pmid: "28587201"
title: "Laurus nobilis: Composição do Óleo Essencial e Suas Atividades Biológicas"
authors: "Caputo L, Nazzaro F, Souza LF, Aliberti L, De Martino L, Fratianni F, Coppola R, De Feo V"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2017 Jun 03"
doi: "10.3390/molecules22060930"
source: "PMC Full Text"

Laurus nobilis: Composição do Óleo Essencial e Suas Atividades Biológicas

Autores

Caputo L, Nazzaro F, Souza LF, Aliberti L, De Martino L, Fratianni F, Coppola R, De Feo V

Periodico

Molecules (Basel, Switzerland) (2017 Jun 03)

Conteudo

Laurus nobilis: Composição do Óleo Essencial e Suas Atividades Biológicas
Laurus nobilis é nativa da região sul do Mediterrâneo e cultivada principalmente na Europa e nos EUA como planta ornamental e medicinal. A composição química do óleo essencial (OE) das folhas de L. nobilis, coletadas no sul da Itália, foi estudada por CG e CG-EM. No total, 55 compostos foram identificados, representando 91,6% do óleo essencial total. 1,8-Cineol (31,9%), sabineno (12,2%) e linalol (10,2%) foram os principais componentes. As atividades antimicrobiana e antifúngica do OE e do 1,8-cineol foram determinadas in vitro. A citotoxicidade do OE foi avaliada na linhagem celular SH-SY5Y, bem como a influência do OE na expressão da adenilato ciclase 1 (ADCY1), sugerindo possíveis efeitos do óleo essencial no Sistema Nervoso Central.

1. Introdução
   O louro, Laurus nobilis L., uma árvore ou arbusto perene pertencente à família Lauraceae, é nativo das partes sul da Europa e da região do Mediterrâneo; esta planta é amplamente cultivada em muitos países desta região. Suas folhas secas e o óleo essencial (OE) derivado das folhas são utilizados como uma valiosa especiaria e agente aromatizante na culinária e na indústria alimentícia. As folhas têm sido utilizadas, na medicina popular iraniana, para tratar epilepsia, neuralgia e parkinsonismo. Folhas e frutos foram relatados como possuindo propriedades aromáticas, estimulantes e narcóticas. Vários estudos relataram as propriedades antimicrobianas e antioxidantes do óleo essencial e/ou extratos de louro. As folhas de L. nobilis são tradicionalmente usadas por via oral para tratar os sintomas de problemas gastrointestinais, como distensão epigástrica e flatulência. O óleo essencial das folhas de louro é amplamente utilizado nas indústrias de perfumes e sabões. Além disso, tem sido usado para aliviar hemorroidas e dores reumáticas. Também possui atividades diurética e antifúngica.
   O presente estudo descreve a composição do óleo essencial das folhas de L. nobilis e algumas de suas atividades biológicas. Em particular, avaliamos os possíveis efeitos antimicrobianos contra diferentes cepas de bactérias e fungos, sua citotoxicidade em células SH-SY5Y e seus possíveis efeitos subcelulares em células SH-SY5Y são usados para avaliar os possíveis efeitos no Sistema Nervoso Central (SNC).

2. Resultados

2.1. Rendimento e Composição do Óleo Essencial
A hidrodestilação das folhas de L. nobilis, colhidas em Montecorice (Campânia, sul da Itália), forneceu um óleo essencial caracterizado por um odor típico, com um rendimento de 0,57% calculado sobre o peso fresco. A Tabela 1 relata a composição química do óleo; os compostos estão listados de acordo com sua eluição em uma coluna capilar HP-5 MS.
No total, foram identificados 55 compostos, correspondendo a 91,6% do óleo total. Os monoterpenos oxigenados representam 48,6% do OE, sendo 1,8-cineol (31,9%), sabineno (12,2%) e linalol (10,2%) os principais componentes. Outros componentes foram acetato de α-terpinila (5,9%), α-pineno (5,8%), α-terpineol (3,3%), metil-eugenol (3,3%), neoiso-isopulegol (2,5%), eugenol (1,6%), β-pineno (1,4%) e γ-terpineno (1,0%). Os sesquiterpenos representam 3,4% do óleo, sendo os hidrocarbonetos 3,2% (β-funebreno 0,5%, β-elemeno 0,4%, espatulenol 0,4%) e os compostos oxigenados 0,2%.

2.2. Atividade Antimicrobiana

A atividade antibacteriana do óleo essencial e do 1,8-cineol foi testada, em diferentes quantidades, em cinco cepas bacterianas, pertencentes tanto a bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas — nomeadamente Staphylococcus aureus, Bacillus cereus (4313) e B. cereus (4384) representantes das Gram-positivas; e Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, bactérias Gram-negativas características. Os resultados da atividade, ou seja, os diâmetros de inibição calculados em mm, são apresentados na Tabela 2.

O óleo essencial apresentou atividade antimicrobiana significativa contra todos os microrganismos já na menor quantidade utilizada no teste (0,4 µL), produzindo zonas de inibição entre 6,33 e 8,66 mm. Esses resultados foram particularmente atraentes, no que nos diz respeito, considerando a zona de inibição produzida pela tetraciclina. De fato, os diâmetros de inibição produzidos por 0,4 µL do óleo essencial resultaram em dois casos quase iguais (versus E. coli) ou até superiores (versus S. aureus) ao produzido pela tetraciclina. Deve-se também enfatizar que 1 e 2 µL de óleo essencial resultaram em uma sensibilidade de todas as cepas testadas superior àquela fornecida pelo contato com a tetraciclina, produzindo zonas de inibição entre 13,33 e 18 mm. B. cereus 4313 revelou-se o organismo mais sensível entre os testados, sendo também mais sensível quando comparado à outra cepa de B. cereus utilizada no ensaio.

Em todos os casos, o óleo essencial foi mais eficaz do que o 1,8-cineol, que foi ineficaz contra E. coli (exceto a 2 µL/mL) e contra P. aeruginosa e S. aureus na concentração de 0,4 µL/mL.

Os resultados do teste de inibição do halo foram confirmados pelo teste de CIM (Tabela 3). De fato, exceto para Bacillus cereus 4313, cujo crescimento foi inibido utilizando o mesmo volume de OE e 1,8-cineol, em todos os outros casos, o óleo essencial foi capaz de inibir o crescimento das cepas microbianas com um volume menor do que o 1,8-cineol.

2.3. Atividade Antifúngica
Na Tabela 4, relatamos as larguras (mm) dos halos de inibição exibidos por diferentes volumes do OE de L. nobilis e de 1,8-cineol contra diferentes fungos (Aspergillus niger, A. versicolor, Penicillium citrinum e P. expansum). No geral, as cepas fúngicas foram sensíveis tanto ao OE de L. nobilis quanto ao 1,8-cineol. P. expansum apresentou a maior sensibilidade à ação do óleo essencial, apenas no volume mínimo utilizado no teste, produzindo halos de 8 mm. A. versicolor foi mais resistente apenas no volume mais baixo utilizado.
2.4. Citotoxicidade do 1,8-cineol e do óleo essencial de Laurus nobilis
O tratamento de células de neuroblastoma SH-SY5Y com (1600–50 µg/mL) de 1,8-cineol e óleo essencial de Laurus nobilis por 24 h resultou em baixa atividade citotóxica. O 1,8-cineol e o óleo essencial apresentaram CI50 > 2000 µg/mL e CI50 = 47.106 µg/mL, respectivamente. No entanto, o tratamento com óleo essencial resultou em uma citotoxicidade mais forte (CI50 < 500 µg/mL) (Figura 1).
2.5. Adenilato Ciclase (ADCY1): Análise de Western Blot
Investigamos os efeitos do 1,8-cineol e do óleo essencial de L. nobilis em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Western blots representativos e densitometria quantitativa para a expressão da proteína adenilato ciclase 1 (ADCY1) em SH-SY5Y após exposição a diferentes concentrações de 1,8-cineol e do óleo essencial são mostrados na Figura 2. Tratamentos de células de neuroblastoma SH-SY5Y com 1,8-cineol não influenciaram a expressão de ADCY1 (Painel A), enquanto um tratamento com 200 e 100 µg/mL de óleo essencial de L. nobilis por 24 h reduziu significativamente a expressão de ADCY1 (Painel B).
3. Discussão
Na composição do óleo essencial de L. nobilis, 1,8-cineol, sabineno e linalol são os principais componentes, com outros compostos presentes em baixas porcentagens ou mesmo em traços.
A comparação com a literatura mais recente sobre a composição química do óleo essencial de L. nobilis de outras áreas mediterrâneas mostrou diferenças substanciais: a porcentagem de 1,8-cineol encontrada (31,9%) é menor do que os valores registrados em outros estudos: Turquia 44,97%, Tunísia 56,0%, Chipre 58,59%, Marrocos 52,43%, mas semelhante ao óleo essencial argelino (34,62%). Em nossa amostra, a quantidade de sabineno foi de 12,2%, maior do que nos óleos essenciais analisados por Derwich e colaboradores, Snuossi e colaboradores, e Yalcin, que encontraram porcentagens de sabineno de 6,13, 3,5 e 6,13%, respectivamente. O linalol foi encontrado em concentrações comparáveis a estudos anteriores, mas no óleo essencial analisado por Derwick e colaboradores, o linalol não foi encontrado.
A técnica do halo de inibição é frequentemente utilizada para avaliar a atividade antibacteriana de extratos vegetais e óleos essenciais. Nossos resultados sobre a atividade antimicrobiana confirmam que o comportamento de um agente antimicrobiano pode ser não apenas espécie-específico, mas também cepa-específico. A literatura disponível relata diversos estudos que comprovam a atividade antibacteriana do óleo essencial de *L. nobilis* contra diferentes patógenos. O óleo essencial de louro argelino contra *E. coli* e *Ps. aeruginosa* produziu um halo de inibição de 13,73 mm e 10,73 mm, respectivamente. O óleo produziu um halo de inibição de 13,03 mm quando testado contra *S. aureus*. Em nossos experimentos, a atividade antimicrobiana foi superior à do óleo essencial de *L. nobilis* coletado na Turquia, quando testado contra *E. coli* O157:H7. Considerando a composição química do óleo essencial, podemos hipotetizar uma ação sinérgica, pelo menos, dos principais compostos presentes, especificamente monoterpenos e monoterpenos oxigenados, que apresentam *per se* baixa atividade antimicrobiana quando usados como compostos isolados. Outros terpenos — como α-pineno, β-pineno, γ-terpineno, δ-3-careno, (+)-sabineno e α-terpineno — mostraram atividade antimicrobiana muito baixa ou nula contra 25 gêneros de bactérias. Esses testes *in vitro* confirmam que os terpenos apresentam atividade antimicrobiana ineficaz quando usados como compostos isolados. O óleo essencial de *L. nobilis* apresentou atividade antifúngica diferente (Tabela 4) em relação a estudos anteriores: de fato, nossos resultados indicam uma atividade antifúngica acentuada, superior, por exemplo, à observada por Simic e colaboradores tanto contra *Aspergillus* quanto contra *Penicillium* spp., apesar de seu alto teor de 1,8-cineol. Portanto, o diâmetro do halo produzido pelo 1,8-cineol contra os fungos foi menos evidente. Por essa razão, hipotetizamos um efeito sinérgico entre os diferentes componentes do OE de *L. nobilis*, que, de certa forma, anulam a fraqueza demonstrada pelos componentes individuais. A notável eficácia exibida pelo óleo essencial estudado pode ser interessante, por exemplo, na fabricação e no processamento de alimentos, que, como se sabe, está cada vez mais direcionado ao uso de tecnologias verdes capazes de salvaguardar a qualidade dos alimentos, o meio ambiente e, especialmente, a saúde do consumidor. Portanto, os resultados animadores obtidos com o uso do óleo essencial de *L. nobilis* indicam que tal óleo poderia ser utilizado como agente antimicrobiano, também para fins de saúde e alimentícios. O uso desse óleo essencial prolongou a vida útil de filés de peixe embalados em atmosfera modificada (MAP). O óleo essencial de louro também foi utilizado para salvaguardar a qualidade e a segurança de salsichas frescas, prolongando também sua vida útil e evitando os problemas relacionados à oxidação de gorduras.
A atividade citotóxica do 1,8-cineol e do óleo essencial foi avaliada em linhagem celular de neuroblastoma humano (SH-SY5Y). Os valores de IC50 foram > 400 µg/mL, indicando que as substâncias não foram citotóxicas, de acordo com o critério estabelecido pelo National Cancer Institute, que afirmou que apenas substâncias naturais com IC50 < 20 µg/mL eram consideradas citotóxicas contra as células tratadas. No entanto, comparando os valores de IC50, nossos achados indicaram que o OE de L. nobilis é mais citotóxico que o 1,8-cineol. Essa citotoxicidade pode ser provavelmente atribuída a uma atividade sinérgica deste e de outros componentes.

A indução específica de apoptose pelo 1,8-cineol foi observada em células de leucemia humana Molt 4B e HL-60, mas não em células de câncer gástrico humano KATO III. No entanto, este monoterpeno não foi citotóxico contra os modelos de câncer humano in vitro no presente estudo. Nossos resultados mostraram que o óleo essencial apresentou menor citotoxicidade do que aquele testado nas linhagens celulares ACHN e C32 (IC50 202,62 e 209,69 µg/mL para ACHN e C32, respectivamente) e o extrato foliar testado nas linhagens celulares de neuroblastoma humano SK-N-BE(2)-C e SH-SY5Y.

Óleos essenciais têm sido usados por séculos como medicina tradicional, e atualmente são usados mundialmente no manejo de depressão, ansiedade e distúrbios relacionados ao estresse, mas há muito pouca ciência verificada por trás de seu uso. Para esclarecer a crença tradicional nos efeitos antiepilépticos e o uso em neuralgia e parkinsonismo de L. nobilis na medicina popular, investigamos a possível influência do óleo essencial e de seus principais componentes na expressão de ADCY1. Nossos resultados mostraram que o tratamento com 200 e 100 µg/mL de óleo essencial de L. nobilis reduziu a expressão de ADCY1 em células SH-SY5Y e, consequentemente, a produção intracelular de cAMP. O 1,8-cineol não teve efeito sobre a expressão de ADCY1, mas levantamos a hipótese de que o efeito do óleo essencial se deve à presença de linalol (10,2%). Elisabetsky e colaboradores mostraram que o linalol possui efeitos sedativos dose-dependentes no Sistema Nervoso Central. Em nosso estudo anterior, relatamos que o linalol é um componente de muitos óleos essenciais que pode influenciar a expressão de ADCY1 e ERK.

Além disso, na composição fitoquímica complexa do óleo essencial, um ou mais componentes podem atuar sinergicamente para influenciar a expressão de ADCY1 em células SH-SY5Y.

4. Materiais e Métodos

4.1. Material Vegetal

Folhas de L. nobilis foram coletadas em fevereiro de 2016, em Montecorice, área de Cilento (Campânia, sul da Itália, 40°14′9″24 N, 14°59′13″20 E), 90 m acima do nível do mar. Amostras representativas homogêneas da população foram coletadas durante o período balsâmico. A planta foi identificada pelo Prof. V. De Feo, com base na Flora d’Italia e um espécime voucher foi depositado no Herbário da Cátedra de Botânica Médica da Universidade de Salerno.
Cem gramas de folhas secas de L. nobilis foram trituradas em um liquidificador Waring e, em seguida, submetidas a hidrodestilação por 3 h de acordo com o procedimento padrão descrito na Farmacopeia Europeia. O óleo essencial amarelo foi solubilizado em n-hexano, filtrado sobre sulfato de sódio anidro e armazenado sob N2 a +4 °C no escuro, até ser testado e analisado.
4.3. Análise por CG-DIC
A cromatografia gasosa analítica foi realizada em um cromatógrafo a gás Perkin-Elmer Sigma-115 (Pelkin-Elmer, Waltham, MA, EUA) equipado com um DIC e um processador de dados. A separação foi obtida usando uma coluna capilar de sílica fundida HP-5MS (30 m × 0,25 mm d.i., 0,25 μm de espessura de filme). Temperatura da coluna: 40 °C, com manutenção inicial de 5 min, e depois até 270 °C a 2 °C/min, 270 °C (20 min); modo de injeção splitless (1 μL de uma solução 1:1000 em n-hexano). As temperaturas do injetor e do detector foram de 250 °C e 290 °C, respectivamente. A análise também foi realizada usando uma coluna capilar de sílica fundida HP Innowax de polietilenoglicol (50 m × 0,20 mm d.i., 0,25 µm de espessura de filme). Em ambos os casos, hélio foi usado como gás de arraste (1,0 mL/min).
4.4. Análise por CG/EM
A análise foi realizada em um aparelho Agilent 6850 Ser. II (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, EUA), equipado com uma coluna capilar de sílica fundida DB-5 (30 m × 0,25 mm d.i., 0,33 μm de espessura de filme), acoplado a um Detector Seletivo de Massas Agilent MSD 5973; energia de ionização 70 eV; tensão do multiplicador de elétrons 2000 V. Os espectros de massa foram varridos na faixa de 40–500 amu, com tempo de varredura de 5 varreduras/s. As condições cromatográficas a gás foram conforme relatado no parágrafo anterior; temperatura da linha de transferência, 295 °C.
4.5. Identificação dos Componentes do Óleo Essencial
A identificação dos constituintes do óleo essencial baseou-se na comparação de seus índices de retenção de Kovats (IR), determinados em relação aos valores de tR de n-alcanos (C10–C35), com aqueles da literatura e espectros de massa em ambas as colunas com os de compostos autênticos disponíveis em nossos laboratórios por meio das bibliotecas de espectros de massa NIST 02 e Wiley 275. As concentrações relativas dos componentes foram obtidas por normalização da área dos picos. Nenhum fator de resposta foi calculado.
4.6. Atividade Antimicrobiana
O teste do halo de inibição foi realizado para avaliar a atividade antimicrobiana potencial do óleo essencial de L. nobilis e do 1,8-cineol. As cepas bacterianas testadas neste estudo foram a Gram-negativa Escherichia coli DMS 8579 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 50071, e as Gram-positivas Bacillus cereus DSM 4313, Bacillus cereus 4384 e Staphylococcus aureus DSM 25693. As bactérias foram adquiridas da Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ). Caldo nutriente (Sigma Aldrich, Milão, Itália) foi utilizado como meio de crescimento bacteriano a 37 °C por 18 h. As densidades ópticas de todas as culturas foram ajustadas para corresponder a um padrão McFarland de 0,5 de 1 × 10⁸ unidades formadoras de colônias (UFC)/mL e espalhadas em placas de ágar nutriente. O óleo essencial de L. nobilis, bem como o componente puro 1,8-cineol, foram ressuspensos em dimetilsulfóxido (DMSO) e depois diluídos para serem submetidos às análises biológicas. Discos de papel filtro estéreis (5 mm) foram impregnados com volumes correspondentes a 0,4, 1 e 2 µL do óleo essencial e colocados nas placas. Estas foram deixadas por 30 min em temperatura ambiente sob condições estéreis antes da incubação a 37 °C por 24 h; o diâmetro da zona clara mostrada nas placas (zona do halo de inibição) foi medido com precisão (“Extra steel Caliper mod 0289”, escala de leitura mm/polegadas, precisão 0,05 mm, Mario De Maio, Milão, Itália). Um disco tratado apenas com DMSO serviu como controle negativo. A tetraciclina (7 µg/disco; Sigma Aldrich, Milão, Itália) foi utilizada como fármaco de referência. Os experimentos foram realizados em triplicata e a média foi calculada.
4.7. Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Uma versão modificada do ensaio de microtitulação com resazurina foi utilizada para avaliar a concentração inibitória mínima do óleo essencial de L. nobilis e do 1,8-cineol. Resumidamente, diferentes volumes do material teste—preparado conforme descrito acima—foram pipetados em uma placa multipoços com diferentes volumes de caldo Muller-Hinton (Sigma Aldrich, Milão, Itália). Diluições seriadas duplas foram realizadas de modo que cada poço tivesse 50 μL do material teste em concentrações seriadamente decrescentes. 30 μL de caldo isossensibilizado 3,3 × concentrado (Sigma Aldrich) e 5 μL de solução indicadora de resazurina (previamente preparada dissolvendo um comprimido de 270 mg adquirido da Sigma Aldrich em 40 mL de água destilada estéril) foram adicionados em cada poço, para atingir um volume final/poço de 240 µL. Finalmente, 10 μL de suspensão bacteriana foram adicionados a cada poço para atingir uma concentração de aproximadamente 5 × 10⁵ UFC/mL. Ciprofloxacina (3 µM em DMSO, Sigma Aldrich) e DMSO foram usados como controles positivo e negativo, respectivamente. As placas foram preparadas em triplicata, envoltas em filme plástico para evitar a desidratação bacteriana e incubadas a 37 °C por 24 h. A menor concentração na qual ocorreu uma mudança de cor (avaliada visualmente de azul/roxo escuro para rosa, ou incolor) indicou o valor da CIM.
4.8. Atividade Antifúngica
A possível atividade antifúngica do óleo essencial e do 1,8-cineol foi testada contra quatro cepas fúngicas de interesse agroalimentar, Aspergillus versicolor DSM 1943, Penicillium expansum DSM 1994, Penicillium citrinum DSMZ 1179 e Aspergillus niger DSM 1957, seguindo o método de Marrufo e colaboradores. As cepas foram adquiridas da DSMZ. Foram cultivadas em caldo de dextrose de batata (Sigma Aldrich, Milão, Itália) a 28 °C. Uma suspensão celular de fungos foi preparada em água destilada estéril, ajustada para conter aproximadamente 106 UFC/mL, e plaqueada em ágar dextrose de batata. Após 30 min em condições estéreis, as placas inoculadas foram inoculadas com diferentes quantidades das amostras, previamente diluídas 1:10 (v/v) em DMSO. Após 20 min em condições estéreis à temperatura ambiente, as placas foram incubadas a 28 °C por 48–72 h. Quando o micélio dos fungos atingiu as bordas da placa controle (controle negativo sem adição das amostras), o diâmetro da zona clara exibida nas placas (halo de inibição) foi medido com precisão ("Extra steel Caliper mod 0289", escala de leitura mm/polegada, precisão 0,05 mm, Mario De Maio, Milão, Itália); DMSO foi utilizado como controle negativo (10 µL/disco de papel). A atividade antifúngica foi expressa em mm. As amostras foram testadas em triplicata e os resultados são expressos como média ± desvio padrão.
4.9. Culturas Celulares
Células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) foram cultivadas em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 1% de L-glutamina, 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (SFB), 1% de penicilina/estreptomicina (todos da Sigma Aldrich) a 37 °C em atmosfera de 95% O2 e 5% CO2.
4.10. Ensaio MTT
As células foram plaqueadas (7 × 10³) em placas de cultura de 96 poços em 150 µL de meio de cultura e incubadas a 37 °C em atmosfera umidificada de 95% O2 e 5% CO2. No dia seguinte, uma alíquota de 150 µL de diluições seriadas de 1,8-cineol e do óleo essencial (1600–50 µg/mL) foi adicionada às células e incubada por 24 h. Apenas DMSO foi utilizado como controle. A viabilidade celular foi avaliada através do ensaio MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio). Brevemente, 30 µL de MTT (5 mg/mL) foram adicionados e as células incubadas por mais 3 h. Em seguida, as células foram lisadas e os cristais azul-escuros solubilizados com 30 µL de uma solução contendo 50%, v/v, N,N-dimetilformamida, 20%, p/v, SDS com pH ajustado para 4,5. A densidade óptica (DO) de cada poço foi medida com um espectrofotômetro de microplacas (Thermo Scientific Multiskan GO) equipado com um filtro de 520 nm. A viabilidade celular em resposta ao tratamento foi calculada como uma porcentagem das células controle tratadas com DMSO na concentração final de 0,1% de células viáveis = (100 × DO das células tratadas)/DO das células controle.
4.11. Extração de Proteínas e Western Blotting
As células foram tratadas com diferentes concentrações (400–50 µg/mL) do 1,8-cineol e do óleo essencial e, após 24 h, foram coletadas e lisadas utilizando tampão Laemmli para extrair proteínas totais. Para a análise de Western blot, uma alíquota de proteína total foi submetida a eletroforese em géis de SDS-PAGE a 8% e transferida para nitrocelulose. Os blots de nitrocelulose foram bloqueados com 10% de leite seco desnatado em solução salina Tris com 0,1% Tween-20 durante a noite a 4 °C. Após o bloqueio, os blots foram incubados com anticorpos dirigidos contra ADCY1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), p44/42 MAP quinase (ERK) fosforilada ou p44/42 MAP quinase (ERK) total fosforilada por 3 h à temperatura ambiente. A imunorreatividade foi detectada por incubação sequencial com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA, EUA) e reagentes de quimioluminescência intensificada (ImmunoCruz, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA).
4.12. Análise Estatística
Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os dados de cada experimento foram analisados estatisticamente utilizando o software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA) seguido pela comparação de médias (ANOVA de duas vias) usando o teste de comparações múltiplas de Dunnett, com nível de significância de p < 0,05.
Disponibilidade de Amostras: Amostras do óleo essencial e do 1,8-cineol estão disponíveis com os autores.
Contribuições dos Autores
V.D.F. concebeu e desenhou os experimentos; L.C., L.D.M. e L.A. realizaram os experimentos; L.C., F.N. e L.F.S. analisaram os dados; F.N. contribuiu para os experimentos, forneceu reagentes, materiais e ferramentas de análise, e ajudou na redação do manuscrito; F.F. e R.C. contribuíram com as ferramentas de análise; V.D.F. escreveu o artigo.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Evaluation of the volatile oil composition and antiproliferative activity of Laurus nobilis L. (Lauraceae) on breast cancer cell line models
Supercritical fluid extraction of antioxidant and antimicrobial compounds from Laurus nobilis L. chemical and functional characterization
Chemical composition and antibacterial activity of leaves essential oil of Laurus nobilis from Morocco
Effective antibacterial and antioxidant properties of methanolic extract of Laurus nobilis seed oil
Antidiarrheal activity of Laurus nobilis L. leaf extract in rats
A simple method to obtain essential oils from Salvia triloba L. and Laurus nobilis L. by using microwave-assisted hydrodistillation
Phytochemical and pharmacological review on Laurus nobilis
Chemical composition, antimicrobial activity and antioxidant capacity of some medicinal and aromatic plant extracts
Laurus nobilis, Zingiber officinale and Anethum graveolens Essential Oils: Composition, Antioxidant and Antibacterial Activities against Bacteria Isolated from Fish and Shellfish
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Propriedades anticonvulsivantes do linalol em modelos de convulsão relacionados ao glutamato
Óleos essenciais de Coriandrum Sativum e Lavandula angustifolia: Composição química e atividade no sistema nervoso central
Índices de retenção cromatográfica gasosa de monoterpenos e sesquiterpenos em fases de metil silicone e Carbowax 20M
Ensaio antibacteriano em microplaca baseado na incorporação de resazurina como indicador de crescimento celular, e sua aplicação na triagem antibacteriana in vitro de produtos naturais
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Atividade anti-inflamatória de verminosídeo de Kigelia africana e avaliação da irritação cutânea em culturas celulares e epiderme humana reconstituída
A dexametasona inibe a apoptose induzida por TRAIL em células de câncer de tireoide via indução de Bcl-xL
Viabilidade celular calculada como porcentagem após ensaio de MTT. As células foram tratadas com diferentes concentrações (1600–50 µg/mL) de 1,8-cineol (A) e óleo essencial de L. nobilis (B), por 24 h e apenas solvente (DMSO, 0,1%). Os dados são a média ± DP de três experimentos ** p < 0,01, **** p < 0,0001 vs. DMSO.
Níveis de expressão relativa da proteína ADCY1 em células SH-SY5Y tratadas com 1,8-cineol (A) e óleo essencial de Laurus nobilis (B). Cada painel mostra a densitometria das bandas nos grupos tratados e no controle. Os valores são a média ± DP em cada grupo (n = 3). * p < 0,05, comparado ao controle (ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett).
Composição química do óleo essencial (OE) isolado das folhas de L. nobilis.
No. Composto % Ri a Ri b Identificação c 1 Pentanoato de metila 0,1 850 828 1,2 2 Isovalerato de etila 0,1 853 858 1,2 3 α-Tujeno 0,7 916 930 1,2 4 α-Pineno 5,8 922 939 1,2,3 5 Canfeno 0,8 935 954 1,2 6 Sabineno 12,2 962 975 1,2 7 β-Pineno 1,4 980 979 1,2,3 8 α-Felandreno 0,5 991 1002 1,2,3 9 δ-2-Careno 0,4 997 1002 1,2 10 α-Terpineno 0,6 1004 1017 1,2,3 11 o-Cimeno 0,3 1013 1026 1,2 12 1,8-Cineol 31,9 1016 1031 1,2,3 13 (Z)-β-Ocimeno 0,2 1028 1037 1,2 14 (E)-β-Ocimeno 0,2 1038 1050 1,2 15 γ-Terpineno 1,0 1048 1059 1,2,3 16 Hidrato de cis-Sabineno 0,3 1057 1070 1,2 17 ρ-Menta-3,8-dieno 0,5 1077 1072 1,2 18 Hidrato de trans-Sabineno 10,2 1093 1098 1,2 19 Linalol 0,1 1096 1096 1,2,3 20 exo-Fencol 0,1 1111 1121 1,2 21 alo-Ocimeno 0,2 1118 1132 1,2 22 trans-Sabinol 0,2 1128 1142 1,2 23 Cânfora 0,2 1133 1146 1,2,3 24 Óxido de β-pineno 0,1 1147 1159 1,2 25 Isoborneol 0,5 1155 1160 1,2 26 iso-Isopulegol 0,6 1157 1159 1,2 27 neoiso-Isopulegol 2,5 1165 1171 1,2 28 α-Terpineol 3,3 1180 1188 1,2,3 29 cis-Carveol 0,2 1219 1229 1,2 30 cis-p-Menta-1(7),8-dien-2-ol 0,1 1232 1230 1,2 31 Acetato de trans-sabineno hidratado 0,7 1246 1256 1,2 32 2-(1E)-Propenil-fenol 0,1 1265 1267 1,2 33 Acetato de neo-3-tujanol 0,4 1275 1276 1,2 34 α-Terpinen-7-al 0,3 1284 1285 1,2 35 Acetato de iso-verbanol 0,3 1306 1309 1,2 36 Acetato de α-terpinila 5,9 1340 1349 1,2 37 Eugenol 1,6 1347 1359 1,2,3 38 Ciclosativeno 0,1 1360 1371 1,2 39 Longicicleno 0,2 1373 1374 1,2 40 β-Elemeno 0,4 1381 1390 1,2 41 Metil-eugenol 3,3 1394 1403 1,2,3 42 β-Funebreno 0,5 1408 1414 1,2 43 cis-Tujopseno 0,2 1427 1431 1,2 44 Espirolepecineno 0,1 1445 1451 1,2 45 alo-Aromadendreno 0,1 1449 1460 1,2,3 46 γ-Himacaleno 0,1 1474 1482 1,2 47 a-Amorpeno 0,1 1483 1484 1,2 48 δ-Amorpeno 0,1 1502 1512 1,2 49 δ-Cadineno 0,2 1512 1523 1,2 50 Elemicina 0,5 1546 1557 1,2 51 Espatulenol 0,4 1563 1578 1,2,3 52 Óxido de cariofileno 0,3 1572 1583 1,2,3 53 Tujopsan-2-α-ol 0,1 1580 1587 1,2 54 Viridiflorol 0,2 1591 1592 1,2 55 Eremoligenol 0,1 1630 1631 1,2 Total 91,6 Monoterpenos hidrocarbonetos 34,0 Monoterpenos oxigenados 48,6 Sesquiterpenos hidrocarbonetos 3,2 Sesquiterpenos oxigenados 0,2 Compostos fenólicos 5,6
a Índice de retenção linear em coluna HP-5MS; b Índice de retenção linear em coluna HP Innowax; c Método de identificação: 1 = índice de retenção linear; 2 = identificação baseada na comparação de espectros de massa; 3 = coinjeção com compostos padrão.
Cepas Bacterianas Diâmetro de Inibição (mm) Óleo Essencial de Laurus nobilis 1,8-cineol Tetraciclina 0,4 µL/mL 1 µL/mL 2 µL/mL 0,4 µL/mL 1 µL/mL 2 µL/mL 7 µg/mL B. cereus 4313 8,66 ± 1,54 b 14,66 ± 0,57 c 18 ± 0 e 5,66 ± 1,54 e 12 ± 2,64 c 14,66 ± 0,57 d 10,33 ± 0,57 a B. cereus 4384 7,66 ± 1,54 b 12 ± 2,64 d 15,66 ± 0,57 e 5,66 ± 1,54 c 11,66 ± 1,54 c 14,66 ± 0,57 e 8,67 ± 1,67 a S. aureus 8,33 ± 0,57 c 11,66 ± 1,54 a 13,33 ± 1,54 b 0 ± e 7,66 ± 1,54 d 12 ± 1,54 a 11,33 ± 0,57 a E. coli 6,33 ± 0,57 e 12 ± 0 a 16 ± 2 e 0 ± e 0 ± e 5,66 ± 1,54 e 12,70 ± 1,67 a P. aeruginosa 8,33 ± 1,54 b 12 ± 1,73 d 15,33 ± 0,57 e 0 ± e 7,66 ± 1,54 c 12 ± 1,73 d 9,67 ± 0,57 a
Os dados são expressos em mm. Os resultados são apresentados como média ± DP (n = 3). Médias seguidas por letras diferentes em cada coluna diferem significativamente pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett, no nível de significância de p < 0,05. e: p < 0,0001; d: p < 0,001; c: p < 0,001; b: p < 0,005; a: p < 0,05 vs. tetraciclina (7 µg).
Concentração inibitória mínima (CIM, µL) do OE de Laurus nobilis e do 1,8-cineol.
Micro-organismo CIM (µL/mL) Laurus nobilis 1,8-cineol Bacillus cereus 4313 0,2 0,2 Bacillus cereus 4384 0,2 0,4 Staphylococcus aureus 0,4 1 Escherichia coli 0,8 1,5 Pseudomonas aeruginosa 0,4 1
Atividade antifúngica do óleo essencial de L. nobilis e do 1,8-cineol.
A. niger A. versicolor P. citrinum P. expansum OE de Laurus nobilis 0,4 µL 2 ± 0 - 2,33 ± 0,57 8 ± 1,73 1 µL 4,33 ± 1,52 5,66 ± 1,54 4,66 ± 0,57 9,33 ± 2,08 2 µL 6 ± 1 7,66 ± 1,54 5,66 ± 1,54 9,66 ± 0,57 1,8-cineol 2 µL - - - - 4 µL - - - - 8 µL 5,66 ± 1,54 7,66 ± 1,54 5,66 ± 1,54 9,66 ± 0,57
Os dados são expressos em mm. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (DP) do halo de inibição (n = 3).