pmid: "35859173"
title: "Sestrina medeia a detecção e adaptação a dietas com baixo teor de leucina em Drosophila."
authors: "Gu X, Jouandin P, Lalgudi PV, Binari R, Valenstein ML, Reid MA, Allen AE, Kamitaki N, Locasale JW, Perrimon N, Sabatini DM"
journal: "Nature"
pubdate: "2022 Aug"
doi: "10.1038/s41586-022-04960-2"
source: "PMC Full Text"
Sestrina medeia a detecção e adaptação a dietas com baixo teor de leucina em Drosophila.
Autores
Gu X, Jouandin P, Lalgudi PV, Binari R, Valenstein ML, Reid MA, Allen AE, Kamitaki N, Locasale JW, Perrimon N, Sabatini DM
Periodico
Nature (2022 Aug)
Conteudo
Sestrina medeia a detecção e adaptação a dietas com baixo teor de leucina em Drosophila
O complexo 1 do alvo mecanístico da rapamicina (mTORC1) regula o crescimento celular e o metabolismo em resposta a múltiplos nutrientes, incluindo o aminoácido essencial leucina. Trabalhos recentes em células de mamíferos cultivadas estabeleceram as Sestrinas como proteínas de ligação à leucina que inibem a sinalização de mTORC1 durante a privação de leucina, mas seu papel na resposta do organismo à leucina dietética permanece indefinido. Aqui, descobrimos que moscas nulas para Sestrina (Sesn−/−) não conseguem inibir mTORC1 ou ativar a autofagia após a privação aguda de leucina e apresentam desenvolvimento prejudicado e uma vida útil reduzida em uma dieta com baixo teor de leucina. Moscas knock-in expressando um mutante de Sestrina deficiente na ligação à leucina (SesnL431E) apresentam atividade de mTORC1 reduzida e insensível à leucina. Notavelmente, descobrimos que as moscas podem discriminar entre alimentos com ou sem leucina, e preferencialmente se alimentam e depositam sua progênie em alimentos contendo leucina. Essa preferência depende da Sestrina e de sua capacidade de se ligar à leucina. A leucina regula a atividade de mTORC1 em células gliais, e a redução de Sesn nessas células diminui a capacidade das moscas de detectar alimentos sem leucina. Assim, a detecção de nutrientes por mTORC1 é necessária para que as moscas não apenas se adaptem, mas também detectem uma dieta deficiente em um nutriente essencial.
Introdução
A proteína quinase mTORC1 regula o crescimento e o metabolismo em resposta a diversos sinais, incluindo fatores de crescimento e nutrientes como aminoácidos. Os aminoácidos ativam mTORC1 promovendo sua translocação para a superfície lisossomal, onde reside seu ativador essencial Rheb. As GTPases Rag heterodiméricas, que estão sob o controle de vários complexos proteicos de múltiplos componentes, incluindo GATOR1 e GATOR2, regulam a localização lisossomal de mTORC1. GATOR1 é uma proteína ativadora de GTPase para RagA e RagB e é necessária para que a privação de aminoácidos iniba a sinalização de mTORC1. Por outro lado, GATOR2 é necessário para que os aminoácidos ativem mTORC1 e interage diretamente com vários dos sensores de aminoácidos descobertos até agora, indicando que atua como um centro de detecção de nutrientes, apesar de sua função bioquímica ainda desconhecida.
Entre os aminoácidos proteinogênicos, a leucina é o ativador mais bem estabelecido do mTORC1. Trabalhos em células de mamíferos em cultura mostraram que a leucina controla o mTORC1 regulando a interação do GATOR2 com a família de proteínas Sestrina, que são repressoras da sinalização mTORC1. As Sestrinas humanas 1 e 2 ligam leucina com afinidades compatíveis com a concentração de leucina necessária para ativar o mTORC1 e são necessárias para que a privação de leucina iniba a sinalização mTORC1. Além disso, um mutante da Sestrina2 que não liga leucina não se dissocia do GATOR2 na presença de leucina, e em células que expressam esse mutante, a atividade do mTORC1 permanece baixa mesmo quando as células são cultivadas em condições com abundância de leucina. Apesar das evidências de que a Sestrina é um sensor de leucina para a via mTORC1 em células de mamíferos em cultura, os papéis da detecção de leucina mediada pela Sestrina na fisiologia de um organismo intacto permanecem em grande parte inexplorados.
Embora grande parte do trabalho sobre a detecção de leucina tenha sido em sistemas de mamíferos, a Sestrina e a maquinaria central de detecção de nutrientes, incluindo as Rag GTPases, GATOR1 e GATOR2, são conservadas na maioria dos invertebrados, incluindo a mosca Drosophila melanogaster. Ao contrário dos mamíferos, as moscas expressam apenas um gene para a Sestrina (Sesn), o que facilita muito o estudo in vivo da detecção de leucina pelo mTORC1. Aqui, mostramos que a Sestrina e seu bolsão de ligação à leucina são necessários para que a leucina regule a atividade do mTORC1 em tecidos de moscas in vivo e para que as moscas detectem e se adaptem a dietas deficientes em leucina.
Resultados
O mTORC1 da mosca detecta leucina in vivo via Sestrina
Em um ensaio de ligação em equilíbrio, a Sestrina de Drosophila ligou leucina com uma constante de dissociação (Kd) de cerca de 100 μM (Fig. 1a), uma afinidade várias vezes menor do que as das Sestrinas humanas 1 e 2 (valores de Kd de cerca de 15–20 μM). Essa afinidade reduzida provavelmente é resultado de uma diferença entre os bolsões de ligação à leucina da Sestrina humana e da mosca. Estudos estruturais mostram que na Sestrina2 humana um triptofano (W444) forma o fundo do bolsão, mas na proteína da mosca, o resíduo análogo é uma leucina (L431), um resíduo menor que, quando introduzido na Sestrina2 humana (W444L), é suficiente para reduzir sua capacidade de ligação à leucina em várias vezes. A baixa afinidade da Sestrina da mosca pela leucina é consistente com a observação de que a hemolinfa da mosca tem concentrações de aminoácidos substancialmente maiores do que o plasma humano, uma diferença provavelmente refletida intracelularmente. Assim como o mutante análogo da Sestrina2 humana (W444E), a Sestrina da mosca L431E não liga leucina (Fig. 1b).
Para examinar se a leucina regula a interação da Sestrina de mosca com GATOR2, expressamos de forma estável em células S2R+ de Drosophila uma proteína controle marcada com Flag (und, o ortólogo em Drosophila da metap2 de mamíferos, metionil aminopeptidase) ou WDR59, um dos cinco componentes centrais do complexo GATOR2. A Sestrina co-imunoprecipitou com GATOR2, mas não com und, e a remoção da leucina do meio celular aumentou fortemente essa interação. A adição de leucina, mas não de isoleucina, valina ou metionina, aos imunoprecipitados foi suficiente para liberar a Sestrina de GATOR2 (Fig. 1c). Assim, como a proteína humana, a Sestrina de mosca se liga a GATOR2 de uma forma que é especificamente desfeita pela leucina.
Para estender nosso trabalho in vivo, geramos moscas que expressam ectopicamente WDR24 marcado com MYC, outro componente central de GATOR2 (moscas lpp>myc-WDR24), no corpo gorduroso, e são ou do tipo selvagem no lócus Sesn ou possuem uma mutação knock-in que causa a substituição L431E que torna a Sestrina incapaz de se ligar à leucina (SesnL431E). Por um período de 4,5 h, alimentamos larvas de terceiro instar com uma dieta quimicamente definida (veja Métodos e Tabelas 1–4 dos Dados Estendidos para detalhes) contendo todos os aminoácidos proteinogênicos (repleta de aminoácidos) ou a mesma dieta sem leucina (sem leucina) ou sem valina (sem valina). Independentemente do genótipo, as larvas que se alimentaram das dietas sem leucina ou sem valina apresentaram níveis reduzidos de leucina ou valina, respectivamente (Dados Estendidos Fig. 1a, b). Em lisados preparados a partir de corpos gordurosos isolados, a Sestrina endógena co-imunoprecipitou com GATOR2, mas não com uma proteína controle (GFP-MYC), e a privação de leucina, mas não de valina, aumentou fortemente a interação. Em contraste, a Sestrina L431E se ligou igualmente bem a GATOR2 em todas as condições dietéticas, o que é consistente com o mutante ser insensível à leucina (Fig. 1d). Em células cultivadas e em corpos gordurosos, observamos que a Sestrina possui múltiplas isoformas (Fig. 1c, d), provavelmente resultado de splicing diferencial.
Em larvas do tipo selvagem, a alimentação com a dieta livre de leucina, mas não de valina, inibiu o mTORC1 no corpo gorduroso, conforme avaliado pela fosforilação de S6K, um substrato canônico do mTORC1. A perda de Sestrin (Sesn−/−) não afetou a atividade do mTORC1 em larvas que consumiam a dieta rica em aminoácidos, mas preveniu completamente a inibição do mTORC1 normalmente causada pela privação de leucina (Fig. 1e). A Sestrin também foi necessária para que a dieta livre de leucina ativasse a autofagia, um processo suprimido pelo mTORC1, conforme monitorado pela formação de puncta positivas para mCherry-Atg8a (Fig. 1c dos Dados Estendidos). Em larvas SesnL431E, a atividade do mTORC1 foi baixa em relação à das larvas do tipo selvagem e também não foi afetada pela privação de leucina, indicando que o mutante de ligação à leucina da Sestrin atua como um inibidor não reprimível do mTORC1 (Fig. 1e). Notavelmente, a sinalização do mTORC1 foi inibida em larvas Sesn−/− privadas de todo alimento de forma semelhante às larvas do tipo selvagem (Fig. 1d dos Dados Estendidos), o que é consistente com trabalhos em células de mamíferos cultivadas mostrando que a Sestrin tem um papel específico na transmissão da disponibilidade de leucina para o mTORC1. Por fim, em larvas sem um componente do GATOR1 (Nprl2−/−) ou GATOR2 (Mio−/−), a ausência de leucina na dieta não afetou a atividade do mTORC1, e esta permaneceu hiperativa ou suprimida, respectivamente, como quando as larvas foram alimentadas com a dieta rica em aminoácidos (Fig. 1e). Consistentemente com o mTORC1 promovendo a transcrição de Sesn como parte de uma alça de retroalimentação, as moscas Nprl2−/− e Mio−/− apresentaram níveis aumentados e diminuídos de Sestrin, respectivamente (Fig. 1e). Coletivamente, esses resultados mostram que a leucina da dieta modula o mTORC1 in vivo e que essa regulação requer a Sestrin e seu bolsão de ligação à leucina, bem como os complexos GATOR1 e GATOR2.
Sestrin medeia a adaptação a dietas com baixo teor de leucina
Raciocinamos que a supressão do mTORC1 mediada pela Sestrin ajuda os animais a se adaptarem e, assim, sobreviverem a uma dieta pobre em leucina. Primeiro tentamos testar essa ideia alimentando as larvas com comida sem leucina, mas todas as larvas, independentemente do genótipo, morreram em 2 a 3 dias após o início da dieta, o que é consistente com a leucina sendo um aminoácido essencial necessário para o crescimento larval. Quando receberam comida contendo um décimo do conteúdo normal de leucina, ~40% das larvas do tipo selvagem sobreviveram por um período de 16 dias (Fig. 2a, b). Em contraste, apenas ~10% das larvas Sesn−/− o fizeram (Fig. 2b). Além disso, as larvas sobreviventes cresceram para um tamanho muito menor do que suas contrapartes do tipo selvagem (Fig. 2c), um defeito resgatado pela expressão da Sestrin do tipo selvagem a partir do promotor ubíquo Tubulin-Gal4, Tubulin-Gal80ts (Fig. 2c). Quando alimentadas com a dieta padrão de laboratório, as larvas Sesn−/− e do tipo selvagem se desenvolveram de forma indistinguível (Fig. 2a dos Dados Estendidos).
De acordo com trabalhos anteriores mostrando que moscas adultas podem viver por semanas em uma dieta sem nenhuma fonte de aminoácidos, nossas observações mostraram que moscas do tipo selvagem também sobreviveram por muitas semanas em uma dieta sem leucina (Fig. 2e, h, Extended Data Fig. 2c, f e Supplementary Data 1). Assim como nas larvas, as moscas adultas também necessitaram de Sestrina para se adaptar à escassez de leucina, uma vez que os animais machos e fêmeas Sesn−/− tiveram longevidades muito reduzidas na dieta sem leucina, mas não na dieta completa em aminoácidos (Fig. 2d, e, g, h e Supplementary Data 1). Por outro lado, as moscas Sesn−/− tiveram longevidades ligeiramente mais curtas do que as contrapartes selvagens quando alimentadas com a dieta sem valina (Fig. 2f, i e Supplementary Data 1), uma dieta na qual a atividade de processos controlados pelo mTORC1, como a síntese proteica e a autofagia, seria esperada impactar a sobrevivência. Quando as moscas SesnL431E foram alimentadas com as mesmas dietas quimicamente definidas, elas sobreviveram de forma semelhante às moscas do tipo selvagem (Extended Data Fig. 2b–g e Supplementary Data 1). Consistente com a supressão crônica da sinalização de mTORC1, as larvas SesnL431E criadas na dieta padrão de laboratório se desenvolveram mais lentamente do que as selvagens (Extended Data Fig. 2h).
Monitoramos a atividade de mTORC1 em lisados de moscas inteiras de moscas adultas fêmeas e machos que haviam sido submetidas a jejum noturno e então realimentadas por 90 min com as dietas quimicamente definidas usadas acima. A perda de Sestrina impediu a inibição de mTORC1 causada pela dieta sem leucina em moscas machos e fêmeas (Extended Data Fig. 3a, b).
Além disso, focamos na oogênese, uma característica fisiológica reconhecida por ser regulada pela dieta. Ademais, sabe-se que a dieta regula a função ovariana por meio dos complexos GATOR1-GATOR2, e o gene Mio, que codifica um dos componentes de GATOR2, recebeu esse nome porque mutações nele resultam em um fenótipo de ausência de ovócito. Descobrimos que a atividade de mTORC1 estava fortemente aumentada nos ovários de moscas Sesn−/− que comiam a dieta padrão de laboratório e, como nos corpos gordurosos larvais (Fig. 1e), estava suprimida nos ovários das moscas SesnL431E (Extended Data Fig. 3c).
Quando alimentadas com a dieta repleta de aminoácidos ou sem valina, as moscas Sesn−/− e selvagens apresentaram ovários de tamanhos semelhantes, mas a perda de Sestrina reduziu drasticamente o tamanho dos ovários em moscas sob condições de privação aguda de leucina (Figura de Dados Estendidos 3d, e), novamente apontando para um papel específico da Sestrina na adaptação à escassez de leucina. Os ovários das moscas SesnL431E eram igualmente pequenos em todas as dietas (Figura de Dados Estendidos 3d, e), consistente com um papel do mTORC1 no controle do desenvolvimento das gônadas. As moscas SesnL431E também apresentaram fecundidade reduzida, pois depositaram menos ovos que as moscas selvagens (Figura de Dados Estendidos 3f). Ovos de moscas selvagens, SesnL431E e Sesn−/− tiveram taxas de eclosão comparáveis, sugerindo que a Sestrina não afeta a fertilidade (Figura de Dados Estendidos 3g). Coletivamente, esses dados revelam que, em larvas e moscas adultas, a Sestrina promove a sobrevivência em uma dieta pobre em leucina e tem um papel particularmente importante no controle do tamanho e da função dos ovários.
A Sestrina regula o comportamento alimentar
Tendo estabelecido que a Sestrina é importante para as moscas se adaptarem e sobreviverem a dietas pobres em leucina, investigamos se as moscas também necessitam da Sestrina para detectar e, assim, evitar alimentos pobres em leucina. Para isso, desenvolvemos um ensaio para testar se moscas adultas preferem comer alimentos ricos em leucina em vez de pobres em leucina. A configuração experimental consistiu em 15 moscas fêmeas e 5 machos em um frasco contendo 2 pedaços de maçã, o primeiro pintado com uma solução de um ou mais aminoácidos e o segundo com um controle apropriado (Fig. 3a). Cada um também continha uma quantidade traço de um oligonucleotídeo de DNA único, que serviu como código de barras para medir o consumo alimentar, uma abordagem previamente descrita e que validamos (Figura de Dados Estendidos 4a–c e Métodos). Escolhemos a maçã como alimento base por ser rica em carboidratos e pobre em proteínas, permitindo-nos configurar opções alimentares com composições diferentes de aminoácidos, mas o mesmo teor de açúcares. As maçãs são relatadas como contendo muito pouca leucina e valina.
Descobrimos que as moscas fêmeas do tipo selvagem preferem comer maçãs revestidas com leucina em vez de água. Essa preferência surge depois que as moscas estão se alimentando do alimento por cerca de 6 h e aumenta de 5 a 6 vezes em 24 h, o ponto de tempo que usamos nos experimentos subsequentes (Fig. 3b). A preferência pela leucina é dependente da concentração (Extended Data Fig. 4d) e nem todo aminoácido provoca uma preferência, já que as moscas não distinguem entre maçãs revestidas com valina ou água (Extended Data Fig. 4e). Diante de uma escolha entre quantidades iguais de leucina e valina, as moscas ainda preferem leucina, sugerindo que a preferência pela leucina não é simplesmente o resultado de um desequilíbrio de nitrogênio (Extended Data Fig. 4e). Além disso, a preferência pela leucina requer atividade diferencial de mTORC1, já que quando as moscas foram alimentadas com o inibidor de mTORC1 rapamicina, elas não mostraram mais preferência (Fig. 3c). O tratamento com rapamicina também reduziu a quantidade total de alimento consumido pelas moscas (Extended Data Fig. 4f), consistente com relatos anteriores.
Notavelmente, nem as fêmeas Sesn−/− nem as SesnL431E—ambas com sinalização mTORC1 insensível à leucina—tiveram preferência pela leucina, pois comeram quantidades semelhantes de alimentos ricos e pobres em leucina (Fig. 3d, e e Extended Data Fig. 4g). No entanto, os dois mutantes Sesn provavelmente diferem na quantidade total de alimento que cada um comeu. A quantidade de alimento (rico em leucina ou pobre em leucina) que as fêmeas Sesn−/− comeram foi semelhante à quantidade de alimento rico em leucina consumido pelas moscas do tipo selvagem (w1118) (Extended Data Fig. 4h). O oposto foi verdadeiro para as moscas fêmeas SesnL431E. Essas moscas comeram uma quantidade de alimento (rico em leucina ou pobre em leucina) semelhante à quantidade de alimento pobre em leucina consumido pelas moscas do tipo selvagem (OreR) (Extended Data Fig. 4i). O fato de as moscas SesnL431E, que têm baixa sinalização mTORC1, comerem menos alimento do que os controles do tipo selvagem é consistente com a rapamicina causar uma redução no consumo de alimentos (Extended Data Fig. 4f). A reexpressão em todo o corpo nas moscas fêmeas Sesn−/− de Sestrina dirigida por Tub>Gal4 restaurou parcialmente a preferência pela leucina dos animais (Extended Data Fig. 4j).
Também examinamos se as moscas podem distinguir entre alimentos com uma diferença mais sutil na composição de aminoácidos: uma maçã revestida com os 20 aminoácidos proteogênicos versus apenas 19 deles (isto é, faltando apenas leucina). De fato, foi esse o caso e essa preferência também estava ausente nas moscas Sesn−/− e SesnL431E (Fig. 3f). A valina novamente serviu como controle: quando removida do coquetel de 20 aminoácidos, nem as moscas do tipo selvagem nem as mutantes Sesn mostraram preferência pelo alimento contendo valina (Extended Data Fig. 4k).
Para obter controle temporal da supressão de Sestrina, geramos um sistema de knockdown condicional utilizando um RNA em grampo curto (shRNA) direcionado a Sesn. A expressão ubíqua do shRNA reduziu os níveis da proteína Sestrina (Fig. 3g) e, como esperado, a preferência das moscas pelo alimento contendo leucina (Fig. 3h). Utilizando um driver de shRNA sensível à temperatura, suprimimos a Sestrina especificamente durante a fase adulta (Fig. 3i, j). Isso também reduziu a preferência por leucina (Fig. 3k), indicando que a perda aguda de Sestrina em moscas adultas é suficiente para impactar a preferência por leucina. Notavelmente, a mudança de temperatura para 29°C aumentou os níveis de Sestrina (Fig. 3j), consistente com trabalhos anteriores mostrando que múltiplos estresses induzem sua transcrição. Portanto, as moscas fêmeas podem detectar prontamente o alimento sem leucina, mesmo que ele contenha açúcares e outros aminoácidos. Essa habilidade requer a Sestrina e sua capacidade de se ligar à leucina.
Para analisar ainda mais a relevância fisiológica da detecção de leucina via o eixo Sestrina-mTORC1, testamos o impacto de ambos, leucina e Sestrina, na escolha entre dietas com baixo e alto teor de proteína: maçã revestida com uma quantidade baixa ou alta de extrato de levedura, que é um tipo de alimento complexo e a principal fonte de proteína para moscas criadas em laboratório. Moscas selvagens tinham uma forte preferência pela maçã com maior teor proteico. A adição de leucina ao alimento pobre em proteína reduziu a preferência das moscas fêmeas selvagens pelo alimento rico em proteína, mas impactou minimamente a preferência das mutantes SesnL431E (Fig. de Dados Estendidos 5a). As mutantes Sesn−/− tiveram uma tendência semelhante (Fig. de Dados Estendidos 5b), mas não foi estatisticamente significativa. Juntos, esses dados sugerem que as moscas usam a detecção de leucina via o eixo Sestrina-mTORC1 como um indicador do conteúdo proteico do alimento.
Sestrina regula o comportamento de postura de ovos
Descobrimos que as moscas fêmeas preferem depositar ovos nas maçãs revestidas com leucina. Para explorar isso mais a fundo, colocamos 15 moscas fêmeas e 5 machos no frasco de ensaio e, 24 h depois, contamos o número de ovos em cada pedaço de maçã (Fig. de Dados Estendidos 6a). Em um teste inicial, descobrimos que as moscas depositaram muito mais ovos em um pedaço de maçã pintado com uma suspensão de levedura em vez de água, consistente com a levedura sendo um alimento rico em nutrientes e os estímulos olfativos que atraem as moscas (Fig. de Dados Estendidos 6b).
Moscas selvagens que haviam sido privadas de proteína durante a noite depositaram 5 a 6 vezes mais ovos em um pedaço de maçã revestido com os 20 aminoácidos proteinogênicos em vez de água (Fig. de Dados Estendidos 6c, d, f). As moscas tiveram uma preferência semelhante, embora menor (três vezes), por maçã revestida com leucina, e essa preferência foi mais acentuada quando as moscas haviam sido privadas de proteína. É importante notar que as moscas não distinguiram entre pedaços de maçã pintados com a mesma substância (Fig. de Dados Estendidos 6d, f).
Descobrimos que as moscas mutantes SesnL431E não apresentaram uma forte preferência por depositar ovos na maçã revestida com leucina e tiveram uma preferência reduzida pela maçã com os 20 aminoácidos (Extended Data Fig. 6e), embora o número total de ovos depositados pelas moscas mutantes SesnL431E tenha sido cerca de 25% menor em comparação com as moscas selvagens (Extended Data Fig. 3f). Esse comportamento alterado de oviposição também foi observado nas moscas Sesn−/−, que depositaram um número semelhante de ovos ao dos animais selvagens (Extended Data Fig. 6g). Além disso, as moscas selvagens preferiram levemente depositar ovos em um pedaço de maçã pintado com os 20 aminoácidos proteogênicos em vez de 19 (ou seja, sem leucina), uma escolha muito mais complexa, e essa capacidade foi reduzida nas moscas SesnL431E (Extended Data Fig. 6h). Ao enfrentar a mesma escolha complexa, as moscas Sesn−/− não apresentaram um comportamento estatisticamente significativo diferente em comparação com as moscas selvagens (Extended Data Fig. 6h), o que pode refletir a sutileza e o ruído dessa configuração de escolha complexa. Consistente com a preferência por leucina que observamos no ensaio de escolha alimentar, descobrimos que as moscas fêmeas também depositaram menos ovos no alimento sem leucina, e essa capacidade requer o bolsão intacto de ligação à leucina da Sestrina. Esse achado pode refletir uma escolha ativa para a deposição de ovos ou a quantidade de tempo que as moscas passam em cada maçã devido à sua preferência por consumir alimento contendo leucina.
Sestrina glial regula a preferência por leucina
Para determinar em qual(is) tecido(s) a Sestrina é necessária para que as moscas distingam entre alimento com ou sem leucina, suprimimos a Sestrina com o shRNA de Sesn sob o controle de diversos drivers Gal4 específicos de tipos celulares. Notavelmente, o knockdown de Sesn especificamente em células gliais (repo-Gal4) foi suficiente para reduzir a preferência das moscas pelo alimento contendo leucina de forma semelhante a quando expresso de forma ubíqua (da-Gal4; Fig. 4a). Em contraste, o knockdown de Sesn em muitos outros tecidos, incluindo o corpo gorduroso e o músculo, não afetou a preferência por leucina. É importante notar que a capacidade intrínseca de cada linhagem de driver Gal4 de distinguir entre alimento com ou sem leucina variou consideravelmente (Extended Data Fig. 7a), provavelmente devido a seus diferentes backgrounds genéticos. Assim, embora estejamos confiantes de que a preferência das moscas por alimento contendo leucina requer a Sestrina nas células gliais, somos cautelosos em descartar contribuições de outros tecidos, particularmente aqueles examinados com linhagens de driver com preferências intrínsecas por leucina mais baixas, como as linhagens neuronais pan (elav-Gal4) e dopaminérgicas e colinérgicas (ddc-Gal4) (Extended Data Fig. 7a).
Em consonância com um papel importante da Sestrina glial na regulação da preferência por leucina, a expressão de Sestrina selvagem apenas em células gliais de moscas nocaute para Sestrina resgatou parcialmente o defeito na detecção de alimentos pobres em leucina (Fig. de Dados Estendidos 7b). Em moscas selvagens, a expressão nas células gliais de Sestrina selvagem ou Sestrina(L431E) diminuiu a preferência por leucina, o que é consistente com a inibição da mTORC1 causada pela superexpressão de Sestrina (Fig. de Dados Estendidos 7b). De fato, a superexpressão de TSC1 e TSC2 — inibidores bem estabelecidos da sinalização da mTORC1 — sob o controle de repo-Gal4 também foi suficiente para diminuir a preferência por leucina (Fig. de Dados Estendidos 7c).
Análises de um conjunto de dados de sequenciamento de RNA de célula única indicaram que a Sestrina é expressa na maioria dos subtipos gliais (Fig. de Dados Estendidos 7d). A expressão do shRNA de Sesn sob o controle de linhagens condutoras Gal4 que têm como alvo subtipos de células gliais revelou que nenhuma causou uma supressão tão forte da preferência por leucina quanto o condutor pan-glial repo-Gal4 (Fig. de Dados Estendidos 7e), embora a depleção de Sesn conduzida por Wrapper-Gal4 tenha levado a uma redução parcial da preferência por leucina. Portanto, múltiplos subtipos gliais provavelmente participam da mediação da preferência por leucina.
Dada a importância da Sestrina glial na mediação da preferência por leucina, examinamos a sinalização da mTORC1 em células gliais nos cérebros de moscas fêmeas adultas. Para isso, usamos uma linhagem que expressa um repórter baseado em GFP para o fator de transcrição MITF, que é o ortólogo em Drosophila do TFEB de mamíferos. A mTORC1 suprime o MITF, de modo que, com a inibição da mTORC1, a atividade do MITF aumenta e impulsiona a expressão de GFP. Em moscas selvagens, a privação de proteína total ativou, conforme indicado pela elevada expressão de GFP, o MITF em células gliais Repo-positivas, particularmente naquelas ao redor do esôfago (Fig. de Dados Estendidos 7f). Notavelmente, a privação apenas de leucina também aumentou o número de células gliais GFP-positivas periesofágicas (Fig. 4b–d e Fig. de Dados Estendidos 8a, b). Em contraste, em moscas Sesn−/−, a privação de leucina não aumentou o número de células gliais GFP-positivas periesofágicas, que eram poucas independentemente da dieta (Fig. 4c, d e Fig. de Dados Estendidos 8a, b). Em moscas SesnL431E, havia muitas células gliais GFP-positivas periesofágicas e, assim como nas moscas Sesn−/−, a privação de leucina não aumentou seus números (Fig. 4c, d e Fig. de Dados Estendidos 8a, b). Notavelmente, a quantificação de células GFP-positivas nos corpos pedunculados e lobos ópticos mostrou que, diferentemente das células gliais periesofágicas, a atividade da mTORC1 nessas células não respondeu significativamente aos tratamentos dietéticos agudos (Fig. de Dados Estendidos 8b–e). Assim, a leucina dietética regula a sinalização da mTORC1 em um subconjunto de células gliais de uma forma que depende da Sestrina e de sua capacidade de se ligar à leucina, e essa regulação se correlaciona com a capacidade das moscas de distinguir entre alimentos ricos ou pobres em leucina.
Mostramos que Drosophila melanogaster requer Sestrin para regular a sinalização de mTORC1 em resposta à leucina dietética, sobreviver a uma dieta pobre em leucina e controlar medidas fisiológicas sensíveis à leucina, como escolha alimentar e tamanho dos ovários. Moscas com uma mutação pontual que elimina a capacidade de ligação à leucina da Sestrin(L431E) têm sinalização de mTORC1 suprimida e insensível à leucina. Além disso, enquanto moscas selvagens podem viver com dietas sem leucina por semanas, moscas sem Sestrin morrem muito mais rapidamente. Em suma, nossos resultados estabelecem a Sestrin como um sensor de leucina fisiologicamente relevante in vivo. Recentemente, Lu et al. relataram achados complementares de um papel sensor de aminoácidos da Sestrin a montante de mTORC1 no controle do desenvolvimento, fecundidade e longevidade de Drosophila.
Descobrimos que a Sestrin e seu bolsão de ligação à leucina são necessários para a preferência de moscas fêmeas adultas por consumir, bem como depositar ovos em, alimentos ricos em leucina em vez de pobres em leucina, mesmo quando contém açúcares e outros aminoácidos. Até onde sabemos, a capacidade das moscas de escolher alimentos ricos em leucina em vez de alimentos que carecem de leucina mas ainda retêm um conjunto complexo de outros nutrientes não havia sido documentada anteriormente, embora tal comportamento tenha sido relatado em camundongos. Quando confrontadas com uma escolha mais contrastante do que a que fornecemos—um açúcar puro, como sacarose ou glicose, versus um aminoácido individual—as moscas preferem comer uma variedade de aminoácidos essenciais de maneiras dependentes do sexo e do estágio de desenvolvimento.
Há um interesse de longa data em entender os mecanismos que permitem que animais, incluindo moscas e roedores, prefiram dietas ricas em proteínas. Uma variedade de mecanismos em moscas foi implicada, incluindo transportadores de aminoácidos, receptores gustativos, GCN2, sinalização de serotonina e dopamina, receptor do peptídeo sexual, microbioma, bem como mTOR e S6K. Como esses mecanismos se coordenam para impactar a detecção de proteína da dieta pelo organismo permanece uma questão em aberto.
Nosso trabalho levanta várias questões para estudos futuros. Uma dessas questões diz respeito a se há interação entre o comportamento de preferência alimentar controlado por células gliais e as mudanças agudas no tamanho ovariano causadas pelo estresse nutricional. Outra questão é se as moscas fêmeas escolhem ativamente depositar mais ovos no alimento contendo leucina porque ele possui os nutrientes necessários para o crescimento larval, ou se a preferência aparente simplesmente reflete a quantidade de tempo que passam nele devido à sua preferência alimentar. Como as moscas levam muitas horas para distinguir entre alimentos com e sem leucina (Fig. 3b), parece improvável que as alterações na Sestrina eliminem a preferência pela leucina ao interferir substancialmente na capacidade das moscas de sentir o gosto da leucina. Em vez disso, favorecemos a ideia de que a leucina, por meio da Sestrina-mTORC1, ativa um circuito de recompensa neuronal que impulsiona o consumo de alimentos (veja modelo potencial na Fig. 4e). Trabalhos anteriores identificaram um conjunto de neurônios dopaminérgicos que controla a fome por proteínas e será interessante examinar se a sinalização mTORC1 sensível à leucina mediada pela Sestrina pode impactar essas células. Nesse sentido, é intrigante que a preferência pela leucina exija a expressão da Sestrina na glia, já que há evidências crescentes de que as células gliais podem ser intermediárias fundamentais entre um sinal ambiental e sua modulação de um circuito neuronal. Por último, será interessante investigar por que a atividade da mTORC1 em um conjunto de células gliais periesofágicas é particularmente sensível à regulação dependente da Sestrina pela leucina dietética.
Materiais e Métodos
Materiais
Os reagentes foram obtidos das seguintes fontes: anticorpo secundário anti-coelho conjugado com HRP e os anticorpos contra Drosophila Fosfo-70 S6 Quinase (Thr398) (#9209), Akt (#9272), fosfo-ERK (#9101), ERK (#4695), Akt (#9272), MYC (#2278) e o epítopo FLAG (#2368) da Cell Signaling Technology (CST); anticorpo anti-Proteína Fluorescente Verde (GFP) da Aves Labs (GFP-1020); anticorpo anti-Repo 8D12 do Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); anticorpos secundários conjugados com Alexa 488, 568 e 647 e Complete Protease Cocktail da Roche; meio de Schneider e Soro Fetal Bovino Inativado (IFS) da Invitrogen; meio de Schneider livre de aminoácidos da US Biologicals; [3H]-leucina da American Radiolabeled Chemicals, Inc.; leucina da Sigma (L8912); rapamicina da LC Laboratories (#R-5000); e Reliance One-Step Multiplex RT-qPCR Supermix da BIO-RAD. Maçãs frescas (Gala) foram do Star Market. O anticorpo dS6K foi um presente de Mary Stewart (North Dakota State University) e o anticorpo para Sestrina de Drosophila um presente de Jun Hee Lee (University of Michigan).
Células S2R+ de Drosophila foram cultivadas em meio Schneider com 10% de soro fetal bovino inativado a 25°C e 5% de CO2. A linhagem celular S2R+ foi obtida do Drosophila RNAi Screening Center/Transgenic RNAi Project Functional Genomics Resources e do Drosophila Research & Screening Center-Biomedical Technology Research Resource da Harvard Medical School. Ela foi validada molecularmente por sequenciamento de DNA e RNA (ver Tabela 2 de uma autenticação recente).
Células Suspension FreeStyle 293F foram obtidas da Thermo Fisher Scientific e cultivadas em meio de expressão FreeStyle 293 (ThermoFisher (12338018)), suplementado com 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina, sob agitação de 125 rpm a 37°C e 8% de CO2, 80% de umidade. Nenhuma contaminação por micoplasma foi detectada por PCR.
Lise de células, tecidos e moscas e Imunoprecipitações
As células foram lavadas com PBS gelado e lisadas em tampão de lise (1% de Triton, 10 mM de β-glicerol fosfato, 10 mM de pirofosfato, 40 mM de HEPES pH 7,4, 2,5 mM de MgCl2 e 1 comprimido de inibidor de protease sem EDTA [Roche] (por 25 mL de tampão)). Os lisados celulares foram clarificados por centrifugação em microcentrífuga (15.000 rpm por 10 minutos a 4°C). As amostras de lisado celular foram preparadas pela adição de tampão de amostra 5X (0,242 M de Tris, 10% de SDS, 25% de glicerol, 0,5 M de DTT e azul de bromofenol), resolvidas por SDS-PAGE de 8% a 12% e analisadas por imunotransferência.
Tecidos dissecados e moscas inteiras foram triturados fisicamente usando um bead beater em tampão de lise com 1% de Triton (o mesmo descrito acima). Os lisados resultantes foram clarificados por centrifugação em microcentrífuga (15.000 rpm por 10 minutos a 4°C) e analisados como acima. Para imunoprecipitações anti-FLAG, a resina de afinidade anti-FLAG M2 (Sigma #A2220) foi lavada três vezes com tampão de lise e então ressuspendida na proporção de 50:50 de resina de afinidade para tampão de lise. 25 μL da suspensão bem homogeneizada foram adicionados aos lisados clarificados e incubados a 4°C em agitador por 90–120 minutos. Para imunoprecipitações anti-Myc, beads magnéticas anti-Myc (Pierce) foram lavadas três vezes com tampão de lise. 30 μL das beads ressuspendidas em tampão de lise foram adicionados aos lisados clarificados e incubados a 4°C em agitador por 90–120 minutos. Os imunoprecipitados foram lavados três vezes; uma vez com tampão de lise e duas vezes com tampão de lise contendo 500 mM de NaCl. As proteínas imunoprecipitadas foram desnaturadas pela adição de 50 μL de tampão de amostra contendo SDS (0,121 M de Tris, 5% de SDS, 12,5% de glicerol, 0,25 M de DTT e azul de bromofenol) e aquecidas em água fervente por 5 minutos. As amostras desnaturadas foram resolvidas por SDS-PAGE de 8% a 12% e analisadas por imunotransferência.
Ensaio de ligação de leucina
Para ensaios de ligação de leucina radiomarcada utilizando Sestrina de Drosophila com tag FLAG, células HEK293F em suspensão foram semeadas a 2,5 milhões de células/ml e transfectadas com o cDNA pRK5-FLAG-Sestrina usando polietilenimina. 72 horas após a transfeção, as células foram lavadas uma vez com PBS frio e lisadas em tampão de lise Triton 1% (1% Triton, 40 mM Hepes pH 7,4, 2,5 mM MgCl2 e 1 comprimido de inibidor de protease sem EDTA [Roche] por 25 ml de tampão). Após uma imunoprecipitação anti-FLAG, as esferas foram lavadas 4 vezes com tampão de lise contendo 500 mM de NaCl e, em seguida, incubadas por uma hora no gelo em tampão citosólico (0,1% Triton, 40 mM HEPES pH 7,4, 10 mM NaCl, 150 mM KCl, 2,5 mM MgCl2) com a quantidade indicada de [3H]-leucina e leucina não marcada. Após uma hora, as esferas foram aspiradas até secar e rapidamente lavadas quatro vezes com tampão de lavagem de ligação (0,1% Triton, 40 mM HEPES pH 7,4, 300 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2). As esferas foram aspiradas novamente até secar e ressuspensas em 80 μl de tampão citosólico. Cada amostra foi bem misturada e, em seguida, alíquotas de 15 μl foram quantificadas separadamente usando um contador de cintilação TriCarb (Perkin Elmer). Esse processo foi repetido em pares para cada amostra, para garantir tempos de incubação e lavagem semelhantes para todas as amostras analisadas em diferentes experimentos.
A afinidade pela leucina da Sestrina-FLAG de Drosophila foi determinada normalizando-se primeiro as concentrações de [3H]-leucina ligada em três ensaios de ligação separados, realizados com quantidades variáveis de leucina fria. Esses valores foram plotados e ajustados a uma equação hiperbólica (equação de Cheng-Prusoff) para estimar o valor de IC50. O valor de Kd foi derivado do valor de IC50 usando a equação:
Ensaio de dissociação GATOR2-Sestrina in vitro
Células S2 de Drosophila que expressam estavelmente WDR59 de Drosophila com tag Flag foram privadas de leucina por 1 hora ou mantidas em meio completo, foram lisadas e submetidas a imunoprecipitações anti-FLAG como descrito acima. Os complexos GATOR2-Sestrina imobilizados nas esferas FLAG foram lavados duas vezes em tampão de lise com 250 mM de NaCl e, em seguida, incubados por 25 minutos em 0,3 ml de tampão citosólico (0,1% Triton, 40 mM HEPES pH 7,4, 10 mM NaCl, 150 mM KCl, 2,5 mM MgCl2) com as concentrações indicadas de leucina ou outros aminoácidos em frio. As esferas foram então lavadas três vezes no tampão citosólico. O WDR59 com tag FLAG e a quantidade de Sestrina que permaneceu ligada às esferas foram avaliados por SDS-PAGE e immunoblotting.
Metabolômica baseada em cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) e quantificação das abundâncias de metabólitos
LC/MS-based metabolomics were performed and analyzed as previously described using 500 nM isotope-labeled internal standards. Briefly, an 80% methanol extraction buffer with 500 nM isotope-labeled internal standards was used for whole fly metabolite extraction. Samples were briefly vortexed, dried by vacuum centrifugation, and stored at −80°C until analyzed. On the day of analysis, samples were resuspended in 100 μL of LC/MS grade water and insoluble material was cleared by centrifugation at 15,000 rpm. The supernatant was then analyzed as previously described by LC/MS.
Fly stocks and maintenance
All flies were reared at 25°C and 60% humidity with a 12 hours on/off light cycle on standard laboratory food (12.7 g/L deactivated yeast, 7.3 g/L soy flour, 53.5 g/L cornmeal, 0.4 % agar, 4.2 g/L malt, 5.6 % corn syrup, 0.3 % propionic acid, 1% tegosept/ethanol). The following stocks were used: nprl1 , Mio1 , Sesn8A11 , Lpp-gal4 (gift from S. Eaton and P. Léopold); PromE-Gal4, yw,hs-Flp; mCherry–Atg8a; Act>CD2>GAL4, UAS–nlsGFP/TM6B (gift from Eric Baehrecke), hsFlp; act>CD2>Gal4, UAS nlsGFP, and w; UAS-sfGFPMODC-3xMyc. Elav-Gal4 (#458), Repo-Gal4 (#7415), Mef2-Gal4 (27390), ddc-gal4 (#7010), Tdc2-Gal4 (#9313), vGAT-Gal4 (#58980), attP40 (#36304), attP2 (#36303) and Sesn RNAi (#64027) were obtained from the Bloomington Drosophila Stock Center. Da-Gal4, esg-Gal4, Myo1A-Gal4, Pros-Gal4 were constructed (Perrimon lab stocks).
UAS-Sesn, UAS-Sesn-L431E, UAS-Myc-WDR24 were constructed using the Gateway system. cDNAs were cloned in entry plasmids used for the LR clonase reaction (Invitrogen, 11791–020), with the destination vector pWALIUM10-roe or equivalent (Frederik Wirtz-Peitz, unpublished data). The plasmids were then microinjected into embryos for ϕ31-mediated recombination at attP2 or attP40 landing sites, as per standard procedures to create transgenic flies. attP40, attP2, W1118 and OreR were used as controls.
In Fig. 2c, the larvae of genotype w; Sesn−/−; tubulin-Gal4, tubulin-Gal80ts/UAS-Sesn were raised at a mildly permissive temperature (25°C) to express relatively physiological levels of the Sestrin cDNA in Sestrin-null larvae.
Moscas knock-in SesnL431E foram geradas com a tecnologia CRISPR/Cas9 para obter uma substituição de dois nucleotídeos no lócus endógeno. Foi utilizado um doador de oligo de fita simples (ssODN), contendo a troca de códon (CTG>GAG) flanqueada por braços de homologia de 20 pb (Sequência: ACCAAGGACTACGATAGTGTGGAGGTCGAGCTGCAGGACAGTGA). Um sgRNA único com um sítio de corte adjacente ao lócus de substituição de nucleotídeos (sequência F/R: GTCGCAAGGACTACGATAGTGTGC/ AAACGCACACTATCGTAGTCCTTG) foi clonado no vetor de expressão pCFD3, conforme relato anterior. pCFD3-sgRNA e ssODN foram injetados em embriões nos-Cas9 e os adultos emergentes foram cruzados com Sco/Cyo. As progênies foram triadas por sequenciamento de animais heterozigotos (5–10 animais/cruzamento fundador) (primers de PCR/Sequenciamento: Primer direto: CGACGACTACGACTATGGCGAA; Primer reverso: GCATGTGTGGGTATGTGTGTGGT). Estoques individuais foram estabelecidos e retrocruzados 9 vezes para um fundo controle OreR (utilizando os mesmos primers de PCR e sequenciamento acima para genotipagem).
Formulação e preparação de alimento sintético para moscas
As formulações de dieta para Drosophila foram derivadas de receitas anteriores com as seguintes modificações: (1) o tipo de Ágar (Ágar de Micropropagação Tipo II; Caisson Laboratories #A037), (2) a porcentagem final de Ágar (1%), (3) a quantidade de sacarose (25 g/L de alimento), e (4) os aminoácidos adicionados às soluções estoque antes ou depois da autoclavagem, cuja ordem está descrita abaixo. A composição de aminoácidos da dieta, incluindo as concentrações de leucina, isoleucina e valina, baseou-se na formulação de dieta combinada ao exoma (ou seja, as concentrações utilizadas para um dado aminoácido correspondem à prevalência de exons para aquele aminoácido no genoma de Drosophila) e na formulação de dieta para Drosophila desenvolvida em um estudo anterior que se mostrou ótima para crescimento e fecundidade sem comprometer a longevidade. A justificativa para quais aminoácidos fizeram parte do processo de autoclavagem baseou-se em considerações de solubilidade.
O procedimento completo, a fórmula e as soluções estoque para a produção de alimento são os seguintes:
Procedimento:
Preparar a mistura “Parte 1” (ver Tabelas de Dados Estendidos 1, 3 e 4);
Agitar usando barra magnética;
Autoclavar a mistura “Parte 1” por 15 minutos;
Preparar a mistura “Parte 2” (ver Tabelas de Dados Estendidos 2–4) e reservar;
Retirar a mistura “Parte 1” da autoclave, em seguida combinar com a Mistura “Parte 2” e agitar, certificando-se de misturar bem;
Pipetar rapidamente o alimento em frascos para Drosophila (5–10 mL de alimento/frasco);
Deixar o alimento solidificar/esfriar por aproximadamente uma hora, em seguida tampar os frascos (com tampões de algodão ou com filme plástico) e armazenar o alimento a 4°C.
O alimento é válido por cerca de 3 semanas a 4°C (encolherá e se afastará das paredes dos frascos devido à evaporação).
Nota:
Após a autoclavagem, a mistura “Parte 1” contendo ágar pode começar a solidificar (tanto antes quanto depois de combinar as duas misturas, mas a combinação das duas misturas fará o alimento esfriar e solidificar rapidamente). Combine e despeje o alimento rapidamente enquanto a mistura autoclavada ainda está quente para evitar isso. Adicionar água à bandeja da autoclave e
Manter a mistura “Parte 1” nessa água quente até o momento de combinar e despejar ajuda a prevenir a solidificação prematura.
Números de Catálogo para reagentes não listados nas Tabelas de Dados Estendidos 1–4:
Sacarose: Sigma, S7903
Ágar: Caisson, A037
Ácido propiônico: Sigma, P5561
As soluções estoque podem ser armazenadas a 4°C por vários meses, a menos que especificado de outra forma.
Geração de clones expressando o shRNA de Sesn
Os clones foram gerados pelo cruzamento de yw,hs-flp; mCherry–Atg8a; Act>CD2>GAL4, UAS–nlsGFP/TM6B com as linhagens UAS indicadas. A progênie do genótipo relevante foi criada a 25°C e clones espontâneos foram gerados no corpo adiposo devido à expressão basal da flipase de choque térmico (hs-flp).
Ensaio de preferência alimentar
A determinação do consumo relativo de alimentos a partir de duas fontes alimentares diferentes utilizando oligômeros de DNA únicos foi realizada conforme relatado anteriormente.
Oligômero de DNA 1:
5’ACCTACACGCTGCGCAACCGAGTCATGCCAATATAAGCAGATTAGCATTACTTTGAGCAACGTATCGGCGATCAGTTCGCCAGCAGTTGTAATGAGCCCC-3’
Primer Forward qPCR 1 – 5’ – GCAACCGAGTCATGCCAATA – 3’
Primer Reverse qPCR 1 – 5’ – TTACAACTGCTGGCGAACTG – 3’
Oligômero de DNA 2:
5’GGGCAGCAGGATAACTCGAATGTCTTAGTGCTAGAGGCTTGGGGCGTGTAAGTGTATCG AAGAAGTTCGTGTTAAACGCTTTGGAATGACTGTAATGTAG-3’
Primer Forward qPCR 2 – 5’ – CAGCAGGATAACTCGAATGTCTTA – 3’
Primer Reverse qPCR 2 – 5’ – CAGTCATTCCAAAGCGTTTAACA – 3’
Primers qPCR para Cyp1 genômico:
Primer Forward qPCR Cyp1 – 5’ – ACCAACCACAACGGCACTG – 3’
Primer Reverse qPCR Cyp1 – 3’ – TGCTTCAGCTCGAAGTTCTCATC – 5’
Os oligômeros de DNA e seus primers qPCR correspondentes foram adquiridos da Integrated DNA Technologies (IDT) com 4 nmol por tubo e diluídos em água livre de nucleases para soluções estoque com uma concentração final de DNA de 3,5 μg/μl.
Pulverize e limpe a superfície de maçãs Gala frescas usando etanol 70%. Pedaços de maçã Gala fresca (~1 g) que contêm tanto um pedaço de casca quanto de polpa foram cortados em um campo limpo usando uma faca, e tanto a faca quanto o campo foram pré-limpos com etanol 70%. Dois pedaços de maçã com formato e peso semelhantes foram colocados nos cantos opostos de um frasco limpo para Drosophila de 6 oz (177 ml; 57C × 57L × 103A (em mm)). Soluções de 100 μL contendo um oligômero de DNA (concentração final de 3,5 ng/μL) e substâncias (isto é, água estéril, soluções de aminoácidos, etc.) foram distribuídas uniformemente sobre os pedaços de maçã e deixadas para absorção por 1,5–2 horas. Moscas adultas com idade sincronizada (15 fêmeas e 5 machos) foram transferidas para esses frascos de ensaio e alimentadas ad libitum com as maçãs pelos tempos indicados nos experimentos de curso temporal (Fig 3b e Fig de Dados Estendidos 4g) e por 24 horas nos outros experimentos de preferência alimentar.
Moscas anestesiadas com CO2 foram coletadas com uma pinça. De cada frasco, dois tubos de moscas fêmeas foram coletados, com cinco moscas por tubo. Cinco moscas foram homogeneizadas para cada amostra de qPCR. A homogeneização foi realizada usando um beads beater no frio após adicionar 250 μL de tampão de esmagamento (Tris-HCl 10 mM, pH 8,2, EDTA 1 mM, NaCl 1 mM) e 0,5 μL de proteinase K a 20 mg/mL (Thermofisher Scientific # AM2546). Os lisados de mosca inteira foram digeridos a 37 °C por 30–40 minutos após a homogeneização, seguido pela inativação da proteinase K a 95 °C por 5 minutos. As amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 15.000 rpm em temperatura ambiente e 2 μL do sobrenadante foram carregados em cada reação de qPCR em uma placa de qPCR de 96 poços. Usamos o master mix de qPCR SYBR green da BIO-RAD e um Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real CFX96 Touch com Tm=60°C e 40 ciclos por corrida.
Os valores de Ct do qPCR do gene Cyp1 genômico foram usados para controlar a eficiência da extração. Para cada lote de amostras, uma média dos valores de Ct de Cyp1 foi calculada e todas as amostras que se afastassem ±0,5 da média foram descartadas. Curvas padrão para cada oligômero de DNA 1 e 2 foram geradas, e a quantidade de oligômero de DNA de cada tubo de moscas foi calculada ajustando seus valores de Ct às curvas padrão. O índice de preferência foi gerado dividindo a quantidade calculada do oligômero de DNA 1 pela quantidade calculada do oligômero de DNA 2.
Para remover o oligômero externo que pode aderir à parte externa das moscas, usamos um protocolo de quatro etapas descrito anteriormente: (1) lavagem de dez minutos com detergente para vidraria em pó Contrex AP a 10% (Cat #5204, Decon Laboratories, Inc.); (2) lavagem de cinco minutos em ddH2O; (3) lavagem de dois minutos em 30% de alvejante; e (4) lavagem de cinco minutos em ddH2O. Todas as lavagens foram realizadas em um tubo de microcentrífuga de 1500 μL com agitação contínua em temperatura ambiente.
Para a Figura 3c e a Extended Data Figure 4f, alimentamos as moscas com comida contendo 25 μM de Rapamicina ou 25 μM de etanol por 2 dias antes da privação de proteína durante a noite ou não (incluindo 25 μM de Rapamicina ou 25 μM de etanol). Em seguida, para o ensaio de escolha final, 25 μM de Rapamicina ou 25 μM de etanol foram adicionados a ambos os pedaços de maçã no recipiente.
Ensaios de imunofluorescência
Corpos gordurosos de larvas com 96 horas AEL (após a postura dos ovos) foram dissecados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente, fixados por 25–30 min em formaldeído a 4%, lavados duas vezes por 10 min em PBS com Triton a 0,3% (PBST), bloqueados por 30 min (PBST, BSA a 5%, FBS a 2%, NaN3 a 0,02%), incubados com anticorpos primários no tampão de bloqueio durante a noite e lavados 4 vezes por 15 min. Anticorpos secundários diluídos 1:500 em PBST foram adicionados por 1 hora e os tecidos lavados 4 vezes antes da montagem em Vectashield (Vector Laboratories) contendo DAPI. Cérebros de moscas fêmeas adultas com 5–10 dias de idade foram dissecados e processados como em um estudo anterior.
Imagens da Figura 2c e da Figura de Dados Estendidos 3d foram adquiridas em um Zeiss Axio Zoom V16. Imagens para a Figura 4b, 4c, Figura de Dados Estendidos 1c, Figura de Dados Estendidos 7f e Figuras de Dados Estendidos 8b, 8c foram adquiridas em um microscópio Zeiss AxioVert200M com objetiva de imersão em óleo de 63X ou 40X ou objetiva de 10X e uma cabeça confocal de disco giratório Yokogawa CSU-22 com a modificação Borealis (Spectral Applied Research/Andor) e uma câmera CCD Hamamatsu ORCA-ER. O pacote de software MetaMorph (Molecular Devices) foi utilizado para controlar o hardware e a aquisição das imagens. Os lasers de excitação utilizados para capturar as imagens foram de 405 nm, 488 nm e 561 nm. As imagens das Figuras de Dados Estendidos 6b, 6c foram adquiridas com a câmera de um iPhone XR acoplada a um microscópio binocular.
Ensaio de preferência de oviposição
A configuração do ensaio de preferência de oviposição foi idêntica à do ensaio de preferência alimentar. Em vez de coletar moscas fêmeas para análises de qPCR, os dois pedaços de maçã foram removidos do frasco e examinados sob um microscópio binocular. O número de ovos em cada pedaço de maçã foi determinado.
Quantificação do tamanho do ovário
Ovários foram dissecados em PBS e imagens de campo claro foram adquiridas utilizando um microscópio Zeiss Axio Zoom V16. O tamanho dos ovários foi quantificado utilizando a área média de ovários individuais no ImageJ.
Tempo de desenvolvimento
Cruzamentos com três dias de idade foram utilizados para períodos de 3–4 horas de coleta de ovos em alimento padrão de laboratório. Larvas L1 recém-eclodidas foram coletadas 24 horas depois para crescimento sincronizado utilizando as dietas indicadas a uma densidade de 30 animais por frasco. O tempo de desenvolvimento foi monitorado contando-se o número de animais que entraram em pupariação, a cada duas horas em condições alimentadas, ou uma/duas vezes ao dia em condições de privação. É relatado o tempo no qual metade dos animais haviam entrado em pupariação. Para experimentos de tempo de desenvolvimento larval, foi utilizada uma dieta quimicamente definida com 10% de leucina, pois a privação completa de leucina causava letalidade rapidamente, antes que qualquer comparação de tamanho entre genótipos pudesse ser realizada de forma eficiente e significativa.
Experimentos de longevidade
Para gerar moscas adultas com idade sincronizada, larvas foram criadas em alimento de laboratório em baixa densidade, transferidas para alimento fresco assim que emergiam como adultas e acasaladas por 48h. Os animais foram anestesiados com baixos níveis de CO₂ e separados a uma densidade de 25 moscas por frasco. Cada condição examinada utilizou de 8 a 10 frascos de moscas. As moscas foram transferidas para frascos novos três vezes por semana, momento no qual as mortes também foram registradas. Para moscas adultas, foi utilizada dieta sem leucina ou dieta sem valina.
Análises estatísticas
Para experimentos que não envolviam sobrevivência, foram utilizados testes t não pareados bicaudais, testes t múltiplos, análises de ANOVA de uma via ou duas vias seguidas por testes post hoc para comparação entre dois grupos no GraphPad Prism (GraphPad Software v.9). Todas as comparações foram bicaudais, a menos que especificado. Todos os valores de P analisados são indicados para cada comparação feita em todos os painéis das figuras. Valores de P menores que 0,05 foram considerados indicativos de significância estatística.
Para comparações de sobrevivência nas Figuras 2a e 2b, foram realizados testes z de duas proporções. Os dados de porcentagem de pupariação (Figura 2a, h de Dados Estendidos) foram comparados usando testes de permutação, onde a estatística de teste foi a diferença nas médias dos tempos de pupariação dos dois genótipos. A distribuição da estatística de teste sob a hipótese nula foi estimada simulando 100 milhões de rearranjos dos dados. Os testes de permutação foram realizados no R (script disponível nos Dados Suplementares 2). Os resultados de todas as análises estatísticas foram resumidos nos arquivos de dados fonte correspondentes a cada figura.
Análise dos dados de sobrevivência
Todos os dados eram completos e não censurados. As estimativas de Kaplan-Meier da função de sobrevivência foram plotadas e usadas para calcular os tempos medianos de sobrevivência. Testes de log-rank foram usados para comparar as distribuições de sobrevivência, e a análise univariada de riscos proporcionais de Cox (com empates tratados pela aproximação de Efron) foi usada para calcular as razões de risco entre moscas mutantes de Sestrin versus tipo selvagem dentro de cada condição dietética. Para examinar a interação entre genótipo e dieta (especificamente usando a hipótese alternativa de que o defeito de tempo de vida das moscas mutantes de Sestrin versus tipo selvagem é exacerbado em uma dieta sem leucina em comparação com uma sem valina), testes de Wald unicaudais foram conduzidos nos coeficientes de interação gerados por modelos de riscos proporcionais de Cox com dois fatores e interação (com empates tratados pela aproximação de Efron). Todas as análises estatísticas dos dados de sobrevivência foram realizadas no R (script disponível nos Dados Suplementares 3).
Dados Estendidos
Validação das dietas quimicamente definidas e perda dos fenótipos de Sestrin nos corpos gordurosos larvais.
a, b, Larvas de Drosophila alimentadas com dietas quimicamente definidas carentes de aminoácidos individuais apresentam níveis reduzidos do aminoácido ausente. Níveis relativos de leucina (a) e valina (b) medidos por LC-MS/MS em extratos larvais totais de larvas do tipo selvagem (OreR) ou SesnL431E alimentadas com a dieta indicada por 4,5 horas. Os valores são média ± DP de réplicas técnicas de um experimento representativo. n=4 amostras biológicas independentes. Duas amostras do tipo selvagem (OreR) sem leucina e sem valina, respectivamente, não produziram picos adequados para os níveis de leucina, sendo assim descartadas. Testes t não pareados múltiplos, método de comparação múltipla de Holm-Šídák.
c, O knockdown de Sesn impede a indução da autofagia pela privação de leucina. Células do corpo gorduroso em larvas no meio do terceiro instar expressando mCherry-Atg8a foram alimentadas com as dietas indicadas por 4,5 horas. O RNAi de Sesn foi expresso em clones de células (GFP, contornadas) usando o sistema FLP-out. Barra de escala, 10 μm.
d, A perda de Sestrin não afeta a inibição de mTORC1 causada pela privação total de alimento. Análises por imunoblot de fosfo-S6K e S6K em moscas adultas fêmeas no estado alimentado ou privadas de todo alimento por 1 dia.
A mutação SesnL431E não afeta o tempo de vida das moscas adultas nas dietas quimicamente definidas, mas atrasa levemente o desenvolvimento larval, enquanto a perda de Sestrin não afeta o desenvolvimento larval.
a, A perda de Sestrina não afeta o desenvolvimento de larvas alimentadas com uma dieta completa. Tempo até a pupariação para larvas w1118
e Sesn
−/− alimentadas com a dieta padrão à base de levedura.
b-g, Curvas de sobrevivência para animais do sexo e genótipos indicados, alimentados com as dietas quimicamente definidas indicadas. (a) nWT(OreR)=235; n(SesnL431E)=238; (b) nWT(OreR)=233; n(SesnL431E)=237; (c) nWT(OreR)=242; n(SesnL431E)=248; (d) nWT(OreR)=242; n(SesnL431E)=240; (e) nWT(OreR)=229; n(SesnL431E)=243; (f) nWT(OreR)=245; n(SesnL431E)=245. Consulte as estatísticas nos Dados Suplementares 1 e métodos.
h. Larvas SesnL431E criadas em uma dieta padrão à base de levedura apresentam atraso no desenvolvimento.
Os dados são representativos de três experimentos independentes com resultados semelhantes. A análise estatística foi realizada usando um teste de permutação sobre a diferença das médias dos tempos de pupariação dos dois genótipos (a, h).
Sinalização de mTORC1 mediada por Sestrina nos ovários.
a, b, A Sestrina medeia a detecção de leucina pelo mTORC1 em animais adultos. Análises de immunoblot de animais adultos inteiros do sexo e genótipo indicados, após jejum noturno e 1,5 horas de realimentação com as dietas indicadas.
c, Em moscas alimentadas com uma dieta padrão e sem Sestrina ou expressando o mutante de Sestrina deficiente na ligação à leucina (L431E), a atividade do mTORC1 está aumentada ou diminuída, respectivamente. Os lisados foram preparados a partir de ovários isolados de animais dos genótipos indicados e alimentados com uma dieta padrão à base de levedura.
d, e, A perda de Sestrina acelera a redução no tamanho dos ovários causada pela privação de leucina. (d) Tamanho dos ovários em fêmeas dos genótipos indicados, alimentadas com as dietas indicadas por 24 horas. Os resultados são quantificados em (e). Barra de escala, 500 μm.
f, g, Moscas SesnL431E apresentam fecundidade reduzida, mas não fertilidade. (f) Número de ovos colocados durante um período de 60 horas por fêmeas dos genótipos indicados mantidas na dieta padrão à base de levedura. (g) Taxa de eclosão dos ovos colocados nas mesmas condições de (f).
(e, f, g) Os valores são média ± DP de réplicas técnicas de um experimento representativo. (e) n=6 (Tipo selvagem (w1118)), 8 (Sesn
−/−), 7 (SesnL431E dieta completa em aminoácidos), 5 (SesnL431E dieta sem leucina) e 6 (SesnL431E dieta sem valina). (f) n=5. (g) n=4. Os dados são representativos de três experimentos independentes com resultados semelhantes. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey (e), e ANOVA de uma via (f, g) seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett.
A Sestrina medeia a preferência por alimentos contendo leucina e influencia a ingestão total de alimentos.
a-c, Caracterização dos métodos utilizados no ensaio de dupla escolha alimentar. (a) Mensuração do peso dos pedaços de maçã utilizados no ensaio. n=8. (b) Determinação do sinal de qPCR de fundo para cada oligonucleotídeo de código de barras utilizado no ensaio. n=6 para cada condição. (c) Os sinais de qPCR usados para determinar a preferência por leucina das moscas do tipo selvagem provêm principalmente de oligonucleotídeos de DNA internos, em vez de externos que poderiam contaminar a superfície do corpo das moscas fêmeas. qPCR para os oligonucleotídeos de código de barras em um ensaio de escolha entre leucina e água, antes e depois da lavagem dos animais conforme descrito anteriormente. n=4 para ambas as condições pré e pós-lavagem.
d, Preferência das moscas por pedaços de maçã pintados com as concentrações indicadas de leucina. Os animais tiveram a opção de escolha entre maçãs cobertas com leucina ou água. As concentrações indicadas de leucina (5 mM, 15 mM, 30 mM e 70 mM) foram as concentrações das soluções usadas para cobrir as maçãs. A concentração final no alimento deve estar cerca de 10 vezes mais diluída. n (5 mM) = 7, n (15 mM e 30 mM) = 6, n (70 mM) = 5.
e, Moscas fêmeas adultas não apresentam preferência por pedaços de maçã pintados com valina em comparação aos pintados com água. Animais do tipo selvagem (OreR) receberam as opções alimentares indicadas e a diferença de preferência em número de vezes foi mostrada. n (leucina vs água) = 8, n (valina vs água) = 10, n (leucina vs valina) = 7.
f, O tratamento com rapamicina reduz o consumo alimentar das moscas. Animais pré-tratados com veículo ou rapamicina tiveram a opção de escolha entre maçãs cobertas com leucina ou água. Para o grupo rapamicina durante o ensaio de escolha, os animais foram alimentados com maçãs pintadas com rapamicina além de leucina ou água. Os dados mostram os valores normalizados de consumo alimentar. n=5 para ambas as condições.
g, Animais SesnL431E não apresentam preferência por maçã pintada com valina em relação à pintada com água. Os animais tiveram a opção de escolha entre maçãs cobertas com valina ou água e a preferência alimentar foi medida nos momentos indicados. Os dados mostram a diferença em número de vezes na ingestão relativa de alimentos pela maçã coberta com valina em comparação com a maçã coberta com água. n=10 (2 h), 12 (4 h), 12 (6 h), 9 (9 h) e 9 (24 h).
h,i, Animais SesnL431E apresentam menor ingestão alimentar independentemente do teor de leucina do alimento (h), e animais Sesn−/− apresentam maior ingestão alimentar independentemente do teor de leucina do alimento (i). n=4 para todas as condições.
j, A reexpressão corporal total da Sestrina selvagem dirigida por Tub>Gal4 é suficiente para restaurar parcialmente a preferência por alimento contendo leucina em moscas fêmeas adultas Sesn−/−. Animais com os genótipos indicados tiveram a opção de escolha entre maçãs cobertas com leucina ou água. Os dados mostram a diferença de preferência em número de vezes. n (attP2) = 10, n (Sestrin WT) = 6.
k, Moscas fêmeas adultas não desenvolvem preferência por maçã contendo valina, independentemente do seu genótipo. Animais com os genótipos indicados receberam a escolha entre maçãs revestidas com leucina ou água. Os dados mostram a preferência como diferença em vezes. n (Tipo selvagem OreR, SesnL431E, Sesn−/−) = 10, n (Tipo selvagem w1118) = 12.
Os valores são média ± DP de repetições técnicas de um experimento representativo. Os dados são representativos de três experimentos independentes com resultados semelhantes. A análise estatística foi realizada usando teste t não pareado bicaudal (c, f, j), ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett (d, g), ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey (e), ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey (h, i) e ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Šídák (k).
A detecção de leucina via o eixo Sestrina-mTORC1 contribui para a detecção do conteúdo proteico dos alimentos.
a, Moscas do tipo selvagem (OreR) preferem alimentos contendo uma alta quantidade de extrato de levedura e essa preferência é reduzida pela adição de leucina a alimentos contendo uma baixa quantidade de extrato de levedura. Moscas SesnL431E têm uma preferência reduzida pelo alimento contendo uma alta quantidade de extrato de levedura e a adição de leucina tem impacto mínimo na preferência. A forma como o índice de preferência alimentar foi calculado está descrita nos métodos. n (Tipo selvagem OreR, sem leucina)=5, n (Tipo selvagem OreR, com leucina)=7, n (SesnL431E, sem leucina)=6, n (SesnL431E, com leucina)=9.
b, Como em (a), um experimento de escolha para moscas do tipo selvagem w1118 e Sesn−/−. n (Tipo selvagem w1118, sem leucina)=9, n (Tipo selvagem w1118, sem leucina)=8, n (Sesn−/−, sem leucina)=9, n (Sesn−/−, com leucina)=12.
Os valores são média ± DP de repetições técnicas de um experimento representativo. Os dados são representativos de três experimentos independentes com resultados semelhantes. A análise estatística foi realizada usando teste t não pareado bicaudal, método de Holm-Šídák.
Moscas preferem depositar ovos em alimentos contendo leucina de uma maneira que requer a capacidade de ligação à leucina da Sestrina.
a, Esquema da configuração utilizada no ensaio de preferência de oviposição. Dois pedaços idênticos de maçã foram pintados com soluções contendo diferentes substâncias e colocados em lados opostos de um recipiente. Os animais puderam se alimentar ad libitum durante o ensaio e o número de ovos depositados em cada maçã foi contado após 24 horas.
b, c, Moscas do tipo selvagem preferem depositar ovos em maçãs pintadas com levedura ou aminoácidos em relação às maçãs pintadas com água. Barras de escala, 1 mm.
d-h, Animais SesnL431E e Sesn−/− não preferem depositar ovos na maçã contendo leucina.
(a) criado com BioRender.com. Os valores são média ± DP de três repetições técnicas de um experimento representativo. Os dados são representativos de dois experimentos independentes com resultados semelhantes. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey (d-g) e teste de comparações múltiplas de Šídák (h).
Sinalização de mTORC1 regulada por Sestrin em células gliais controla a preferência das moscas por alimento contendo leucina.
a, Mesmos dados da Figura 4a, exceto que os valores não foram normalizados em relação aos valores das moscas expressando o shRNA controle de cada um dos drivers indicados. n=5 (da, pros attP40 shRNA; da Sesn shRNA), 8 (repo, tdc2 attP40 shRNA; vGAT Sesn shRNA), 12 (repo, esg Sesn shRNA), 15 (Elav attP40 shRNA), 16 (Elav, Mef2, ddc Sesn shRNA), 22 (Mef2 attP40 shRNA; Myo1A Sesn shRNA), 10 (ddc, Lpp attP40 shRNA; tdc2, promE Sesn shRNA), 11 (vGAT attP40 shRNA; Lpp Sesn shRNA), 9 (promE attP40 shRNA; pros Sesn shRNA), 13 (esg attP40 shRNA), 24 (Myo1A attP40 shRNA). Cada ponto representa a razão entre a quantidade de dois códigos de barras de oligonucleotídeos por 5 moscas.
b, Expressão da Sestrin selvagem sob o driver repo-Gal4 em moscas Sesn
−/− é suficiente para resgatar parcialmente o fenótipo de preferência por leucina. n (repo-attP40 no tipo selvagem w1118) = 4, n (outras condições) = 8.
c, Superexpressão de TSC1+TSC2 em células gliais utilizando repo-Gal4; Tub-Gal80ts reduz a preferência das moscas por alimento contendo leucina. n (attP40) = 16, n (TSC1+2) = 19.
d, O mRNA de Sesn (vermelho) é expresso em todos os subtipos classificados de células gliais, conforme indicado pela coexpressão de um marcador pan-glial, Repo (verde). O conjunto de dados de sequenciamento de RNA de célula única é de um estudo anterior.
e, O knockdown de Sestrin usando um driver pan-glial de células (repo-Gal4) reduz a preferência por leucina das moscas de forma muito mais significativa do que um knockdown usando drivers para subtipos gliais. O knockdown de Sestrin em células gliais do córtex usando a linhagem driver wrapper-Gal4 diminuiu significativamente a preferência das moscas por leucina. n=8 (repo, 9.GMR50A12, 15.R85G01-Gal4 attP40 shRNA; 9.GMR50A12, 15.R85G01-Gal4 Sesn shRNA), 12 (1.GMR60F04, 2.GMR53B07, 3.GMR55B03, 4.GMR56F03, 5.GMR86E01, 6.GMR53H12, 10.Alrm-Gal4 attP40 shRNA; repo, 2.GMR53B07, 3.GMR55B03, 4.GMR56F03, 5.GMR86E01, 10.Alrm-Gal4, 14.R75H03-Gal4 Sesn shRNA), 10 (7.GMR35E04 attP40 shRNA, 1.GMR60F04 Sesn shRNA), 11 (8.GMR77A03, 11.Wrapper-Gal4, 14.R75H03-Gal4 attP40 shRNA; 6.GMR53H12, 11.Wrapper-Gal4 Sesn shRNA), 28 (12.Eaat1-Gal4 39915, 13.Mdr65-Gal4 attP40 shRNA), 9 (7.GMR35E04, 8.GMR77A03 Sesn shRNA), 24 (12.Eaat1-Gal4 39915 Sesn shRNA), 18 (13.Mdr65-Gal4 Sesn shRNA).
f, Projeção confocal de cérebros de fêmeas selvagens expressando 4MBOX-GFP alimentadas com o alimento padrão à base de levedura ou privadas de proteína por 24 horas. Barra de escala, 10 μm.
Os valores são média ± DP de réplicas técnicas de um experimento representativo. Os dados são representativos de dois experimentos independentes com resultados semelhantes. A análise estatística foi realizada usando teste t não pareado bicaudal (a, c, e) e ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett (b).
A leucina dietética regula a sinalização de mTORC1 em células gliais na área periesofágica de uma maneira que depende de Sestrin e de sua capacidade de se ligar à leucina.
a, Esquema das áreas imageadas e quantificadas para a razão de células GFP-positivas para células Repo-positivas. O retângulo vermelho representa a zona 1, o retângulo laranja representa a zona 2 e o retângulo roxo representa a zona 3.
b, Imagens confocais representativas das áreas cerebrais das zonas 1 e 2 de moscas fêmeas selvagens, Sesn
−/− e SesnL431E alimentadas com dieta completa em aminoácidos ou livre de leucina. Barra de escala, 25 μm. Nota: as imagens foram reprocessadas durante a revisão a partir do mesmo lote de amostras da Figura 4c, com o objetivo de mostrar claramente todas as zonas 1, 2 e 3. Os cérebros exatos das moscas nas imagens e pilhas representativas podem variar em relação à Figura 4c, embora todos sejam do mesmo lote de amostras.
c, Imagens confocais representativas das áreas cerebrais da zona 3 de moscas fêmeas selvagens, Sesn
−/− e SesnL431E alimentadas com dieta completa em aminoácidos ou livre de leucina. Barra de escala, 10 μm. Nota: as imagens são dos mesmos cérebros mostrados em (b).
(a) criado com BioRender.com. d, e, Quantificação da razão GFP-positivo para Repo-positivo na zona 1 (d) e zona 3 (e). n=3 cérebros individuais com o tratamento dietético e genótipo indicados para cada condição. Os valores são média ± DP de réplicas biológicas de um experimento representativo. Os dados são representativos de três experimentos independentes com resultados semelhantes. A análise estatística foi realizada usando ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparações múltiplas de Šídák.
Mistura de alimento quimicamente definido “Parte 1”
Parte 1 (AUTOCLAVAR 15 minutos) Categoria Ingrediente Quantidade de solução estoque por litro Agente Gelificante Agar Tipo II 10 g Açúcar Sacarose 25 g Íons Metálicos CaCl26H2O 1 mL CuSO45H2O 1 mL FeSO47H2O 1 mL MgSO4 (anidro) 1 mL MnCl24H2O 1 mL ZnSO47H2O 1 mL Colesterol Colesterol 15 mL Aminoácidos Tirosina 0,93g Histidina 50 mL Isoleucina 50 mL Metionina 50 mL Fenilalanina 50 mL Treonina 50 mL Valina 50 mL Água Água (milliQ) 158 mL
Mistura de alimento quimicamente definido “Parte 2”
Parte 2 Categoria Ingrediente Quantidade de solução estoque por litro Base Tampão 100 ml Aminoácidos Arginina 10 mL Cisteína 10 mL Glutamato 10 mL Glicina 10 mL Lisina 10 mL Prolina 10 mL Serina 10 mL Alanina 50 mL Asparagina 50 mL Aspartato 50 mL Glutamina 50 mL Leucina 50 mL Triptofano 50 mL Solução de Vitaminas ver Parte 1 21 mL Ácido Fólico Ácido Fólico 1 mL Solução de Outros Nutrientes ver Parte 1 8 mL Conservantes Ácido propiônico 6 mL metil 4-hidroxibenzoato 15 mL
Aminoácidos Número de Catálogo g/50mL Suspender em: L-Alanina Sigma, A7469 1,1 H2O L-Asparagina Amresco, 94341 1,03 H2O Ácido L-Aspártico Alfa Aesar, A13520 1,17 NaOH 0,5N L-Glutamina Amresco, 0374 1,12 H2O L-Histidina Amresco, 1B1164 0,65 H2O L-Isoleucina Amresco, E803 1,12 H2O L-Leucina Sigma, L8912 2,03 HCl 0,2N L-Metionina Amresco, E801 0,6 H2O L-Fenilalanina Sigma, P5482 1,01 H2O L-Treonina Sigma, T8441 1,11 H2O L-Triptofano Amresco, E800 0,32 H2O L-Valina Amresco, 1B1102 1,2 H2O L-Arginina HCl Amresco, 0877 8,16 H2O L-Cisteína Sigma, 30089 1,71 HCl 1N Ácido L-Glutâmico Alfa Aesar, A12919 7,59 H2O L-Glicina Alfa Aesar, A13816 3,84 H2O L-Lisina HCl Amresco, 0437 6,83 H2O L-Prolina Sigma, P5607 4,89 H2O L-Serina Sigma, S4311 6,89 H2O L-Tirosina Sigma, T8566 *adicionar pó de Tyr N/A
Outras soluções estoque
Solução de vitaminas Número de Catálogo g/50mL Suspender em: Biotina Sigma, B4501 0,001 H2O Pantotenato de cálcio Sigma, 21210 0,039 H2O Ácido nicotínico Sigma, N4126 0,03 H2O Piridoxina HCl Sigma, P9755 0,006 H2O Riboflavina Sigma, R4500 0,003 H2O Tiamina (aneurina) Sigma, T4625 0,005 H2O Solução de ácido fólico Número de Catálogo g/50mL Suspender em: Ácido fólico Sigma F8758 0,025 NaOH 0,004N Solução de outros nutrientes Número de Catálogo g/50mL Suspender em: Cloreto de colina MP Biomedicals, 194639 0,3125 H2O Inosina Sigma, I4125 0,4065 H2O Mio-Inositol Sigma, I7508 0,0315 H2O Uridina Sigma, U3003 0,375 H2O Solução de metil 4-hidroxibenzoato Número de Catálogo g/50mL Suspender em: Metil 4-hidroxibenzoato Sigma, H3647 5 EtOH 95% Tampão Número de Catálogo Estoque de 50 mL Ácido acético glacial Millipore, AX0074 1,5 mL KH2PO4 JT Baker, 3246 1,5 g NaHCO3 Sigma, S8875 0,5 g Água Completar para 50 mL Íons metálicos Número de Catálogo g/50mL Suspender em: CaCl26H2O Sigma, 21108 12,5 H2O CuSO4*5H2O Sigma, C7631 0,125 H2O FeSO47H2O Sigma, F7002 1,25 H2O (armazenar a -20°C) MgSO4 (anidro) Sigma, M7506 12,5 H2O MnCl24H2O Sigma, M3634 0,05 H2O ZnSO47H2O Sigma, Z0251 1,25 H2O Solução de colesterol Número de Catálogo g/50mL Suspender em: Colesterol Sigma, C8253 1 EtOH
Material Suplementar
Conflitos de interesse
D.M.S. é acionista da Navitor Pharmaceuticals, que tem como alvo terapêutico a via de detecção de aminoácidos a montante de mTORC1. J.W.L. assessora a Raphael Pharmaceuticals, Nanocare Technologies, Petri Biologics e Restoration Foodworks. M.A.R. atualmente trabalha na Amgen, que tem interesses em doenças neurodegenerativas. Essas relações não têm sobreposição com este estudo. Os outros autores declaram não haver conflitos de interesse.
Informações suplementares estão disponíveis para este artigo.
Disponibilidade de dados
Os dados que sustentam os achados deste estudo estão disponíveis junto aos autores correspondentes e ao Whitehead Institute (sabadmin@wi.mit.edu) mediante solicitação razoável.
Referência
mTOR na intersecção de nutrição, crescimento, envelhecimento e doenças
Base estrutural para a detecção de leucina pela via Sestrin2-mTORC1
A Sestrina2 é um sensor de leucina para a via mTORC1
As GTPases Rag ligam-se à raptor e medeiam a sinalização de aminoácidos para mTORC1
Regulação de TORC1 por GTPases Rag na resposta a nutrientes
A localização de Rheb na endomembrana é essencial para sua função de sinalização
Um complexo supressor tumoral com atividade GAP para as GTPases Rag que sinalizam suficiência de aminoácidos para mTORC1
Arg-78 de Nprl2 catalisa a hidrólise de GTP estimulada por GATOR1 pelas GTPases Rag
Arquitetura dos complexos humanos GATOR1 e GATOR1-GTPases Rag
Os efeitos dos aminoácidos no repressor traducional 4E-BP1 são mediados principalmente por L-leucina em adipócitos isolados
Regulação da sinalização TOR sensível a aminoácidos por análogos de leucina em adipócitos
Leucina e mTORC1: uma relação complexa
A leucina estimula a síntese proteica no músculo esquelético de leitões neonatos ao aumentar a ativação de mTORC1
A Sestrina2 inibe mTORC1 através da modulação dos complexos GATOR
As Sestrinas interagem com GATOR2 para regular negativamente a via de detecção de aminoácidos a montante de mTORC1
Sestrina como inibidor de retroalimentação de TOR que previne patologias relacionadas à idade
GCN2 mantém a supressão de mTORC1 durante a privação de aminoácidos ao induzir Sestrina2
O Alvorecer da Era dos Sensores de Aminoácidos para a Via mTORC1
Análise de aminoácidos da hemolinfa de larvas individuais de Drosophila
mTORC1 equilibra o suprimento de aminoácidos celulares com a demanda de síntese proteica através do controle pós-transcricional de ATF4
O Complexo GATOR1 regula a homeostase metabólica e a resposta ao estresse nutricional em Drosophila melanogaster
Transformando alimento em ovos: percepções da biologia nutricional e fisiologia do desenvolvimento de Drosophila
Os inibidores de TORC1 Nprl2 e Nprl3 medeiam uma resposta adaptativa à privação de aminoácidos em Drosophila
Os reguladores de TORC1 Iml1/GATOR1 e GATOR2 controlam a entrada na meiose e o desenvolvimento do ovócito em Drosophila
A nucleoporina Seh1 forma um complexo com Mio e desempenha uma função essencial tecido-específica na oogênese de Drosophila
missing oocyte codifica uma proteína nuclear altamente conservada necessária para a manutenção do ciclo meiótico e da identidade do ovócito em Drosophila
Monitoramento da preferência alimentar em Drosophila por marcação com oligonucleotídeos
Caracterização nutricional de maçã em função do genótipo
Efeitos da localização dentro da copa da árvore sobre carboidratos, ácidos orgânicos, aminoácidos e compostos fenólicos na casca e na polpa do fruto de três cultivares de maçã (Malus × domestica)
Composição de aminoácidos livres de sucos de maçã com potencial para produção de sidra determinada por UPLC-PDA
A administração única de rapamicina induz uma redução prolongada no peso corporal defendido em ratos
A rapamicina aumenta a longevidade e inibe a tumorigênese espontânea em camundongos fêmeas consanguíneos
Sestrina2 como um Novo Biomarcador e Alvo Terapêutico para Diversas Doenças
Leveduras, e não voláteis de frutas, medeiam a atração, oviposição e desenvolvimento de Drosophila melanogaster
A sinalização química e atração de insetos é uma característica conservada em Drosophila
Um estudo nutricional de insetos, com referência especial a microrganismos e seus substratos
O estado interno de aminoácidos modula neurônios gustativos de levedura para apoiar a homeostase proteica em Drosophila
Um Atlas do Transcriptoma de Célula Única do Cérebro Envelhecido de Drosophila
Mitf é um regulador mestre da v-ATPase, formando um módulo de controle para a homeostase celular com a v-ATPase e o TORC1
Mitf de Drosophila regula a V-ATPase e a via lisossomal-autofágica
Sestrina é um regulador chave da função de células-tronco e da longevidade em resposta a aminoácidos da dieta
Reexame da Detecção de Aminoácidos da Dieta Revela um Mecanismo Independente de GCN2
Um sensor pós-ingestivo de aminoácidos promove o consumo de alimentos em Drosophila
Uma base molecular e neuronal para a detecção de aminoácidos na larva de Drosophila
Preferência e aprendizado de aminoácidos em larvas de Drosophila
A quinase GCN2 influencia o comportamento alimentar para manter a homeostase de aminoácidos em onívoros
Um Papel Dependente do Contexto Molecular e Celular para Ir76b na Detecção do Sabor de Aminoácidos
Respostas fisiológicas do labelo de Drosophila a aminoácidos
A detecção de aminoácidos em um circuito dopaminérgico promove a rejeição de uma dieta incompleta em Drosophila
Um papel para a quinase S6 e a serotonina na mudança alimentar pós-cópula e no equilíbrio de nutrientes em D. melanogaster
Plasticidade específica de ramos de um circuito de dopamina bifuncional codifica a fome de proteína
O receptor do peptídeo sexual e a sinalização neuronal TOR/S6K modulam o equilíbrio de nutrientes em Drosophila
A alimentação cruzada metabólica em dietas desequilibradas permite que micróbios intestinais melhorem a reprodução e alterem o comportamento do hospedeiro
Neuromoduladores sinalizam através de astrócitos para alterar a atividade do circuito neural e o comportamento
A glia envoltória regula a velocidade e a precisão da sinalização neuronal no sistema nervoso periférico de Drosophila
A sulfito oxidase Shopper controla a atividade neuronal regulando a homeostase do glutamato na glia envoltória de Drosophila
Um novo protocolo de autenticação baseado em elementos transponíveis para linhagens celulares de Drosophila
Um Papel Essencial da Cadeia de Transporte de Elétrons Mitocondrial na Proliferação Celular é Permitir a Síntese de Aspartato
A Quantificação Absoluta de Metabólitos da Matriz Revela a Dinâmica do Metabolismo Mitocondrial
Células especializadas marcam a identidade sexual e de espécie em Drosophila melanogaster
O relógio circadiano controla o estado regenerativo das células-tronco intestinais
Estudo in vivo da expressão gênica com um temporizador transcricional fluorescente de dupla cor aprimorado
Vetor e parâmetros para interferência de RNA transgênica direcionada em Drosophila melanogaster
Edição do genoma baseada em Cas9 em Drosophila
Um meio holídico para Drosophila melanogaster
Ajustar o Equilíbrio de Aminoácidos da Dieta ao Exoma Traduzido In Silico Otimiza o Crescimento e a Reprodução sem Custo para a Longevidade
Um protocolo para dissecar cérebros de Drosophila melanogaster para imagem ao vivo ou imunocoloração
A Sestrina de Drosophila se liga a GATOR2 e regula mTORC1 in vivo em resposta à leucina dietética.
a, Dados de um ensaio de ligação em equilíbrio mostrando que a FLAG-Sestrina purificada se ligou à leucina, Kd ~ 100 μM. Os valores são média ± DP de três réplicas técnicas de um experimento representativo.
b, A mutação L431E bloqueia a ligação à leucina pela Sestrina de Drosophila. A Sestrina selvagem com etiqueta HA e Sestrina(L431E) foram preparadas a partir de células HEK293T expressando os cDNAs apropriados. Os ensaios de ligação foram realizados como em (a). Os valores são média ± DP de três réplicas técnicas de um experimento representativo. Os valores de P foram determinados usando um teste t não pareado com correção de Welch e o método de comparações múltiplas de Holm-Šídák.
c, A privação de leucina aumenta a interação Sestrina-GATOR2. Imunoprecipitados FLAG (IPs) foram preparados a partir de células S2R+ expressando de forma estável FLAG-und (controle negativo) ou WDR59 (um componente de GATOR2) e privadas ou não de leucina. Os IPs e lisados foram analisados por imunotransferência para as proteínas indicadas. A adição aos IPs de 1 mM de leucina, mas não de outros aminoácidos, interrompeu a interação Sestrina-GATOR2.
d, A leucina dietética regula in vivo a interação da Sestrina com GATOR2 dependendo do sítio de ligação à leucina da Sestrina. Imunoprecipitados foram preparados a partir de lisados de corpos gordurosos de larvas selvagens (OreR) ou SesnL431E expressando a proteína controle com etiqueta MYC GFP ou o componente de GATOR2 com etiqueta MYC WDR24 no corpo gorduroso (lpp-gal4). Os animais foram alimentados com as dietas indicadas por 4,5 horas antes da coleta das amostras. Dieta completa em aminoácidos: dieta quimicamente definida contendo todos os aminoácidos; sem leucina ou sem valina: dieta quimicamente definida sem leucina ou sem valina, respectivamente.
e, A ligação da Sestrina à leucina regula a sinalização de mTORC1 in vivo. São mostrados imunotransferências de Sestrina, S6K e fosfo-S6K em corpos gordurosos preparados como em (d) a partir de larvas com os genótipos indicados. Nprl2 e Mio codificam componentes centrais dos complexos GATOR1 e GATOR2, respectivamente. A composição da dieta e o período de alimentação foram como em (d).
Os dados são representativos de três (a, b) ou dois (c-e) experimentos independentes com resultados semelhantes.
Drosophila requer a Sestrina para se adaptar a uma dieta com baixo teor de leucina.
a, b, A perda de Sestrina reduz a sobrevivência durante o desenvolvimento sob privação de leucina. Os gráficos de barras mostram a sobrevivência (%) de larvas criadas por 10 dias em uma dieta quimicamente definida contendo 10% da leucina da dieta controle. Os valores de P foram determinados usando o teste z de duas proporções (bilateral). As barras mostram a porcentagem de larvas sobreviventes em cada genótipo e as barras de erro representam o intervalo de confiança de Wald de 95%.
c, A Sestrina é necessária para o crescimento larval em uma dieta com baixo teor de leucina. São mostrados animais com idade sincronizada dos genótipos indicados criados por 9 dias em uma dieta completa em aminoácidos ou uma dieta com leucina reduzida (10%). Barra de escala, 1 mm.
d-i, A perda de Sestrina reduz a sobrevivência de moscas adultas sob privação de leucina. Animais Sesn−/− apresentam redução da longevidade quando alimentados com uma dieta sem leucina (0% de leucina). Curvas de sobrevivência de animais adultos machos e fêmeas com idades sincronizadas e genótipos indicados, alimentados com as dietas indicadas. (c) nWT(w1118)=157; nSesn−/−=217; (d) nWT(w1118)=221; nSesn−/−=225; (e) nWT(w1118)=206; nSesn−/−=203; (f) nWT(w1118)=205; nSesn−/−=226; (g) nWT(w1118)=222; nSesn−/−=230; (h) nWT(w1118)=221; nSesn−/−=228. Ver estatísticas em Dados Suplementares 1 e Métodos.
(a-i), Dados representativos de três experimentos independentes com resultados semelhantes.
As moscas preferem ingerir alimentos contendo leucina de uma maneira que depende da capacidade de a Sestrina se ligar à leucina.
a, Esquema do ensaio de preferência alimentar de duas opções (ver Métodos para detalhes). AA, aminoácidos.
b, Fêmeas selvagens desenvolvem preferência por leucina ao longo de várias horas. Os dados mostram a diferença em vezes na ingestão relativa de alimento entre as maçãs revestidas com leucina e as revestidas com água. n≥11 por ponto temporal.
c, A rapamicina impede que as moscas desenvolvam preferência pela maçã revestida com leucina. n≥5 por condição.
d-f, Animais SesnL431E e Sesn−/− não desenvolvem preferência pela maçã contendo leucina. (d, e), n≥4 por condição; (f) n≥6 por condição.
g, Immunoblotting para Sestrina após knockdown de Sesn em moscas adultas. Akt serve como controle de carregamento.
h, O knockdown ubíquo de Sesn reduz a preferência de moscas fêmeas adultas por leucina. Os dados mostram a diferença em vezes na ingestão de alimento da maçã revestida com leucina em relação à maçã revestida com água. n≥5 por condição.
i, Abordagem utilizada para obter controle temporal do knockdown de Sesn em (j, k).
j, Immunoblot de Sesn mostrando depleção de Sestrina mediada por Gal80ts em animais adultos, mas não em desenvolvimento. Os extratos foram preparados a partir de moscas criadas nas temperaturas indicadas. S6K serve como controle de carregamento. Note que o choque térmico induz os níveis da proteína Sestrina nas moscas controle.
k, O knockdown de Sestrina durante a idade adulta é suficiente para diminuir a preferência de moscas fêmeas por maçãs contendo leucina. n≥13 por condição.
(a, i) criado com BioRender.com. (b, c, d-f, h, k), Os valores são média ± DP de réplicas biológicas de um experimento representativo. Cada experimento foi repetido três (d-k) ou duas (b, c) vezes com resultados semelhantes. Análises estatísticas: ANOVA de um fator seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett (b), ANOVA de dois fatores seguida pelo teste de comparações múltiplas de Šídák (c-e), ANOVA de um fator seguida pelo teste de comparações múltiplas de Šídák (f) e teste t não pareado bicaudal (h, k).
A sinalização de mTORC1 regulada por Sestrina em células gliais controla a preferência das moscas por alimentos contendo leucina.
a, Uma triagem genética identifica um papel para Sesn nas células gliais na mediação da preferência por leucina. A interferência de RNA de Sesn foi realizada em vários tecidos com as linhagens Gal4 indicadas. O knockdown de Sesn em células gliais (Repo-Gal4) e ubiquitariamente (da-Gal4), mas não em outros tecidos, reduz a preferência pela maçã revestida com leucina em comparação com a revestida com água. Para cada linhagem Gal4, os dados estão normalizados para a preferência de leucina das moscas controle. Consulte os dados não normalizados na Extended Data Figure 7a. n≥5 por condição.
b, c, Projeção confocal de cérebros de moscas adultas fêmeas dos genótipos indicados expressando 4MBOX-GFP, um repórter para o fator de transcrição MITF que é negativamente regulado por mTORC1. Os animais foram alimentados com as dietas indicadas por 1 dia e os cérebros foram corados para GFP e Repo. As imagens em (b) e (c) foram obtidas com objetivas de 10X e 40x, respectivamente. As barras de escala em (b) e (c) representam 50 μm e 10 μm, respectivamente.
d, Em moscas selvagens, mas não em moscas SesnL431E ou Sesn−/−, a privação de leucina aumenta o número de células gliais periesofágicas positivas para GFP. Cada ponto representa a razão entre o número de células positivas para GFP e Repo na área esofágica de um cérebro de mosca. n≥3 por condição.
e, Função proposta da via Sestrin-mTORC1 na regulação da preferência das moscas por alimentos contendo leucina.
(a, d), Os valores são média ± DP de réplicas técnicas de um experimento representativo. Os dados são representativos de três experimentos independentes com resultados semelhantes. A análise estatística foi realizada utilizando teste t não pareado bicaudal (a), e ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparações múltiplas de Šídák (d).