pmid: "29988087"
title: "Leucina compete com a quinurenina pelo transporte do sangue para o cérebro e previne o comportamento do tipo depressivo induzido por lipopolissacarídeo em camundongos."
authors: "Walker AK, Wing EE, Banks WA, Dantzer R"
journal: "Molecular psychiatry"
pubdate: "2019 Oct"
doi: "10.1038/s41380-018-0076-7"
source: "PMC Full Text"

Leucina compete com a quinurenina pelo transporte do sangue para o cérebro e previne o comportamento do tipo depressivo induzido por lipopolissacarídeo em camundongos.

Autores

Walker AK, Wing EE, Banks WA, Dantzer R

Periodico

Molecular psychiatry (2019 Oct)

Conteudo

A leucina compete com a quinurenina pelo transporte do sangue para o cérebro e previne o comportamento do tipo depressivo induzido por lipopolissacarídeo em camundongos

A inflamação ativa a indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), que metaboliza o triptofano em quinurenina. A quinurenina circulante é transportada para o cérebro pelo transportador de aminoácidos grandes LAT1 ao nível da barreira hematoencefálica. Nossa hipótese é de que a administração de leucina, que tem alta afinidade pelo LAT1, poderia impedir a entrada de quinurenina no cérebro e atenuar a formação de metabólitos neurotóxicos da quinurenina. Para testar se a leucina poderia prevenir o comportamento do tipo depressivo induzido por inflamação, camundongos foram tratados com lipopolissacarídeo (LPS, 0,83 mg/kg IP) ou solução salina e receberam L-leucina (50 mg/kg, IP) ou veículo administrados antes e 6 h após o LPS. O comportamento do tipo depressivo foi medido pelo aumento da duração da imobilidade no teste do nado forçado e pela diminuição da preferência por sacarose. A leucina diminuiu os níveis cerebrais de quinurenina, bloqueou o comportamento do tipo depressivo induzido por LPS e apresentou efeitos do tipo antidepressivo em camundongos controle. A leucina não teve efeito próprio sobre o comportamento de doença e a neuroinflamação. Para confirmar que a leucina atua interferindo no transporte de quinurenina para o cérebro, camundongos foram injetados com L-leucina (300 mg/kg, IP) imediatamente antes da quinurenina (33 mg/kg IP) e os níveis cerebrais de quinurenina e o comportamento do tipo depressivo foram medidos 3 horas depois. A leucina impediu a entrada de quinurenina exógena no cérebro e aboliu o comportamento do tipo depressivo medido pelo aumento da duração da imobilidade no teste do nado forçado. Experimentos adicionais utilizando um modelo in vitro da barreira hematoencefálica confirmaram que a quinurenina compete com a leucina ao nível do transportador de aminoácidos LAT1 para captação cerebral. Esses experimentos também revelaram que o efluxo era a direção dominante do transporte de quinurenina e era amplamente independente do LAT1 e da leucina, o que explica por que a leucina pôde bloquear a captação cerebral de quinurenina sem afetar a depuração cerebral. Esses achados demonstram que a leucina possui propriedades antidepressivas em relação à depressão induzida por inflamação, e um mecanismo para isso é o bloqueio da capacidade da quinurenina de entrar no cérebro.
A ativação da enzima degradadora de triptofano indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) está implicada no desencadeamento da depressão induzida por inflamação. A IDO metaboliza o triptofano em quinurenina, que é posteriormente metabolizada em metabólitos neurotóxicos da quinurenina, incluindo o ácido quinolínico, um agonista do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). Estudos clínicos demonstraram aumentos nas razões quinurenina:triptofano medidas no plasma e no líquido cefalorraquidiano de pacientes com melanoma maligno e hepatite C em terapia com interferon-alfa, as quais se correlacionam com a intensidade dos sintomas depressivos nesses pacientes. Estudos pré-clínicos demonstraram que tanto o bloqueio genético quanto o farmacológico da IDO anulam o comportamento do tipo depressivo em camundongos induzido por lipopolissacarídeo (LPS) ou bacilo de Calmette-Guérin. O metabolismo da quinurenina no cérebro de camundongos expostos ao LPS é direcionado para a formação de metabólitos neurotóxicos da quinurenina, principalmente devido ao aumento da atividade da enzima micloglial quinurenina mono-oxigenase. No entanto, outros ramos da via da quinurenina também podem estar envolvidos, uma vez que o bloqueio genético da KMO não resgata todos os comportamentos do tipo depressivo. Além disso, o pré-tratamento com o antagonista do receptor NMDA cetamina bloqueia o desenvolvimento do comportamento do tipo depressivo induzido por LPS.
É importante destacar que quase toda a quinurenina no cérebro é derivada da periferia. Na ausência de inflamação, cerca de 80% da quinurenina cerebral é transportada do sangue para o cérebro; esse valor sobe para 98% ou mais em resposta ao LPS. Tanto o triptofano quanto a quinurenina são transportados do sangue para o cérebro pelo sistema de transporte L, também conhecido como LAT1, que transporta vários aminoácidos aromáticos e de cadeia ramificada, incluindo a L-leucina. Nosso objetivo foi determinar se é possível aproveitar o transporte sangue-cérebro da quinurenina para prevenir a depressão induzida por inflamação, inibindo competitivamente o transporte de quinurenina pelo LAT1 com L-leucina (doravante denominada leucina). A leucina foi escolhida devido à sua alta afinidade pelo LAT1 e ao fato de não ser metabolizada pela IDO, ao contrário do triptofano. Aqui, mostramos que a leucina pode reduzir o comportamento do tipo depressivo em camundongos com e sem inflamação, inibindo o transporte de quinurenina para o cérebro via LAT1.
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais e Tratamentos
Camundongos machos CD1 e C57Bl/6J (12-16 semanas de idade) (Charles River Laboratories) foram utilizados nesses experimentos. Os camundongos foram alojados individualmente em gaiolas padrão tipo caixa de sapatos, em ambiente com temperatura (23°C) e umidade (45–55%) controladas, com ciclo claro-escuro modificado de 12/12 horas (luzes acesas às 22:00). Água e ração estavam disponíveis à vontade. Os camundongos foram manipulados diariamente por 1 semana antes do experimento.
No dia da injeção, soluções frescas de LPS (L-020M4062, sorotipo 0127:B8; Sigma, St Louis, MO) e leucina foram preparadas e administradas por via intraperitoneal. O LPS foi preparado com solução salina tamponada com fosfato isotônica estéril e livre de endotoxinas (PBS). A leucina (BP385-100, Fisher, EUA) foi preparada com HCl a 6% em PBS. Veículos apropriados foram administrados para cada solução. Os camundongos receberam 0,83 mg/kg de LPS e 50 mg/kg de leucina em cada injeção ou veículo (equivolume) para os estudos de depressão induzida por inflamação. Esta dose de LPS foi escolhida por sua capacidade de induzir de forma confiável a resposta aguda do comportamento de doença e os subsequentes comportamentos do tipo depressivo nos pontos temporais aqui examinados. A dose de 50 mg/kg de leucina foi selecionada com base em estudos piloto de dose-resposta. A leucina foi administrada nos tempos 0 e 6 h para os ensaios comportamentais, e os camundongos foram aleatoriamente distribuídos nos grupos de tratamento para estes estudos: PBS + veículo (n = 17); PBS + leucina (n = 15); LPS + veículo (n = 21); LPS + leucina (n = 19). As análises bioquímicas foram realizadas 27 h após o LPS para garantir que uma concentração adequada de leucina fosse mantida para bloquear o transporte de quinurenina para o cérebro no ponto de pico de ativação da IDO (24 h). Para examinar o impacto da leucina no pico precoce da resposta inflamatória, os camundongos foram injetados uma vez no tempo 0 h e os tecidos coletados às 6 h, antes do que normalmente seria o momento da segunda injeção. Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos nos grupos de tratamento para estes estudos: PBS + veículo (n = 7); PBS + leucina (n = 8); LPS + veículo (n = 8); LPS + leucina (n = 8). Examinamos os níveis de quinurenina:triptofano nesses animais 27 horas após a administração do LPS.
Para confirmar que a leucina atua bloqueando a entrada da quinurenina no cérebro, os camundongos foram injetados por via intraperitoneal com leucina ou veículo imediatamente antes da quinurenina (equivolume) e testados 2–3 horas depois. Grupos independentes de camundongos foram utilizados para a medição da leucina cerebral e para o comportamento do tipo depressivo. A quinurenina foi injetada na dose de 33 mg/kg, pois essa dose aumentou de forma consistente a duração da imobilidade no teste do nado forçado. A leucina foi injetada na dose de 330 mg/kg para o experimento de bioquímica (n = 6 por grupo, aleatoriamente distribuídos) e 300 mg/kg para o experimento de comportamento. Os camundongos foram aleatoriamente alocados em grupos. Veículo + veículo (n = 10); veículo + quinurenina (n = 9); leucina + quinurenina (n = 10).
Ao final do experimento, os camundongos foram eutanasiados com CO2. O sangue foi coletado por punção cardíaca e os tecidos foram removidos após perfusão com PBS estéril. Todos os protocolos deste estudo foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do MD Anderson Cancer Center, Texas A&M University e Monash University.
Ensaios Comportamentais
Todos os experimentos comportamentais foram realizados durante as primeiras 5 h da fase escura do ciclo claro/escuro. A doença (perda de peso corporal, redução da ingestão de alimentos e da atividade locomotora) e o comportamento do tipo depressivo (diminuição da preferência por sacarose, aumento da imobilidade no teste do nado forçado (FST)) foram medidos conforme descrito anteriormente. Nós demonstramos anteriormente que o comportamento do tipo depressivo induzido por LPS pode ser dissociado da doença a partir de 24 h após o LPS. A doença foi medida pelas reduções induzidas por LPS no peso corporal e no consumo de alimentos, avaliadas 24 e 27 h após o LPS, e na atividade locomotora, medida 2 e 24 h após o LPS. O comportamento do tipo depressivo foi medido pela preferência reduzida por sacarose e pelo aumento da duração da imobilidade no teste do nado forçado. Para o teste de preferência por sacarose, os camundongos foram treinados para obter preferência ótima por sacarose (solução a 1%) antes do teste. Um teste de preferência por sacarose com duas garrafas foi conduzido imediatamente após a avaliação locomotora 24 h pós-tratamento, por 3 h. O teste do nado forçado foi realizado 2 h após a administração de quinurenina ou 27 h após LPS. O experimentador estava cego em relação aos grupos de tratamento durante as sessões de testes comportamentais.
Avaliação das razões quinurenina:triptofano no cérebro e no plasma
Para diminuir a variabilidade nos ensaios bioquímicos de triptofano e quinurenina cerebrais, apenas camundongos com respostas comportamentais evidentes ao LPS foram selecionados para as dosagens plasmáticas e cerebrais de quinurenina e triptofano (n = 5 para todos os grupos, exceto LPS + veículo, onde n = 7) utilizando um kit ELISA para a razão quinurenina:triptofano (Immusmol, França). Os limites de detecção para quinurenina e triptofano foram inferiores a 47,5 ng/mL e 1,2 μg/mL, respectivamente. O uso de ELISAs para medir quinurenina e triptofano no cérebro de camundongos foi otimizado em estudos piloto. O tecido cerebral foi sonicado 3 vezes por 5 s a 65% de amplitude em PBS gelado em uma proporção peso:volume de 1:1 ou 500 μL/amostra. As amostras foram então centrifugadas a 4°C a 13.000 rpm por 15 minutos e o sobrenadante armazenado a −80°C até a dosagem. No experimento sobre os efeitos da leucina na entrada de quinurenina exógena no cérebro, os camundongos foram eutanasiados 3 horas após a administração de quinurenina e leucina e as amostras cerebrais foram processadas da mesma maneira descrita acima.
Análises de Expressão Gênica
O RNA total de amostras de fígado e cérebro foi extraído com o reagente TRIzol® (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA). Todas as reações de transcrição reversa utilizaram o kit de transcriptase reversa Ambion® PureLink® RNA Mini (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA; cat # 12183018A) de acordo com as instruções do fabricante, com primers decâmeros aleatórios para cada reação. A RT-PCR em tempo real foi realizada utilizando ensaios de expressão gênica TaqMan® para interleucina (Il)6, Il1b, Il10, fator de necrose tumoral (Tnf)a, indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO)1 e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), conforme descrito anteriormente. A avaliação da expressão gênica de SLC3A2 e SLC7A5 no córtex pré-frontal de camundongos no Experimento 2 também foi determinada por qRT-PCR. SLC3A2 e SLC7A5 codificam, respectivamente, as proteínas da subunidade pesada 4F2hc e da subunidade leve CD98 do transportador LAT1.
Modelo in vitro de transporte de quinurenina, triptofano e leucina através da barreira hematoencefálica (BHE)
Células endoteliais microvasculares cerebrais primárias (BMECs) foram isoladas de camundongos CD1, cultivadas de acordo com protocolos publicados anteriormente e semeadas no fundo de um inserto de poliéster Transwell revestido com fibronectina e colágeno tipo IV para formar monocamadas de BMECs com junções de oclusão entre as células. As culturas foram utilizadas 3 dias após o início. Algumas cavidades foram tratadas com lipopolissacarídeo de Salmonella typhimurium (10 ng/ml; Sigma Aldrich) e interferon gama (1 ng/ml; PeproTech) por 6 horas na câmara luminal antes do início dos experimentos de permeabilidade. Os insertos Transwell foram então lavados com solução de albumina sérica bovina a 1% em Ringer lactato (BSA/LR a 1%) aquecida e colocados em uma nova placa de 24 cavidades. Para estudos de efluxo, 100 μl de BSA/LR a 1% fresca foram adicionados ao interior do inserto Transwell (o lado "luminal"). A radioatividade foi adicionada à cavidade (600 μl), e amostras (50 μl) foram coletadas da câmara luminal. Para estudos de influxo, 600 μl de BSA/LR a 1% fresca foram adicionados à cavidade (o lado "abluminal") e a radioatividade foi adicionada à câmara luminal. Amostras (500 μl) foram coletadas da câmara abluminal. Para estudos de efluxo, a quinurenina radioativa foi colocada no lado abluminal e as amostras foram coletadas do lado luminal. A solução de radioatividade consistia em BSA/LR a 1% com sacarose-14C (Perkin Elmer), um dos três aminoácidos tritiados (triptofano, leucina ou quinurenina; Perkin Elmer) e um aminoácido frio (triptofano, leucina, quinurenina ou o inibidor de LAT1 ácido 2-aminobiciclo-heptano-2-carboxílico [BCH]; Sigma Aldrich). Triptofano, leucina, quinurenina e BCH foram usados na concentração de 1 mM. As amostras foram coletadas aos 10, 20, 30 e 45 min após o início dos experimentos de permeabilidade. Após a coleta das amostras, um volume igual ao da amostra de BSA/LR a 1% fresca foi reposto na câmara de coleta. Foi adicionado líquido de cintilação a cada amostra e as contagens foram realizadas em um contador beta. O coeficiente de permeabilidade foi calculado de acordo com métodos anteriores. Resumidamente, a correção para variações na permeabilidade da monocamada foi feita medindo a entrada de sacarose-14C da câmara luminal para a abluminal. O coeficiente de permeabilidade endotelial Pe foi calculado como a inclinação da curva de depuração em função do tempo e expresso em microlitros por minuto por centímetro quadrado. Todos os isótopos foram adquiridos da Perkin Elmer, EUA, e usados na concentração de 1.000.000 dpm/ml.
Análises de variância de duas vias (ANOVAs) (LPS vs. PBS × leucina vs. veículo) foram realizadas para o comportamento do tipo depressivo induzido por LPS e todas as medidas bioquímicas dos tecidos. ANOVAs de medidas repetidas de três vias (LPS vs. PBS × leucina vs. veículo × tempo como fator repetido) foram realizadas para medidas de doença (perda de peso corporal, consumo de alimento, atividade locomotora). ANOVAs de uma via e testes t não pareados foram realizados para estudos de permeabilidade da BBB in vitro e comportamento do tipo depressivo induzido pela quinurenina. Comparações planejadas foram realizadas para avaliar a mudança em relação ao grupo controle, e foram determinadas usando testes de comparações múltiplas de Newman-Keuls ou testes t com alfa ajustado para o número de comparações. Para as interações LPS × leucina observadas nos desfechos de doença, comparações planejadas para o efeito da leucina foram conduzidas em relação à presença ou ausência de LPS. Os testes estatísticos foram bilaterais e a variância entre os grupos foi avaliada. Em casos de heterocedasticidade, foram aplicados testes t de variância desigual. Todos os experimentos foram replicados pelo menos duas vezes. Os outliers foram excluídos quando estavam a mais de 2 desvios padrão da média. As estimativas do tamanho da amostra foram realizadas com base em estudos anteriores investigando os efeitos in vivo do LPS sobre o comportamento e a quinurenina, e na modelagem in vitro da barreira hematoencefálica, com base em um tamanho de efeito esperado de 0,8 unidade padronizada, com poder de 80% e nível de significância de 5%.
RESULTADOS
A leucina previne o comportamento do tipo depressivo (Figura 1A,B)
Para determinar se a leucina pode bloquear o desenvolvimento do comportamento do tipo depressivo induzido pelo LPS, tratamos camundongos com 50 mg/kg de leucina por via IP imediatamente antes e 6 h após 0,83 mg/kg de LPS e avaliamos o comportamento do tipo depressivo de 24 a 27 h após o LPS. O LPS reduziu a preferência por sacarose (F(1,63) = 38,9, p < 0,0001) e aumentou a imobilidade no FST (F(1,66) = 5,14, p < 0,05). Por outro lado, o tratamento com leucina reverteu esses efeitos em ambos os ensaios para camundongos tratados com ou sem LPS (F(1,63) = 5,14, p < 0,0001 para preferência por sacarose, e F(1,66) = 5,95, p < 0,05 para imobilidade no FST), indicando propriedades antidepressivas da leucina (Figura 1A,B).
A leucina diminui as razões quinurenina:triptofano no cérebro (Figura 1C,D)
Para determinar se o comportamento do tipo depressivo induzido por LPS correspondia a níveis aumentados de quinurenina no plasma e no cérebro, e se os efeitos do tipo antidepressivo da leucina correspondiam a concentrações cerebrais diminuídas de quinurenina, avaliamos quinurenina e triptofano no cérebro e plasma de camundongos tratados com LPS e leucina vs. controles. Como esperado, as razões quinurenina:triptofano no cérebro e plasma de camundongos tratados com LPS e leucina vs. controles. Como esperado, o LPS administrado 27 h antes aumentou as razões quinurenina:triptofano tanto no plasma quanto no cérebro, independentemente do tratamento com leucina (F(1,20) = 17,6, p < 0,001 e F(1,17) = 5,96, p < 0,05, respectivamente). Mais importante ainda, a leucina reduziu as razões quinurenina:triptofano no cérebro tanto em camundongos tratados com LPS quanto nos controles (F(1,17) = 4,53, p < 0,05) (Figura 1C,D). Não foram observadas diferenças no triptofano plasmático e cerebral. O LPS aumentou a quinurenina plasmática e cerebral (F(1,20) = 16,4, p < 0,001 e F(1,18) = 4,83, p < 0,05, respectivamente). A leucina reduziu os níveis cerebrais de quinurenina (F(1,18) = 10,46, p < 0,01) (Figura Suplementar 1). Não foram observadas interações entre LPS e leucina.
Para confirmar que as concentrações cerebrais reduzidas de quinurenina e os efeitos do tipo antidepressivo da leucina não foram confundidos por efeitos inespecíficos da leucina na inflamação, avaliamos a doença e medimos citocinas e mRNAs de IDO nos fígados, córtices pré-frontais (CPF) e hipocampos coletados 6 h (após uma injeção de leucina) e 27 h (após 2 injeções de leucina). Como esperado, observamos que o LPS aumentou a expressão de citocinas pró-inflamatórias, IL-10 e IDO no fígado, córtex pré-frontal e hipocampo com alguma variação entre 6 e 27 h e entre as áreas do fígado e do cérebro. A leucina não teve, na maioria dos casos, efeito sobre a resposta de citocinas e IDO ao LPS (ver Figuras Suplementares 2–5 e Tabela Suplementar 1).
A leucina impede a entrada de quinurenina exógena no cérebro e bloqueia o comportamento do tipo depressivo induzido por quinurenina (Figura 2)
Para confirmar que a leucina anula o comportamento do tipo depressivo induzido por LPS, bloqueando a entrada de quinurenina no cérebro, tratamos camundongos com 330 mg/kg IP de leucina imediatamente antes de 33 mg/kg IP de quinurenina e avaliamos as concentrações cerebrais de quinurenina 3 h após a quinurenina (Figura 2A). Como esperado, a leucina reduziu os níveis cerebrais de quinurenina em resposta à quinurenina exógena (F(1,20) = 14,24, p < 0,01).
Para confirmar que uma dose de leucina que impede a entrada de quinurenina exógena no cérebro também pode bloquear o comportamento do tipo depressivo induzido por quinurenina in vivo, tratamos camundongos com 300 mg/kg IP de leucina imediatamente antes de 33 mg/kg IP de quinurenina e avaliamos o comportamento do tipo depressivo usando o FST de 2–3 h após a quinurenina. A quinurenina aumentou significativamente a imobilidade no FST em comparação com camundongos controle tratados com veículo, o que foi revertido com o pré-tratamento com leucina (F(2,26) = 5,5, p = 0,01) (Figura 2B).
A quinurenina compartilha o influxo mediado por LAT1 com a leucina, mas possui um sistema de efluxo independente (Figura 3)
O transportador de aminoácidos do tipo L, LAT1, medeia a entrada de quinurenina e leucina na barreira hematoencefálica. Antes de analisar as interações entre o transporte de leucina e quinurenina nas células endoteliais da barreira hematoencefálica, primeiro determinamos se a leucina ou o LPS alteravam a expressão do transportador LAT1 cerebral. Devido à sua riqueza em vasos sanguíneos, avaliamos os níveis de mRNA das subunidades pesada e leve do transportador LAT1 no córtex pré-frontal 6 h após a administração de LPS (n = 4–5 por grupo). O LPS aumentou significativamente SLC3A2 em 1,9 vezes, indicando um aumento da subunidade pesada 4F2hc, mas não houve alteração na subunidade leve CD98 (F(1,15) = 4,58; p < 0,05). A leucina isoladamente aumentou a expressão dos transcritos de ambas as cadeias do LAT1, mas esse efeito foi menor do que o do LPS e não atingiu significância (Figura Suplementar 6).
Utilizamos um modelo in vitro de monocamada da barreira hematoencefálica para determinar as relações entre o transporte de leucina e quinurenina. Este modelo é polarizado, com superfícies luminal (lado sanguíneo) e abluminal (lado cerebral), permitindo-nos também avaliar a direcionalidade do transporte. Os valores foram corrigidos para o extravasamento residual medido pela sacarose marcada com 14C. A Figura 3A mostra que o transporte de leucina tritiada do sangue para o cérebro foi autoinibido pela leucina não marcada, pelo triptofano não marcado (que também é transportado para o cérebro pelo LAT1), pelo inibidor seletivo do LAT1, BCH, e pela quinurenina (F(4,25) = 3,86; p < 0,05). Esses resultados são consistentes com o LAT1 sendo o transportador do sangue para o cérebro para a quinurenina. A Figura 3B mostra que, quando a quinurenina tritiada foi colocada na câmara luminal, os valores corrigidos pela sacarose resultaram negativos. Uma causa comum para valores negativos é a presença de um transportador de efluxo robusto do cérebro para o sangue, dominante sobre o influxo. A Figura 3B mostra que o triptofano, mas não a leucina ou o BCH, competiu com esse sistema de efluxo. A falta de efeito do BCH demonstra que o efluxo não é mediado pelo LAT1 (F(3,28) = 15,01; p < 0,0001). A leucina também não afetou a quinurenina tritiada, sugerindo que ela pode bloquear o influxo de quinurenina dependente de LAT1 sem interferir no seu efluxo. Não está claro se o triptofano inibiu diretamente o efluxo de quinurenina tritiada ou se foi a quinurenina convertida a partir do triptofano pela IDO presente nas células endoteliais cerebrais. Um teste para a presença de um sistema de efluxo é verificar se a adição de materiais não marcados produz um aumento paradoxal nos valores de influxo; de fato, descobrimos que a quinurenina não marcada produziu um aumento paradoxal no influxo de quinurenina tritiada (Figura 3C) (t(14) = 10,66; p < 0,0001).
Em seguida, avaliamos formalmente o efluxo colocando quinurenina tritiada na câmara abluminal e coletando amostras da câmara luminal (Figura 3D). Encontramos um valor positivo, confirmando a presença do sistema de efluxo. O efluxo não foi inibido pela leucina e pelo BCH, sugerindo que o LAT1 não está envolvido no efluxo. A quinurenina não marcada produziu um aumento paradoxal no efluxo, confirmando que existe um braço de influxo no transporte de quinurenina através da barreira hematoencefálica.
DISCUSSÃO
Estes resultados mostram que a administração do aminoácido competitivo do LAT1, leucina, bloqueia o transporte de quinurenina endógena e exógena para o cérebro e anula o desenvolvimento de comportamento semelhante à depressão em resposta ao LPS. Esses achados demonstram pela primeira vez que a inibição competitiva do transporte de quinurenina do sangue para o cérebro pode representar uma forma eficaz de tratar a depressão induzida por inflamação.
Utilizando um modelo já validado de depressão induzida por inflamação e duas medidas comportamentais diferentes de comportamento do tipo depressivo, conseguimos mostrar que a leucina bloqueia o desenvolvimento de comportamento semelhante à depressão em resposta ao LPS. Surpreendentemente, descobrimos que a leucina também poderia induzir um efeito semelhante ao antidepressivo em camundongos independentemente do tratamento com LPS. Esses achados comportamentais foram apoiados pela capacidade da leucina de reduzir a quinurenina cerebral tanto em camundongos controle quanto nos tratados com LPS. Essa redução é possível porque os níveis circulantes de quinurenina são 100–1000 vezes menores que os de triptofano circulante durante a inflamação, tornando muito mais fácil bloquear o transporte de quinurenina do que o de triptofano para o cérebro. Nossos achados também são consistentes com a observação de que a grande maioria do pool cerebral de quinurenina deriva do sangue no estado basal e em resposta à inflamação sistêmica. Um estudo recente confirma a capacidade da leucina de influenciar o transporte de quinurenina através das membranas, demonstrando que a leucina pode inibir a produção de ácido quinurênico cortical de rato in vitro. No entanto, nosso estudo, baseado em um modelo in vivo de inflamação sistêmica e depressão, é o primeiro a mostrar que influenciar os mecanismos de transporte do sangue para o cérebro pode ser uma ferramenta terapêutica.
Para confirmar que a leucina não estava afetando a inflamação periférica ou central em nosso modelo, examinamos as respostas de doença e inflamatórias em nossos camundongos. Em nossos experimentos comportamentais voltados a examinar o comportamento semelhante à depressão, houve alguma evidência de que a leucina poderia ter atenuado as respostas de doença ao LPS e alguns marcadores inflamatórios medidos 27 h após o LPS. Para examinar diretamente o impacto da leucina sobre a doença e inflamação, injetamos leucina imediatamente antes do LPS e medimos as respostas de doença e o comportamento 6 h após, durante o pico do período de doença. Não encontramos evidência de que a leucina ameliorasse a resposta pró-inflamatória em camundongos tratados com LPS em um momento que precede imediatamente a ativação da IDO. Embora a leucina tenha diminuído os níveis de mRNA de IL-10 no fígado 6 e 27 h após o LPS, com um efeito mais pronunciado em camundongos tratados com LPS do que nos tratados com PBS, esse efeito não teve consequência sobre a expressão de citocinas pró-inflamatórias no fígado e não foi encontrado no cérebro. Isso possivelmente ocorre porque não houve alteração nos níveis da proteína IL-10, o que ainda precisa ser examinado. Além disso, não observamos diferenças na ativação da IDO induzida por LPS entre camundongos tratados com leucina vs. veículo, indicando que a leucina não alterou a ativação da IDO em resposta ao LPS. Isso é ainda apoiado pelas reduções nas razões quinurenina:triptofano dos camundongos controle. Deve-se notar que em nossos experimentos comportamentais semelhantes à depressão, os camundongos foram tratados com leucina no basal e 6 h após o LPS, enquanto que em nossos experimentos para examinar as respostas inflamatórias de pico, os camundongos foram tratados com leucina apenas no basal. Um estudo recente demonstrou que a leucina pode ser protetora em peixes contra respostas inflamatórias ao LPS, no entanto, os peixes foram suplementados com leucina por 8 semanas antes da exposição ao LPS, o que é muito mais longo do que a exposição aguda à leucina utilizada neste estudo.
Para confirmar que a leucina atua na entrada da quinurenina no cérebro, administramos leucina a camundongos tratados com quinurenina exógena e mostramos que, como esperado, a leucina bloqueou o aumento dos níveis de quinurenina e o comportamento semelhante à depressão induzido pela quinurenina administrada exogenamente. No experimento comportamental, não incluímos um grupo leucina/placebo, pois o objetivo não era avaliar mais uma vez os efeitos da leucina per se, mas apenas confirmar que a leucina bloqueava o aumento da imobilidade induzida pela quinurenina no teste do nado forçado. Vale notar que, enquanto a quinurenina exógena aumentou os níveis cerebrais de quinurenina, ela não levou a um aumento nos níveis plasmáticos de quinurenina. Isso provavelmente se deve ao fato de a quinurenina exógena ser rapidamente metabolizada na periferia e no cérebro. Um estudo anterior mostrou que a quinurenina administrada a camundongos foi rapidamente metabolizada no cérebro e no fígado dentro de 30 minutos - 2,5 h antes da avaliação da quinurenina cerebral no presente estudo.
Parece que a leucina inibiu o transporte de quinurenina do sangue para o cérebro, o que reduziu o comportamento do tipo depressivo induzido por LPS. Para identificar o mecanismo responsável pelas reduções nas razões quinurenina:triptofano em camundongos tratados com leucina, realizamos uma modelagem in vitro do transporte de triptofano, quinurenina e leucina através da BHE. As células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) formam junções estreitas quando cultivadas em membranas transwell e representam um modelo in vitro validado da BHE. Como tal, este modelo é idealmente adequado para responder a questões-chave de prova de conceito sobre o aproveitamento do transporte de quinurenina através da BHE para tratar a depressão.

Primeiro, confirmamos que a leucina pode competir com a quinurenina pela entrada no cérebro via LAT1, atuando como um transportador de influxo comum, avaliando a taxa de transporte de leucina tritiada através da camada de BMECs. O influxo de leucina tritiada (movimento da câmara transwell luminal para a abluminal) foi igualmente inibido pela leucina não marcada. Isso é consistente com o influxo de quinurenina sendo mediado pelo LAT1, fornecendo assim um mecanismo pelo qual a leucina inibe sua entrada no cérebro.
Em seguida, examinamos o influxo diretamente no modelo in vitro de BHE, colocando quinurenina tritiada na câmara luminal e verificamos não apenas um valor paradoxalmente negativo para o influxo, mas também que a quinurenina não marcada aumentava paradoxalmente o influxo. A explicação usual para esses achados é a presença de um sistema de efluxo robusto. O efluxo devolve qualquer quinurenina tritiada que entre na câmara abluminal para a câmara luminal; como isso inclui o material que vazou, a captação é ainda menor que a da sacarose-14C e, portanto, é negativa quando corrigida. O material não marcado também atravessa e pode se acumular em níveis que inibem o sistema de efluxo, revelando assim o influxo. O triptofano também produziu o aumento paradoxal no influxo de quinurenina tritiada, mas não está claro se isso ocorre porque ele também é um substrato para o transportador ou porque o triptofano foi metabolizado em quinurenina pela IDO das células endoteliais cerebrais. Ao colocar quinurenina tritiada na câmara abluminal, conseguimos demonstrar formalmente a presença de um sistema de efluxo para a quinurenina. A capacidade da quinurenina não marcada de aumentar paradoxalmente o efluxo de quinurenina tritiada indica que o transportador é bidirecional, mas com o efluxo sendo a direção dominante do transporte. Embora a presença desse transportador de efluxo limite nossa capacidade de mostrar in vitro que a leucina não marcada bloqueia diretamente o influxo de quinurenina tritiada para a câmara abluminal, isso indica que o transporte cérebro-sangue de quinurenina produzida no cérebro em resposta à inflamação sistêmica, relatado anteriormente, provavelmente ocorre através desse mecanismo de efluxo recém-descoberto. A natureza desse transportador ainda é desconhecida, apesar de sua importância potencial, uma vez que seu funcionamento em condições in vivo poderia ajudar a diminuir os níveis cerebrais de quinurenina, especialmente no contexto de ativação da IDO cerebral como consequência de lesão cerebral direta ou inflamação. Descobrimos que BCH e leucina não afetaram o movimento da quinurenina tritiada colocada na câmara luminal e não tiveram efeito significativo sobre a quinurenina tritiada colocada na câmara abluminal, mostrando que o LAT1 não desempenha um papel importante no efluxo de quinurenina. Seja como for, esses achados confirmam que a leucina é uma boa escolha para inibir competitivamente o transporte de quinurenina para o cérebro e bloquear o comportamento semelhante à depressão, porque inibe o transporte de quinurenina para o cérebro, mas não sua remoção do cérebro. Em teoria, a leucina poderia ser substituída por outros aminoácidos de cadeia ramificada que compartilham o LAT-1 como seu transportador predominante e, portanto, podem ser igualmente eficazes em competir com o transporte sangue-cérebro de quinurenina e prevenir a depressão induzida por inflamação. Essa possibilidade não foi testada, pois o objetivo primário do presente estudo foi demonstrar que interferir no transporte sangue-cérebro de quinurenina é suficiente para abolir a depressão induzida por inflamação.
Outras limitações do nosso estudo devem-se principalmente à natureza do estímulo inflamatório agudo utilizado para induzir a depressão induzida por inflamação. O comportamento semelhante à depressão induzido por LPS reproduz as principais características da depressão induzida por inflamação, mas carece da cronicidade característica do transtorno depressivo maior. Ainda resta determinar se a administração repetida de leucina pode abolir o comportamento semelhante à depressão associado a condições inflamatórias crônicas e garantir que não haja toxicidade pelo uso da leucina. Atualmente, existem muitos estudos aprovados pelo NIH investigando o uso da leucina no combate à fragilidade e sarcopenia em idosos (ClinicalTrials.gov), que não demonstraram toxicidade e podem ser informativos quanto à eficácia da leucina em indivíduos com inflamação crônica. Além disso, poderia-se objetar que o tratamento crônico com leucina ou outros aminoácidos de cadeia ramificada poderia aumentar o risco de diabetes tipo 2, já que os níveis circulantes de aminoácidos de cadeia ramificada tendem a estar elevados em indivíduos com obesidade e resistência à insulina. No entanto, essa associação não parece ser causal e provavelmente reflete a diminuição da atividade das enzimas catabólicas.
Conclusão
Um resumo dos nossos achados sobre os mecanismos da inibição competitiva pela leucina do transporte de quinurenina do sangue para o cérebro e do bloqueio da depressão é apresentado na Figura 4. Em conjunto, esses achados fornecem a primeira evidência de que o aproveitamento dos mecanismos de transporte da barreira hematoencefálica pode ser utilizado na prevenção e no tratamento dos sintomas semelhantes à depressão induzida por inflamação. Especificamente, aqui demonstramos que o bloqueio do transporte de quinurenina do sangue para o cérebro é eficaz na prevenção dos sintomas semelhantes à depressão induzidos por inflamação e potencialmente no tratamento dos sintomas semelhantes à depressão na ausência de inflamação. Confirmamos que a leucina é uma escolha ideal como antagonista competitivo da entrada de quinurenina no cérebro, utilizando um modelo in vitro de BMEC de transporte sangue-cérebro, uma vez que compete com a quinurenina para se ligar ao LAT1 para influxo ao cérebro, mas não compete com a quinurenina para o efluxo do cérebro. Informações suplementares estão disponíveis no site da Molecular Psychiatry.
Material Suplementar
CONFLITO DE INTERESSES:
O Dr. Dantzer recebeu honorários da Danone Nutricia Research, França, que não estão relacionados ao trabalho apresentado neste artigo. Todos os demais autores declaram não haver conflito de interesses.
Quinureninas no cérebro de mamíferos: quando a fisiologia encontra a patologia
O bloqueio do receptor NMDA pela cetamina ab-roga o comportamento depressivo induzido por lipopolissacarídeo em camundongos C57BL/6J
Aumento das classificações de depressão em pacientes com hepatite C recebendo imunoterapia baseada em interferon-alfa está relacionado a alterações induzidas por interferon-alfa no sistema serotoninérgico
Alterações no metabolismo do triptofano induzidas por interferon-alfa: relação com depressão e tratamento com paroxetinaOutras limitações do nosso estudo devem-se principalmente à natureza do estímulo inflamatório agudo utilizado para induzir a depressão induzida por inflamação. O comportamento semelhante à depressão induzido por LPS reproduz as principais características da depressão induzida por inflamação, mas carece da cronicidade característica do transtorno depressivo maior. Ainda resta determinar se a administração repetida de leucina pode abolir o comportamento semelhante à depressão associado a condições inflamatórias crônicas e garantir que não haja toxicidade pelo uso da leucina. Atualmente, existem muitos estudos aprovados pelo NIH investigando o uso da leucina no combate à fragilidade e sarcopenia em idosos (ClinicalTrials.gov), que não demonstraram toxicidade e podem ser informativos quanto à eficácia da leucina em indivíduos com inflamação crônica. Além disso, poderia-se objetar que o tratamento crônico com leucina ou outros aminoácidos de cadeia ramificada poderia aumentar o risco de diabetes tipo 2, já que os níveis circulantes de aminoácidos de cadeia ramificada tendem a estar elevados em indivíduos com obesidade e resistência à insulina. No entanto, essa associação não parece ser causal e provavelmente reflete a diminuição da atividade das enzimas catabólicas.
Conclusão
Um resumo dos nossos achados sobre os mecanismos da inibição competitiva pela leucina do transporte de quinurenina do sangue para o cérebro e do bloqueio da depressão é apresentado na Figura 4. Em conjunto, esses achados fornecem a primeira evidência de que o aproveitamento dos mecanismos de transporte da barreira hematoencefálica pode ser utilizado na prevenção e no tratamento dos sintomas semelhantes à depressão induzida por inflamação. Especificamente, aqui demonstramos que o bloqueio do transporte de quinurenina do sangue para o cérebro é eficaz na prevenção dos sintomas semelhantes à depressão induzidos por inflamação e potencialmente no tratamento dos sintomas semelhantes à depressão na ausência de inflamação. Confirmamos que a leucina é uma escolha ideal como antagonista competitivo da entrada de quinurenina no cérebro, utilizando um modelo in vitro de BMEC de transporte sangue‑cérebro, uma vez que compete com a quinurenina para se ligar ao LAT1 para influxo ao cérebro, mas não compete com a quinurenina para o efluxo do cérebro. Informações suplementares estão disponíveis no site da Molecular Psychiatry.
Material Suplementar
CONFLITO DE INTERESSES:
O Dr. Dantzer recebeu honorários da Danone Nutricia Research, França, que não estão relacionados ao trabalho apresentado neste artigo. Todos os demais autores declaram não haver conflito de interesses.
Quinureninas no cérebro de mamíferos: quando a fisiologia encontra a patologia
O bloqueio do receptor NMDA pela cetamina ab-roga o comportamento depressivo induzido por lipopolissacarídeo em camundongos C57BL/6J
Aumento das classificações de depressão em pacientes com hepatite C recebendo imunoterapia baseada em interferon‑alfa está relacionado a alterações induzidas por interferon‑alfa no sistema serotoninérgico
Alterações no metabolismo do triptofano induzidas por interferon‑alfa: relação com depressão e tratamento com paroxetina
Tratamento com interferon-alfa (IFN alfa) de pacientes com hepatite C induz menor atividade da dipeptidil peptidase IV sérica, a qual está relacionada aos sintomas depressivos e de ansiedade induzidos por IFN alfa e à ativação imune
Concentrações liquóricas de triptofano cerebral e quinureninas durante estimulação imune com IFN-alfa: relação com respostas imunes do SNC e depressão
Indução de IDO pelo bacilo de Calmette-Guérin é responsável pelo desenvolvimento de comportamento do tipo depressivo em camundongos
Comportamento do tipo depressivo induzido por lipopolissacarídeo é mediado pela ativação da indoleamina 2,3-dioxigenase em camundongos
O metabolismo neurotóxico da quinurenina está aumentado no hipocampo dorsal e impulsiona comportamentos depressivos distintos durante a inflamação
Efeitos da inflamação sistêmica e localizada no sistema nervoso central sobre as contribuições de precursores metabólicos para os pools de L-quinurenina e ácido quinolínico no cérebro
Expressão seletiva do transportador de aminoácidos neutros grandes na barreira hematoencefálica
Caracterização e modulação astrocítica dos transportadores do sistema L em células endoteliais da microvasculatura cerebral
Interferon-gama e fator de necrose tumoral-alfa mediam a regulação positiva da indoleamina 2,3-dioxigenase e a indução de comportamento do tipo depressivo em camundongos em resposta ao bacilo de Calmette-Guérin
TNFα altera a ocludina e a permeabilidade endotelial cerebral: Papel da p38MAPK
Aminoácidos inibem a formação de ácido quinurênico via supressão da captação de quinurenina ou da síntese de ácido quinurênico em cérebro de rato in vitro
Efeitos protetores da leucina contra a resposta inflamatória induzida por lipopolissacarídeo em alevinos de Labeo rohita
Produção de ácido quinurênico e 3-hidroxiquinurenina a partir de D-quinurenina em camundongos
A barreira hematoencefálica na neuroimunologia: Contos de separação e assimilação
Efeitos da inflamação sistêmica e localizada no sistema nervoso central sobre as contribuições de precursores metabólicos para os pools de L-quinurenina e ácido quinolínico no cérebro
Aminoácidos de cadeia ramificada na sinalização metabólica e resistência à insulina
Leucina reduz as razões quinurenina:triptofano cerebrais e bloqueia o comportamento do tipo depressivo

A,B Média da preferência por sacarose (%) e tempo de imobilidade no teste do nado forçado (s) (± EPM) de camundongos tratados com leucina ou veículo imediatamente antes e 6 h após LPS ou PBS (n ≥ 14 por grupo). C,D Razões médias quinurenina:triptofano no plasma e cérebros (± EPM) de camundongos tratados com 50 mg/kg de leucina ou veículo imediatamente antes e 6 h após LPS ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) (n = 5 por grupo). **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,0001 para efeitos principais LPS vs PBS. #p ≤ 0,05, ##p ≤ 0,01, ###p ≤ 0,0001 para efeitos principais leucina vs veículo.
A Concentrações médias cerebrais de quinurenina (ng/ml) (± EPM) de camundongos tratados com leucina ou veículo imediatamente antes de quinurenina ou veículo (n = 6 por grupo). B Tempo médio de imobilidade no teste de nado forçado (s) (± EPM) de camundongos tratados com leucina ou veículo imediatamente antes de quinurenina ou veículo (n ≥ 9). ##p ≤ 0,01 para efeitos principais de leucina vs veículo. xp ≤ 0,05 para diferenças significativas na Figura B.
A leucina compete com o influxo cerebral de quinurenina, mas não com o efluxo, via LAT1 in vitro
Materiais tritiados (3H) foram colocados na câmara luminal e o influxo para a câmara abluminal foi medido. A Permeabilidade média (μl/min/cm2) (± EPM) da leucina tritiada através de células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) da câmara luminal para a abluminal de um transwell. A leucina não marcada (fria) (10 mg/ml), o BCH (1 mM) e a quinurenina (1 mM) inibiram a permeabilidade da leucina. B Permeabilidade média (μl/min/cm2) (± EPM) da quinurenina tritiada (3H) através de BMECs da câmara luminal para a abluminal de um transwell, que indicou a predominância de um sistema de efluxo que foi desmascarado pela auto-inibição (C) e pelo triptofano não marcado (frio) (1 mM), mas não pela leucina ou BCH não marcados (frios). D O efluxo de quinurenina é amplamente independente do LAT1. A quinurenina tritiada (3H) foi colocada na câmara abluminal e o efluxo para a câmara luminal foi medido. O efluxo foi facilmente medido para a quinurenina tritiada (3H), com modesta inibição pela leucina ou BCH. O aumento do efluxo pela quinurenina não marcada (fria) é compatível com um componente de influxo, mas este é mais facilmente inibido até mesmo pela quinurenina abluminal do que o componente de efluxo. E Resumo diagramático dos achados da Figura 2, mostrando que a leucina é capaz de inibir o transporte de leucina, quinurenina e triptofano para o cérebro via LAT1, mas não interfere no transporte de triptofano ou do excesso de quinurenina para fora do cérebro. 3H = tritiado; UL = não marcado. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,0001
Representação diagramática do nosso principal achado sobre o bloqueio do comportamento do tipo depressivo pela leucina em camundongos com ou sem inflamação
A Visão geral da via da depressão induzida por inflamação e os efeitos antidepressivos da leucina. B Visão geral do transporte de quinurenina do sangue para o cérebro através das BMECs. A inflamação aumenta a quinurenina sanguínea, resultando em maior ligação da quinurenina ao LAT1 e seu transporte para o cérebro, o que é bloqueado pelo antagonista específico do LAT1, o BCH. A leucina inibe competitivamente a ligação da quinurenina ao LAT1 e, assim, reduz o transporte de quinurenina do sangue para o cérebro. Um transportador de efluxo predomina no transporte de quinurenina do cérebro para o sangue, que não é o LAT1 e não é ligado pela leucina. Este transportador de efluxo extrude a quinurenina produzida localmente pelo cérebro.