pmid: "38473763"
title: "Linalol, um Composto de Fragrância em Plantas, Protege Neurônios Dopaminérgicos e Melhora a Função Motora e a Força Muscular Esquelética em Modelos Experimentais da Doença de Parkinson."
authors: "Chang WH, Hsu HT, Lin CC, An LM, Lee CH, Ko HH, Lin CL, Lo YC"
journal: "International journal of molecular sciences"
pubdate: "2024 Feb 21"
doi: "10.3390/ijms25052514"
source: "PMC Full Text"

Linalol, um Composto de Fragrância em Plantas, Protege Neurônios Dopaminérgicos e Melhora a Função Motora e a Força Muscular Esquelética em Modelos Experimentais da Doença de Parkinson.

Autores

Chang WH, Hsu HT, Lin CC, An LM, Lee CH, Ko HH, Lin CL, Lo YC

Periodico

International journal of molecular sciences (2024 Feb 21)

Conteudo

Linalol, um Composto de Fragrância em Plantas, Protege Neurônios Dopaminérgicos e Melhora a Função Motora e a Força Muscular Esquelética em Modelos Experimentais da Doença de Parkinson

A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo comum caracterizado pela perda gradual de neurônios dopaminérgicos na substância negra pars compacta (SNpc), resultando em níveis reduzidos de dopamina no estriado e eventual início de sintomas motores. O linalol (3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol) é um monoterpeno encontrado em plantas aromáticas que exibe propriedades antioxidantes, antidepressivas e ansiolíticas. O objetivo deste estudo é avaliar os impactos neuroprotetores do linalol em células SH-SY5Y dopaminérgicas, neurônios mesencefálicos e corticais primários tratados com íon 1-metil-4-fenilpiridínio (MPP+), bem como em camundongos com fenótipos semelhantes à DP induzidos por 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP). Foram realizados ensaios de viabilidade celular, coloração com α-tubulina, western blotting, imuno-histoquímica e experimentos comportamentais. Em células SH-SY5Y tratadas com MPP+, o linalol aumentou a viabilidade celular, reduziu a retração de neuritos, melhorou a defesa antioxidante através da regulação negativa da sinalização de apoptose (linfoma de células B 2 (Bcl-2), caspase-3 clivada e poli(ADP-ribose) polimerase (PARP)) e NADPH oxidase de fagócitos (gp91phox), bem como da regulação positiva da sinalização neurotrófica (fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e fator de crescimento nervoso (NGF)) e da via do fator nuclear eritroide 2 relacionado ao fator 2 (Nrf2)/heme oxigenase-1 (HO-1). Em neurônios mesencefálicos primários tratados com MPP+, o linalol aumentou as expressões de tirosina hidroxilase (TH), sirtuína 1 (SirT1) e parkina. Em neurônios corticais primários tratados com MPP+, o linalol regulou positivamente a expressão proteica de SirT1, receptor de ácido gama-aminobutírico tipo A-α1 (GABAA-α1) e receptor de ácido gama-aminobutírico tipo B (GABAB). Em camundongos com fenótipos semelhantes à DP, o linalol atenuou a perda de neurônios dopaminérgicos na SNpc. O linalol melhorou os déficits comportamentais motores e não motores e a força muscular dos camundongos com fenótipos semelhantes à DP. Esses achados sugerem que o linalol potencialmente protege neurônios dopaminérgicos e melhora os sintomas de comprometimento da DP.

1. Introdução

A doença de Parkinson (DP) é uma doença complexa e multifatorial caracterizada pela regressão de neurônios dopaminérgicos na substância negra pars compacta (SNpc). Evidências crescentes sugerem que vários fatores, como neuroinflamação, disfunção mitocondrial, estresse oxidativo e apoptose de neurônios dopaminérgicos, desempenham papéis na progressão da DP. As alterações neuropatológicas eventualmente levam a sintomas clínicos em pacientes com DP, incluindo rigidez, tremor de repouso, instabilidade postural e lentidão de movimentos. Além dessas características típicas, os pacientes com DP também manifestam sintomas não motores, incluindo disfunção autonômica, ansiedade, depressão e distúrbios do sono, contribuindo para um declínio na qualidade de vida dos indivíduos com DP.
A apoptose é um processo de morte celular regulado que as células sofrem para se adaptar ao ambiente dinâmico de vida, eliminando células inúteis ou prejudiciais. Essencialmente, a apoptose é um resultado benéfico da regulação gênica. No entanto, em condições patológicas, a apoptose pode se tornar desregulada, levando ao dano de células normais e agravando a progressão da doença. Pesquisas indicaram uma presença significativa de neurônios apoptóticos no mesencéfalo de indivíduos com DP. A progressão da DP envolve fatores causadores que desencadeiam a apoptose de neurônios que, de outra forma, seriam saudáveis. Consequentemente, a sinalização apoptótica agrava o risco de eventos patológicos adicionais, incluindo neuroinflamação, contribuindo para danos adicionais aos neurônios. Fatores neurotróficos foram estabelecidos como desempenhando um papel importante na sobrevivência das células na DP. Esses fatores, como o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e o fator de crescimento nervoso (NGF), foram drasticamente diminuídos na substância negra do cérebro humano acometido pela DP. Enquanto isso, a redução dos níveis plasmáticos de BDNF e NGF foi demonstrada em pacientes com transtorno bipolar e em pacientes maníacos e deprimidos. Em alguns estudos, o NGF mostrou ser capaz de proteger ou restaurar neurônios dopaminérgicos após lesão. O BDNF está mais claramente associado ao sistema dopaminérgico nigroestriatal. O BDNF aumenta a sobrevivência de neurônios dopaminérgicos cultivados e estimula o crescimento e a arborização dos neuritos. Portanto, a prevenção da regulação negativa do BDNF é neuroprotetora para os neurônios dopaminérgicos.

O cérebro, um órgão com alta taxa de consumo de oxigênio, é considerado altamente suscetível a danos causados pelo estresse oxidativo, que tem sido proposto como um fator essencial na progressão da DP. O estresse oxidativo resulta de um desequilíbrio entre os sistemas de defesa antioxidante e a geração de espécies reativas de oxigênio, levando à morte neuronal ou neurodegeneração. O fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2 (Nrf2) é um fator de transcrição sensível a reações redox, induzindo a expressão de uma série de proteínas antioxidantes para reduzir o dano celular causado pelo estresse oxidativo. Além disso, a superexpressão do gene a jusante do Nrf2, heme oxigenase 1 (HO-1), produziu uma resposta de sobrevivência adequada contra o estresse oxidativo na DP. Portanto, a terapia antioxidante direcionada ao Nrf-2 e à HO-1 pode ser essencial na prevenção e no tratamento da DP.
Óleos essenciais (OEs) têm sido tradicionalmente empregados para diversos fins medicinais, incluindo sedação, alívio da ansiedade, efeitos antidepressivos e propriedades hipnóticas. Linalol (3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol; Figura 1A), um monoterpeno natural, é geralmente encontrado em OEs de plantas aromáticas. Estudos anteriores demonstraram que o linalol possui efeitos antinociceptivos, anticonvulsivantes, antioxidantes, antidepressivos e ansiolíticos. Os medicamentos atualmente utilizados no tratamento da DP incluem precursores dopaminérgicos, agonistas dopaminérgicos, inibidores da catecol-O-metiltransferase e da monoamina oxidase B. No entanto, esses medicamentos anti-DP têm pouco benefício clínico no tratamento de características não motoras, que infelizmente são frequentemente as que mais impactam a qualidade de vida. Estudos recentes demonstraram que a aromaterapia tem efeitos terapêuticos em doenças neurodegenerativas, e o componente crítico responsável pelo impacto é o linalol. O linalol foi indicado como produtor de um efeito semelhante ao antidepressivo por meio da interação com a via serotoninérgica. Além disso, em camundongos com Alzheimer-like, o linalol reduziu a neurotoxicidade e melhorou a função cognitiva ao ativar Nrf2/HO-1 e BDNF.
1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP) é identificado como um modelo padrão de DP por sua capacidade de induzir inúmeros marcadores da DP, incluindo apoptose, inflamação, falha energética e estresse oxidativo em muitos mamíferos, como macacos e camundongos. O MPTP pode atravessar a BHE devido à sua alta lipofilicidade e rapidamente se transforma em seu metabólito ativo, o íon 1-metil-4-fenilpiridínio (MPP+), pela monoamina oxidase B nas células gliais, o que então causa danos à via dopaminérgica nigroestriatal e leva a danos nos neurônios dopaminérgicos. Com base nessa evidência, hipotetizamos que o linalol poderia melhorar os sintomas motores e não motores da DP. Portanto, neste estudo, avaliamos os efeitos neuroprotetores do linalol em células SH-SY5Y dopaminérgicas, neurônios mesencefálicos primários e neurônios corticais contra a apoptose e o estresse oxidativo induzidos por MPP+. Além disso, investigamos os efeitos protetores do linalol no comprometimento induzido por MPTP dos sintomas motores e não motores em um modelo de camundongo com DP-like.
2. Resultados
2.1. O Linalol Aumentou a Viabilidade Celular de Células SH-SY5Y Tratadas com MPP+
Primeiro, investigamos o efeito do linalol na viabilidade celular de células SH-SY5Y usando um ensaio MTT. O tratamento com linalol (0,01–1 µM) por 24 h não afetou a viabilidade celular das células SH-SY5Y (Figura 1B). Em contraste, quando as células SH-SY5Y foram tratadas com MPP+ (100, 500, 1000 µM) por 24 h, houve uma diminuição significativa dependente da concentração na viabilidade celular (Figura 1C). No entanto, o tratamento com linalol (0,1 nM–1 µM) atenuou a citotoxicidade induzida por MPP+ (Figura 1D).
2.2. O Linalol Diminuiu a Morte Celular Apoptótica e a Retração de Neuritos Induzidas por MPP+ Acompanhada pelo Aumento de Fatores Neurotróficos em Células SH-SY5Y
Os efeitos antiapoptóticos do linalol em células SH-SY5Y tratadas com MPP+ foram examinados por coloração com Hoechst 33342. Conforme mostrado na Figura 2A,B, o MPP+ induziu condensação nuclear e morte apoptótica das células SH-SY5Y, cujos efeitos foram inibidos pelo linalol (indicado por setas vermelhas). O linalol também aumentou a expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 (Figura 2C) e reduziu a expressão das proteínas apoptóticas caspase-3 clivada (Figura 2D) e PARP clivada (Figura 2E) em células SH-SY5Y tratadas com MPP+. Além disso, o MPP+ reduziu significativamente as proteínas neurotróficas BDNF (Figura 3A) e NGF (Figura 3B), cujos efeitos foram revertidos pelo linalol. Investigamos ainda os efeitos protetores do linalol no comprimento dos neuritos. Conforme mostrado na Figura 3C,D, o linalol atenuou a retração de neuritos induzida por MPP+.
2.3. O Linalol Aumentou os Fatores Antioxidantes Nrf2/HO-1 e Inibiu a NADPH Oxidase em Células SH-SY5Y Tratadas com MPP+
Examinamos ainda a capacidade antioxidante do linalol em células SH-SY5Y tratadas com MPP+. Nas células tratadas com MPP+, o linalol aumentou a expressão proteica do Nrf2 nuclear e do HO-1 citosólico, um fator crítico que medeia a característica antioxidante em neurônios (Figura 4A,B). Além disso, examinamos ainda os efeitos do linalol na expressão proteica de gp91phox (também conhecida como NOX2), uma das subunidades catalíticas da nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase, que induz a produção de ROS. Os resultados indicaram que o linalol reduziu a expressão de gp91phox em células SH-SY5Y tratadas com MPP+ (Figura 4C). Esses resultados sugeriram que o linalol aumentou a defesa antioxidante em células SH-SY5Y tratadas com MPP+.
2.4. O Linalol Aumentou a Expressão de SirT1, Parkina e TH em Neurônios Mesencefálicos Primários Tratados com MPP+ e a Expressão de SirT1 e Ácido γ-Aminobutírico (GABA) em Neurônios Corticais Primários Tratados com MPP+
Em seguida, examinamos os efeitos do linalol na expressão proteica da via relacionada à sirtuína1 (SirT1) na neuroproteção, depressão e ansiedade. Em neurônios mesencefálicos primários, o tratamento com MPP+ diminuiu a expressão proteica de SirT1 (Figura 5A) e parkina (Figura 5B). No entanto, o pré-tratamento com linalol reverteu a expressão proteica de SirT1 e parkina, que está envolvida na neuroproteção contra o estresse oxidativo induzido por mitocôndrias em neurônios mesencefálicos primários tratados com MPP+. Além disso, o linalol atenuou a redução induzida por MPP+ da expressão proteica de TH (Figura 5C), um marcador reconhecido de neurônios dopaminérgicos. Examinamos ainda a expressão de SirT1 e GABA em neurônios corticais primários, que estão envolvidos em transtornos de humor como depressão e ansiedade. Nosso resultado indicou que o MPP+ diminuiu a expressão de SirT1 (Figura 6A), GABAA-α1 (Figura 6B) e GABAB (Figura 6C) no neurônio cortical primário. No entanto, o linalol aumentou a expressão proteica de SirT1, GABAA-α1 e GABAB em neurônios corticais primários tratados com MPP+.
2.5. Linalool Protegeu Neurônios Dopaminérgicos e Melhorou a Atividade Motora no Modelo de Camundongo de DP Induzido por MPTP
Observou-se uma diminuição drástica dos neurônios dopaminérgicos (neurônios positivos para TH) na SNpc de camundongos tratados com MPTP (Figura 7A,B) em comparação ao grupo controle. No entanto, o linalool reverteu a redução dos neurônios positivos para TH em camundongos tratados com MPTP (Figura 7A,B).
Para avaliar o efeito protetor do linalool na disfunção neurológica motora no modelo de DP, o teste de força de preensão e o teste de suspensão em fio são utilizados para examinar a força muscular. Dados do estudo relataram que camundongos com características semelhantes à DP apresentam baixa força de preensão (Figura 8A) e tempos de suspensão mais curtos (Figura 8B). A força muscular dos camundongos com características semelhantes à DP foi melhorada nos grupos tratados com 12,5 e 25 mg/kg de linalool. Além disso, os resultados do teste de campo aberto indicaram que a distância total de movimento dos camundongos com características semelhantes à DP foi significativamente reduzida em comparação ao grupo controle. No entanto, o linalool aumentou a distância total de movimento (Figura 8C), demonstrando que o linalool melhorou a atividade locomotora em camundongos com características semelhantes à DP.
2.6. Linalool Melhorou Comportamentos do Tipo Depressivo e Ansioso no Modelo de Camundongo de DP Induzido por MPTP
Para avaliar o efeito de melhora do linalool nos sintomas não motores da DP, foram realizados o teste de campo aberto, o teste de natação forçada e o teste do labirinto em cruz elevado — três paradigmas comportamentais de depressão. Os resultados do teste de campo aberto mostraram que o tempo gasto na área central dos camundongos com características semelhantes à DP diminuiu acentuadamente em comparação ao grupo controle. No entanto, o linalool melhorou o tempo gasto na área central (Figura 9A). Além disso, o MPTP aumentou o tempo de imobilidade (comportamento passivo) no teste de natação forçada. No entanto, o tratamento com linalool (12,5 ou 25 mg/kg) atenuou o tempo de imobilidade em camundongos tratados com MPTP (Figura 9B). Além disso, o tempo gasto nadando ou escalando (comportamento ativo) foi diminuído nos camundongos tratados com MPTP, enquanto aqueles tratados com linalool prolongaram o tempo de natação (Figura 9C). Transtornos de ansiedade e depressão são frequentemente comórbidos com a DP. Assim, o teste do labirinto em cruz elevado foi avaliado para medir sintomas de ansiedade em camundongos. Os efeitos ansiogênicos induzidos por MPTP, conforme demonstrado pela redução do tempo gasto nos braços abertos (Figura 9D), diminuição do número de entradas nos braços abertos (Figura 9E) e aumento do tempo gasto nos braços fechados (Figura 9F) no teste do labirinto em cruz elevado. Após a aplicação do linalool, o tempo gasto nos braços abertos e o número de entradas nos braços abertos aumentaram acentuadamente (Figura 9D,E), enquanto o tempo gasto nos braços fechados diminuiu (Figura 9F). Em conjunto, esses dados forneceram evidências de que o linalool atenuou o comportamento do tipo depressivo e ansioso em camundongos com características semelhantes à DP induzidos por MPTP.
3. Discussão
A doença de Alzheimer (DA) e a doença de Parkinson (DP) destacam-se como dois distúrbios neurodegenerativos altamente comuns em todo o mundo. Ambas as condições estão ligadas a irregularidades no sistema nervoso central e danos celulares, levando a diversos níveis de disfunções cognitivas e motoras. O linalol é um álcool terpênico natural comumente encontrado em várias plantas. Alguns estudos sugerem que o linalol pode ter propriedades terapêuticas potenciais, como efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios, que poderiam ser especialmente benéficos na neuroproteção. Estudos anteriores indicaram que a administração oral de linalol por três meses reverte as características histopatológicas da DA e restaura as funções cognitivas e emocionais por meio de um efeito anti-inflamatório em um modelo de camundongos idosos transgênicos triplos para DA (3xTg-AD). O estudo de Yuan et al. em 2021 indicou que o linalol atua contra os efeitos neurotóxicos do β-amiloide (Aβ) em um modelo de mosca da DA que expressa Aβ humano, suprimindo a produção de radicais livres e a resposta inflamatória. No modelo de rato com lesão unilateral de Aβ1–42 para DA, o linalol também reduziu o início do estresse oxidativo e da gliose causados pelo tratamento com Aβ1–42 no hipocampo do rato. O linalol também reverte os déficits cognitivos por meio da atenuação da apoptose e do estresse oxidativo, dependente da ativação da sinalização Nrf2/HO-1 em modelo de camundongos com DA tratados com Aβ1–40. Assim, espera-se que o linalol seja utilizado como agente preventivo ou terapêutico para a DA. No presente estudo, revelamos que o linalol possui novos efeitos neuroprotetores por meio da regulação de vias antiapoptóticas, antioxidantes e neurotróficas. O linalol aumentou significativamente a sobrevivência dos neurônios dopaminérgicos na SNpc e melhorou os prejuízos na força muscular esquelética e nos sintomas motores/não motores em camundongos com DP induzida por MPTP.
Foi demonstrado que o MPP+ inibe o crescimento de neuritos, diminui o número de células neuronais e reduz o comprimento dos neuritos. No entanto, o linalol atenuou a retração de neuritos induzida por MPP+ em células SH-SY5Y. Os fatores neurotróficos BDNF e NGF desempenham papéis importantes na regulação da sobrevivência, diferenciação e funções neuronais. Em nosso resultado, o linalol aumentou a expressão proteica dos fatores neurotróficos BDNF e NGF, que diminuíram com o MPP+ em células SH-SY5Y. Vários estudos indicaram que o estresse oxidativo induzido por MPP+ tem sido considerado um dos efeitos prejudiciais proeminentes que induzem a toxicidade dos neurônios na DP. Enquanto isso, a via Nrf2/HO-1 é um alvo terapêutico promissor para a DP. Nossos resultados indicaram que o linalol pode regular os efeitos da via Nrf2/HO-1 em células SH-SY5Y tratadas com MPP+. Além disso, múltiplas evidências sugerem que as enzimas NOX transportam elétrons através da membrana plasmática, o que aumenta a produção de ROS para induzir a morte de células neuronais nos processos patológicos da DP. No presente estudo, nossos resultados ilustraram que o linalol aliviou significativamente o aumento da expressão de NOX2 causado pelo MPP+ em células SH-SY5Y, implicando os efeitos neuroprotetores do linalol através da modulação do sistema de estresse oxidativo. Um estudo recente demonstrou o efeito neuroprotetor da SirT1 através da atenuação da geração de estresse oxidativo na DP. Além disso, foi relatado que a parkina está envolvida no papel neuroprotetor da SirT1 na disfunção mitocondrial induzida por estresse oxidativo. Células de cultura primária podem manter de forma mais estável a forma original, as características biológicas e os perfis de expressão gênica das células. Portanto, neurônios mesencefálicos primários foram utilizados para investigar mais a fundo o efeito protetor do linalol na redução de SirT1, parkina e TH induzida por MPP+. Nossos resultados sugeriram os efeitos neuroprotetores do linalol através da regulação positiva de SirT1 e parkina contra a neurotoxicidade induzida pela neurotoxina parkinsoniana MPP+ em neurônios mesencefálicos primários. Além disso, fatores neurotróficos como o BDNF mantêm a plasticidade neuronal e evitam danos neuronais induzidos por estresse oxidativo. Os resultados deste estudo demonstraram que o linalol atenuou de forma dose-dependente a neurotoxicidade mediada por MPP+, acompanhada pelo aumento da defesa antioxidante (Nrf2 e HO-1) e da sinalização neurotrófica (BDNF e NGF). Esses resultados apoiaram que o linalol possui efeitos antioxidantes e neurotróficos contra a neurotoxicidade induzida por MPP+ em células SH-SY5Y. Além disso, a TH é a enzima limitante da taxa que catalisa a hidroxilação da tirosina em L-DOPA e é reconhecida como o marcador de neurônios dopaminérgicos. O linalol promove a expressão de TH em neurônios mesencefálicos primários tratados com MPP+ e em camundongos com fenótipo semelhante à DP, sugerindo o potencial protetor do linalol sobre os neurônios dopaminérgicos.
Os sintomas motores na DP tornam-se aparentes quando uma parte significativa dos neurônios dopaminérgicos na SNpc é perdida. Além disso, os sintomas não motores, incluindo distúrbios neuropsiquiátricos, autonômicos, do sono e sensoriais, afetam ainda mais a qualidade de vida do paciente com DP. Fatores neurotróficos demonstraram desempenhar papéis cruciais na sobrevivência das células neuronais na DP. Os níveis de BDNF e NGF estavam drasticamente diminuídos na SNpc do cérebro humano afetado pela DP. Portanto, o agonista de fatores de crescimento poderia ser outra opção para mitigar a patologia da DP. Enquanto isso, as reduções nos níveis plasmáticos de BDNF e NGF foram demonstradas no transtorno bipolar e em pacientes maníacos e deprimidos. Assim, nossos resultados demonstraram que o linalol resgatou a expressão de BDNF e NGF na neurotoxicidade induzida por MPP+ em células SH-SY5Y e melhorou os comportamentos do tipo depressivo e ansioso na DP induzida por MPTP. Os sintomas não motores da DP geralmente respondem mal ao tratamento dopaminérgico. Além da perda de dopamina, as alterações em outros neurotransmissores, como glutamato e GABA, participaram da patogênese dos sintomas não motores na DP. Além disso, estudos farmacológicos e genéticos demonstraram que a hipofunção do receptor GABA resulta nas patologias da esquizofrenia, transtorno bipolar e transtorno depressivo maior. A alteração no GABA também é observada na patogênese dos sintomas não motores na DP. Ademais, a via SirT1 está envolvida na neuroproteção, depressão e ansiedade em modelos de DP. A ativação de SirT1 desempenha um papel na modulação da secreção de GABA. Relatos anteriores mostraram que o linalol tem efeitos calmantes para neutralizar a ansiedade. Nossos resultados indicaram que o linalol aumentou a expressão de SirT1 em neurônios corticais primários tratados com MPP+ e protegeu contra a citotoxicidade induzida por MPP+ em células SH-SY5Y e células neuronais embrionárias primárias de rato. Além disso, o linalol atenuou o comprometimento motor induzido por MPTP em camundongos C57BL/6, como capacidade de exercício, força de preensão e resistência muscular, bem como sintomas não motores, como sintomas de depressão e ansiedade. Essas descobertas revelam os potenciais benefícios na terapia complementar para a DP.
4. Materiais e Métodos
4.1. Produtos Químicos e Anticorpos
Linalol, (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio) (MTT), MPP+, MPTP, Hoechst 33342 e anticorpo de camundongo contra β-actina foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). DMEM, SFB e Alexa Fluor 488 IgG de cabra anti-coelho foram adquiridos da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Anticorpos de camundongo contra Bcl-2, anticorpo de cabra contra HO-1 e todos os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Anticorpo de camundongo contra caspase-3 e anticorpo de coelho contra PARP foram obtidos da Cell Signaling (Danvers, MA, EUA). Anticorpo de camundongo contra gp91phox foi adquirido da BD Bioscience (San Jose, CA, EUA). Anticorpo de coelho contra α-tubulina, anticorpo de coelho contra TH, reagente de quimioluminescência intensificada e membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) foram obtidos da Millipore (Bedford, MA, EUA). Todos os materiais para SDS-PAGE foram adquiridos da Bio-Rad (Hercules, CA, EUA).

4.2. Culturas de Células
Células dopaminérgicas humanas SH-SY5Y foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC). As células SH-SY5Y foram incubadas em meio de crescimento DMEM contendo 10% de SFB, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37 °C. Para avaliar o impacto protetor do linalol contra danos induzidos por MPP+, as células SH-SY5Y foram pré-tratadas com veículo (0,1% EtOH) ou linalol (1, 10, 100, 1000 nM) por 1 h, seguidas de exposição a MPP+ (1 mM) por 24 h. Neurônios primários corticais e mesencefálicos foram preparados a partir de córtices e mesencéfalo ventral dissecados de embriões de quinze dias (E15) de ratos SD, respectivamente. Após 6 dias in vitro, as células cultivadas foram tratadas com várias concentrações de linalol no experimento. Para avaliar os efeitos protetores do linalol contra danos induzidos por MPP+, neurônios primários corticais e mesencefálicos foram pré-tratados com veículo (0,1% EtOH) ou linalol nas concentrações de 0,1, 1 e 10 nM por 1 h. Subsequentemente, as células foram expostas a MPP+ (100 μM) por 24 h.

4.3. Ensaio de Viabilidade Celular
A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. As células foram tratadas com 0,5 mg/mL de MTT por 3 h a 37 °C, e então os cristais de formazan nas células foram dissolvidos com 100 μL de DMSO (Phillipsburg, NJ, EUA). A absorbância foi lida a 540 nm e 630 nm usando um leitor de microplacas.

4.4. Condensação Nuclear Apoptótica
A condensação nuclear apoptótica foi detectada pela coloração com Hoechst 33342. As células SH-SY5Y foram semeadas em placas de 6 poços e então tratadas conforme descrito acima. Após os tratamentos, Hoechst 33342 (10 μM) foi adicionado para incubar por 10 min. As imagens foram obtidas usando um microscópio de fluorescência (Nikon, Tóquio, Japão). O grau de apoptose foi avaliado contando a porcentagem de células apoptóticas.

4.5. Medição do Comprimento de Neuritos
Para medir o comprimento dos neuritos, as células SH-SY5Y foram diferenciadas em meio DMEM contendo 3% de SBF e ácido retinoico (10 µM) por 5 dias antes do tratamento com o fármaco. A coloração de α-tubulina foi avaliada para medir o crescimento dos neuritos, medindo o comprimento dos neuritos de todas as células identificadas como positivas para neuritos e calculando a média do comprimento do neurito por célula usando o software ImageJ versão 1.54 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). Resumidamente, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 30 min e permeabilizadas com Triton X-100 a 0,2% (USB Corporation, Cleveland, OH, EUA) em PBS. As células foram então incubadas com tampão de bloqueio (BSA a 2% em PBS) por 1 h, e com anti-α-tubulina de coelho durante a noite a 4 °C. Alexa Fluor 488 IgG anti-coelho de cabra foi usado como anticorpo secundário. As imagens foram coletadas em um microscópio de fluorescência (Nikon, Japão). Os neuritos foram definidos como prolongamentos com comprimento igual ou superior a dois diâmetros do corpo celular. A análise do crescimento dos neuritos envolveu a medição do comprimento dos neuritos para todas as células identificadas positivamente como portadoras de neuritos. Subsequentemente, o comprimento médio do neurito por célula foi calculado.
4.6. Análise de Western Blot
Após o tratamento indicado, as células foram coletadas e lisadas para determinar a expressão proteica. As células foram lisadas em tampão de extração de proteína tecidual T-PER para obter o extrato celular total ou em reagentes de extração nuclear e citoplasmática NE-PER™ para isolar a fração nuclear. A proteína coletada foi usada para eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, e a concentração de proteína foi determinada usando o kit de ensaio de proteína Bio-Rad (Hercules, CA, EUA). As membranas foram incubadas, cada uma com os anticorpos primários indicados em diferentes diluições durante a noite a 4 °C. As membranas foram então lavadas com TBST e incubadas com anticorpos secundários (diluídos 1:10.000 em leite desnatado a 5%), agitando à temperatura ambiente por 1 h. A expressão proteica foi detectada com quimioluminescência usando um kit de detecção ECL Amersham (Cytiva, Marlborough, MA, EUA), e o sinal foi capturado usando o sistema de imageamento quimioluminescente TopBio Multigel-21 (Topbio, Taiwan) e quantificado com o software ImageJ versão 1.54 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA).
4.7. Agrupamentos de Animais e Administração de Fármacos
O Comitê de Uso e Cuidado Animal da Universidade Médica de Kaohsiung aprovou o uso e os métodos animais (IACUC-104153; data de aprovação: 21 de janeiro de 2016). Camundongos C57BL/6 machos (7–8 semanas de idade, 20–25 g) foram adquiridos do Centro Nacional de Reprodução e Pesquisa de Animais de Laboratório (Taipei, Taiwan). Para administração oral aos camundongos, o linalol foi dissolvido em solução salina normal contendo 0,2% de Tween 80. Os camundongos foram separados aleatoriamente em quatro grupos (seis camundongos por grupo) da seguinte forma: controle (veículo); MPTP (MPTP + veículo); MPTP + linalol (12,5 mg/kg/dia); MPTP + linalol (25 mg/kg/dia). Os camundongos foram pré-tratados com veículo (5 mL/kg) ou linalol (12,5 mg/kg/5 mL ou 25 mg/kg/5 mL, uma vez ao dia por 7 dias, e então o MPTP foi injetado no 8º dia. O modelo de camundongo com DP subaguda induzida por MPTP foi construído no presente estudo. Os camundongos receberam 20 mg/kg de MPTP via injeção intraperitoneal quatro vezes em intervalos de 2 horas dentro de um dia.
4.8. Teste de Força de Preensão
Um medidor de força de preensão (Bio-GS3, BioSeb, Vitrolles, França) foi utilizado para avaliar a força muscular da musculatura de todo o membro; o teste de força de preensão dos camundongos foi conduzido seguindo a metodologia descrita em nossos relatórios anteriores e em relatórios de pesquisa de outros laboratórios. Antes do experimento, os camundongos foram aclimatados ao novo ambiente por 2 h. Para cada tentativa, os camundongos foram colocados na grade do dispositivo e puxados paralelamente ao solo a uma velocidade constante até a perda da preensão, e a força máxima gerada imediatamente antes de o camundongo perder a pegada foi registrada. Este processo foi replicado três vezes por três ciclos, e cada tentativa foi seguida por um período de descanso de 5 s do camundongo na bancada. Os camundongos foram autorizados a descansar por 10 min entre cada ciclo. Os valores médios máximos de força muscular dos membros em gramas (g) foram utilizados na avaliação.
4.9. Teste de Suspensão no Fio
O teste de suspensão no fio avaliou a força neuromuscular. Antes do experimento, os camundongos foram aclimatados ao novo ambiente por 2 h. Após isso, os camundongos foram colocados em uma linha esticada horizontalmente até que segurassem a linha com as quatro patas. O fio foi instalado a 30 cm acima do solo e possui amortecimento embaixo para evitar lesões causadas por quedas. Para avaliar a força neuromuscular da musculatura de todo o membro, realizamos nove experimentos consecutivos para cada camundongo. Os camundongos foram autorizados a descansar entre os testes. Os valores médios de latência para queda em segundos (s) foram utilizados na avaliação.
4.10. Teste de Campo Aberto
O teste de campo aberto foi utilizado para medir a atividade locomotora e o comportamento do tipo ansioso. O aparato é composto por uma câmara (50 × 50 cm de diâmetro, 25 cm de altura). Antes do experimento, os camundongos foram aclimatados ao novo ambiente por 2 h e colocados em uma câmara por 5 min, seguido de medição automática por um analisador DigiScan (ViewPoint behavior technology, Civrieux, França), que transmitiu os dados de atividade para um computador. Os dados de atividade apresentados foram a distância total (cm) de movimento, a velocidade média (cm/s) e o tempo na zona central durante o período de registro de 5 min.
4.11. Teste do Labirinto em Cruz Elevado
O teste do labirinto em cruz elevado foi utilizado para avaliar o comportamento do tipo ansioso. O aparato é composto por um quadrado central (5 × 5 cm), dois braços abertos (30 × 5 cm) e dois braços fechados com paredes (30 × 5 × 15 cm). Os dados de atividade apresentados foram o tempo gasto nos braços abertos, o número de entradas nos braços abertos e o tempo gasto nos braços fechados durante o período de registro de 5 min.
4.12. Teste de Natação Forçada
O teste de natação forçada foi utilizado para avaliar o comportamento do tipo depressivo. O aparato é composto por um cilindro de plástico (12 cm de diâmetro, 25 cm de altura). O cilindro foi preenchido com água (24 ± 1 °C) até uma altura de 15 cm. Antes do experimento, os camundongos foram aclimatados ao novo ambiente por 2 h. Após isso, os camundongos foram colocados no cilindro por 6 min (1 min para adaptação ao ambiente e 5 min para registrar o tempo de imobilidade), seguido de medição automática por um analisador DigiScan (ViewPoint behavior technology, Civrieux, França), transmitindo os dados de atividade para um computador. Os dados de atividade apresentados foram o tempo de imobilidade durante o período de registro de 5 min.
4.13. Imuno-histoquímica
Na imuno-histoquímica, os cérebros foram primeiro fixados por perfusão com paraformaldeído a 4% e depois pós-fixados durante a noite após a dissecção. Os tecidos cerebrais foram desidratados e embebidos em parafina, e cortes coronais consecutivos de 5 µm de espessura foram coletados. Os cortes foram então incubados com H2O2 a 0,3% por 15 min para exaurir a atividade da peroxidase endógena. Subsequentemente, as lâminas foram incubadas com um tampão de bloqueio contendo albumina sérica bovina (BSA) a 3% por 30 min. Os cortes de tecido foram incubados durante a noite com o anticorpo primário TH (1:100) a 4 °C. Após lavagem com PBS, os cortes foram incubados com um anticorpo secundário conjugado com HRP anti-coelho (1:500) por 30 min à temperatura ambiente. Os cortes foram então revelados com diaminobenzidina (DAB). Neurônios TH-positivos na SNpc foram capturados sob um microscópio óptico (ECLIPSE 80i, Nikon, Japão) com uma ampliação de 200×. A capacidade dos neurônios na SNpc de sintetizar dopamina foi avaliada quantificando as células neuronais TH-positivas na SNpc.
4.14. Análise Estatística
A análise estatística foi realizada utilizando o InStat versão 3.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). Os dados foram expressos como médias ± EPM e a significância estatística foi analisada utilizando ANOVA de uma via seguida pelo teste de Dunnett para todas as comparações entre pares. A significância foi estabelecida em um valor de p menor que 0,05.
5. Conclusões
Nossos resultados demonstraram que o linalol atenuou a morte apoptótica induzida por MPP+, o dano neurítico e o estresse oxidativo. Enquanto isso, o linalol melhorou não apenas a função motora de camundongos com fenótipo semelhante à DP, mas também a função não motora. Essas descobertas fornecem novos insights baseados em evidências, apoiando o uso potencial do linalol ou de óleos essenciais contendo linalol como terapia complementar para a DP.
Isenção de responsabilidade/Nota do Editor: As declarações, opiniões e dados contidos em todas as publicações são exclusivamente dos autores e colaboradores individuais e não do MDPI e/ou dos editores. O MDPI e/ou os editores se isentam de responsabilidade por qualquer dano a pessoas ou propriedades decorrentes de quaisquer ideias, métodos, instruções ou produtos mencionados no conteúdo.
Contribuições dos Autores
Conceituação, W.-H.C., H.-T.H., C.-C.L. e Y.-C.L.; metodologia, W.-H.C., H.-T.H., C.-C.L., L.-M.A. e Y.-C.L.; validação, H.-T.H., C.-C.L., C.-L.L. e C.-H.L.; análise formal, W.-H.C., C.-C.L. e L.-M.A.; investigação, W.-H.C., H.-T.H. e C.-C.L.; recursos, H.-H.K. e Y.-C.L.; curadoria de dados, W.-H.C., C.-C.L., C.-H.L. e C.-L.L.; preparação do rascunho original, W.-H.C., C.-C.L., C.-H.L. e H.-T.H.; redação — revisão e edição, W.-H.C. e Y.-C.L.; administração do projeto, Y.-C.L.; aquisição de financiamento, Y.-C.L. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Comitê de Revisão Institucional
O protocolo do estudo animal foi aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional (ou Comitê de Ética) do Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade Médica de Kaohsiung (número de aprovação do IACUC: 104153, data de aprovação: 21 de janeiro de 2016).
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados apresentados neste estudo estão disponíveis mediante solicitação ao autor correspondente.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Referências
Extrato de Sophora Tomentosa Previne o Parkinsonismo Induzido por MPTP em Camundongos C57BL/6 Através da Inibição da Fosforilação de GSK-3β e do Estresse Oxidativo
Anais: Terapias celulares para a doença de Parkinson, da descoberta à clínica
Acacetina inibe a morte celular neuronal induzida por 6-hidroxidopamina em modelo celular da doença de Parkinson
Doença de Parkinson: Da patologia aos mecanismos moleculares da doença
Doença de Parkinson
Efeitos com Viés de Gênero da Administração Intranasal de MPTP em Comportamentos do Tipo Anedônico e Depressivo em Camundongos C57BL/6: O Papel dos Fatores Neurotróficos
O início dos sintomas não motores na doença de Parkinson (o estudo ONSET PD)
Apoptose: Uma perspectiva de bioprocessamento de células de mamíferos
Efeitos do Co-Tratamento com Tilirosídeo e Lisurida na Via de Sinalização PI3K/Akt: Modulando a Neuroinflamação e a Apoptose na Doença de Parkinson
Mais Insights sobre o BDNF contra a Neurodegeneração: Antiapoptose, Antioxidante e Supressão da Autofagia
Regulação do Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro e das Vias de Sinalização de Fatores de Crescimento pela Tirosina Fosfatase Shp2 na Retina: Uma Breve Revisão
Variações do Fator de Crescimento Neural em Pacientes com Transtornos do Humor: Sem Alterações em Oito Semanas de Tratamento Clínico
O Papel dos Fatores Neurotróficos em Comportamentos do Tipo Maníaco, Ansioso e Depressivo Induzidos pela Sensibilização por Anfetamina: Implicações para o Modelo Animal de Transtorno Bipolar
O Papel do BDNF na Depressão com Base em sua Localização no Circuito Neural
Neuroregeneração na Doença de Parkinson: De Proteínas a Pequenas Moléculas
Vias de Sinalização Induzidas pelo Estresse Oxidativo Implicadas na Patogênese da Doença de Parkinson
Estresse Oxidativo na Doença de Parkinson: Uma Revisão Sistemática e Metanálise
Papel do Sistema Nrf2/HO-1 no Desenvolvimento, Resposta ao Estresse Oxidativo e Doenças: Um Mecanismo Evolutivamente Conservado
Dano Oxidativo e a Via Nrf2-ARE em Doenças Neurodegenerativas
Sinalização de Nrf2:INrf2 (Keap1) no Estresse Oxidativo
Efeitos do Linalol Inalado na Ansiedade, Interação Social e Comportamento Agressivo em Camundongos
Efeitos Antinociceptivos e Anticonvulsivantes do Monoterpeno Óxido de Linalol
Atividade Anticonvulsivante do Óleo Essencial da Flor de Citrus aurantium (Neroli): Envolvimento do Sistema GABAérgico
(-)-Linalol Atenua a Alodinia na Dor Neuropática Induzida por Ligadura do Nervo Espinhal em Camundongos C57/Bl6
Atividade Antidepressiva do Óleo Essencial de Litsea glaucescens: Identificação de β-Pineno e Linalol como Princípios Ativos
Efeitos Ansiolíticos Induzidos pelo Odor do Linalol em Camundongos
Linalol como Ferramenta Terapêutica e Medicinal no Tratamento da Depressão: Uma Revisão
Efeitos Psicológicos e Antibacterianos do Banho de Pés Usando o Óleo Essencial de Lindera umbellata
Avaliação da Coordenação Motora e Atividades Antidepressivas do Óleo Foliar de Cinnamomum osmophloeum ct. Linalol em Modelo Roedor
Doença de Parkinson
Potenciais Neuroprotetores e Antienvelhecimento dos Óleos Essenciais de Plantas Aromáticas e Medicinais
L-linalol Exerce uma Ação Neuroprotetora em Ratos Hemiparkinsonianos
Estudos Computacionais Aplicados a Derivados de Linalol e Citronelal contra os Transtornos de Alzheimer e Parkinson: Uma Revisão com Abordagem Experimental
Potencial Efeito Antiparkinsoniano do S-(+)-linalol das Folhas de Cinnamomum osmophloeum ct. linalol está Associado à Regulação Mitocondrial via gas-1, nuo-1 e mev-1 em Caenorhabditis elegans
Efeitos Diferenciais dos Extratos Etanólicos de Alho Processado e Não Processado (Allium sativum L.) na Neuritogênese e Sinaptogênese em Neurônios Hipocampais Primários de Ratos
Linalol e β-pineno Exercem sua Atividade do Tipo Antidepressiva Através da Via Monoaminérgica
O Efeito Protetor do Óleo Essencial de Lavanda e Seu Principal Componente Linalol contra os Déficits Cognitivos Induzidos por D-Galactose e Tricloreto de Alumínio em Camundongos
Efeitos neuroquímicos e comportamentais do 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) em ratos, cobaias e macacos
Parkinsonismo crônico em humanos devido a um produto da síntese de análogos da meperidina
Efeitos Neuroprotetores do San-Huang-Xie-Xin-Tang nos Modelos de Doença de Parkinson MPP+/MPTP In Vitro e In Vivo
Melhorando a Disfunção Mitocondrial de Neurônios por Nanopartículas de Direcionamento Biomimético Mediando a Biogênese Mitocondrial para Potencializar a Terapia da Doença de Parkinson
Avanços em nossa compreensão dos mecanismos de neurotoxicidade do MPTP e compostos relacionados
Os efeitos do 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) nas funções cognitivas e motoras em roedores: Uma revisão sistemática e meta-análise
NADPH oxidases na doença de Parkinson: Uma revisão sistemática
Via SIRT1 na doença de Parkinson: Um instantâneo distante, mas tão próximo
Características não motoras da doença de Parkinson
O linalol reverte déficits neuropatológicos e comportamentais em camundongos transgênicos triplos idosos com Alzheimer
O Linalol Alivia a Neurodegeneração Induzida por Aβ42 através da Supressão da Produção de ROS e Inflamação em Modelos de Mosca e Rato da Doença de Alzheimer
Efeitos protetores do linalol contra déficits cognitivos e danos induzidos por beta-amiloide em camundongos
Progressão clínica na doença de Parkinson e a neurobiologia dos axônios
Distribuição do Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro no Cérebro do Pequeno-Tubarão-Chato Scyliorhinus canicula, e Evolução das Neurotrofinas em Vertebrados Basais
Estresse oxidativo e doença de Parkinson
Estudos comparativos sobre os mecanismos de citotoxicidade do paraquato e do 1-metil-4-fenilpiridina (MPP+)
Nrf2: Um modulador da doença de Parkinson?
NADPH oxidases como alvos de medicamentos e biomarcadores em doenças neurodegenerativas: Qual é a evidência?
SIRT1 melhora a morte celular neural induzida por estresse oxidativo e é regulado negativamente na doença de Parkinson
Estudo Multicêntrico de Sydney sobre a doença de Parkinson: Problemas não responsivos à L-dopa dominam aos 15 anos
Neuropatologia e neuroquímica dos sintomas não motores na doença de Parkinson
A expressão dos receptores GABAA α2-, β1- e ε é alterada significativamente no cerebelo lateral de indivíduos com esquizofrenia, depressão maior e transtorno bipolar
O sistema GABA na ansiedade e depressão e seu potencial terapêutico
Níveis mais baixos de marcadores de função GABAérgica em neurônios que expressam o Hormônio Liberador de Corticotropina no sgACC de indivíduos humanos com depressão
Receptores GABA(A) como alvos para tratar sintomas afetivos e cognitivos da depressão
Contribuição do Sistema GABAérgico para Manifestações Não Motoras em Estágios Pré-motores e Iniciais da Doença de Parkinson
A via de mitofagia mediada por PINK1/parkin está relacionada à neuroproteção pelo ácido carnósico em células SH-SY5Y
Expressão gênica alterada da sirtuína desacetilase em pacientes com transtorno do humor
Conectividade Alterada na Depressão: Déficits de Neurotransmissores GABA e Glutamato e Reversão por Novos Tratamentos
O Resveratrol Atenua as Alterações Induzidas por Estresse Leve Crônico Imprevisível na Via SIRT1/PGC1α/SIRT3 e Disfunção Mitocondrial Associada em Camundongos
O Paeonol Atenua a Inflamação Mediada por Microglia e a Neurotoxicidade Induzida por Estresse Oxidativo em Microglia Primária e Neurônios Corticais de Ratos
As Propriedades Antioxidantes, Anti-Inflamatórias e Neuroprotetoras do Derivado Sintético de Chalcona AN07
A Berberina, um medicamento antidiabético natural, atenua a neurotoxicidade da glicose e promove o crescimento de neuritos relacionados ao Nrf2
Efeitos protetores dos extratos aquosos de Liuwei Dihuang na atrofia muscular diabética
A Terapia com Oxigênio Hiperbárico Melhora a Doença de Parkinson ao Promover a Biogênese Mitocondrial através da Via SIRT-1/PGC-1alfa
O Triptolídeo Previne a Atrofia Muscular Esquelética Induzida por LPS ao Inibir a Via NF-κB/TNF-α e Regular a Via de Síntese/Degradação de Proteínas
A Insuficiência de Vitamina D Reduz a Força de Preensão, a Resistência de Preensão e Aumenta a Fragilidade em Camundongos C57Bl/6J Envelhecidos
O Treinamento em Esteira ao Longo da Vida Melhora a Função Muscular Detectada por um Teste Modificado de Força de Preensão Durante o Envelhecimento em Camundongos BALB/c
A Gintonina Mitiga a Perda de Neurônios Dopaminérgicos Nigroestriatais Induzida por MPTP e o Acúmulo de alfa-Sinucleína através da Via Nrf2/HO-1
Três métodos de teste comportamental para medir a ansiedade—Uma revisão
O Linalol atenuou a citotoxicidade induzida por 1-metil-4-fenilpiridínio (MPP+) em células SH-SY5Y. (A) Estrutura química do linalol. (B) Efeitos do linalol na viabilidade celular das células SH-SY5Y. Células SH-SY5Y foram tratadas com linalol (0,001–1000 nM) por 24 h. (C) Efeito do MPP+ na viabilidade celular das células SH-SY5Y. Células SH-SY5Y foram tratadas com diferentes concentrações de MPP+ (100, 500, 1000 µM) por 24 h. (D) Efeitos do linalol na viabilidade celular das células SH-SY5Y. Células SH-SY5Y foram tratadas com linalol (1 pM–1 µM) por 24 h. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio MTT. As barras representam a média ± EPM. Os dados representam a média ± EPM de seis experimentos independentes. # p < 0,05 vs. grupo controle (apenas veículo, 0,1% EtOH); * p < 0,05 vs. grupo apenas MPP+.
O Linalol diminuiu a morte apoptótica induzida por MPP+ em células SH-SY5Y. As células foram pré-tratadas com linalol (1, 10, 100 e 1000 nM) por 1 h, e depois tratadas com MPP+ (1 mM) por 24 h. (A) A condensação nuclear (seta vermelha) foi identificada pela coloração com Hoechst 33342 e observada por microscópio de fluorescência. Barra de escala = 50 µm. (B) O grau de apoptose foi avaliado pela contagem da porcentagem de células apoptóticas (coloração com Hoechst 33342). As expressões proteicas de (C) Bcl-2, (D) caspase-3 clivada e (E) PARP clivada foram medidas por Western blotting. As análises densitométricas são apresentadas como a razão relativa de proteína/β-actina e representadas como porcentagens do grupo controle. Os dados representam a média ± EPM de seis experimentos independentes. # p < 0,05 vs. grupo controle (apenas veículo, 0,1% EtOH); * p < 0,05 vs. grupo apenas MPP+.
O linalol atenuou a redução da retração de neuritos induzida por MPP+ em células SH-SY5Y. As células foram pré-tratadas com linalol (1–1000 nM) por 1 h e, em seguida, tratadas com MPP+ (1 mM) por 24 h. Para medir o comprimento dos neuritos, as células SH-SY5Y foram diferenciadas em meio DMEM contendo 3% de SBF e 10 µM de ácido retinoico por cinco dias antes do tratamento com os fármacos. As análises densitométricas são apresentadas como a razão relativa das proteínas (A) BDNF e (B) NGF/β-actina e são representadas como porcentagens do grupo controle ou MPP+. (C) O comprimento dos neuritos e o núcleo foram confirmados pela imagem fluorescente de α-tubulina (verde) e DAPI (azul) corados sob um microscópio de fluorescência, respectivamente. Barra de escala = 100 μm. (D) O comprimento dos neuritos foi calculado utilizando o software Image J versão 1.54. Os dados representam a média ± EPM de seis experimentos independentes. # p < 0,05 vs. grupo controle (apenas veículo, 0,1% EtOH); * p < 0,05 vs. grupo MPP+.
O linalol aliviou a geração de estresse oxidativo induzida por MPP+ em células SH-SY5Y. As células foram pré-tratadas com linalol (1, 10 e 100 nM) por 1 h e, em seguida, tratadas com MPP+ (1 mM) por 24 h. As análises de Western blotting são apresentadas como a razão relativa de (A) nuclear-Nrf2/Lamin B, (B) HO-1/β-actina e (C) gp91phox/β-actina, e são representadas como porcentagens do grupo controle ou MPP+. Os dados representam a média ± EPM de seis experimentos independentes. # p < 0,05 vs. grupo controle (apenas veículo, 0,1% EtOH); * p < 0,05 vs. grupo MPP+.
Efeitos do linalol na expressão das proteínas SirT1, parkina e TH em neurônios mesencefálicos primários tratados com MPP+. Neurônios mesencefálicos primários foram pré-tratados com linalol (0,1, 1 e 10 nM) por 1 h e, em seguida, tratados com MPP+ (100 µM) por 24 h. O linalol reverteu a regulação negativa de (A) SirT1, (B) parkina e (C) TH em culturas de neurônios mesencefálicos primários tratados com MPP+. As análises densitométricas são apresentadas como a razão relativa da proteína/β-actina e são representadas como porcentagens do grupo controle. Os dados representam a média ± EPM de seis experimentos independentes. # p < 0,05 vs. grupo controle (apenas veículo, 0,1% EtOH); * p < 0,05 vs. grupo MPP+.
O linalol melhorou a expressão das proteínas SirT1, GABAA-α1 e GABAB em neurônios corticais primários tratados com MPP+. Neurônios corticais primários foram pré-tratados com linalol (0,1, 1 e 10 nM) por 1 h e, em seguida, incubados com MPP+ (100 μM) por 24 h. O linalol atenuou a regulação negativa induzida por MPP+ de (A) SirT1, (B) GABAA-α1 e (C) GABAB em neurônios corticais primários. As análises de Western blotting são apresentadas como a razão relativa da proteína/β-actina e são representadas como porcentagens do grupo controle ou grupo MPP+. Os dados representam a média ± EPM de seis experimentos independentes. # p < 0,05 vs. grupo controle (sem qualquer tratamento); * p < 0,05 vs. grupo MPP+.
Linalol preveniu a morte neuronal dopaminérgica induzida por MPTP em camundongos. (A) A coloração imuno-histoquímica foi realizada para observar neurônios positivos para TH na SNpc de camundongos tratados com MPTP. Barra de escala no painel esquerdo da subfigura (A) = 500 µm. Barra de escala no painel direito da subfigura (A) = 100 µm. (B) Quantificação da intensidade da coloração para TH. Os dados representam a média ± EPM de seis experimentos independentes. # p < 0,05 vs. grupo controle (CTL, veículo apenas); * p < 0,05 vs. grupo MPTP.
Linalol melhorou a força muscular e a função motora em camundongos com DP induzida por MPTP. (A) A força de preensão e (B) o teste de suspensão na barra foram utilizados para avaliar a força muscular. (C) O teste de campo aberto avaliou a atividade locomotora medindo trajetórias, distância total percorrida e velocidade média. Os dados representam a média ± EPM de seis experimentos independentes. # p < 0,05 vs. grupo controle (CTL, veículo apenas); * p < 0,05 vs. grupo MPTP.
Linalol reverteu comportamentos depressivos e ansiosos induzidos por MPTP em camundongos com DP. (A) Tempo gasto na área central no teste de campo aberto, (B) tempo de imobilidade e (C) tempo de natação no teste de natação forçada foram usados para medir o comportamento depressivo. O teste do labirinto em cruz elevado foi utilizado para avaliar o comportamento ansioso, registrando (D) o tempo gasto nos braços abertos, (E) o número de entradas nos braços abertos e (F) o tempo gasto nos braços fechados. Os dados representam a média ± EPM de seis experimentos independentes. # p < 0,05 vs. grupo controle (CTL, veículo apenas); * p < 0,05 vs. grupo MPTP.