarca). As placas foram incubadas aerobicamente a 37 °C por 24 h. As culturas foram removidas e os poços da microplaca foram lavados duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4 e 130 mM NaCl a pH 7,4) para remover células não aderentes, e foram secos em posição invertida. As bactérias aderidas foram coradas com violeta de cristal 1% (Merck, Paris, França) por 15 min. Os poços foram enxaguados mais uma vez e o violeta de cristal foi solubilizado em 200 µL de etanol-acetona (80:20 v/v). A densidade óptica (DO595nm) foi medida em espectrofotômetro (Amadèo Bibby, Sterling, França). Os seguintes valores foram atribuídos para determinação de biofilme: não formador de biofilme DO595 = 1; formador de biofilme fraco 1 < DO = 2; formador de biofilme médio 2 < DO = 3; formador de biofilme forte DO595 = 3. Cada ensaio foi realizado em triplicata.
4.4. Material Vegetal, Extração e Caracterização Química do Óleo Essencial
Sementes de A. graveolens e Z. officinale (rizoma) foram adquiridas em um mercado local na Tunísia (Souk El Blat). As folhas de L. nobilis foram coletadas de árvores crescendo silvestres em Grombalia (Tunísia). As plantas foram identificadas pelo Prof. Abderrazak Smaoui e espécimes testemunho estão preservados no Laboratoire de Traitement et Valorisation des Rejets Hydriques (LR 15 CERTE O5, Technopole de Borj-Cédria, Tunísia). Cem gramas de material fresco foram submetidos a hidrodestilação durante três horas utilizando 500 mL de água destilada em um aparelho tipo Clevenger. O óleo obtido foi coletado e seco sobre sulfato de sódio anidro e armazenado em frascos de vidro selados em refrigerador a 4 °C.
As análises por CG/EM foram realizadas com um cromatógrafo a gás CP-3800 (Varian, Palo Alto, CA, EUA) equipado com uma coluna capilar HP-5 (30 m × 0,25 mm; espessura do revestimento 0,25 μm) e um detector de massas do tipo armadilha de íons Varian Saturn 2000. Condições analíticas: temperaturas do injetor e da linha de transferência a 220 e 240 °C, respectivamente; temperatura do forno programada de 60 a 240 °C a 3 °C/min; gás de arraste hélio a 1 mL/min; injeção de 0,2 µL (solução a 10% em hexano); razão de split 1:30. A maioria dos constituintes foi identificada por cromatografia gasosa através da comparação de seus índices de retenção de Kovats (Ri) (determinados em relação ao tR de n-alcanos (C10–C35)), com aqueles da literatura e espectros de massa em ambas as colunas com os de compostos autênticos disponíveis em nossos laboratórios, por meio das bibliotecas NIST 02 e Wiley 275. As concentrações relativas dos componentes foram obtidas por normalização da área dos picos. Nenhum fator de resposta foi calculado.
4.5. Propriedades Antioxidantes
4.5.1. Atividade de Captura do Radical DPPH
A atividade antioxidante dos três óleos essenciais foi medida em termos de capacidade de doação de hidrogênio ou captura de radicais usando o método estável do DPPH. Resumidamente, 0,25 mL de uma solução metanólica de DPPH 0,2 mM foi misturado com 1 mL de extrato de óleo essencial em diferentes concentrações (50 a 2000 µg/mL). A mistura foi deixada por 30 min à temperatura ambiente no escuro. A absorbância da solução resultante foi então lida a 517 nm. A atividade antiradicalar foi expressa como IC50 (µg·mL−1). A capacidade de capturar o radical DPPH foi calculada usando a seguinte Equação (1): onde Ac é a absorbância do controle aos 30 min, e As é a absorbância da amostra ou controle (BHT a 1, 10, 20 e 50 µg/mL) aos 30 min. As concentrações de óleo essencial e BHT (µg/mL) que proporcionam 50% da atividade de captura do radical DPPH (IC50) foram calculadas. Todas as amostras foram analisadas em triplicata.
4.5.2. Atividade de Captura do Ânion Superóxido
A atividade de captura do ânion superóxido foi avaliada usando o método descrito por Duh e colaboradores. A mistura de reação continha 0,2 mL de óleo essencial em diferentes concentrações (200 a 2000 µg/mL), 0,2 mL de solução estoque de PMS 60 mM, 0,2 mL de NADH 677 mM e 0,2 mL de NBT 144 mM, todos em tampão fosfato (0,1 mol/L, pH 7,4). Após incubação à temperatura ambiente por 5 min, a absorbância foi lida a 560 nm contra um branco. A avaliação da atividade antioxidante foi baseada no IC50. O valor do índice IC50 foi definido como a quantidade de antioxidante necessária para reduzir a geração de ânions superóxido em 50%. Os valores de IC50 (três réplicas por tratamento) foram expressos em μg/mL. Assim como para o DPPH, um valor de IC50 menor corresponde a uma maior atividade antioxidante do extrato vegetal. A porcentagem de inibição da geração de ânion superóxido foi calculada usando a seguinte fórmula Equação (2): onde A0 e A1 têm o mesmo significado da Equação (1).
4.5.3. Determinação do Poder Redutor
A capacidade dos óleos essenciais de reduzir Fe³⁺ foi analisada pelo método de Oyaizu. Resumidamente, 1 mL de óleo essencial foi misturado com 2,5 mL de tampão fosfato (0,2 mol/L, pH 6,6) e 2,5 mL de K₃Fe(CN)₆ (1 g/100 mL). Após incubação a 50 °C por 25 min, 2,5 mL de ácido tricloroacético (10 g/100 mL) foram adicionados e a mistura foi centrifugada a 650 × g por 10 min. Finalmente, 2,5 mL da camada superior foram misturados com 2,5 mL de água destilada e 0,5 mL de FeCl₃ aquoso (0,1 g/100 mL). A absorbância foi medida a 700 nm. As médias dos valores de absorbância foram plotadas contra a concentração e uma análise de regressão linear foi realizada. O aumento da absorbância da mistura de reação indicou aumento do poder redutor. O valor de EC50 (mg·mL−1) é a concentração efetiva na qual a absorbância foi 0,5 para o poder redutor. O ácido ascórbico foi usado como controle positivo.
4.5.4. Sistema Modelo de Ácido β‑Caroteno‑linoleico
A atividade antiperoxil foi avaliada medindo os peróxidos gerados durante a oxidação do ácido linoleico em alta temperatura, de acordo com o método de Hajlaoui e colaboradores, com algumas modificações. Brevemente, 0,2 mg de β-caroteno foram dissolvidos em 2 mL de clorofórmio, e adicionados com 20 mg de ácido linoleico e 200 mg de Tween 40. Após remover o CHCl3 sob vácuo, foi adicionada água oxigenada (100 mL), e o frasco foi vigorosamente agitado até que todo o material se dissolvesse. A emulsão obtida foi preparada imediatamente antes de cada experimento. Uma alíquota de 150 μL da emulsão foi distribuída em cada um dos poços de microplacas de 96 poços e 10 mg do OE ou da solução padrão de BHA foram adicionados. Uma quantidade igual de emulsão foi usada para a amostra em branco. A microplaca foi incubada a 45 °C e as absorbâncias foram medidas a 490 nm usando um leitor de cinética de microplacas visível/UV (EL × 808, Bio-Tek instruments, Winooski, VT, EUA). As leituras de todas as amostras foram realizadas imediatamente (t = 0 min) e após 120 min de incubação. A atividade antioxidante (AA) dos extratos foi avaliada em termos do branqueamento do β-caroteno usando a seguinte fórmula Equação (3): onde A0 é a absorbância do controle em 0 min, e At é a absorbância da amostra em 120 min. Os resultados são expressos como valores de IC50 (μg/mL).
4.6. Atividades Antimicrobianas
4.6.1. Microrganismos
Trinta e quatro cepas isoladas de peixes frescos de aquicultura (D. labrax: robalo, S. aurata: dourada) e mariscos (P. longirostris: camarão-rosa, M. galloprovincialis: mexilhão-azul) foram selecionadas para testar as atividades antibacterianas in vitro dos três óleos essenciais.
4.6.2. Ensaio de Difusão em Disco
O teste de atividade antimicrobiana foi realizado de acordo com o protocolo descrito por Snoussi e colaboradores. Para os experimentos, uma alçada do estoque de trabalho do microrganismo foi enriquecida em um tubo contendo 9 mL de caldo de enriquecimento (MH) e então incubada a 37 °C por 18–24 h. As culturas overnight foram usadas para a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais utilizados neste estudo e a densidade óptica foi ajustada para 0,1 de turbidez padrão (DO600nm). Os inóculos foram estriados em placas de ágar MH (NaCl 1%) usando um swab estéril. Discos de filtro estéreis (diâmetro de 6 mm, Biolife, Milano, Itália) foram impregnados com 10 mg de óleo essencial. Eritromicina e canamicina foram usadas como controles positivos para todas as cepas bacterianas testadas. A suscetibilidade aos antibióticos foi determinada usando o método de Kirby-Bauer. As placas foram incubadas a 37 °C por 18–24 h. O diâmetro das zonas de inibição ao redor de cada um dos discos foi considerado como medida da atividade antimicrobiana.
4.6.3. Método de Microdiluição para Determinação das CIMs e CBMs
Os valores da concentração inibitória mínima (CIM) e da concentração bactericida mínima (CBM) foram determinados para todas as bactérias testadas neste estudo utilizando o ensaio de microdiluição. Os inóculos das cepas bacterianas foram preparados a partir de culturas overnight e suspensões e ajustados para a turbidez padrão de 0,5 McF. Os óleos essenciais, dissolvidos em dimetilsulfóxido a 5% (DMSO 5%), foram primeiro diluídos até a concentração mais alta a ser testada (100 mg/mL). Em seguida, diluições seriadas duplas foram feitas em uma faixa de concentrações de 50 a 0,05 mg/mL nas placas de 96 poços, preparadas dispensando 100 µL de alíquota das soluções estoque de cada óleo essencial adicionados a 95 µL do caldo correspondente no primeiro poço. Depois, 100 µL das diluições seriadas foram transferidos para 10 poços consecutivos. Finalmente, 5 µL do inóculo de cada microrganismo foi adicionado aos poços. O último poço contendo 195 µL de caldo nutriente sem óleo essencial e 5 µL do inóculo em cada tira foi usado como controle negativo. O volume final em cada poço foi de 200 µL. As placas foram incubadas a 37 °C por 18–24 h.
4.7. Análise Estatística
Todos os dados dos ensaios de adesão quantitativa foram expressos como Médias ± Desvio Padrão (D.P.). Cada análise foi realizada utilizando o Pacote Estatístico SPSS 16.0 para Windows. As diferenças nas médias foram calculadas usando o teste de múltiplas faixas de Duncan para médias com limite de confiança de 95% (p = 0,05).
- Conclusões
Os três óleos essenciais testados no presente estudo possuem diferentes graus de atividade antibacteriana contra várias espécies bacterianas Gram positivas e Gram negativas isoladas de produtos de peixe e marisco. Parece que o óleo essencial de louro possui a maior atividade antibacteriana contra todas as bactérias testadas. Portanto, eles poderiam potencialmente ser usados como conservantes naturais contra patógenos transmitidos por alimentos, a fim de inibir a oxidação lipídica e retardar o crescimento microbiano em peixes e mariscos. Esses óleos essenciais também podem ser misturados com dietas de peixes para prevenir a multiplicação de bactérias deteriorantes naturais. Em tanques de criação de peixes Sparus aurata ou Dicentrarchus labrax, ou suas presas vivas (culturas de rotíferos), esses óleos essenciais podem reduzir a contagem de bactérias patogênicas como cepas de Vibrio spp.
Além disso, a atividade antioxidante-antirradical registrada pode ser importante para preservar produtos marinhos conhecidos por conterem vários componentes propensos à degradação química. Parece que o óleo essencial de louro foi o mais eficaz em comparação com os óleos de endro e gengibre. Portanto, este óleo pode ser usado para prolongar a vida útil de frutos do mar devido aos seus efeitos protetores contra a deterioração microbiológica e química, prevenindo assim sabores estranhos e a formação de todos os agentes tóxicos mencionados acima.
Mais experimentos devem ser realizados para confirmar a viabilidade do uso comercial desses óleos essenciais, e especialmente o óleo volátil de louro, se usado para prevenir a multiplicação da flora natural de deterioração de peixes e mariscos na indústria alimentícia, ou em incubadoras de peixes para controlar a multiplicação de bactérias patogênicas como membros das famílias Vibrionaceae e Aeromonadaceae em culturas de presas vivas (Artemia salina e Brachionus plicatilis) e tanques de criação de peixes.
Disponibilidade de Amostras: Amostras dos compostos de óleos essenciais estão disponíveis junto aos autores.
Contribuições dos Autores
Snuossi, M. projetou o trabalho experimental e realizou os ensaios microbiológicos com a colaboração de Trabelsi, N., Dehmeni, A. e Ben Taleb, S. As análises químicas e a discussão dos dados obtidos foram realizadas por Flamini, G. e De Feo, V. Todos os autores colaboraram na redação do manuscrito.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesse.
Referências
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Composição do óleo essencial, propriedades antimicrobianas e antioxidantes de Mosla chinensis Maxim
Voláteis de Aroma, Propriedades Antibacterianas, Antifúngicas e Antioxidantes de Óleos Essenciais Obtidos de Algumas Especiarias Amplamente Consumidas no Egito
Comparação de métodos para avaliação da capacidade antioxidante e compostos fenólicos em especiarias comuns
Atividade antioxidante do óleo essencial e oleorresina de Zingiber officinale Roscoe influenciada pelo ambiente químico
Atividade antioxidante do extrato de gengibre em óleo de girassol
Especiarias e ervas: Fontes naturais de antioxidantes—Uma mini revisão
Avaliação in vitro das atividades antibacteriana e antioxidante do óleo essencial e extrato metanólico de Zataria multiflora Boiss endêmica
Composições químicas e efeitos antibacterianos dos óleos essenciais de orégano turco (Origanum minutiflorum), louro (Laurus nobilis), lavanda espanhola (Lavandula stoechas L.) e funcho (Foeniculum vulgare) sobre patógenos alimentares comuns
Atividades antimicrobianas em fase sólida e vapor de seis óleos essenciais: suscetibilidade de cepas bacterianas e fúngicas alimentares selecionadas
Constituintes químicos, investigações antimicrobianas e potenciais antioxidantes do óleo essencial e extrato acetônico de Anethum graveolens L.: Parte 52
Efeito antibacteriano de dentes de Allium sativum e rizomas de Zingiber officinale contra patógenos clínicos multirresistentes
Avaliação antibacteriana in vitro de extratos de Zingiber officinale, Curcuma longa e Alpinia galanga como conservantes naturais de alimentos
Extratos de CO2 supercrítico e óleo essencial de gengibre (Zingiber officinale R). Composição química e atividade antibacteriana
Composição química e atividade antimicrobiana de óleos essenciais de ervas selecionadas cultivadas no Sul do Brasil contra deterioração de alimentos e patógenos alimentares
Efeitos antimicrobianos de própolis, pólen e louro turcos sobre microrganismos deteriorantes e patogênicos relacionados a alimentos
Atividade antimicrobiana de óleos essenciais de plantas aromáticas tunisianas
Constituintes químicos e atividades antibacterianas do extrato bruto e óleos essenciais de Alpinia galanga e Zingiber officinale
Composição e atividade antimicrobiana do óleo essencial de duas espécies de Origanum
Composições químicas e atividade antibacteriana do óleo essencial de frutos de endro (Anethum graveolens L.) cultivados na Tailândia
Estudo quantitativo, identificação e sensibilidade a antibióticos de algumas Vibrionaceae associadas a um incubatório de peixes marinhos
A proteína de superfície enterocócica, Esp, está envolvida na formação de biofilme por Enterococcus faecalis
Índices de retenção cromatográfica a gás de monoterpenos e sesquiterpenos em fases de silicone metílico e Carbowax 20M
Modelos práticos de índice de retenção de OV-101, DB-1, DB-5 e DB-Wax para compostos de sabor e fragrância
Dois novos flavonoides e outros constituintes na raiz de alcaçuz: Suas adstringência relativa e efeitos de eliminação de radicais
Atividade antioxidante do extrato aquoso de HarngJyur (Chrysanthemum morifolium Ramat)
Estudos sobre o produto da reação de escurecimento preparado a partir de glicose amina
Composição química e atividades biológicas do óleo essencial de Cuminum cyminum L. da Tunísia: Alta eficácia contra cepas de Vibrio spp.
Atividade anti-Vibrio spp. in vitro e composição química de algumas plantas aromáticas tunisianas
Teste de susceptibilidade a antibióticos por um método padronizado de disco único
Morfotipos obtidos em ágar vermelho Congo com base na escala colorimétrica: (b): colônias pretas; (B): colônias bordô; (rb): colônias vermelhas com escurecimento no centro; (pr): colônias rosas com centro vermelho; (P): colônias rosas; (r): colônias vermelhas.
Biotipos obtidos em tiras Api, perfil de exoenzimas e propriedades adesivas das 34 cepas isoladas de produtos de peixe e marisco. (−): Negativo; (+): Positivo.
Amostras Código Identificação Biotipo no Api % id Perfil de Exoenzimas Propriedades Adesivas Hemólise Caseinase DNase Amilase Lecitinase Slime (CRA) DO595 ± DP P. longirostris R58 Klebsiella oxytoca 5245573 93,6 γ + − + − Vermelho 0,28 ± 0,02 R44 Aeromonas hydrophila 7772755 98,2 γ + + + + Preto 0,26 ± 0,06 R63 Vibrio alginolyticus 7650745 82,2 + + + − Rosa 0,21 ± 0,02 R72 Aeromonas hydrophila 5652355 88,2 + + + − Bordô 0,41 ± 0,03 R32 Staphylococcus lugdunensis 6314150 42,6 + + + − Rosa 0,21 ± 0,09 R53 Staphylococcus sciuri 6314050 72,5 + + + − Rosa 0,19 ± 0,01 R30 Staphylococcus lentus 6731771 99,6 + + + − Preto 0,31 ± 0,04 R64 Staphylococcus xylosus 6735753 99 + + + − Vermelho 0,18 ± 0,02 D. labrax R14 Aeromonas hydrophila 7576755 83,8 + + + + Bordô 0,27 ± 0,02 R35 Staphylococcus sciuri 6314050 72,5 + + + − Rosa 0,19 ± 0,04 R3 Aeromonas hydrophila 5567745 82 γ + − + − Vermelho 0,22 ± 0,01 R23 Aeromonas hydrophila 5777745 99,5 γ + − + − Rosa 0,21 ± 0,02 R2 Staphylococcus sciuri 6334070 99 + + + − Vermelho 0,28 ± 0,12 R71 Aeromonas hydrophila 7535755 99,9 + + + + Rosa 0,15 ± 0,01 R16 Enterobacter cloacae 5245573 38,4 γ + − + − Rosa 0,26 ± 0,05 M. galloprovincialis R5 Aeromonas hydrophila 7577754 99,9 + − + + Bordô 0,18 ± 0,04 R29 Aeromonas hydrophila 7577776 99,9 + + + − Vermelho 0,19 ± 0,03 R70 Aeromonas hydrophila 7577755 99,3 + − + + Bordô 0,36 ± 0,09 R47 Aeromonas hydrophila 7573744 99,8 + + + + Bordô 0,20 ± 0,01 R22 Aeromonas hydrophila 5677254 99,2 + + + − Preto 0,20 ± 0,01 R13 Aeromonas hydrophila 7477754 99,9 + + + − Preto 0,26 ± 0,01 S. aurata R46 Aeromonas hydrophila 7777757 99,9 γ + − + − Rosa 0,19 ± 0,02 R11 Aeromonas hydrophila 7777757 99,9 + + + + Vermelho 0,16 ± 0,01 R68 Enterobacter cloacae 5245573 38,4 γ + − + − Rosa 0,13 ± 0,01 R40 Staphylococcus sciuri 6314050 72,5 + + + − Vermelho 0,22 ± 0,05 R9 Klebsiella ornithinolytica 5345573 91 γ + + + + Rosa 0,19 ± 0,01 R4 Aeromonas hydrophila 7537745 99,6 + − + + Vermelho 0,25 ± 0,10 R36 Staphylococcus sciuri 6314050 72,5 + + + − Rosa 0,27 ± 0,04 R48 Aeromonas hydrophila 7577755 99,9 + + + + Bordô 0,20 ± 0,01 R37 Staphylococcus sciuri 6314050 72,5 + + + − Rosa 0,22 ± 0,05 R18 Aeromonas hydrophila 7477777 78,1 + + + + Rosa 0,19 ± 0,03 R55 Aeromonas hydrophila 7777744 99,6 + + + + Preto 0,30 ± 0,02 R69 Serratia odorifera 7347573 95,2 γ + + + − Vermelho 0,37 ± 0,03 R1 Staphylococcus lugdunensis 6314150 42,6 + − + − Vermelho 0,18 ± 0,03
Composição dos óleos essenciais de L. nobilis (Ln), A. graveolens (Ag) e Z. officinale (Zo). IR: Índice de Retenção; Tr: Traços (menos de 0,5%).
Constituintes RI Óleos Essenciais Constituintes RI Óleos Essenciais Ln Ag Zo Ln Ag Zo (E)-3-Hexen-1-ol 853 0,3 Aldeído cumínico 1241 0,2 2-Heptanona 891 Tr Neral 1241 27,0 0,5 2-Heptanol 901 0,4 Carvona 1244 25,7 0,3 Tricicleno 928 0,3 Piperitona 1254 α-Tujeno 933 0,2 Tr Geraniol 1256 0,7 α-Pineno 941 3,8 0,8 3,0 Geranial 1269 0,6 Canfeno 955 0,5 0,1 11,5 Felandral 1274 0,4 Sabineno 977 3,5 0,5 Acetato de bornila 1287 0,6 0,9 β-Pineno 982 3,6 0,2 0,2 2-Undecanona 1292 1,0 6-Metil-5-hepten-2-ona 987 1,0 Acetato de α-terpinila 1352 9,0 Mirceno 993 0,3 1,5 1,0 α-Copaeno 1377 0,2 δ-2-Careno 1003 0,6 Acetato de geranila 1383 0,8 α-Felandreno 1006 Tr 1,4 2,0 β-Elemeno 1392 Tr δ-3-Careno 1013 Tr Metil eugenol 1403 3,6 α-Terpineno 1020 0,3 0,1 1,4 β-Cariofileno 1419 Tr p-Cimeno 1027 0,5 0,7 1,2 Alo-aromadendreno 1461 1,1 Limoneno 1032 0,7 20,6 β-Chamigreno 1477 0,4 β-Felandreno 1033 10,7 γ-Curcumeno 1481 1,1 1,8-Cineol 1034 56,0 10,4 ar-Curcumeno 1483 4,6 γ-Terpineno 1063 0,6 0,2 Tr Valenceno 1493 0,4 cis-Sabineno hidratado 1070 0,2 Tr α-Zingibereno 1495 6,9 Óxido de cis-linalol (furanóide) 1077 Tr 0,2 β-Bisaboleno 1509 3,2 Terpinoleno 1090 0,2 0,2 β-Sesquifelandreno 1524 4,1 p-Cimeneno 1091 0,7 Selina-3,7(11)-dieno 1544 0,2 2-Nonanona 1092 0,4 Elemol 1549 0,2 Linalol 1101 3,8 1,9 (E)-Nerolidol 1565 0,5 exo-Fenchol 1118 0,4 Espatulenol 1577 0,4 cis-p-Ment-2-en-1-ol 1123 Tr 0,1 0,3 Óxido de cariofileno 1582 0,3 trans-Pinocarveol 1141 0,3 10-epi-γ-Eudesmol 1622 2,5 trans-p-Ment-2-en-1-ol 1142 0,1 0,2 Apiol de endro 1623 8,0 cis-Verbenol 1142 Tr γ-Eudesmol 1631 0,8 Cânfora 1145 4,4 0,5 β-Eudesmol 1650 0,8 Canfeno hidratado 1150 0,8 α-Eudesmol 1653 0,5 Isoborneol 1158 0,5 α-Cadinol 1654 1,0 Borneol 1168 Tr 6,4 β-Bisabolol 1672 0,7 4-Terpineol 1178 5,2 0,3 1,0 α-Bisabolol 1684 0,2 p-Cimen-8-ol 1185 0,4 Hidrocarbonetos monoterpênicos 26,9 14,2 32,0 Éter de endro 1186 0,6 Monoterpenos oxigenados 64,8 79,8 31,0 α-Terpineol 1190 4,7 3,2 Hidrocarbonetos sesquiterpênicos 0 0 22,2 Mirtenol 1195 0,2 Sesquiterpenos oxigenados 0 0,7 7,2 cis-Diidrocarvona 1195 1,7 Fenilpropenóides 8,0 3,6 0 trans-Diidrocarvona 1202 4,9 Outros 0 0,3 2,8 trans-Piperitol 1207 0,2 Total identificado 99,7 98,6 95,2
Atividades antioxidantes dos três óleos essenciais testados em comparação com os padrões BHT, BHA e ácido ascórbico.
Atividades Óleos Essenciais Padrões L. nobilis Z. officinale A. graveolens BHT Ácido Ascórbico BHA DPPH (IC50; µg/mL) 135 470 3000 11,5 RP (EC50; µg/mL) 1850 1900 2400 37,3 β-carotenos (µg/mL) 3600 1900 4000 48 Íon superóxido (O2−) (µg/mL) 620 320 400 1,5
Zona de inibição do crescimento (média ± DP, mm), CIMs e CBMs (mg/mL) causadas pelos três óleos essenciais e pelos antibióticos padrão.
Espécie Código Óleos Essenciais Antibióticos L. nobilis Z. officinale A. graveolens ZI ± DP CIM CBM ZI ± DP CIM CBM ZI ± DP CIM CBM 1 2 A. hydrophila R4 12,33 ± 0,58 hi 0,05 >12,5 8,67 ± 0,58 ij 0,05 >12,5 11,33 ± 0,58 ghi 0,05 50 8 6 A. hydrophila R47 20 ± 1 b 0,05 25 13,67 ± 0,58 cd 0,05 >0,78 15,33 ± 0,58 d 0,05 >25 15 7 A. hydrophila R48 22,33 ± 0,58 a 0,10 50 14,33 ± 0,58 bc 0,20 12,5 11,67 ± 0,58 gh 0,10 50 10 6 A. hydrophila R71 16,67 ± 0,58 c 0,20 >25 13,67 ± 0,58 cd 0,05 >25 13 ± 1 ef 0,20 >12,5 15 6 A. hydrophila R29 14,33 ± 0,58 efg 0,10 >6,25 12,33 ± 0,58 efg 0,10 >25 13 ± 0 ef 0,10 50 6 20 A. hydrophila R5 20,67 ± 0,58 b 0,10 12,5 12,67 ± 0,58 ef 0,10 12,5 25,33 ± 0,58 a 0,10 50 11 8 A. hydrophila R13 11,33 ± 0,58 j 0,10 >12,5 7 ± 0 k 0,05 >25 6 ± 0 l 0,10 >12 13 6 A. hydrophila R3 15,33 ± 0,58 d 0,10 >25 15,33 ± 0,58 a 0,10 >12,5 13,33 ± 0,58 e 0,10 >12,5 19 6 A. hydrophila R46 14,33 ± 0,58 def 0,10 25 14,33 ± 0,58 bc 0,05 >25 12,33 ± 0,58 efg 0,10 >12,5 11 7 A. hydrophila R22 11,67 ± 0,58 ij 0,05 6,25 8,67 ± 0,58 ij 0,05 12,5 7,33 ± 0,58 k 0,10 >12,5 11 6 A. hydrophila R14 13,67 ± 0,58 g 0,05 >6,25 10,33 ± 0,58 h 0,05 >25 8,67 ± 0,58 j 0,05 >25 14 6 A. hydrophila R70 11,67 ± 0,58 ij 0,20 >25 11,67 ± 0,58 fg 0,10 50 11,33 ± 0,58 ghi 0,05 >12,5 7 6 A. hydrophila R11 14,67 ± 0,58 de 0,10 >25 12,67 ± 0,58 ef 0,05 >6,25 14,67 ± 0,58 d 0,05 >12,5 10 7 A. hydrophila R55 12 ± 1 ij 0,05 12,5 12,00 ± 0 fg 0,05 >3,13 12 ± 1 fgh 0,10 12,5 10 6 A. hydrophila R18 13,67 ± 0,58 efg 0,05 12,5 12,67 ± 0,58 ef 0,05 50 11 ± 0 hi 0,05 >25 11 7 A. hydrophila R23 14,67 ± 0,58 de 0,05 >6,25 12,33 ± 0,58 efg 0,05 50 13 ± 0 ef 0,10 >25 12 6 A. hydrophila R44 13,33 ± 0,58 fg 0,10 >25 6 ± 0 l 0,05 50 6 ± 0 l 0,05 >12,5 12 6 A. hydrophila R72 15,33 ± 0,58 d 0,05 12,5 12,33 ± 0,58 efg 0,05 >0,78 12,33 ± 0,58 efg 0,05 >25 11 6 E. cloacae R68 10,33 ± 0,58 k 0,20 >25 9 ± 0 i 0,05 >25 11,67 ± 0,58 gh 0,05 >25 8 8 E. cloacae R16 11,67 ± 0,58 ij 0,05 >50 8 ± 0 j 0,10 >25 7,67 ± 0,58 k 0,10 50 12 7 K. ornithinolytica R9 17 ± 0 c 0,05 6,25 11,33 ± 0,58 g 0,20 >25 8,67 ± 0,58 j 0,05 >25 15 7 K. oxytoca R58 14,67 ± 0,58 de 0,05 >12,5 13 ± 0 de 0,05 >12,5 12 ± 0 fgh 0,10 50 10 11 S. lentus R30 6 ± 0 l 0,05 >6,25 6 ± 0 l 0,05 >3,13 11,33 ± 0,58 ghi 0,05 >25 22 6 S. lugdunensis R1 14,33 ± 0,58 def 0,10 >25 10,33 ± 0,58 h 0,05 >12,5 10,33 ± 0,58 i 0,10 >25 19 6
lugdunensis R32 15.33 ± 0.58 d 0.05 >12.5 14.67 ± 0.58 ab 0.20 >12.5 17.67 ± 0.58 c 0.39 50 22 20 S. odorifera R69 14.33 ± 0.58 def 0.10 >12.5 11.33 ± 0.58 g 0.05 >12.5 11.33 ± 0.58 ghi 0.10 >12.5 8 7 S. sciuri R40 14.67 ± 0.58 de 0.05 >25 11.33 ± 0.58 g 0.10 >25 11.33 ± 0.58 ghi 0.10 50 15 7 S. sciuri R35 14.67 ± 0.58 de 0.05 >25 11.67 ± 0.58 fg 0.05 >25 13.33 ± 0.58 e 0.10 >25 24 6 S. sciuri R36 14.33 ± 0.58 def 0.05 >6.25 12.33 ± 0.58 efg 0.20 >6.25 14.67 ± 0.58 d 0.05 >25 10 13 S. sciuri R37 14.67 ± 0.58 de 0.05 >25 8.67 ± 0.58 ij 0.05 >6.25 11.67 ± 0.58 gh 0.10 >25 7 15 S. sciuri R2 14 ± 1 ef 0.05 >12.5 11.67 ± 0.58 fg 0.10 >12.5 11.67 ± 0.58 gh 0.10 50 8 20 S. sciuri R53 14.67 ± 0.58 de 0.05 12.5 13.67 ± 0.58 cd 0.05 1.56 20 ± 1 b 0.05 >12.5 10 7 S. xylosus R64 14.33 ± 0.58 def 0.05 >6.25 12.33 ± 0.58 efg 0.05 >12.5 15.33 ± 0.58 d 0.10 >12.5 12 8 V. alginolyticus R63 13 ± 0 gh 0.05 >6.25 10.33 ± 0.58 h 0.05 >25 12.33 ± 0.58 efg 0.10 50 8 7
MIC: Concentração Inibitória Mínima (mg/mL). MBC: Concentração Bactericida Mínima (mg/mL). IZ: Zona de inibição em diâmetro (mm ± DP) ao redor dos discos impregnados com 10 mg/disco de óleo essencial, incluindo o diâmetro do disco. DP: desvio padrão; (a–l): Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem significativamente a p = 0,05 com base no teste de Duncan de alcance múltiplo. 1: Eritromicina (15 µg). 2: Kanamicina (15 µg).