pmid: "26054437"
title: "Efeitos anticonvulsivantes potentes da D-leucina."
authors: "Hartman AL, Santos P, O'Riordan KJ, Stafstrom CE, Marie Hardwick J"
journal: "Neurobiology of disease"
pubdate: "2015 Oct"
doi: "10.1016/j.nbd.2015.05.013"
source: "PMC Full Text"
Efeitos anticonvulsivantes potentes da D-leucina.
Autores
Hartman AL, Santos P, O'Riordan KJ, Stafstrom CE, Marie Hardwick J
Periodico
Neurobiology of disease (2015 Oct)
Conteudo
Potentes efeitos anticonvulsivantes da D-leucina
Não existem tratamentos eficazes para milhões de pacientes com epilepsia intratável. Dietas cetogênicas com alto teor de gordura podem proporcionar benefícios clínicos significativos, mas são difíceis de implementar. Baixos níveis de carboidratos parecem ser essenciais para o funcionamento da dieta cetogênica, mas os ingredientes ativos nas intervenções dietéticas permanecem desconhecidos, e o papel da cetogênese tem sido questionado. Um potencial papel anticonvulsivante da proteína dietética ou de aminoácidos individuais na dieta cetogênica é pouco estudado. Investigamos os dois aminoácidos exclusivamente cetogênicos, L-leucina e L-lisina, e descobrimos que apenas a L-leucina protege potentemente camundongos quando administrada antes do início das crises induzidas por injeção de ácido caínico, mas não por indução de cetose. Inesperadamente, o enantiômero D da leucina, encontrado em quantidades ínfimas no cérebro, funcionou tão bem ou melhor do que a L-leucina contra crises induzidas tanto por ácido caínico quanto por eletrochoque de 6 Hz. No entanto, ao contrário da L-leucina, a D-leucina interrompeu potentemente as crises mesmo após o início da atividade convulsiva. Além disso, a D-leucina, mas não a L-leucina, reduziu a potenciação de longo prazo, mas não teve efeito sobre a transmissão sináptica basal in vitro. Em uma triagem de receptores neuronais candidatos, a D-leucina não competiu pela ligação de ligantes cognatos, potencialmente sugerindo um novo alvo. Mesmo em doses baixas, a D-leucina suprimiu crises em andamento pelo menos tão eficazmente quanto o diazepam, mas sem efeitos sedativos. Estes estudos levantam a possibilidade de que a D-leucina possa representar uma nova classe de agentes anticonvulsivantes e que a D-leucina possa ter uma função previamente desconhecida em eucariotos.
INTRODUÇÃO
Aproximadamente um milhão de pessoas nos EUA têm convulsões que não são controladas por medicamentos adequadamente escolhidos. No entanto, a eficácia dos medicamentos para epilepsia não melhorou substancialmente nos últimos 50 anos. Uma opção subutilizada para esses pacientes é a terapia baseada no metabolismo, sendo a dieta cetogênica rica em gorduras e pobre em carboidratos a forma mais amplamente utilizada. No entanto, o benefício total da dieta cetogênica é dificultado por problemas na implementação. Os esforços para decifrar os mecanismos de ação concentraram-se principalmente nos metabólitos de ácidos graxos e na restrição de carboidratos. O outro componente relevante da dieta cetogênica é a proteína, que é minimizada para induzir cetose sistêmica. Assim, a possibilidade de que as proteínas ou seus componentes aminoácidos possam contribuir ativamente para a eficácia da dieta cetogênica parece contraintuitiva. Além disso, os aminoácidos livres estimulam potentemente a quinase sensora de nutrientes mTORC1 (alvo mamífero do complexo rapamicina 1), que já está hiperativa em pacientes com epilepsia com mutações no TSC1/2 (complexo de esclerose tuberosa). Além disso, a atividade do mTOR está elevada no cérebro de roedores após convulsões induzidas por ácido caínico. No entanto, o papel do mTOR em outras etiologias da epilepsia não é compreendido, e nossos estudos em camundongos do tipo selvagem indicam que o inibidor do mTOR rapamicina tem benefício mínimo ou nenhum em vários modelos de convulsões agudas.
Além de seu papel na sinalização de nutrientes para o mTORC1, a L-leucina é um aminoácido cetogênico, no sentido de que sua degradação resulta na produção de corpos cetônicos, particularmente acetoacetato e seu metabólito β-hidroxibutirato, ambos implicados como anticonvulsivantes. No entanto, níveis elevados de L-leucina e outros aminoácidos de cadeia ramificada foram associados a desfechos anormais de desenvolvimento e convulsões, diminuindo a exploração de aminoácidos potencialmente eficazes. Testamos o aminoácido cetogênico L-leucina em camundongos e encontramos uma proteção impressionante contra a atividade convulsiva, mas sem evidência de elevação de cetonas no sangue. Notavelmente, o enantiômero D-leucina foi um agente anticonvulsivante mais potente do que a L-leucina. Os L-enantiômeros de aminoácidos geralmente são considerados responsáveis pela maioria ou por todos os seus papéis biológicos, incluindo tradução de proteínas, sinalização, efeitos mediados por transportadores e como substratos metabólicos. No entanto, a D-leucina é encontrada em alimentos e é produzida por bactérias, mas não tem função fisiológica conhecida em eucariotos. Nossa descoberta de que a D-leucina, mas não a L-leucina, altera a potenciação de longa duração (LTP) em fatias agudas de cérebro é consistente com a possibilidade de que a D-leucina tenha uma atividade de sinalização previamente desconhecida em mamíferos. A D-leucina também pode oferecer uma alternativa mais segura em relação à L-leucina.
MÉTODOS
Testes de convulsão
Camundongos machos foram alojados 3–4 por gaiola após serem separados na chegada à instalação pela equipe de Cuidados com Animais. Ácido caínico (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, EUA e Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA) foi injetado por via intraperitoneal. No momento do experimento, os camundongos foram randomizados em diferentes grupos de tratamento por peso para garantir que todas as coortes tivessem pesos médios semelhantes (Figs. Suplementares 1B e 2B) e tivessem a mesma idade (5 semanas) no momento do tratamento. Os testes de convulsão foram realizados conforme descrito anteriormente. Resumidamente, o ácido caínico foi injetado i.p. e as convulsões foram pontuadas (em uma escala de 7 pontos) com base na gravidade máxima da convulsão durante épocas sequenciais de 5 minutos, usando uma escala de Racine modificada. Observe que a gravidade das convulsões nos controles tratados com veículo difere em experimentos diferentes, principalmente devido a diferentes fornecedores de ácido caínico e diferenças inerentes entre diferentes remessas de camundongos; no entanto, as coortes controle e experimental foram estreitamente pareadas. O teste de 6 Hz foi administrado exatamente como descrito anteriormente, às 6 semanas de idade (tratamentos com leucina por 2 semanas foram iniciados às 4 semanas de idade), e, como em trabalhos anteriores, qualquer mudança de comportamento foi pontuada como convulsão após a administração do eletrochoque. Os resultados de todos os camundongos testados são apresentados aqui e todas as observações foram feitas por pessoal que estava cego para a condição de tratamento durante a administração do tratamento e durante a pontuação das convulsões em todos os experimentos. As medições de glicose e β-hidroxibutirato foram realizadas em um camundongo de cada gaiola (selecionado por um gerador de números aleatórios) exatamente como descrito. Todos os protocolos animais para este estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais (ACUC) (JHU e UW) e foram rigorosamente seguidos.
Tratamentos com aminoácidos
Uma dose única de cada aminoácido dissolvido em H2O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi injetada por via intraperitoneal (i.p.) em camundongos de 5 semanas de idade, 3 h antes da injeção de ácido caínico. A pureza relatada dos lotes de L- e D-leucina utilizados foi de 99% (com base em dados de rotação óptica); a L-leucina não continha mais de 5% do isômero D, e a D-leucina continha 0,4% do isômero L (Sigma Aldrich, dados técnicos). Em experimentos separados, a L- e a D-leucina foram administradas no tempo indicado (15 ou 20 min) após a injeção de ácido caínico. O tempo de 15–20 min é a faixa intermediária para a definição clínica operacional de estado epiléptico (definido como 5–30 min de atividade convulsiva sem retorno à linha de base,). Nesses experimentos, todos os camundongos haviam apresentado pelo menos duas convulsões com pontuação ≥ 3 quando a D-leucina foi administrada, com as convulsões iniciando 10–15 min após a injeção de ácido caínico. Diazepam (solução injetável de 5 mg/ml, diluída 1:1,5 em solução salina tamponada com fosfato; Hospira, Lake Forest, IL, EUA) foi injetado i.p. aos 20 min após a injeção de ácido caínico, quando todos os camundongos haviam apresentado duas ou três convulsões de estágio ≥3.
Eletrofisiologia
Camundongos C57BL/6 machos, com 7–8 semanas de idade, de ninhadas irmãs (Harlan Laboratories, Madison, WI) foram distribuídos aleatoriamente em grupos de tratamento e fatias hipocampais foram preparadas conforme descrito anteriormente. Fatias de 6 animais diferentes foram utilizadas para estudos de LTP, testando cada fatia três vezes para relação entrada/saída e facilitação por pulso pareado, tanto antes da adição dos aminoácidos quanto após as medições de LTP na presença dos aminoácidos. Os fEPSPs foram registrados a partir do stratum radiatum de CA1 com eletrodos de registro preenchidos com LCRa (2–5 MΩ). Um eletrodo de estimulação bipolar de platina-tungstênio (92:8 Pt:Y) foi posicionado na borda CA3/CA1 ao longo da via colateral de Schaffer. A transmissão sináptica basal inicial foi avaliada para cada fatia aplicando estímulos crescentes (0,5 V – 20 V, 25 nA – 1,5 µA, isolador de estímulos A-M Systems modelo 2200, Carlsborg, WA) em líquido cefalorraquidiano artificial (LCRa) regular, sem aminoácidos, para determinar a relação entrada:saída (E/S). Os estímulos subsequentes de LTP foram ajustados para evocar um fEPSP com metade da inclinação máxima do fEPSP. Antes da indução da LTP, as fatias também foram testadas em LCRa regular sem aminoácidos usando um paradigma de facilitação por pulso pareado (FPP), que consistia em um estímulo inicial único para as colaterais de Schaffer, seguido por um segundo estímulo de magnitude igual à metade da intensidade máxima, conforme definido pela curva E/S. Esse paradigma de FPP foi repetido com intervalos interpulsos crescentes (10 ms a 300 ms). A FPP em cada intervalo de tempo foi registrada em triplicata e, em seguida, calculada a média. As inclinações dos fEPSPs do segundo pulso foram plotadas como porcentagem da inclinação inicial.
Após o registro inicial dos dados de E/S e FPP sem aminoácidos, os dados basais de pré-tratamento foram obtidos por 30 min, seguidos pela adição dos respectivos aminoácidos. Após 60 min de pré-incubação com aminoácidos, a LTP foi então induzida por estimulação theta burst (10 rajadas/trem, 3 trens/estímulo, intervalo entre trens de 20 s). Cada rajada continha 4 estímulos a 100 Hz, com um intervalo entre rajadas de 200 ms. A eficácia sináptica foi monitorada continuamente (0,05 Hz). A cada 2 min, as varreduras eram calculadas em média (pClamp, Molecular Devices). Após 180 min, ainda na presença dos aminoácidos, os dados de E/S e FPP foram adquiridos repetindo os protocolos descritos acima para verificar a integridade das preparações de fatias.
Para os experimentos de disparos em salva induzidos por potássio, após 15 min de registro basal em fatias separadas, as salvas epileptiformes foram induzidas pelo aumento do [K+]o para 7,5 mM. Uma taxa de disparo basal estável de 13,7 ± 1,0 foi estabelecida ao longo de 30 min, após os quais o LCRa com várias concentrações adicionadas de D-leucina (100 µM, 1 mM, 10 mM) foi perfundido.
Estudos de ligação de radioligante a receptores in vitro
Protocolos detalhados estão disponíveis para todos os ensaios no site do NIMH-PDSP (http://pdspdb.unc.edu/pdspWeb/?site=binding). Os ensaios de triagem primária com D-Leu foram realizados em uma concentração final de 10 µM em quadruplicata para 47 receptores diferentes, e como descrito na Fig. 4D para receptores de ácido caínico. Os resultados foram normalizados como porcentagem relativa de inibição, com a ligação específica na ausência de ligante competidor definida como 100% (sem inibição) e a ligação específica na presença do composto de referência como 0% (100% de inibição). O tampão para o ensaio de ligação secundário (Fig. 4D) foi Tris HCl 50 mM, CaCl2 2,5 mM, pH 7,4.
Estatística
No teste do ácido caínico, a inclinação da curva gerada pelos pontos de escore de convulsão foi analisada usando um modelo de regressão linear de efeitos mistos multinível com medidas individuais ao longo do tempo para cada camundongo (efeito aleatório), camundongos individuais dentro de uma coorte (efeito aleatório) e coortes dentro de um grupo de tratamento (efeito fixo) (Stata 13.1, Stata Corporation, College Station, TX, EUA). Comparações adicionais dos outros parâmetros entre os grupos foram feitas usando teste t ou ANOVA de uma via com testes post-hoc de Tukey, conforme apropriado (GraphPad Prism 4, LaJolla, CA, EUA). O nível de significância foi P ≤ 0,05 para duas comparações, e com correções de Bonferroni para comparações múltiplas (ou seja, quando seis comparações foram feitas, P ≤ 0,008 foi usado). No teste de 6 Hz, análises probit foram usadas para determinar o desfecho primário, a corrente convulsiva 50 (CC50), a corrente na qual 50% dos camundongos apresentaram qualquer comportamento convulsivo (Minitab 16, State College, PA, EUA). Os dados de eletrofisiologia foram analisados por ANOVA de 2 vias (tratamento e tempo) com medidas repetidas (modelo misto) e testes post-hoc de Bonferroni (GraphPad Prism 6, LaJolla, CA, EUA).
RESULTADOS
O pré-tratamento com L-leucina protege contra convulsões induzidas
Estudos iniciais em ratos descobriram que aminoácidos de cadeia ramificada, incluindo L-leucina, retardam o início das convulsões induzidas por picrotoxina ou pentilenotetrazol (PTZ), mas sem afetar a duração da convulsão. Testamos a L-leucina em um modelo de convulsão que desenvolvemos anteriormente para demonstrar a eficácia da dieta cetogênica, que inclui um período de pré-tratamento prolongado mais típico do uso clínico. Camundongos expostos à L-leucina na água de beber por 12–14 dias foram protegidos de convulsões induzidas por 6 Hz, com uma margem de proteção semelhante à da dieta cetogênica neste teste (Fig. 1A, Fig. suplementar 1A). No entanto, a L-leucina não induziu cetose sistêmica com base nos níveis sanguíneos normais de β-hidroxibutirato e glicose (Fig. 1B, Fig. suplementar 1B).
Relatamos anteriormente que a dieta cetogênica não protege contra convulsões induzidas pelo ácido caínico, um agonista de dois tipos de receptores de glutamato (ácido caínico e AMPA). Em contrapartida, descobrimos que uma única dose baixa de 3 mg/kg de L-leucina, injetada 3 h antes das convulsões induzidas por ácido caínico, suprimiu potentemente a atividade convulsiva, enquanto a menor dose testada (0,3 mg/kg) foi estatisticamente diferente do veículo, mas sem um benefício geral substancial (Fig. 1C & Figs. Suplementares 1C & D). A eficácia em uma dose tão baixa sugere que a L-leucina pode atuar por um mecanismo de sinalização de receptores, em vez de como um substrato metabólico. Curiosamente, a maior dose de 300 mg/kg de L-leucina, selecionada com base nos estudos anteriores em ratos, apresentou apenas proteção intermediária, possivelmente refletindo toxicidade por aminoácidos de cadeia ramificada (Fig. 1C & Figs. Suplementares 1C & D). A dieta cetogênica pode não proteger neste ensaio porque seu mecanismo difere do da L-leucina ou porque a dieta cetogênica adaptada para camundongos não foi otimizada para detectar os efeitos benéficos dos aminoácidos.
Para avaliar melhor se a proteção mediada pela L-leucina está relacionada a efeitos cetogênicos não detectados por nossos ensaios, a L-lisina, o outro aminoácido que é apenas cetogênico (isto é, não também glicogênico), foi testada contra convulsões induzidas pelo ácido caínico. A L-lisina (3 mg/kg) não proporcionou proteção clínica substancial (embora tenha sido estatisticamente significativa para a duração das convulsões) e não foi investigada mais a fundo (Fig. 1D & Fig. Suplementar 1E).
O pré-tratamento com o enantiômero D-leucina protege potentemente contra convulsões induzidas Consideramos a possibilidade de que um contaminante presente em fontes comerciais de L-leucina (preparada a partir de uma fonte bacteriana, dados técnicos da Sigma Aldrich) fosse responsável pela atividade anticonvulsivante observada. O contaminante mais abundante é o enantiômero D-leucina. A D-leucina não é sintetizada por animais, mas é ingerida a partir de fontes alimentares e está presente no tecido cerebral, incluindo o hipocampo (ratos e camundongos), a glândula pineal (ratos), o cérebro (camundongos) e outras regiões cerebrais em concentrações mais baixas. Descobrimos que duas semanas de D-leucina na água de beber (1,5% p/v) protegeram no teste de 6 Hz (Fig. 2A, Figs. Suplementares 2A). De modo semelhante à L-leucina, mas diferentemente da dieta cetogênica, a D-leucina não teve efeito aparente sobre a cetose sistêmica, pois os níveis sanguíneos de β-hidroxibutirato e glicose não se alteraram, e não houve diferença no consumo de alimento ou água, nem nos pesos corporais (Figs. Suplementares 1B e 2B). Assim, parece improvável que a proteção contra convulsões pela L- e D-leucina seja mediada por efeitos sobre as alterações metabólicas sistêmicas.
A dose elevada (300 mg/kg) de D-leucina suprimiu de forma potente a atividade convulsiva induzida pelo ácido caínico, semelhante à dose de 3 mg/kg (Fig. 2B, Fig. Suplementar 2C e D). A D-leucina parece ser um anticonvulsivante mais potente do que a L-leucina, porque os camundongos tratados com veículo apresentaram intensidades de convulsão um pouco mais intensas do que nos experimentos testando a L-leucina (compare os controles H2O nas Figs. 1C e 2B, Figs. Suplementares 1D e 2D). A D-leucina também pode reduzir a atividade convulsiva um pouco mais precocemente do que a L-leucina. A contaminação cruzada da D-leucina ou da L-leucina com seus enantiômeros não pode explicar a proteção observada por qualquer um dos enantiômeros, uma vez que o nível de contaminação na dose de 3 mg/kg é inferior à dose ineficaz de 0,3 mg/kg (ver Métodos). No entanto, esses dados não excluem a possibilidade de a L- e/ou D-leucina sofrer racemização após a injeção, embora o curto intervalo de tempo para o início do efeito pareça inconsistente com essa hipótese.
A D-leucina interrompe crises em andamento
Para mimetizar mais de perto os contextos clínicos, a D-leucina foi administrada 15 min após a injeção de ácido caínico nos animais (aproximadamente 5–10 min após o início da atividade convulsiva). Surpreendentemente, tanto a dose alta (300 mg) quanto a baixa (3 mg) de D-leucina aboliram a atividade convulsiva comportamental em todos os camundongos testados (Fig. 3, Fig. Suplementar 3). A D-leucina também foi comparada ao diazepam, o medicamento mais comumente usado para interromper o estado de mal epiléptico em roedores (e um medicamento comumente usado na clínica) que também é um forte sedativo. Para proporcionar um desafio ainda maior ao tratamento, os camundongos receberam uma dose mais elevada de ácido caínico, e o tratamento com D-leucina e/ou diazepam foi postergado até 20 min após o ácido caínico. Todos os tratamentos levaram a melhores escores de convulsão (Fig. 4A, Fig. Suplementar 4A e B). Entretanto, nenhum dos camundongos tratados apenas com diazepam retornou ao valor basal até 3 h (isto é, escore de convulsão = 0 e despertar fácil com movimentação suave da gaiola). Além disso, os camundongos tratados apenas com D-leucina retornaram ao valor basal em menos tempo do que a combinação de medicamentos (Fig. 4B). Em contraste com a D-leucina, a L-leucina não proporcionou nenhum benefício substancial contra um estímulo convulsivo semelhante, embora a L-leucina tenha alcançado significância estatística (Fig. 4C, Fig. Suplementar 4C). Assim, a D-leucina interrompe as crises em andamento de forma mais eficaz do que o diazepam, enquanto a L-leucina foi ineficaz após o início das crises.
Nenhum candidato a receptor para D-leucina
Para investigar possíveis mecanismos anticonvulsivantes, determinamos se a D-leucina poderia competir com a ligação do ácido caínico a receptores endógenos. No entanto, a D-leucina não conseguiu deslocar o ácido caínico radiomarcado de seus receptores em preparações teciduais, ao contrário do L-glutamato (Fig. 4D). Portanto, a proteção no teste do ácido caínico provavelmente não se deve à competição da D-leucina pelos sítios de ligação do ácido caínico nos receptores glutamatérgicos. Em busca de um receptor para a D-leucina, um painel de receptores neuronais candidatos foi triado quanto à possível ligação à D-leucina pelo Programa de Triagem de Drogas Psicoativas do Instituto Nacional de Saúde Mental (NIMH-PDSP). Nesses ensaios, a D-leucina foi testada quanto à capacidade de competir com ligantes radiomarcados específicos para um painel de 48 receptores e transportadores neuronais comuns, incluindo receptores acoplados à proteína G, canais iônicos e transportadores, conforme descrito. Como esperado, a D-leucina não conseguiu competir pela ligação aos receptores de ácido caínico, mas também não reduziu a ligação de outros radioligantes aos 47 receptores restantes testados (receptores glutamatérgicos, GABAA, serotoninérgicos, adrenérgicos, dopaminérgicos, histaminérgicos, muscarínicos, Sigma 1/2 e opiáceos) e transportadores (serotonina, dopamina e norepinefrina) (Fig. Suplementar 5). Esses resultados indicam que a D-leucina não se liga competitivamente aos mesmos sítios nem reduz alostericamente a afinidade dos ligantes por seus receptores cognatos. De modo positivo, a D-leucina também parece não apresentar interações inespecíficas com esse painel de receptores do sistema nervoso central, descartando alvos de ligação fora do sítio comumente observados com outras moléculas pequenas.
Nenhum receptor candidato para D-leucina foi identificado nesta triagem. No entanto, como apenas um sítio de ligação foi testado para cada receptor ou transportador (ex.: o sítio MK-801 no receptor NMDA), é formalmente possível que a D-leucina se ligue a outros sítios em uma ou mais dessas proteínas. A falta de efeitos detectáveis na ligação ao substrato, combinada com a faixa de dosagem eficaz nos testes de convulsão em animais, sugere uma margem de segurança que pode ter utilidade clínica.
D-Leucina atenua a potenciação de longa duração, mas não a atividade sináptica basal
LTP representa o aumento duradouro da transmissão de sinal entre dois neurônios que resulta da sua estimulação síncrona e, portanto, representa uma forma de plasticidade sináptica. A medida de LTP é um dos métodos mais comuns para avaliar a função sináptica, a qual (cronicamente) está subjacente não apenas às crises epilépticas, mas também a tarefas rotineiras, como a formação de memória. Portanto, testamos a D-leucina em um paradigma de LTP (estimulação theta burst, TBS) para mimetizar a atividade fisiológica dos neurônios hipocampais. Os declives dos potenciais pós-sinápticos excitatórios de campo (fEPSP) foram significativamente atenuados após a aplicação de 2 mM de D-leucina durante a fase precoce de manutenção independente da síntese proteica, enquanto 2 mM de L-leucina não tiveram efeito (a indução de LTP não foi afetada pela aplicação de D- ou L-leucina em comparação aos controles) (Fig. 5A). Notavelmente, o efeito da D-leucina é mais brando do que o relatado para o diazepam, que bloqueia completamente a LTP. Além disso, nenhum dos aminoácidos teve efeito significativo sobre as relações entrada/saída da função sináptica basal antes da adição dos aminoácidos em comparação com após o platô de LTP na presença dos aminoácidos (Fig. 5B).
Para avaliar qualquer possível contribuição pré-sináptica para a transmissão sináptica, a facilitação por pulso pareado (PPF), uma forma de plasticidade de curta duração, também foi examinada. Houve um grau similar de PPF após o tratamento tanto com veículo quanto com os isômeros de leucina em todos os intervalos inter-estímulo testados (Fig. 5C). Esses resultados comprovam a viabilidade das preparações de fatias.
Para caracterizar os efeitos da D-leucina sobre a hiperexcitabilidade neuronal (isto é, uma medida da propensão a desenvolver crises), elicitamos descargas epileptiformes utilizando potássio extracelular elevado ([K+]o). Não houve diferença na taxa de disparos em salva com nenhuma concentração de D-leucina em comparação com a linha de base pré-leucina ou a lavagem, indicando ausência de efeitos óbvios sobre a atividade epileptiforme induzida (Fig. Suplementar 6).
DISCUSSÃO
Descobrimos que concentrações muito baixas de D-leucina terminam de forma potente crises em andamento ou elevam o limiar convulsivo em camundongos. Este achado é surpreendente porque não se conhece uma função para a D-leucina endógena na epilepsia ou em qualquer outro processo na biologia eucariótica. A D-leucina não é incorporada em proteínas de mamíferos e não estimula a atividade do mTOR de forma apreciável.
A distinção entre os enantiômeros L e D pode ser clinicamente importante, uma vez que os L-aminoácidos de cadeia ramificada estão sendo investigados para uso terapêutico em pacientes com níveis baixos devido à deficiência da quinase da desidrogenase de cetoácidos de cadeia ramificada (OMIM 614923). Com exceção desse distúrbio raro, o tratamento da epilepsia idiopática com altas doses de L-leucina apresenta potenciais questões de segurança devido à neurotoxicidade relatada em pacientes com mutações que levam ao aumento de aminoácidos de cadeia ramificada, incluindo a L-leucina (doença da urina do xarope de bordo). O potencial clínico da L-leucina para epilepsia é ainda mais desafiado pela descoberta de que a exposição aguda à L-leucina induz hipoglicemia por meio da secreção de insulina em camundongos.
Embora uma leucina racemase não tenha sido identificada em mamíferos, não podemos descartar a possibilidade de que possa haver um baixo nível de conversão de D- para L-leucina via desaminação oxidativa (D-aminoácido oxidase), seguida por reaminação mediada por transaminase. No entanto, isso não é corroborado por nosso achado de que a D-leucina foi mais eficaz na dose mais alta testada (300 mg/kg) do que a L-leucina no teste do ácido caínico. Também não podemos descartar a possibilidade de que um produto da degradação da D-leucina seja responsável por seus efeitos, embora nossos dados de fatias hipocampais (Fig. 5) sugiram que metabólitos de origem renal e hepática não sejam os mecanismos subjacentes.
Comparação com outros tratamentos
O ácido caínico é um modelo amplamente utilizado de convulsões de início focal, a causa mais comum de epilepsia em adultos. O pré-tratamento de camundongos com os fármacos clinicamente aprovados diazepam, valproato, etossuximida e topiramato reduz a gravidade das convulsões após uma infusão intravenosa de ácido caínico, embora os resultados para o fenobarbital sejam mistos. Em contraste, a fenitoína, a carbamazepina e a lamotrigina são inativas neste teste. No entanto, o diazepam administrado após o início das convulsões (administrado após 5 min de atividade convulsiva repetitiva) interrompe a progressão do estado de mal epiléptico induzido por ácido caínico i.p., de forma semelhante aos nossos achados. Assim, a D-leucina parece se comparar favoravelmente aos tratamentos anticonvulsivantes clínicos comuns durante o período de observação no teste do ácido caínico.
Descobrimos que a D-leucina inibe a LTP na região CA1 do hipocampo, com o desvio das inclinações dos fEPSPs ocorrendo aproximadamente 30 a 60 minutos após a estimulação, mais cedo do que as alterações relatadas na síntese de proteínas. Outros relataram que a indução de LTP é completamente bloqueada no giro denteado em fatias de hipocampo de ratos que receberam injeções intra-hipocampais de L-leucina 24 horas antes, com o intuito de mimetizar os altos níveis intracerebrais em pacientes com doença da urina em xarope de bordo. Em contraste, nós descobrimos que a D-leucina apenas reduziu (mas não bloqueou) a LTP, e a D-leucina não afetou a frequência de bursting induzida por alto K+, ao contrário dos potenciadores alostéricos GABAérgicos (pentobarbital, benzodiazepínicos). O bloqueador dos canais de sódio fenitoína também não afeta o bursting, mas é ineficaz no teste de 6 Hz, diferenciando-o da D-leucina. Esses dados sugerem que a D-leucina possui um mecanismo de ação diferente de outros agentes que reduzem o bursting.
Alguns medicamentos anticonvulsivantes eficazes (p. ex., diazepam) inibem completamente a LTP, restringindo as interpretações sobre possíveis mecanismos fisiológicos para a prevenção de crises. Uma preocupação geral é que um medicamento que inibe a LTP também possa ter um efeito adverso sobre o aprendizado e a memória. No entanto, efeitos discordantes entre LTP e comportamento foram observados para outro medicamento anticonvulsivante, o felbamato, que reduz a LTP, mas não leva a déficits de aprendizado em roedores. Assim, a relação entre o efeito da D-leucina na LTP e o aprendizado requer mais estudos.
Os únicos outros relatos que mostram um efeito in vivo da D-leucina sugerem um mecanismo relacionado a opioides, com base em evidências de que a D-leucina inibe o transporte de encefalinas através da barreira hematoencefálica e que a naloxona reverte substancialmente esses efeitos analgésicos. No entanto, o papel de receptores opioides específicos na epilepsia não é claro. É improvável que a D-leucina bloqueie as crises por esse mecanismo, pois a dose eficaz mais baixa de D-leucina em nossos testes de crise é várias ordens de grandeza menor do que a necessária para analgesia. Além disso, nossos ensaios de ligação não detectaram ligação da D-leucina aos receptores opioides mu, delta ou kappa. No entanto, como a D-leucina não é incorporada através de processos biossintéticos em proteínas nos eucariotos, prevemos que a D-leucina tenha um receptor específico. Embora não testado aqui, foi relatado que D-aminoácidos (incluindo D-leucina) se ligam aos receptores acoplados à proteína G Tas1R2/R3, mas um papel para esses receptores na epilepsia não foi relatado.
Com base na proteção contra crises em testes quimicamente induzidos e de eletrochoque, os dados aqui apresentados sugerem que a D-leucina pode ser um tratamento inovador para crises. Surpreendentemente, a D-leucina foi eficaz após o início das crises, enquanto a L-leucina não foi. Além disso, a D-leucina foi mais potente como fármaco anticonvulsivante do que em estudos anteriores como agente analgésico. Esses achados podem abrir uma nova área de investigação para o uso terapêutico de D-aminoácidos em distúrbios neurológicos.
Este é um arquivo PDF de um manuscrito não editado que foi aceito para publicação. Como um serviço aos nossos clientes, estamos fornecendo esta versão inicial do manuscrito. O manuscrito passará por edição de texto, diagramação e revisão da prova resultante antes de ser publicado em sua forma final citável. Por favor, observe que durante o processo de produção podem ser descobertos erros que podem afetar o conteúdo, e todas as isenções legais que se aplicam ao periódico são aplicáveis.
Contribuições dos autores
ALH, JMH e CES conceberam e projetaram os experimentos; ALH, PS, KO e CES realizaram a pesquisa; ALH, PS, KO, CES e JMH analisaram os dados; JMH, ALH e CES prepararam o manuscrito.
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
REFERÊNCIAS
A leucina modula o sistema de transporte de peptídeos-1 através da barreira hematoencefálica no sítio estereoespecífico do sistema nervoso central
Regulação do mTORC1 por aminoácidos
Caracterização farmacológica do modelo de crise psicomotora de 6 Hz da epilepsia parcial
O sabor dos D- e L-aminoácidos: Ensaios de ligação in vitro com receptores amargos (TAS2Rs) e doces (TAS1R2/TAS1R3) humanos clonados
Design automatizado de ligantes para perfis polifarmacológicos
Geração de corpos cetônicos a partir da leucina por células astrogliais cultivadas
Padrões de resposta ao tratamento na epilepsia recém-diagnosticada
Um tratamento combinado com D-aminoácidos e eletroacupuntura produz uma analgesia maior do que qualquer tratamento isoladamente; a naloxona reverte esses efeitos
Efeito de drogas anticonvulsivantes na atividade epileptiforme induzida por ácido caínico
A sinalização hipotalâmica do mTOR regula a ingestão de alimentos
Modelos de crises com ácido caínico e 4-aminopiridina em camundongos: avaliação da eficácia de agentes antiepilépticos e antagonistas do cálcio
Papel biológico da D-aminoácido oxidase e D-aspartato oxidase. Efeitos dos D-aminoácidos
Benzodiazepínicos bloqueiam a potenciação de longo prazo em fatias de hipocampo e córtex piriforme
Modulação da atividade convulsiva induzida por pentilenotetrazol por aminoácidos de cadeia ramificada e alfa-cetoisocaproato
Avaliação da concentração e pureza enantiomérica de aminoácidos livres selecionados em bebidas fermentadas de malte (cervejas)
Estudo in vitro dos efeitos metabólicos dos D-aminoácidos
Os efeitos dos aminoácidos no repressor traducional 4E-BP1 são mediados principalmente pela L-leucina em adipócitos isolados
Liberação de insulina e efluxo de íons fosfato de ilhotas pancreáticas de ratos induzidos por L-leucina e seu análogo não metabolizável, ácido 2-aminobiciclo[2.2.1]heptano-2-carboxílico
Tratamento do estado epiléptico precoce e tardio induzido por ácido caínico com o antagonista não competitivo do receptor AMPA GYKI 52466
Resgate da plasticidade sináptica e déficits de aprendizado espacial no hipocampo de camundongos knockout para Homer1 pela entrega gênica viral adeno-associada recombinante de Homer1c
A administração intra-hipocampal de leucina prejudica a consolidação da memória e a geração de LTP em ratos
Distribuição regional e mudanças pós-natais dos D-aminoácidos no cérebro de ratos
Determinação de D-prolina e D-leucina livres nos cérebros de camundongos mutantes sem atividade da D-aminoácido oxidase
A neurofarmacologia da dieta cetogênica
Eficácia da dieta cetogênica no teste de convulsão de 6 Hz
O inibidor de mTOR Rapamicina tem efeitos anticonvulsivantes agudos limitados em camundongos
Aproveitando o poder do metabolismo para prevenção de convulsões: foco em tratamentos dietéticos
Aspectos clínicos da dieta cetogênica
Testes de convulsão distinguem o jejum intermitente da dieta cetogênica
Incidência de epilepsia e convulsões não provocadas em Rochester, Minnesota: 1935–1984
O topiramato protege seletivamente contra convulsões induzidas por ATPA, um agonista do receptor de cainato GluR5
Vigilância de epilepsia entre adultos - 19 Estados, Sistema de Vigilância de Fatores de Risco Comportamentais, 2005
Atividade de disparo epileptiforme induzida por potássio no hipocampo e sua regulação pela inibição mediada por GABA
Potenciação de Longo Prazo em Sinapses Hipocampais CA3-CA1 com Ênfase Especial em Envelhecimento, Doença e Estresse
Identificação precoce da epilepsia refratária
FGF21 é um sinal endócrino de restrição proteica
Estado de mal epiléptico: uma visão geral do problema clínico
Doença da urina do xarope de bordo; um erro inato do metabolismo da valina, leucina e isoleucina associado a deficiência mental grave
LTP e LTD: uma riqueza embaraçosa
Mecanismos de Ação da Dieta Cetogênica
Uma nova síndrome: disfunção cerebral infantil familiar progressiva associada a uma substância urinária incomum
A perda do gene supressor tumoral p53 protege os neurônios da morte celular induzida por cainato
Identificação, purificação e caracterização de uma nova aminoácido racemase, isoleucina 2-epimerase, de espécies de Lactobacillus
A dieta cetogênica para o tratamento da epilepsia infantil: um ensaio clínico randomizado
Efeitos analgésicos dos D-aminoácidos em quatro linhagens isogênicas de camundongos
O efeito protetor de uma dieta cetogênica na morte celular hipocampal induzida por ácido caínico em camundongos ICR machos
Mutações na BCKD-cinase levam a uma forma potencialmente tratável de autismo com epilepsia
O complexo da esclerose tuberosa
L-Leucina melhora a anemia e os defeitos de desenvolvimento associados à anemia de Diamond-Blackfan e SMD del(5q) ativando a via mTOR
Regulação metabólica da plasticidade neuronal pelo sensor de energia AMPK
Efeitos do fármaco antiepiléptico felbamato na potenciação de longo prazo na região CA1 de fatias hipocampais de rato
Hipoglicemia experimental induzida por leucina em camundongos
Perfil anticonvulsivante de uma dieta cetogênica equilibrada em modelos agudos de convulsão em camundongos
As GTPases Rag se ligam à raptor e medeiam a sinalização de aminoácidos para mTORC1
Efeitos da valina, leucina, isoleucina e uma solução balanceada de aminoácidos no limiar convulsivo à picrotoxina em ratos
Felbamato, um novo agente antiepiléptico, não afeta a cognição em roedores
Ações anticonvulsivantes e antiepilépticas da 2-desoxi-D-glicose em modelos de epilepsia
Farmacologia dos receptores ionotrópicos de glutamato: uma perspectiva estrutural
Modulação do limiar convulsivo para aminoácidos excitatórios em camundongos por drogas antiepilépticas e quimioconvulsivantes
Crises eletrográficas espontâneas induzidas por potássio em fatia hipocampal de rato
Sistemas do tronco encefálico-diencefálico-septo-hipocampais controlando o ritmo teta do hipocampo
Drogas anticrises modulam diferencialmente a potenciação de longa duração induzida por rajadas teta em camundongos C57BL/6
Efeitos da modulação diferencial dos sistemas opioides mu, delta e kappa sobre convulsões induzidas por bicuculina em camundongo
Senso comum sobre o paladar: de mamíferos a insetos
Resposta do metabolismo de aminoácidos cerebrais à cetose
A via de sinalização do alvo da rapamicina em mamíferos medeia a epileptogênese em um modelo de epilepsia do lobo temporal
O pré-tratamento com L-leucina protege contra convulsões
(A) Probabilidade de camundongos apresentarem convulsão nas correntes de estímulo de 6 Hz indicadas para camundongos pré-tratados sem ou com L-leucina (1,5% p/v) na água de beber por 12–14 dias. Os dados são de 3 coortes independentes. Os pontos de dados representam a porcentagem de camundongos de todas as coortes que tiveram convulsões em uma dada corrente. As curvas de análise probit representam uma função de probabilidade, portanto, nem todos os pontos se encontram sobre a curva (N = 24–28/tratamento, P=0,02, análise probit). (B) Níveis sanguíneos de β-hidroxibutirato no dia do teste de convulsão em camundongos pré-selecionados aleatoriamente (usando um gerador de números aleatórios) das mesmas coortes da Fig. 1A (H2O N = 6 camundongos, L-leucina N = 7 camundongos, P = 0,79, teste t). As barras sólidas indicam a média; a linha tracejada indica o nível de β-hidroxibutirato observado em camundongos alimentados com uma dieta cetogênica. (C) Escores máximos médios de convulsão (±EPM) para cada intervalo consecutivo de 5 min durante 2 h após a injeção de ácido caínico (23,5 mg/kg) para 3–4 coortes independentes de camundongos pré-tratados com L-leucina ou água (veículo) por 3 h (N = 8–36/tratamento, P < 0,001, modelo de regressão linear de efeitos mistos multinível). (D) Escores máximos médios de convulsão (±EPM) em intervalos consecutivos de 5 min no teste de convulsão por ácido caínico (23,5 mg/kg) para 2 coortes independentes de camundongos pré-tratados com L-lisina (3 mg/kg) ou água (veículo) por 3 h. (N = 8/tratamento, P <0,001, modelo de regressão linear de efeitos mistos multinível). (A–D) Todos os animais testados são apresentados.
O pré-tratamento com D-leucina protege contra convulsões
(A) Probabilidade de camundongos apresentarem convulsões induzidas por 6 Hz, conforme descrito na Fig. 1A, exceto pelo tratamento com D-leucina (1,5% p/v). Os dados são de 3 coortes independentes; todos os camundongos testados são apresentados. (N = 21–22/tratamento, P = 0,02, análise probit). (B) Médias dos escores máximos de convulsão para intervalos consecutivos de 5 min (±EPM) no teste de convulsão por ácido caínico (23,5 mg/kg) para 3–4 coortes independentes de camundongos pré-tratados com D-leucina ou água (veículo) por 3 h e posteriormente observados por 2 h após a administração de ácido caínico (N = 8–15/tratamento, P < 0,001, modelo de regressão linear de efeitos mistos multinível). (A–B) Todos os animais testados são apresentados.
O tratamento com D-leucina após o início da convulsão protege contra convulsões induzidas por ácido caínico (i.p.)
(A) Escores médios de crises convulsivas (±EPM) para 2 coortes de camundongos tratados com D-leucina (300 mg/kg) 15 min após o início das crises induzidas por ácido caínico (23,5 mg/kg i.p.) (seta vermelha). (N = 8/tratamento, P <0,001, modelo de regressão linear de efeitos mistos multinível). (B) Escores médios de crises convulsivas (±EPM) obtidos em intervalos de 5 min para 2 coortes de camundongos tratados com D-leucina (3 mg/kg) 15 min após a indução das crises (seta vermelha). (N = 8/tratamento, P < 0,001, modelo de regressão linear de efeitos mistos multinível). (A–B) Todos os animais testados são apresentados.
Comparação dos tratamentos com D-leucina e diazepam após o início das crises convulsivas
(A) As médias dos escores máximos de crises convulsivas em intervalos consecutivos de 5 min (±EPM) para 4 coortes independentes foram determinadas utilizando condições de crises ligeiramente mais fortes (25 mg/kg de ácido caínico i.p.). Não houve diferenças entre os grupos de tratamento nos escores médios de crises antes do tratamento. Aos 20 min (seta vermelha) após a injeção de ácido caínico (25 mg/kg i.p.), os camundongos foram tratados com uma dose única de D-leucina (3 mg/kg), diazepam (10 mg/kg), uma combinação de D-leucina (3 mg/kg) e diazepam (10 mg/kg) ou uma combinação de seus respectivos veículos (H2O e PBS), respectivamente (N = 8/tratamento, P < 0,001 para comparações entre todos os grupos de tratamento, modelo de regressão linear de efeitos mistos multinível). (B) Gráfico de dispersão mostrando o tempo até o escore de crise = 0 (P= 2,7E-05, teste t). Um camundongo no grupo D-Leu + DZP nunca atingiu escore = 0 e, portanto, foi omitido desta análise. Barras, escore médio. (C) Escores médios de crises convulsivas (±EPM) obtidos em intervalos de 5 min para 2 coortes de camundongos tratados com L-leucina (3 mg/kg) 15 min após a injeção de ácido caínico (25 mg/kg) (seta vermelha). (N = 8/tratamento, P ≤ 0,001, modelo de regressão linear de efeitos mistos multinível; ver Métodos). Todos os animais testados são apresentados para os painéis A–C. (D) D-leucina e L-glutamato (controle positivo) foram testados nas concentrações indicadas quanto à capacidade de competir com o ácido caínico-3H ligado a seus receptores em preparações de membrana de cérebro de rato. Os valores indicam a porcentagem de inibição da ligação do ácido caínico (média ± EPM) em três ensaios independentes, cada um em triplicata (Ki = >10.000 nM).
D-leucina inibe a potenciação de longa duração na área CA1 do hipocampo
(A) Inclinação do fEPSP de campo em função do tempo antes e depois da estimulação theta burst (TBS). Ao longo das 3 horas após a TBS, há uma redução significativa da variação percentual na inclinação do fEPSP ao longo do tempo (ou seja, uma inclinação menor do fEPSP pós-TBS) com 2 mM de D-leucina [(efeito principal do tratamento F(1,15)=26.83, P = 0.0001)], mas não com o tratamento com 2 mM de L-leucina em comparação ao controle (efeito principal do tratamento F(1,13)=1.584, P = 0.23); 2 mM de D-leucina comparado a 2 mM de L-leucina também foi significativo (efeito principal do tratamento, F(1,13)= 8.431, P = 0.01). Dados agrupados de N fatias (número de animais indicado entre parênteses). Seta, aplicação dos aminoácidos durante o experimento (barra preta). (B) As curvas de input/output não mostram efeito na inclinação do fEPSP em função da voltagem de estimulação antes e depois da D-leucina e L-leucina em comparação aos controles não tratados (efeito principal do tratamento, F=(4,44)=0.2898, P = 0.83). (C) O protocolo de facilitação por pulso pareado (PPF) não mostra efeito dos aminoácidos na amplitude do fEPSP (percentual do primeiro estímulo) em função do intervalo entre estímulos (efeito principal do tratamento, F=(4,44) =1.387, P =0.26).
HIGHLIGHTS
O aminoácido cetogênico L-leucina suprime potentemente convulsões em modelos de camundongo
A D-leucina é mais eficaz do que a L-leucina, mas nenhuma das duas induz cetose
Apenas a D-leucina funciona após o início das convulsões e reduz a potenciação de longa duração
O suposto receptor de D-leucina não está entre o painel de 48 receptores neuronais testados