pmid: "30405369"
title: "Efeitos Ansiolíticos Induzidos pelo Odor do Linalol em Camundongos."
authors: "Harada H, Kashiwadani H, Kanmura Y, Kuwaki T"
journal: "Frontiers in behavioral neuroscience"
pubdate: "2018"
doi: "10.3389/fnbeh.2018.00241"
source: "PMC Full Text"
Efeitos Ansiolíticos Induzidos pelo Odor do Linalol em Camundongos.
Autores
Harada H, Kashiwadani H, Kanmura Y, Kuwaki T
Periodico
Frontiers in behavioral neuroscience (2018)
Conteudo
Efeitos Ansiolíticos Induzidos pelo Odor de Linalol em Camundongos
Na medicina popular, há muito se acredita que compostos odoríferos derivados de extratos vegetais podem ter efeitos ansiolíticos. Entre eles, o linalol, um dos álcoois terpênicos presentes em extratos de lavanda, tem sido relatado como possuindo efeitos ansiolíticos. No entanto, a natureza ansiolítica do próprio odor de linalol, bem como sua potencial ação através do sistema olfatório, não foi completamente examinada. Neste estudo, examinamos os efeitos ansiolíticos do odor de linalol com o teste de caixa claro/escuro e com o labirinto em cruz elevado (LCE), e descobrimos que o odor de linalol possui um efeito ansiolítico sem comprometimento motor em camundongos. O efeito não foi observado em camundongos anósmicos, indicando que foi desencadeado pelo input olfatório evocado pelo odor de linalol. Além disso, o efeito foi antagonizado pelo flumazenil, indicando que o efeito ansiolítico induzido pelo odor de linalol foi mediado pela transmissão GABAérgica através de receptores GABAA responsivos a benzodiazepínicos (BDZ). Esses resultados fornecem informações sobre os potenciais mecanismos neuronais centrais subjacentes aos efeitos ansiolíticos induzidos por odores e a base para explorar a aplicação clínica do odor de linalol em tratamentos de ansiedade.
Introdução
Os transtornos de ansiedade são a classe mais prevalente de transtornos mentais. Cerca de 5,3% dos adultos no Japão ou 18,2% dos adultos nos EUA atendem aos critérios diagnósticos para pelo menos um transtorno de ansiedade nos últimos 12 meses (Demyttenaere et al.,). Devido a essas altas taxas, o desenvolvimento de terapia eficaz e ferramentas terapêuticas para tratar transtornos de ansiedade é uma das questões mais urgentes no campo da ciência mental.
A terapia utilizando fármacos ansiolíticos tem sido, por muito tempo, uma opção de primeira linha como tratamento eficaz para transtornos de ansiedade (Hoffman e Mathew,). Os medicamentos mais desenvolvidos e comumente prescritos para tratar transtornos de ansiedade são as azapironas e os inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRSs), que modulam a transmissão sináptica serotoninérgica, e os benzodiazepínicos (BDZs), que modulam a transmissão GABAérgica (Ravindran e Stein,). No entanto, os efeitos colaterais (por exemplo, atraso no efeito clínico, cefaleia, sonolência, tontura e síndrome serotoninérgica para azapironas; atraso no efeito clínico, disfunção sexual e síndrome serotoninérgica para ISRSs; abuso, potencial de dependência, amnésia retrógrada e sedação para BDZs) desses medicamentos podem ser graves e mais prejudiciais do que a própria ansiedade, de modo que o desenvolvimento adicional de novos fármacos ainda é esperado e necessário (Nash e Nutt,).
Além de fármacos ansiolíticos, compostos aromáticos derivados de extratos vegetais têm sido utilizados na medicina tradicional como tratamento para ansiedade (Connor e Vaishnavi,). Por exemplo, o extrato de lavanda tem sido usado para tratar pacientes que sofrem de ansiedade (Kasper et al.,). Vários compostos extraídos da lavanda, como o linalol, foram relatados como tendo efeitos ansiolíticos (De Sousa et al.,). No entanto, os mecanismos neuronais subjacentes aos efeitos ansiolíticos relatados dos compostos odoríferos ainda não foram totalmente elucidados. No caso do linalol, os efeitos ansiolíticos do próprio odor também ainda não foram abordados.
Neste estudo, examinamos os efeitos ansiolíticos do odor de linalol em camundongos. Testes comportamentais clássicos relacionados à ansiedade mostraram que a exposição ao odor de linalol induziu efeitos ansiolíticos significativos. Os efeitos não foram observados em camundongos anósmicos, indicando que os efeitos foram desencadeados pela entrada olfativa evocada pelo odor de linalol. Além disso, descobrimos que o flumazenil antagonizou os efeitos ansiolíticos induzidos pelo odor de linalol, indicando que a transmissão GABAérgica sensível ao BDZ desempenha um papel fundamental nos efeitos ansiolíticos.
Materiais e Métodos
Animais
Camundongos machos do tipo selvagem (C57BL/6N, 25–35 g, n = 240) originalmente adquiridos da CLEA Japan (Tóquio, Japão) foram utilizados para evitar possíveis variações relacionadas ao ciclo menstrual em fêmeas. Todos os animais foram mantidos sob temperatura constante (24 ± 1°C) com livre acesso a comida e água. Os animais foram alojados com luzes acesas às 7:00 A.M. e apagadas às 7:00 P.M. Todos os experimentos foram realizados durante o ciclo claro, entre 12:00 P.M. e 5:00 P.M. Os animais eram ingênuos ao odor de linalol e aos fármacos, e cada camundongo foi utilizado apenas uma vez para evitar efeitos de arrasto. Os animais foram aclimatados por 3 dias com 3 minutos de manuseio em cada dia. Nos dias de experimento, os camundongos foram transferidos para a sala de experimento 3 horas antes do início do experimento. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Sociedade Fisiológica do Japão e foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa em Animais Experimentais da Universidade de Kagoshima.
Fármacos
Cercine® (5 mg/mL de Diazepam (modulador alostérico positivo dos receptores de ácido gama-aminobutírico A (GABAARs) com sítio de ligação BDZ, 1,5 mg/kg i.p.; Takeda Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japão)), Flumazenil (antagonista seletivo do sítio BDZ dos GABAARs, 3 mg/kg i.p.) e WAY100635 (antagonista do receptor de serotonina 1A (5-HT1AR), 0,5 mg/kg i.p.; Tocris Bioscience, Boston, MO, EUA) foram adquiridos. O Diazepam foi diluído com NaCl 0,9%. O Flumazenil e o WAY100635 foram dissolvidos em Tween80 e diluídos com NaCl 0,9% (concentração final de Tween80 foi de 2%). Todos os fármacos e o veículo (Tween80 a 2% em NaCl 0,9%) foram injetados por via intraperitoneal 30 min antes dos testes comportamentais. O Linalol foi adquirido da Tokyo Chemical Industry. O 3-metilindol (3-MI; 300 mg/kg i.p.; Sigma, St. Louis, MO, EUA) foi injetado por via intraperitoneal para privação do epitélio olfatório. Óleo de milho foi utilizado como veículo para o 3-MI.
Exposição ao Odor de Linalol
A exposição ao odor de Linalol foi realizada em uma câmara de odor personalizada. Um pedaço de papel filtro de 2 cm × 2 cm tratado com 0, 20, 200 ou 2.000 μL de linalol foi colocado em cada um dos quatro cantos de uma caixa de acrílico (25 cm × 25 cm × 25 cm). Um camundongo foi colocado dentro de uma gaiola de acrílico com tampa de tela de arame (12 cm × 20 cm × 10 cm) e posicionado no centro da câmara de odor. Os camundongos não podiam acessar diretamente a fonte de odor, mas eram expostos ao ar odorizado. Nesta câmara de odor, os camundongos foram expostos ao odor de linalol por 30 min. Após a exposição, um teste comportamental foi aplicado aos camundongos. Para o grupo exposto ao ar inodoro, um camundongo foi colocado na câmara de odor como no grupo exposto ao linalol, com a única exceção de que os papéis filtro na caixa de acrílico não foram embebidos com linalol. Para evitar o odor residual de linalol, utilizamos outras câmaras de odor para o grupo exposto ao ar inodoro. Todas as caixas e gaiolas de acrílico foram trocadas para cada sujeito e lavadas com água e limpas com etanol 70% após as sessões diárias.
Teste da Caixa Claro/Escuro
O aparato da caixa Claro/Escuro (modificado da caixa CPP, Muromachi Kikai, Tóquio, Japão) foi utilizado para medir a ansiedade (Crawley). Consistia em uma caixa de acrílico com dois compartimentos de tamanhos iguais (25 cm × 18 cm × 21 cm); um compartimento claro e um compartimento escuro. Os dois compartimentos eram conectados por uma pequena entrada (8 cm × 6 cm) e uma folha de plástico foi espalhada no chão de ambas as câmaras. O compartimento claro foi iluminado por uma lâmpada LED com intensidade de 400 LUX no chão. O compartimento escuro foi coberto com uma tampa preta para bloquear a luz. Os camundongos foram colocados no compartimento claro com as costas voltadas para a entrada, e os comportamentos foram registrados com uma câmera de vídeo digital por 5 min. Os dados de vídeo foram analisados pelo EthoVision XT para medir o tempo gasto no compartimento claro e medir o número de entradas no compartimento claro. Após cada teste, as câmaras da caixa claro/escuro foram lavadas com água e limpas com etanol 70%.
Teste do Labirinto em Cruz Elevado
O aparelho de labirinto em cruz elevado (EPM-04M, Muromachi Kikai, Tóquio, Japão) foi utilizado para medir a ansiedade (Lister,). Consistia em dois braços abertos (30 cm × 6 cm) e dois braços fechados com paredes laterais e na extremidade (30 cm × 6 cm × 15 cm), e uma plataforma central (6 cm × 6 cm). A altura do braço era de 40 cm do chão. A iluminação foi ajustada para 100 LUX no piso da plataforma central. O camundongo foi colocado na plataforma central voltado para os braços abertos e foi filmado por 5 min. Os dados de vídeo foram analisados pelo EthoVision XT para medir o tempo gasto nos braços abertos, o número de entradas nos braços abertos e a distância total percorrida. Após cada teste, o labirinto foi lavado com água e limpo com etanol 70%.
Teste do Rotarod Acelerado
Para avaliar a coordenação motora e o equilíbrio, realizamos o teste do rotarod acelerado (Jones e Roberts,) usando o aparelho de rotarod de faixa única (MK-630B, Muromachi Kikai, Tóquio, Japão). Os camundongos receberam duas tentativas de treinamento (cada tentativa durou 300 s com velocidade fixa (4 rpm)) com intervalo de 30 min em dois dias consecutivos antes do teste para aclimatação ao aparelho. No dia experimental, após 30 min de exposição ao odor, os camundongos foram colocados na barra giratória e a velocidade de rotação do rotarod foi aumentada gradualmente de 4 rpm para 40 rpm em 300 s. O tempo de permanência na barra giratória foi medido (Vincenzi et al.,).
Privação do Epitélio Olfatório
Para a privação olfatória, interrompemos o epitélio olfatório pela administração intraperitoneal de 3-MI, que induz destruição extensa da mucosa olfatória, resultando em anosmia (Kim et al.,). Resumidamente, 300 mg/kg de 3-MI a 3% em óleo de milho foi administrado por injeção intraperitoneal. No grupo controle, 10 mL/kg de óleo de milho foi administrado por injeção intraperitoneal no grupo controle. Duas semanas após a injeção, os camundongos tratados com 3-MI foram usados para o teste comportamental (Tashiro et al.,).
Teste de Habituação/Desabituação Olfatória para Anosmia
Quando um animal sente um odor novo, o animal investiga o odor aproximando-se e cheirando. Com apresentações repetidas do odor, o número de aproximações ao odor e o tempo gasto cheirando o odor são progressivamente reduzidos (habitua). Quando o animal é exposto a um odor novo e detecta o novo odor, o animal mostra investigação renovada.
Com base no comportamento inato, realizamos testes de habituação/desabituação olfativa para confirmar se camundongos tratados com 3-MI estavam anósmicos para linalol (Gregg and Thiessen,; Guan et al.,; Luo et al.,; Woodley and Baum,). Um camundongo tratado com 3-MI foi colocado em uma gaiola (12 cm × 20 cm × 10 cm) com tampa de malha de arame e exposto a um cotonete embebido em 20 μL de água três vezes por 2 min (ensaios de habituação) e, em seguida, exposto a um cotonete embebido em 20 μL de linalol por 2 min (ensaio de teste de desabituação). O número de aproximações e o tempo gasto cheirando o cotonete foram registrados como comportamentos exploratórios. Aproximação foi definida como a ação do camundongo movendo o nariz para dentro de 10 mm do cotonete. Cheirar foi definido como a ação do camundongo mantendo o nariz a menos de 10 mm do cotonete por pelo menos 1 s para sentir o cheiro.
Análises de Dados
Se não especificado de outra forma, as comparações estatísticas foram realizadas usando ANOVA de uma via com testes de comparação múltipla post hoc de Tukey usando o software Prism6 (GraphPad Software, Inc.). O critério para significância estatística foi p < 0.05 em todos os casos. Após ANOVA de uma via ou teste t não pareado, realizamos análises de poder post hoc usando o software G*Power três (Faul et al.,). Os dados brutos que suportam a conclusão deste manuscrito serão disponibilizados pelos autores, sem reservas indevidas, a qualquer pesquisador qualificado.
Resultados
A Exposição ao Odor de Linalol Induz Efeitos Ansiolíticos em Camundongos
Para examinar os efeitos ansiolíticos do odor de linalol, realizamos testes clássicos de ansiedade imediatamente após a exposição de camundongos ao vapor de linalol (Figura 1). O teste de caixa claro/escuro revelou que a exposição ao odor de linalol aumentou significativamente o comportamento exploratório na câmara clara (Figuras 1A,B), indicando efeitos ansiolíticos (tempo gasto na caixa clara: F(2,27) = 9,184, p = 0,0009, poder estatístico = 0,9757 (ANOVA de uma via), pcontrole-linalol = 0,0010 (teste de comparação múltipla de Tukey); número de entradas na caixa clara: F(2,27) = 7,317, p = 0,0029, poder estatístico = 0,9365 (ANOVA de uma via), pcontrole-linalol = 0,0029 (teste de comparação múltipla de Tukey), n = 10 por grupo). Os efeitos foram comparáveis aos induzidos pela administração de diazepam (1,5 mg/kg, i.p.) (tempo gasto na caixa clara: plinalol-diazepam = 0,6139 (teste de comparação múltipla de Tukey); número de entradas na caixa clara: plinalol-diazepam = 0,6276). Para confirmar os efeitos ansiolíticos da exposição ao odor de linalol, realizamos em seguida o teste do labirinto em cruz elevado (EPM) (Figuras 1C,D). Os resultados mostraram um aumento significativo da exploração dos braços abertos (tempo gasto nos braços abertos: F(2,27) = 12,35, p = 0,0002, poder estatístico = 0,9958 (ANOVA de uma via), pcontrole-linalol = 0,0416 (teste de comparação múltipla de Tukey); número de entradas nos braços abertos: F(2,27) = 6,982, p = 0,0036, poder estatístico = 0,9252 (ANOVA de uma via), pcontrole-linalol = 0,0258 (teste de comparação múltipla de Tukey), n = 10 por grupo), indicando novamente efeitos ansiolíticos do odor de linalol. Em seguida, para examinar se a exposição ao odor de linalol prejudicava a função motora, realizamos o teste de rotarod acelerado. A latência para queda no grupo exposto ao odor de linalol não foi significativamente diferente daquela no grupo exposto ao ar inodoro (t = 0,121, p = 0,906, poder estatístico = 0,05147 (teste t não pareado); ncontrole = 6, nlinalol = 7), sugerindo que a habilidade motora coordenada não foi afetada pela exposição ao odor de linalol (Figura 1E). A partir desses resultados, concluímos que a exposição ao vapor de linalol induziu efeitos ansiolíticos sem prejuízo motor em camundongos.
Efeitos ansiolíticos da inalação de linalol e injeção de diazepam nos testes de caixa claro/escuro e labirinto em cruz elevado (EPM). No teste de caixa claro/escuro, o tempo gasto na caixa clara (A) e o número de entradas na caixa clara (B) aumentaram significativamente no grupo linalol. No teste EPM, o tempo gasto nos braços abertos (C) e o número de entradas nos braços abertos (D) aumentaram significativamente no grupo linalol. n = 10 para todos os grupos em (A–D). (E) Latência para queda do rotarod acelerado. n = 6 para o grupo de ar inodoro e n = 7 para o grupo linalol. (C) Camundongos expostos ao ar inodoro; L, camundongos expostos a 200 μL de odor de linalol. (D) Camundongos que receberam diazepam intraperitonealmente. Cada coluna representa média ± EPM. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 em comparação ao grupo controle exposto ao ar inodoro (teste post hoc de comparação múltipla de Tukey).
Em seguida, para examinar a dependência de dose dos efeitos ansiolíticos induzidos pelo vapor de linalol, avaliamos o efeito de várias doses de linalol usando o teste EPM. Os resultados indicaram que o tempo gasto nos braços abertos (Figura 2A) e o número total de entradas nos braços abertos (Figura 2B) aumentaram de acordo com o aumento da dose de linalol (tempo gasto nos braços abertos: F(3,36) = 10,54, p < 0,0001, poder estatístico = 0,9989 (ANOVA de uma via), pcontrole-linalol 200 = 0,008, pcontrole-linalol 2000 < 0,0001, plinalol 20-linalol 2000 = 0,0020 (teste de comparação múltipla de Tukey); número de entradas nos braços abertos: F(3,36) = 8,797, p = 0,0002, poder estatístico = 0,9952 (ANOVA de uma via), pcontrole-linalol 200 = 0,0039, pcontrole-linalol 2000 = 0,0002, plinalol 20-linalol 2000 = 0,0203 (teste de comparação múltipla de Tukey); n = 10 por grupo). Deve-se notar que a distância total percorrida durante o teste EPM não foi significativamente afetada pela exposição ao odor de linalol (Figura 2C; F(3,36) = 1,137, p = 0,3472 (ANOVA de uma via), poder estatístico = 0,3086; n = 10 por grupo), sugerindo que os efeitos do odor de linalol foram ansiolíticos, e não sedativos.
Dependência de dose dos efeitos ansiolíticos da exposição ao odor de linalol. O tempo gasto nos braços abertos (A) e o número de entradas nos braços abertos (B) indicam que os efeitos ansiolíticos foram dependentes da concentração de linalol. (C) A atividade locomotora espontânea não foi prejudicada pela exposição ao odor de linalol. As distâncias totais percorridas durante 5 min no EPM não variaram significativamente. Controle, camundongos expostos a ar inodoro; Linalol 20, camundongos expostos a 20 μL de linalol; Linalol 200, camundongos expostos a 200 μL de linalol; Linalol 2.000, camundongos expostos a 2.000 μL de linalol; n = 10 para todos os grupos. Os resultados são expressos como média ± EPM. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 em comparação ao grupo Controle. #P < 0,05, ##P < 0,01 em comparação ao grupo Lin 20 (teste post hoc de comparação múltipla de Tukey).
Efeitos Ansiolíticos Induzidos por Vapor de Linalol Foram Desencadeados por Entrada Olfatória
Para examinar se os efeitos ansiolíticos foram desencadeados pela entrada olfativa evocada pela exposição ao odor de linalol, avaliamos os efeitos em camundongos anosmáticos (Figura 3). Em camundongos anosmáticos tratados com 3-MI, os efeitos ansiolíticos induzidos pelo odor de linalol não foram observados no teste de caixa claro/escuro (Figuras 3A,B; tempo gasto na caixa clara: F(3,36) = 12,75, p < 0,0001 (ANOVA unidirecional), poder estatístico = 0,9998; p(3MI/controle-3MI/linalol) = 0,9994 (teste de comparação múltipla de Tukey); número de entradas na caixa clara: F(3,36) = 10,67, p < 0,0001 (ANOVA unidirecional), poder estatístico = 0,9990; p(3MI/controle-3MI/linalol) = 0,9093 (teste de comparação múltipla de Tukey)) e no teste do labirinto em cruz elevado (LCE) (Figuras 3C,D; tempo gasto nos braços abertos: F(3,36) = 8,794, p = 0,0002 (ANOVA unidirecional), poder estatístico = 0,9952; p(3MI/controle-3MI/linalol) = 0,9994 (teste de comparação múltipla de Tukey); número de entradas nos braços abertos: F(3,36) = 8,827, p = 0,0002 (ANOVA unidirecional), poder estatístico = 0,9953; p(3MI/controle-3MI/linalol) = 0,8035 (teste de comparação múltipla de Tukey); n = 10 por grupo). Após os testes de ansiedade, designamos 10 camundongos tratados com 3-MI e 10 camundongos tratados com veículo para o teste de habituação/desabituação olfativa. O resultado mostrou que comportamentos exploratórios em direção ao odor de linalol não foram observados nos camundongos tratados com 3-MI, indicando que os camundongos tratados com 3-MI não conseguiam detectar o odor de linalol (Figuras 4A,B; número de aproximações à fonte de odor: Ftratamento com 3MI (1,18) = 1,132, ptratamento com 3MI = 0,3014; Fodor (3,54) = 36,75, podor < 0,0001; Finteração (3,54) = 19,26, pinteração < 0,0001 (ANOVA de duas vias com medidas repetidas); plinalol/VEH-linalol/3MI < 0,0001 (teste de comparação múltipla de Bonferroni); tempo gasto cheirando a fonte de odor: Ftratamento com 3MI (1,18) = 5,400, ptratamento com 3MI = 0,0320; Fodor (3,54) = 18,09, podor < 0,0001; Finteração (3,54) = 7,817, pinteração = 0,0002 (ANOVA de duas vias com medidas repetidas), plinalol/VEH-linalol/3MI < 0,0001 (teste de comparação múltipla de Bonferroni), n = 10 por grupo).
A entrada olfativa foi essencial para os efeitos ansiolíticos induzidos pela exposição ao linalol. O aumento no tempo gasto na caixa clara (A) e no número de entradas na caixa clara (B) pela exposição ao odor de linalol não foi observado em camundongos anosmáticos resultantes do tratamento com 3-metilindol (3-MI). O aumento no tempo gasto nos braços abertos (C) e no número de entradas nos braços abertos (D) não foi observado nos camundongos anosmáticos. Controle, camundongos expostos a ar inodoro; Linalol, camundongos expostos a 200 μL de linalol; VEH, camundongos tratados com veículo (óleo de milho, i.p.); 3-MI, camundongos tratados com 3-MI (300 mg/kg, i.p.); n = 10 para todos os grupos; cada coluna representa média ± EPM. ***P < 0,001, ****P < 0,0001 comparado ao grupo Controle injetado com veículo, ##P < 0,01, ###P < 0,001, ####P < 0,0001 comparado ao grupo Linalol injetado com 3-MI (teste de comparação múltipla post hoc de Tukey).
Confirmação da privação olfativa causada pela administração de 3-MI no teste de habituação/desabituação olfativa. O número de aproximações (A) e o tempo gasto cheirando (B) ao cotonete embebido em água não foram diferentes entre camundongos tratados com veículo e 3-MI, mas ambos para o cotonete embebido em linalol foram significativamente reduzidos em camundongos anósmicos tratados com 3-MI. VEH, camundongos administrados com veículo (óleo de milho, i.p.); 3-MI, camundongos administrados com 3-MI (300 mg/kg, i.p.); Água, água destilada (200 μL); Linalol, Linalol (200 μL). n = 10 para todos os grupos. Os resultados são expressos como média ± EPM. ****P < 0,0001 (teste de comparação múltipla post hoc de Bonferroni).
O Sistema GABAérgico Medeia os Efeitos Ansiolíticos Induzidos pelo Odor de Linalol
Os efeitos benéficos dos BDZs e azapironas no tratamento de transtornos de ansiedade indicam o envolvimento dos GABAARs responsivos a BDZ e dos 5-HT1ARs. Para avaliar se esses receptores estavam envolvidos nos efeitos ansiolíticos induzidos pelo odor de linalol, realizamos o teste EPM para examinar os efeitos ansiolíticos induzidos pelo odor de linalol, mas administramos flumazenil (antagonista do sítio BDZ dos GABAARs) ou WAY100635 (antagonista 5-HT1AR) antes do teste (Figura 5). O pré-tratamento com flumazenil aboliu completamente os efeitos ansiolíticos do odor de linalol, indicando que a transmissão GABAérgica via GABAARs responsivos a BDZ era essencial para os efeitos ansiolíticos (tempo gasto nos braços abertos: F(5, 54) = 10,70, p < 0,0001 (ANOVA de uma via), poder estatístico = 0,9999, plinalol/VEH-linalol/Flu = 0,0001, pcontrole/Flu-linalol/Flu = 0,9995 (teste de comparação múltipla de Tukey); número de entradas nos braços abertos: F(5,54) = 8,966, p < 0,0001 (ANOVA de uma via), poder estatístico = 0,9999, plinalol/VEH-linalol/Flu = 0,0002, pcontrole/Flu-linalol/Flu = 0,7239 (teste de comparação múltipla de Tukey); n = 10 por grupo). Em contraste, o tratamento com WAY100635 não induziu alterações significativas nos efeitos ansiolíticos do odor de linalol (tempo gasto nos braços abertos: plinalol/VEH-linalol/WAY = 0,7374, pcontrole/WAY-linalol/WAY = 0,0032 (teste de comparação múltipla de Tukey); número de entradas nos braços abertos: plinalol/VEH-linalol/WAY = 0,9895, pcontrole/WAY-linalol/WAY = 0,0086 (teste de comparação múltipla de Tukey)), sugerindo que a transmissão serotoninérgica via 5-HT1AR pode não estar envolvida nos efeitos.
Influência do pré-tratamento com flumazenil ou WAY100635 nos efeitos ansiolíticos do linalol. O aumento no tempo gasto em braços abertos (A) e no número de entradas em braços abertos (B) decorrente da exposição ao odor de linalol foi eliminado em camundongos tratados com flumazenil, mas não com WAY100635 nos efeitos ansiolíticos induzidos pelo odor de linalol. O pré-tratamento com flumazenil ou WAY100635 sem exposição ao odor de linalol não afetou os comportamentos exploratórios. Controle, camundongos expostos ao ar inodoro; Linalol, camundongos expostos a 200 μL de linalol; VEH; camundongos que receberam veículo (Tween80 a 2% em soro fisiológico); Flu, camundongos que receberam flumazenil (3 mg/kg i.p.); WAY, camundongos que receberam WAY100635 (0,5 mg/kg i.p.); cada coluna representa média ± EPM; n = 10 para todos os grupos. **P < 0,01, ****P < 0,0001 comparado ao grupo Controle + VEH, ###P < 0,001 comparado ao grupo Linalol + Flu, $$P < 0,01 comparado ao grupo Controle + WAY (teste de comparação múltipla post hoc de Tukey).
Discussão
Limitações Técnicas Deste Estudo
Neste estudo, mostramos os efeitos ansiolíticos induzidos pelo odor de linalol apenas em camundongos machos adultos. Para ter uma compreensão geral dos fenômenos, precisamos ainda avaliar os efeitos em fêmeas (para examinar as diferenças sexuais) e em camundongos jovens/idosos (para examinar a dependência da idade).
Entrada Olfatória Evocada pelo Odor de Linalol Induz Efeitos Ansiolíticos
Neste estudo, descobrimos que a exposição ao odor de linalol induziu efeitos ansiolíticos em camundongos (Figura 1). Os efeitos não foram observados em camundongos anósmicos (Figura 4), indicando que os efeitos foram desencadeados pela entrada olfatória evocada pela exposição ao odor de linalol. Anteriormente, vários estudos examinaram que a inalação de linalol induziu efeitos ansiolíticos (Linck et al.,; Takahashi et al.,; Zhang et al.,). No entanto, como a contribuição do sistema olfatório não foi examinada diretamente, a natureza de como o linalol pode induzir os efeitos não foi revelada. Neste estudo, confirmamos que o sistema olfatório era essencial para os efeitos ansiolíticos induzidos pelo odor de linalol usando camundongos anósmicos (Figuras 3, 4). Assim, estabelecemos que a entrada olfatória desencadeada pelo odor de linalol foi responsável por induzir os efeitos ansiolíticos.
Além do linalol, vários outros odores também foram relatados como indutores de efeitos ansiolíticos quando inalados. Por exemplo, a inalação de (+)-limoneno Lima et al., óxido de linalol Souto-Maior et al., ou α-pineno (Satou et al.,) mostrou reduzir a ansiedade em camundongos. Nesses estudos, os autores não abordaram a contribuição da entrada olfatória para os efeitos ansiolíticos. No entanto, a inalação desses compostos odoríferos pode desencadear os efeitos ansiolíticos via entrada olfatória. Vale ressaltar que os efeitos resultantes da inalação de limoneno não foram antagonizados pelo pré-tratamento com flumazenil (Lima et al.,). Considerando nossos resultados, é possível que existam pelo menos duas vias ansiolíticas paralelas envolvendo sistemas dependentes e independentes de GABAARs responsivos a BDZ, evocados pela entrada olfatória.
Devido ao fato de que um determinado receptor odorante é ativado por uma gama de moléculas odoríferas com estrutura(s) semelhante(s) (Malnic et al.,), uma gama de moléculas odoríferas também pode desencadear circuitos neuronais centrais específicos necessários para os efeitos ansiolíticos induzidos pelo linalol. Para análises posteriores, a identificação do(s) receptor(es) odorante(s) que contribuem para os efeitos ansiolíticos induzidos pelo odor e um levantamento sistemático dos odorantes que atuam sobre o(s) receptor(es) seriam benéficos. Além dos receptores odorantes, os canais de cálcio tipo T (TTCCs) também são afetados pelo linalol (El Alaoui et al.,). Como os TTCCs contribuem para a geração de potenciais de ação em neurônios sensoriais olfatórios (Kawai et al.,), a modulação dos TTCCs pelo linalol também pode contribuir para a analgesia induzida pelo odor do linalol.
Vários estudos relataram anteriormente que a administração sistêmica de linalol por via intraperitoneal (Umezu et al.,; Coelho et al.,; Guzman-Gutierrez et al.,) ou oral (Cheng et al.,) induziu efeitos ansiolíticos. Nesses estudos, os locais primários afetados pelo linalol não foram abordados. No entanto, supõe-se que o linalol que entra na corrente sanguínea via absorção pelas vias aéreas pode modular a neurotransmissão glutamatérgica (Elisabetsky et al.,; Batista et al.,). Outra possibilidade levantada por nossos resultados é que o linalol administrado sistemicamente pode ser emitido na respiração exalada e conduzir os efeitos ansiolíticos através do sistema olfatório de forma retronasal (Kikuta et al.,).
Circuitos Neuronais Subjacentes aos Efeitos Ansiolíticos Induzidos pelo Odor do Linalol
Neste estudo, mostramos que a administração de flumazenil aboliu completamente os efeitos ansiolíticos induzidos pelo odor do linalol (Figura 5). O flumazenil bloqueia os efeitos ansiolíticos induzidos pelo GABA ao antagonizar o sítio BDZ do α2-GABAAR (Rudolph et al.,; Low et al.,). Como não houve mais efeitos ansiolíticos do odor do linalol quando camundongos privados de olfato foram utilizados (Figura 3), os efeitos podem não ser evocados pela ativação direta dos sítios BDZ pelo linalol, mas sim pela ativação de circuitos ansiolíticos intrínsecos envolvendo a transmissão GABAérgica via GABAAR responsivo a BDZ.
Em contraste com o antagonismo do flumazenil, o antagonista 5-HT1AR WAY100635 não mostrou alterações significativas nos efeitos ansiolíticos induzidos pelo odor do linalol (Figura 5B). Estudos clínicos e pré-clínicos indicaram que o sistema serotoninérgico, que inclui o 5-HT1AR, também desempenha um papel fundamental na modulação da ansiedade e é um dos principais alvos do tratamento clínico (Gordon e Hen,; Albert et al.,). Por outro lado, nossos achados sugerem que a transmissão serotoninérgica via 5-HT1AR pode não estar envolvida nos efeitos ansiolíticos induzidos pelo odor do linalol.
Em resumo, descobrimos que a exposição ao odor de linalol induziu efeitos ansiolíticos sem comprometimento motor em camundongos. Os efeitos foram abolidos em camundongos anósmicos, indicando que o input olfatório evocado pelo odor de linalol era necessário para desencadear os efeitos. Além disso, a transmissão sináptica com GABAARs responsivos a BDZ também foi essencial para os efeitos. Essas descobertas nos fornecem uma base para a aplicação clínica do odor de linalol para transtornos de ansiedade. Além disso, os efeitos ansiolíticos induzidos pelo odor de linalol podem ser aplicáveis a pacientes pré-operatórios, pois o pré-tratamento com ansiolíticos pode aliviar o estresse pré-operatório e, assim, contribuir para colocar os pacientes sob anestesia geral de forma mais suave. Adicionalmente, para pacientes que podem ter dificuldades com a administração oral ou por supositório de ansiolíticos, como bebês, utilizar o odor de linalol para ajudar a reduzir a ansiedade pode ser uma alternativa conveniente e promissora.
Contribuições dos Autores
HH, TK e HK desenharam o estudo. HH e HK conduziram o estudo e analisaram os dados. HH, YK, TK e HK escreveram o artigo. Todos os autores revisaram o manuscrito.
Declaração de Conflito de Interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Financiamento. Este trabalho foi apoiado pela Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI, Número de Concessão 17K01988 (HK).
Referências
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