pmid: "32975516"
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Fotossíntese sem β-caroteno
Os carotenoides são essenciais na fotossíntese oxigênica: eles estabilizam os complexos pigmento-proteína, são ativos na captação de luz solar e na fotoproteção. Em plantas, estão presentes como carotenos e seus derivados oxigenados, as xantofilas. Embora plantas mutantes que carecem de xantofilas sejam capazes de crescimento fotoautotrófico, nenhuma planta sem carotenos em seus fotossistemas foi relatada até o momento, o que levou à opinião comum de que os carotenos são essenciais para a fotossíntese. Aqui, relatamos a primeira planta que cresce fotoautotroficamente na ausência de carotenos: uma planta de tabaco contendo apenas a xantofila astaxantina. Surpreendentemente, ambos os fotossistemas são totalmente funcionais apesar de seus sítios de ligação de carotenoides estarem ocupados por astaxantina em vez de β-caroteno ou permanecerem vazios (ou seja, não são ocupados por carotenoides). Essas plantas exibem extinção não fotoquímica, apesar da ausência de zeaxantina e luteína, e mostram que o tabaco pode regular a razão entre os dois fotossistemas em uma faixa dinâmica muito ampla para otimizar o transporte de elétrons.
Resumo do eLife
A maior parte da vida na Terra depende da fotossíntese, o processo usado por plantas e muitos outros organismos para armazenar energia da luz solar e produzir oxigênio. Os primeiros passos da fotossíntese, a captura e conversão da luz solar em energia química, ocorrem em grandes montagens de proteínas contendo muitas moléculas de pigmento chamadas fotossistemas. Nas plantas, os pigmentos envolvidos na fotossíntese são as clorofilas verdes e os carotenoides. Além de captar luz, os carotenoides têm um papel importante na prevenção de danos causados pela exposição excessiva à luz solar.
Existem mais de mil carotenoides diferentes nos seres vivos, mas apenas um, o β-caroteno, está presente em todo organismo que realiza o tipo de fotossíntese no qual o oxigênio é liberado, e é considerado essencial para o processo. No entanto, isso nunca pôde ser comprovado porque é impossível remover o β-caroteno das células usando abordagens genéticas típicas sem afetar todos os outros carotenoides.
Xu et al. usaram engenharia genética para criar plantas de tabaco que produziam um pigmento chamado astaxantina no lugar do β-caroteno. A astaxantina é um carotenoide do salmão e do camarão, normalmente não encontrado em plantas. Essas plantas são os primeiros seres vivos conhecidos a realizar fotossíntese sem β-caroteno e demonstram que esse pigmento não é essencial para a fotossíntese, desde que outros carotenoides estejam presentes. Xu et al. também mostram que os fotossistemas podem se adaptar ao uso de diferentes carotenoides e podem até operar com um número reduzido deles.
As descobertas de Xu et al. mostram a alta flexibilidade da fotossíntese em plantas, que são capazes de incorporar elementos não nativos ao processo. Esses resultados também são importantes no contexto do aumento da eficiência fotossintética e, portanto, da produtividade das culturas, já que mostram que um redesenho radical da maquinaria fotossintética é viável.
Introdução
Os carotenoides formam uma grande classe de pigmentos naturais responsáveis pelas cores amarela, laranja e vermelha de frutas e folhas. Nas membranas fotossintéticas, eles estão principalmente associados a proteínas, formando complexos pigmento-proteína. Sua grande seção de choque de absorção na região azul do espectro solar os torna pigmentos coletores de luz ideais, especialmente para organismos aquáticos. No entanto, o papel principal dos carotenoides na fotossíntese é a fotoproteção. Sua capacidade de extinguir tripletos de clorofila (Chl) (evitando assim sua reação com oxigênio molecular e a produção de oxigênio singleto) e de neutralizar o oxigênio singleto os torna essenciais para a sobrevivência do organismo. Além disso, os carotenoides estão envolvidos na extinção de estados excitados singleto de Chl em um processo conhecido como extinção não fotoquímica (NPQ), que controla o nível de estados excitados na membrana, protegendo assim o aparato fotossintético de danos causados por luz intensa.
Duas espécies de carotenoides estão presentes nas membranas fotossintéticas: carotenos e seus derivados oxigenados, as xantofilas. O principal caroteno, o β-caroteno (β-car), está associado ao núcleo dos fotossistemas I e II e está presente em todos os organismos que realizam fotossíntese oxigênica. As xantofilas (em plantas, principalmente luteína (Lut), neoxantina (Neo), violaxantina (Vio) e zeaxantina (Zea)), por outro lado, estão ligadas aos complexos coletores de luz (LHCs) que atuam como antenas periféricas, aumentando a seção de choque de absorção de ambos os fotossistemas. Os LHCs são capazes de acomodar diferentes xantofilas, mas não conseguem se enovelar na presença apenas de β-caroteno. Além disso, foi sugerido que a montagem do PSII requer a presença de carotenos, enquanto o PSI é estável mesmo na ausência de carotenoides.
Embora mutantes deficientes em xantofilas individuais ou todas, mas que ainda contêm carotenos, tenham sido identificados em vários organismos (por exemplo), mutantes deficientes em carotenos foram isolados apenas em cianobactérias e na alga verde Chlamydomonas reinhardtii quando esses organismos foram cultivados heterotroficamente. Nesses mutantes, nenhum PSII foi montado. Essa descoberta, juntamente com o fato de que nunca foram observados complexos de PSII sem carotenos, sugeriu que os carotenos têm um papel vital não apenas na fotossíntese, mas também para a sobrevivência da célula vegetal. No entanto, essa suposição nunca pôde ser verificada, pois os mutantes disponíveis sem carotenos carecem completamente de carotenoides.
Neste trabalho, analisamos plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) nas quais a via biossintética de carotenoides foi modificada (por transformação estável do genoma do cloroplasto) para produzir apenas o cetocarotenoide astaxantina (; Figura 1). As características fisiológicas e o crescimento autotrófico dessas plantas demonstram que a fotossíntese sem carotenos é possível, pelo menos quando as plantas são cultivadas em condições de laboratório.
Plantas em diferentes idades.
(A) Planta do tipo selvagem com 5 semanas de idade. (B) Planta Asta com 14 semanas de idade. (C) Planta Asta com 28 semanas de idade. Observe que as folhas velhas das plantas Asta tornam-se progressivamente verdes.
Fenótipo de plantas de tabaco do tipo selvagem (WT) e sintetizadoras de astaxantina (Asta) e análise de pigmentos.
Plantas WT (A) e Asta (B), com 7 e 21 semanas de idade, respectivamente. Observe que as folhas mais velhas no mutante são menos alaranjadas do que as folhas jovens. Veja também a Figura 1—suplemento da figura 1. (C) Perfis cromatográficos dos pigmentos extraídos das folhas normalizados pelo pico de Chl a. Neo, neoxantina; Vio, violaxantina; Lut, luteína; β-car, β-caroteno; Chl, clorofila; 4-ceto, 4-cetoanteraxantina; Ast, astaxantina; Ado, adonixantina; Can, cantaxantina.
Resultados e discussão
As folhas do mutante de tabaco são alaranjadas em estágio inicial e tornam-se mais verdes com a idade (veja a Figura 1, Tabela 1). Isso provavelmente se deve à alta expressão do genoma do cloroplasto em folhas jovens, que no mutante resulta na produção massiva de astaxantina. A maior parte da astaxantina está presente na forma de cristais ou agregados no cloroplasto. A síntese em alto nível de astaxantina utiliza uma parte substancial do orçamento energético da planta e do carbono fixado, podendo contribuir para o crescimento lento das plantas. Esse efeito negativo no crescimento é provavelmente exacerbado pelo fato de a astaxantina absorver a maior parte da luz incidente, diminuindo o número de fótons disponíveis para a fotossíntese. De fato, o esverdeamento das folhas corresponde a um aumento na taxa de crescimento das plantas. Tanto as folhas jovens quanto as maduras das plantas mutantes contêm apenas 20% das Clorofilas por peso fresco em comparação com o tipo selvagem (WT), mas possuem um teor de carotenoides semelhante (folhas maduras) ou muito maior (folhas jovens) (Tabela 1). No entanto, o mutante, em todos os estágios de crescimento, contém apenas astaxantina e traços de subprodutos da síntese de astaxantina e não acumula (<0,005 vezes o WT) os carotenoides que geralmente estão presentes no WT (Figura 1). Esse resultado é diferente da análise de plantas produtoras de astaxantina geradas anteriormente que ainda continham carotenoides do WT, embora em quantidades reduzidas. Assim, nosso tabaco modificado (doravante denominado Asta) representa o primeiro organismo a apresentar crescimento autotrófico na ausência virtual de carotenos. A seguir, relatamos os experimentos realizados em folhas maduras, que possuem uma relação Clorofila/carotenoide semelhante ao WT.
Composição de pigmentos das folhas.
Amostras Chl a/b Clorofila/carotenoide Clorofila/peso fresco (mg/g) Clorofila/área foliar # (mg) WT 3,79 ± 0,09 4,21 ± 0,20 2,63 ± 0,39 0,0312 ± 0,0026 Folhas maduras de Asta 3,01 ± 0,10 3,02 ± 0,22 0,58 ± 0,07 0,0062 ± 0,0008 Folhas jovens de Asta 3,16 ± 0,19 0,76 ± 0,13 0,55 ± 0,09 0,0049 ± 0,0011
(#50 mm2; Valores médios ± DP são mostrados. n = 10 réplicas biológicas).
Uma vez que a violaxantina e a luteína são consideradas necessárias para o enovelamento dos complexos antena, e o β-caroteno foi considerado necessário para a montagem do PSII e a atividade fotossintética, analisamos o efeito de sua ausência na composição e organização do aparato fotossintético. A eletroforese em gel 2D (Figura 2) e as análises de imunoblot (Figura 2—suplemento da figura 1) de membranas tilacoides mostram que todas as principais proteínas fotossintéticas estão presentes nas plantas Asta, mas a razão PSII/PSI é muito maior do que no WT (Figura 2—suplemento da figura 1). A razão LHC/PSII, no entanto, é semelhante, exceto pela proteína antena Lhcb5 que está fortemente reduzida, e pela PsbS, a principal proteína envolvida no NPQ, que está aumentada no mutante (Figura 2—suplemento da figura 1). PSI-LHCI, ATP sintase e citocromo b6f têm a mesma mobilidade em géis nativos que os complexos do WT, indicando que são estáveis e possuem a mesma organização supramolecular. Em contraste, a estabilidade do PSII parece ser afetada, pois as bandas correspondentes aos supercomplexos de PSII e aos trímeros de LHCII, que são bem definidas no WT, são substituídas por um borrão no mutante, sugerindo que os complexos de PSII são mais heterogêneos, montados de forma incompleta ou menos estáveis do que no WT (Figura 2).
Comparação da composição proteica de plantas WT e Asta.
(A) Imunoblot com anticorpos contra PsaB (subunidade do PSI) e PsbC (subunidade do PSII) para determinar a razão PSI/PSII. Tilacoides equivalentes a 0,5, 1,2 e 1,9 μg (da esquerda para a direita) de Chl foram carregados nas três canaletas. A razão PSII/PSI no mutante foi normalizada para a razão PSII/PSI do WT. (B) Quantidade relativa de LHC. A quantidade de cada Lhc foi determinada pelos imunoblottings mostrados em (C). Os valores são normalizados para uma das proteínas do core (PsbC para Lhcbs e PsaB para Lhcas que foram usadas como padrões internos em todos os blots) e depois duplamente normalizados para o seu nível no WT (Média ± DP são mostradas, n = 3 ou quatro réplicas técnicas). (C) Membranas tilacoides contendo 0,5–2,5 μg de Chl foram carregadas em cada canaleta. As Lhc e as proteínas do core foram detectadas na mesma membrana, que foi revelada com os dois anticorpos. Sinais saturados foram excluídos da análise.
Composição proteica e organização supramolecular dos complexos fotossintéticos em plantas WT e Asta.
(A) Tilacoides foram solubilizados com 1% α-DDM e carregados em um gel nativo-azul. Segunda dimensão SDS-PAGE do WT (B) e do mutante Asta (C). A análise de imunoblotting é mostrada na Figura 2—suplemento da figura 1.
Em seguida, investigamos os efeitos da mudança na composição de carotenoides nas propriedades dos complexos individuais que foram isolados das membranas dos tilacoides e separados por ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose (Figura 3—suplemento da figura 1). A análise de pigmentos (Tabela 2 e Figura 3—suplemento da figura 2) confirmou que a astaxantina é o único carotenoide associado a todos os complexos de ligação de pigmentos em plantas Asta, enquanto o β-caroteno está presente no PSI em uma quantidade altamente subestequiométrica (0,15 moléculas de β-caroteno por complexo) e está virtualmente ausente no PSII (0,03 moléculas por complexo). Isso significa que a maioria dos complexos de PSI e PSII nas plantas mutantes não contém β-caroteno. Normalizados para Chl, os Asta-LHCs contêm o mesmo número de carotenoides que os monômeros do tipo selvagem (WT), mas, em vez de ligar luteína, neoxantina e violaxantina, eles ligam apenas astaxantina, indicando que todos os sítios de ligação de carotenoides são promíscuos e podem acomodar diferentes xantofilas. A análise de pigmentos também mostrou que o β-caroteno pode ser substituído por astaxantina tanto nos núcleos do PSII quanto do PSI. No entanto, a maior razão Chl/car nos complexos Asta isolados em comparação com os complexos WT indica que nem todos os sítios que são ocupados por β-caroteno no WT são ocupados por astaxantina nos complexos mutantes, mas alguns são deixados 'vazios', ou seja, não são ocupados por carotenoides. Embora não possamos excluir a possibilidade de que algumas moléculas de astaxantina estejam mais fracamente ligadas e, portanto, sejam perdidas durante a purificação, o fato de que tanto os complexos de PSI quanto de PSII podem ser purificados com um grande número de sítios 'vazios' indica que sua ocupação por carotenoides não é crucial para a estabilidade dos complexos.
Composição de pigmentos de complexos tilacoidais isolados.
Amostras Chl a/b Chl/car Lute+neo+viola β-caro Asta e seus produtos de bypass Chls totais* Monômeros WT Lhcb 2,41 ± 0,01 4,1 ± 0,03 2,86 ± 0,01 0,06 ± 0,01 n.d. 12 Trímero WT LHCII 1,40 ± 0,00 3,60 ± 0,01 3,90 ± 0,01 n.d. n.d. 14 Monômero Asta-Lhcb 1,48 ± 0,01 4,50 ± 0,03 n.d. n.d. 3,1 ± 0,02 14 WT PSII 8,88 ± 0,12 5,00 ± 0,02 3,47 ± 0,08 3,93 ± 0,08 n.d. 37 Asta PSII 7,74 ± 0,27 8,90 ± 0,17 n.d. 0,03 ± 0,01 4,12 ± 0,01 37 WT PSI-LHCI 9,29 ± 0,12 4,60 ± 0,02 14,37 ± 0,16 19,56 ± 0,16 n.d. 156 Asta-PSI-LHCI 5,44 ± 0,19 8,10 ± 0,18 n.d. 0,15 ± 0,03 19,11 ± 0,03 156
*Chls totais são baseados em valores relatados na literatura para os complexos WT. Os cromatogramas são mostrados na Figura 3—suplemento da figura 2. (Valores médios ± DP são mostrados. n ≥ 3 réplicas biológicas, n.d. = não detectado).
Curiosamente, os espectros de absorção (Figura 3—suplemento da Figura 3A) e dicroísmo circular (Figura 3—suplemento da Figura 3B) dos complexos LHC e do núcleo do PSII do tipo selvagem e do mutante são muito semelhantes (veja a Figura 3—suplemento da Figura 3 para uma explicação mais detalhada) nas regiões de absorção de Chl. Isso indica que não há mudanças significativas na organização dos pigmentos dos complexos e, portanto, em sua estrutura tridimensional. A única exceção é o Asta-PSI-LHCI, cuja emissão de fluorescência apresentou um deslocamento de 6 nm para comprimentos de onda mais curtos em comparação com o complexo do tipo selvagem (Figura 3—suplemento da Figura 3C e Figura 3—suplemento da Figura 4). Como a emissão do PSI a 77 K se origina principalmente de duas Chls específicas (chamadas Chls de vermelho distante) de Lhca3 e Lhca4, podemos concluir que a interação entre essas Chls está ligeiramente alterada no mutante.
Os carotenoides são conhecidos por serem necessários para a estabilidade das holoproteínas de ligação a pigmentos. Nossos dados medidos nos complexos isolados mostram que a diferença na composição entre os complexos do tipo selvagem e do mutante influencia a temperatura de desnaturação em apenas 5–10°C (Figura 3A). Isso é surpreendente, considerando que vários dos sítios de ligação de carotenoides no PSI e PSII isolados não estão ocupados por carotenoides e indica que apenas alguns deles desempenham um papel crucial na estabilidade proteica.
Isolamento de complexos fotossintéticos.
(A) Tilacoides equivalentes a 0,2 mg de Chl total foram solubilizados com 0,6% de α-DDM, carregados em um gradiente de densidade de sacarose e separados por centrifugação. (B) Análise por SDS-PAGE das bandas dos gradientes de sacarose. Espectros de absorção de todas as bandas do WT (C) e Asta (D). Os espectros são normalizados ao máximo na região Qy.
Análise de pigmentos.
(A) Os perfis cromatográficos foram registrados a 440 nm com largura de banda de 4 nm e normalizados ao pico de Chl a. (Neo: neoxantina, Vio: violaxantina, Lut: luteína, β-Car: β-caroteno, 4-ceto: 4-cetoantéraxantina, Ast: astaxantina, Ado: adonixantina, Can: cantaxantina). A presença de Chl b no núcleo do PSII é resultado de alguma contaminação de Lhcbs na preparação. (B) Zoom na área de β-Car do painel A. Observe a diferença de escala entre o cromatograma do WT e o do mutante para os complexos PSI e PSII. (C e D) Exemplos de ajuste do espectro de absorção do extrato de acetona com os espectros dos pigmentos individuais. (C) Tilacoides de folhas jovens do mutante. (D) Asta-LHCs. Os espectros medidos em acetona 80%.
Espectros de absorção, DC e fluorescência a 77K de complexos isolados do WT (preto) e Asta (vermelho).
(A) Espectros de absorção de Lhcb, núcleo do PSII e PSI. Os espectros são normalizados ao máximo na região Qy. (B) Espectros de CD de Lhcb monomérico, núcleo do PSII e PSI-LHCI. (C) Emissão de fluorescência de Lhcb monomérico, núcleo do PSII e PSI-LHCI a 77 K. Todos os espectros são muito semelhantes na região dominada pela absorção das Chls (600–800 nm), enquanto diferem na região dominada pela absorção dos carotenoides (450–550 nm) devido às diferentes propriedades espectroscópicas da astaxantina em comparação com os carotenoides presentes no WT. As pequenas diferenças em torno de 650 nm nos espectros do Lhcb devem-se à presença de uma quantidade maior de LHCII na fração monomérica de Lhcb de plantas Asta em comparação com o WT. Como o LHCII tem um teor relativamente maior de Chl b em comparação com as antenas menores, o sinal devido à Chl b (650 nm) é mais intenso. As diferenças nos espectros de emissão do PSII e PSI devem-se à contaminação, nomeadamente a presença de uma pequena quantidade de PSI na preparação de PSII e de PSII na preparação de PSI, que também é visível no SDS-PAGE (Figura 2—suplemento da figura 1).
Espectros de emissão de fluorescência de tilacoides a 77 K.
Os espectros são normalizados ao máximo.
Espectros originais de CD (A) e absorção (B).
(A) Desnaturação e (B) fotobranqueamento.
Estabilidade térmica e fotoestabilidade de complexos fotossintéticos.
(A) A desnaturação térmica foi monitorada acompanhando os sinais de CD na região Qy (Lhcb: 610–700 nm, núcleo do PSII: 640–700 nm, PSI-LHCI: 675–735 nm) a temperatura crescente. (B) O fotobranqueamento é medido como a diminuição na absorção da área na região Qy (600–750 nm) em função da duração do tratamento com luz intensa (Valores médios ± DP são mostrados para n = 3 réplicas técnicas.). A purificação dos complexos é mostrada na Figura 3—suplemento da figura 1. A análise de pigmentos dos complexos purificados é mostrada na Figura 3—suplemento da figura 2. Os espectros de absorção, CD e emissão de fluorescência dos complexos são mostrados na Figura 3—suplemento da figura 3; para comparação, os espectros de fluorescência dos tilacoides são mostrados na Figura 3—suplemento da figura 4. Os dados brutos utilizados para esta figura são fornecidos na Figura 3—suplemento da figura 5.
A fotoproteção via supressão de tripleto de Chl e eliminação de oxigênio singleto é o papel principal dos carotenoides na fotossíntese. Experimentos de fotobranqueamento (Figura 3B) mostram que, embora a fotoestabilidade dos LHCs e do núcleo do PSII seja apenas parcialmente afetada pela mudança na composição de carotenoides, Asta-PSI-LHCI é muito mais sensível à luz do que o complexo WT. É provável que esse efeito no PSI seja devido ao número reduzido de moléculas de carotenoides associadas ao complexo, o que resulta em uma supressão de tripleto de Chl menos eficiente. No entanto, vale notar que, mesmo com uma grande parte dos sítios de ligação de carotenoides não ocupada por carotenoides, o PSI é mais fotoestável que o PSII-WT, de acordo com o fato de que, no PSII, os carotenoides não podem fornecer proteção eliminando o oxigênio singleto formado via tripleto de P680 devido ao potencial oxidante muito alto do PSII.
Em seguida, investigamos o efeito da substituição de carotenos por astaxantina nas propriedades de captação de luz e aprisionamento dos complexos fotossintéticos in vivo, realizando medidas de fluorescência com resolução temporal a 20°C em folhas intactas (Figura 4 e Figura 4—suplemento da figura 1). A cinética do PSI é muito similar no WT (70 ps) e no mutante (65 ps), e a pequena diferença pode ser atribuída ao teor reduzido de Chl de vermelho-distante de Asta-PSI-LHCI, que é conhecido por influenciar o tempo de aprisionamento do PSI. A cinética do PSII nas folhas mutantes muda na presença versus ausência de fotoquímica (medições realizadas com o centro de reação (RC) aberto e fechado, respectivamente) assim como no WT, indicando que a transferência de energia de excitação ocorre no mutante e a energia captada é usada para fotoquímica. No entanto, todas as cinéticas são mais rápidas e a diferença entre RC fechado e aberto é menor nas folhas mutantes do que nas WT, sugerindo que os complexos antena das plantas mutantes são suprimidos estaticamente in vivo. Medições em Asta-Lhcb isolado mostram que este é realmente o caso: esses complexos são fortemente suprimidos (tempo de vida de 0,87 ns vs. 3,5 ns no WT; Figura 4—suplemento da figura 2) devido à presença de astaxantina. Também foi demonstrado que parte da população de astaxantina pode transferir energia de excitação para as clorofilas, atuando assim também como pigmento captador de luz.
Resultados da fluorescência com resolução temporal de folhas de WT (A e B) e Asta (C e D).
Folhas de tabaco foram medidas em dois estados de fluorescência diferentes: na presença (correspondente ao estado FO; A, C) e na ausência (estado FM; B, D) de fotoquímica. (A, B) Espectros associados ao decaimento (DAS) de folhas WT. (C, D) DAS de folhas Asta.
Traços de decaimento de fluorescência com resolução temporal de Lhcb.
(A) Curvas de decaimento de fluorescência de Lhcb WT (preto) e Asta-Lhcb (vermelho) sob excitação a 468 nm e detecção a 680 nm. (B) Tempos de vida de Lhcs monoméricos de plantas WT e mutantes. (Valores médios (\pm) DP são mostrados para n = 3 réplicas técnicas.)
Traços de decaimento de fluorescência normalizados medidos à temperatura ambiente em folhas WT e Asta na presença (F0) ou ausência (FM) de fotoquímica.
A fluorescência foi detectada em (A) λ = 685 nm e (B) λ = 720 nm, respectivamente. Observe que, embora o decaimento em 680 nm seja dominado pelo PSII e em 720 nm pelo PSI, ambos os complexos contribuem para o decaimento em ambos os comprimentos de onda (veja a Figura 4—suplemento da figura 1 para a análise do conjunto completo de dados com resolução espectral). O decaimento de fluorescência e a análise do LHCII purificado são mostrados na Figura 4—suplemento da figura 2.
A presença de transferência de energia de excitação da antena para o CR em folhas mutantes indica que, embora as interações entre os blocos de construção do supercomplexo do PSII não sejam fortes o suficiente para sobreviver à purificação (veja a Figura 2), os supercomplexos são funcionais in vivo, o que significa que, na membrana, as subunidades estão próximas o suficiente umas das outras para garantir a entrega da energia capturada ao centro de reação. De fato, o curto tempo de vida do estado excitado da antena (indicativo de uma antena constitutivamente suprimida) no mutante pode explicar totalmente a menor eficiência quântica máxima do PSII (FV/FM; Tabela 3) em plantas mutantes, que é principalmente o resultado da baixa emissão de fluorescência na ausência de fotoquímica (FM).
Parâmetros do fotossistema II in vivo.
FV/FM* Razão PSII:PSI (ECS)# Tamanho da antena PSII:PSI (ECS)# Tamanho relativo da antena do PSII (fluorescência)§§ WT 0,82 ± 0,01 1,09 ± 0,12 1 ± 0,59 1 ± 0,04 Asta 0,43 ± 0,03 2,6 ± 0,33 0,33 ± 0,05 0,33 ± 0,02
(Valores médios ± DP são mostrados. *n = 15, #n = 4, §§n = 3 folhas/plantas).
Finalmente, analisamos o desempenho fotossintético das plantas Asta. O deslocamento eletrocrômico (ECS) da absorção de carotenoides é comumente usado para estudar a função de todos os principais complexos fotossintéticos. Verificamos que as plantas mutantes exibem um sinal de ECS e determinamos seu espectro de diferença induzido por luz, que concordou com a previsão de que a astaxantina é a única responsável por esse efeito Stark in vivo (Figura 5—suplemento da figura 1). Usando ECS, observamos que a razão funcional PSII/PSI CR era muito maior no mutante do que no WT, em concordância qualitativa com nossos dados bioquímicos (Tabela 3; Figura 2—suplemento da figura 1). A diferença nos valores obtidos com os dois métodos se deve parcialmente ao poder quantitativo limitado dos imunoblots, mas também sugere que alguns dos núcleos do PSII não são funcionais. A alta razão PSII/PSI no mutante parece ser um mecanismo de compensação para a diminuição no tamanho relativo funcional da antena PSII/PSI (medido com dois métodos independentes; Tabela 3 e Figura 5—suplemento da figura 2) observada nas plantas Asta, que é devida à presença de supressão estática.
De fato, a comparação dos rendimentos fotoquímicos em estado estacionário do PSII e PSI revelou que, em todas as intensidades de luz, tanto em plantas WT quanto mutantes, o equilíbrio entre a fotoquímica do PSII e PSI é mantido (Figura 5A e Figura 5—suplementos de figura 3 e 4), significando que as plantas são capazes de compensar a forte diminuição no tamanho funcional da antena do PSII ao diminuir a razão PSI/PSII. Isso significa que essas plantas têm a capacidade de modular a razão PSI/PSII em uma ampla faixa dinâmica. Finalmente, as cinéticas transitórias de redução e reoxidação da QA sugerem que não ocorrem diferenças significativas na transferência de elétrons do PSII nas plantas mutantes (Figura 5—suplementos de figura 2 e 5).
Deslocamento eletrocrômico: mudanças de absorção induzidas pela formação de um campo elétrico transtilacoide (Δψ) in vivo em plantas Asta.
O pico em ~550 nm é deslocado para o vermelho em comparação com plantas com sementes e algas. (Valores médios ± DP são mostrados para n = 3 folhas, réplicas biológicas.).
Dependência da intensidade luminosa (µE m−2 s−1 de luz vermelha) dos transientes OJIP de três tipos de folhas de tabaco.
(A) WT. (B) Asta. As inserções mostram os mesmos dados, mas em escalas comparáveis para ilustrar o efeito dramático da presença de astaxantina na intensidade da fluorescência variável. Todos os transientes foram normalizados para F0. Os valores de F0 das folhas eram aproximadamente os mesmos. O mutante Asta apresenta todos os pontos característicos da curva OJIP, tem uma dependência luminosa semelhante da cinética do PSII e mostra uma área comparável acima dos traços de fluorescência normalizados. Todas essas observações indicam que a função do PSII e as características da cadeia de transporte de elétrons fotossintética são amplamente semelhantes ao WT. No entanto, devido às diferenças na captação de luz entre o WT e o mutante, a comparação quantitativa desses traços é impossível, pois o tamanho funcional da antena está alterado. Além disso, a quantidade de aceptores de elétrons do PSII e a estrutura das membranas dos tilacoides não foram medidas em plantas Asta, e ambos os parâmetros também influenciarão as curvas OJIP. O tamanho funcional da antena do PSII (Tabela 3 no texto principal) foi medido como a inclinação da dependência da intensidade luminosa do ponto temporal de 300 µs e normalizado para o valor inicial de fluorescência (F300µs/F0) .
qP (A) e qL (B) em função da intensidade luminosa em folhas WT e Asta.
(Valores médios ± DP são mostrados para n = 3 folhas/plantas, réplicas biológicas.).
Relação entre o extinção fotoquímica (qP) e ΦPSI medida em várias intensidades luminosas (70–1030 μmol fótons m−2 s−1).
Cinética de reoxidação da QA-.
A figura mostra o curso temporal da reoxidação do aceptor primário estável de elétrons do PSII, QA-, durante o período de escuro após um pulso saturante. A fluorescência foi medida entre 0,1 e 600 s de escuro após uma exposição de 500 ms a 3500 µE m−2 s−1 de luz vermelha. A diminuição da fluorescência foi recalculada para representar a concentração de QA- (ver Materiais e métodos para detalhes).
Dependência do NPQ em relação à luz.
O NPQ de estado estacionário (10 min de iluminação em cada intensidade luminosa) é plotado em função da intensidade da luz actínica para ambas as plantas WT e Asta. Ambas as linhas mostram uma forma sigmoidal similar da barra de capacidade de NPQ para a amplitude do NPQ induzido pela luz, que é vastamente diminuída nas plantas mutantes. (Valores médios ± DP são mostrados para n = 3 folhas/plantas, réplicas biológicas.)
NPQ(t) em WT e mutante Asta.
Valores de NPQ da Figura 5b foram usados para calcular NPQ(T), um parâmetro que corrige a amplitude aparente do NPQ para a presença de um supressor constitutivo. A taxa deste supressão constitutiva é derivada da diminuição do valor de FV/FM no mutante, assumindo que a totalidade do efeito sobre FV/FM se deve a esta dissipação extra de energia. Note que uma pequena quantidade de QA reduzida no escuro leva a uma superestimação de F0 e diminui significativamente a amplitude de NPQ(T) (n = 3 réplicas biológicas).
Desempenho fotossintético e fotoproteção.
(A) Relação entre qL e ΦPSI medida em várias intensidades luminosas (70–1030 μmol fótons m−2 s−1). (B) Cinética de NPQ após transição do escuro para a luz (seta para cima,) e posterior relaxamento no escuro (seta para baixo). Valores médios ± DP são mostrados para n = 3 folhas/plantas. O inset mostra cinética normalizada pela amplitude. Veja também a Figura 5—suplementos de figura 1–7.
A capacidade operacional completa da cadeia de transporte de elétrons nos permitiu verificar se a regulação fotoprotetora é mantida nas plantas mutantes. Como esperado, a amplitude do NPQ foi amplamente reduzida no mutante (Figura 5B e Figura 5—suplemento de figura 6), porque o supressão induzida por ΔpH e dependente de PsbS tem que competir com o forte supressão constitutiva de astaxantina nessas plantas. Note que a diferença no nível de NPQ (1,8 no WT vs. 0,3 no mutante) pode ser totalmente atribuída à presença do supressor estático no mutante, que reduz fortemente a fluorescência máxima tanto no escuro (FM) quanto na luz (FM’). Isso é apoiado pelo cálculo de NPQ(t), que permite corrigir o NPQ aparente para a presença de um supressão pré-existente, assumindo que uma diminuição do valor de FV/FM é devida unicamente a este supressão estático. Os dados mostram que NPQ(t) é ainda maior no mutante do que no WT (Figura 5—suplemento de figura 7).
Importante notar que, apesar da diferença na amplitude aparente do NPQ, as cinéticas de início e recuperação são idênticas às do WT (inserção na Figura 5B) e consistentes com as características do qE. Esse resultado é particularmente impressionante se considerarmos que as plantas Asta carecem tanto de luteína quanto de zeaxantina, que são consideradas essenciais para o NPQ. É provável que a alta quantidade de PsbS no mutante (Figura 2—suplemento da figura 1) possa compensar a falta do ciclo das xantofilas, ou que a astaxantina também possa ser responsável pelo quenching dinâmico. Seja qual for a razão para a presença de NPQ no mutante, nossas plantas Asta mostram claramente que a luteína e a zeaxantina não são absolutamente necessárias para ele.
Em resumo, mostramos que os sítios de ligação de carotenoides dos complexos centrais do PSI e PSII são promíscuos. Embora eles liguem carotenos em todos os organismos fotossintéticos conhecidos, nossos dados demonstram que eles também podem acomodar xantofilas. Isso difere dos LHCs, que podem ligar várias xantofilas, mas não conseguem se enovelar com carotenos. Mais importante, mostramos que tanto o PSI quanto o PSII são estáveis enquanto a maioria de seus sítios de ligação de carotenoides não está ocupada por carotenoides e o restante está ocupado por uma xantofila alienígena. Esses resultados indicam que os complexos centrais são ainda mais robustos do que as antenas externas e podem suportar mudanças radicais até mesmo em um de seus componentes principais. A esse respeito, é importante perceber que a diferença na taxa de crescimento entre plantas WT e mutantes não se deve à ausência de carotenos, mas sim à presença de astaxantina que estabiliza os LHCs em uma conformação suprimida (quenching). Em conclusão, a substituição de carotenos pela xantofila astaxantina não prejudica a montagem funcional do aparato fotossintético, nem impede a transferência eficiente de elétrons e o NPQ, demonstrando que os carotenos não são essenciais nem para a biossíntese do aparato fotossintético nem para sua função. Essa descoberta tem implicações importantes não apenas para nossa compreensão da estrutura e função do aparato fotossintético, mas também para futuros esforços de projetar fotossistemas sintéticos com propriedades novas e melhoradas.
Materiais e métodos
Crescimento do tabaco e isolamento de tilacoides
Sementes de plantas mutantes e WT foram semeadas em papel filtro umedecido e sincronizadas a 4°C por 2–3 dias antes de serem transferidas para temperatura ambiente até a germinação. As plântulas foram transferidas para solo e cultivadas a 22°C sob 150–200 μmol de fótons m−2 s−1 para as WT e 80–120 μmol de fótons m−2 s−1 para as mutantes, com 14 h de luz por dia. As plantas foram adubadas semanalmente com fertilizante comercial. Folhas de plantas WT (5–6 semanas de idade) e Asta (cerca de 20 semanas para folhas mais jovens, 24–30 semanas para folhas mais velhas) foram utilizadas para medições fisiológicas e isolamento de tilacoides. O isolamento de tilacoides de WT foi realizado conforme descrito em. A velocidade da centrífuga foi aumentada para 4000 g na primeira etapa do isolamento de tabaco mutante.
Análise de pigmentos
Pigmentos de complexos proteína-pigmento isolados ou de folhas foram extraídos com acetona a 80%. A HPLC foi realizada conforme em, com a modificação de que o tampão B foi aumentado linearmente de 0 a 100% em 9,2 min. As razões clorofila a/b e clorofila/carotenoide foram calculadas ajustando seus espectros de absorção individuais aos espectros medidos. Exemplos do ajuste de tilacoides totais e Lhcbs isolados são mostrados na Figura 3—suplemento da figura 2, painéis C e D.
Eletroforese em gel Blue-native, SDS-PAGE, imunotransferência e centrifugação em gradiente de densidade de sacarose
Os géis Blue-native foram realizados conforme descrito em, com as modificações descritas em. A segunda dimensão e a SDS-PAGE foram realizadas conforme descrito em.
Para análise de imunotransferência, extratos proteicos totais foram separados por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose Protran de 0,45 mm. Anticorpos primários específicos (Agrisera) foram utilizados para detectar as proteínas alvo. A quimioluminescência foi detectada usando um sistema de imageamento ImageQuant LAS 4000.
Para o fracionamento em gradiente de densidade de sacarose, tilacoides equivalentes a 0,2 mg de clorofila total foram lavados com EDTA 5 mM e ressuspensos em 200 μL de Hepes 10 mM (pH 7,5). Um volume igual de α-DDM a 1,2% foi adicionado, misturado suavemente, e os tilacoides solubilizados foram centrifugados a 14.000 rpm por 10 min a 4°C. O sobrenadante foi carregado em um gradiente de sacarose 0–1 M (Hepes 10 mM, pH 7,5, α-DDM a 0,03%) e centrifugado a 288.000 g por 17 h. As bandas separadas foram coletadas com uma seringa.
Medições espectroscópicas de estado estacionário
Absorção e DC
Os espectros de absorção foram medidos à temperatura ambiente com um espectrofotômetro Varian Cary 4000 UV-Vis. Os espectros de DC foram registrados usando um espectropolarímetro Chirascan-Plus (Applied Photophysics) a 20°C. A DO das amostras foi de 0,8–1/cm no máximo da região Qy.
Emissão de fluorescência a 77 K
Espectros de emissão de fluorescência a baixa temperatura foram registrados usando um espectrofluorímetro Fluorolog 3.22 (Jobin Yvon-Spex). Para medições a 77 K, um dispositivo caseiro resfriado com nitrogênio líquido foi utilizado. As amostras foram excitadas a 440 nm e a emissão de fluorescência foi detectada na faixa de 600–800 nm. As larguras das fendas de excitação e emissão foram ajustadas para 3 nm.
Todas as medições foram realizadas nos mesmos tampões utilizados para os gradientes de sacarose.
Fotobranqueamento e estabilidade proteica
Fotobranqueamento
As amostras foram diluídas para uma absorbância de cerca de 0,8 no máximo na região Qy. Os complexos proteína-pigmento foram iluminados com luz branca (7100 μmol de fótons m−2 s−1) de uma lâmpada halógena com braço de fibra óptica. Após cada intervalo, a cubeta foi removida do feixe de luz e os espectros de absorção foram registrados com um espectrofotômetro Varian Cary 4000 UV-Vis na faixa entre 600 e 750 nm.
Estabilidade proteica
A estabilidade dos complexos isolados foi testada medindo a curva de desnaturação térmica obtida monitorando as mudanças nos espectros de CD na região Qy enquanto a temperatura era aumentada de 20 a 90°C. Uma amostra de 400 μL com OD 0,8 no máximo na região Qy foi utilizada nesta medição.
Medições de fluorescência resolvida no tempo in vivo
Medições de fluorescência resolvida no tempo em folhas foram realizadas usando um sistema de contagem de fótons únicos correlacionados no tempo (TCSPC) conforme descrito anteriormente. A excitação em 650 nm foi usada para excitar preferencialmente a Chl b. Folhas de plantas destacadas foram colocadas entre duas placas de vidro e montadas na cubeta de rotação (diâmetro: 10 cm; espessura: 1 mm). A cubeta foi girada a 1400 rpm enquanto oscilava lateralmente. A fluorescência foi medida em um arranjo de face frontal a partir do lado superior das folhas. Os decaimentos de fluorescência resolvida no tempo foram medidos em múltiplos comprimentos de onda de detecção (entre 675 e 690 nm com um passo de comprimento de onda de 5 nm, e entre 700 e 760 nm com um passo de comprimento de onda máximo de 10 nm). As medições foram realizadas na presença e na ausência de fotoquímica do PSII (estados aberto (F0) e fechado (FM), respectivamente).
F0 foi medido em completa escuridão após adaptação ao escuro durante a noite. A taxa de repetição foi então reduzida por um Pulse Picker (Spectra Physics) de 40 para 0,8 MHz. A potência de excitação foi de 20 μW. Verificações preliminares com diferentes potências e taxas de repetição foram realizadas para garantir que os centros de reação (RCs) do PSII permanecessem de fato abertos durante a medição.
Para medir folhas com RCs do PSII fechados (FM), as folhas foram incubadas por 12 horas em sacarose (0,3 M) com adição de 50 μM de 3-(3,4-diclorofenil)−1,1-dimetilureia (DCMU). Para alcançar o fechamento completo dos RCs do PSII durante a medição, luz LED azul adicional de baixa intensidade (∼50 μmol de fótons·m−2·s−1) foi usada para pré-iluminar as folhas imediatamente antes da detecção do sinal. A taxa de repetição foi reduzida por um Pulse Picker de 40 MHz para 4 MHz. A potência de excitação foi de 100 μW.
O tempo de medição em um único comprimento de onda foi limitado a 10 minutos, para evitar alterações nas folhas devido à medição prolongada na cubeta rotatória. Realizar um experimento em um estado levou de 2 a 3 horas. Todas as medições in vivo foram realizadas a 20°C. Os traçados de decaimento de fluorescência obtidos foram analisados globalmente com o 'Pacote de Processamento de Dados TRFA' do Centro de Tecnologias de Software Científico (Universidade Estadual da Bielorrússia, Minsk, Bielorrússia). A metodologia de análise global está descrita em. Resumidamente, um número de componentes cinéticos paralelos e não interagentes foi usado como modelo cinético, então o conjunto total de dados foi ajustado com a função f (t, λ) da seguinte forma: onde o espectro associado ao decaimento (DASi) é o fator de amplitude associado a um componente de decaimento i com tempo de vida de decaimento τi, e irf(t, λ) foi medido usando luz espalhada. Valores típicos de largura total à meia altura (FWHM) foram de 28 ± 2 ps.
Medição de fluorescência resolvida no tempo in vitro
Medições de fluorescência resolvida no tempo em LHCII isolado foram realizadas em um sistema FluoTime200 (Picoquant). As amostras foram diluídas para uma DO de 0,05 cm⁻¹ no máximo na região Qy e medidas em uma cubeta de 3,5 mL com caminho óptico de 1 cm a 283 K. A excitação foi fornecida por um diodo laser de 468 nm (excitação preferencial de Chl b) operando a uma taxa de repetição de 10 MHz. A função de resposta do instrumento (IRF) foi obtida medindo o decaimento de um corante iodeto de pinacianol dissolvido em metanol, que possui um tempo de vida de fluorescência de seis ps. A FWHM resultante da IRF foi de ∼88 ps. A cinética de decaimento da fluorescência foi detectada a 680 nm com um espaçamento temporal de canal de 8 ps. A análise dos dados foi realizada pelo software TRFA DATA conforme descrito acima.
Medições baseadas em ECS
O espectro de diferença induzido por luz do ECS foi determinado de acordo com o uso de um espectrofotômetro JTS-10 (BioLogic, Grenoble, França). Resumidamente, a folha foi submetida a um pulso saturante de luz vermelha (3000 µmol fótons m⁻² s⁻¹; 80 ms), e as mudanças de absorção em cada comprimento de onda após o pulso foram registradas sem luz actínica adicional. A linha de base obtida sem o pulso saturante foi subtraída, e os valores entre 100 e 200 ms após o pulso (para evitar a contribuição de sinais devido a mudanças redox rápidas dos citocromos) foram calculados como média. O espectro obtido corresponde de perto ao espectro ECS teórico da astaxantina pura, que é [1-()] da solução de astaxantina-detergente.
A razão RC PSII:PSI foi determinada usando o espectrofotômetro JTS-10 com flashes laser saturantes de turnover único (cinco ns de duração) fornecidos por um laser de corante bombeado por um laser Nd:YAG (Minilite, Continuum) usando o protocolo descrito em, mas adaptado para folhas. Para o sinal PSII+PSI, a folha foi infiltrada com água, e para obter um sinal PSI puro, a folha foi infiltrada com hidroxilamina (HA, 1 mM) e 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilureia (DCMU, 10 µM; ambos da Sigma), após verificação sistemática de que nenhuma fluorescência variável, e portanto atividade do PSII, permanecia na folha. O ECS foi detectado a 546 nm (Asta) e 520–546 nm (WT) usando pulsos de LED de luz branca fraca filtrados com um filtro de interferência de 10 nm de FWHM. A amplitude de pico a 546 nm permite a detecção no ponto isosbéstico dos hemas do cit. b6f. O tamanho funcional da antena foi medido conforme descrito em, mas com 300 µmol fótons m−2 s−1 de luz actínica vermelha (pico de 630 nm) e luz de detecção conforme descrito acima. As quantidades de PSII ativo foram corrigidas para os ~20% de CRs de abertura lenta que se acumulam após a luz actínica.
Medidas de parâmetros fotossintéticos
Estado redox do PSI e PSII
Plantas adaptadas ao escuro foram medidas com um Dual-PAM-100 (Walz) para registrar qL e P700 em diferentes intensidades de luz actínica (70–1030 μmol fótons·m−2·s−1). Folhas adaptadas ao escuro durante a noite foram iluminadas por 10 min para atingir um estado estacionário. O sinal de absorbância a 820 nm corrigido para mudanças de absorbância a 870 nm foi usado para a análise da cinética do P700. O qL foi calculado conforme.
NPQ
Plantas adaptadas ao escuro foram medidas por um Dual-PAM-100 (Walz) com uma luz de medição modulada de 7 μmol fótons m−2 s−1 para manter os centros de reação no estado aberto, e um pulso saturante de 4000 μmol fótons m−2 s−1 (500 ms) para fechar os centros de reação. Luz actínica de 531 μmol fótons m−2 s−1 foi usada para induzir o NPQ. O NPQ(T) foi calculado conforme descrito em.
OJIP
Um HandyPEA (Hansatech Instruments Ltd, Reino Unido) foi utilizado para medir a indução de fluorescência durante uma transição do escuro para a luz. Três LEDs vermelhos (intensidade de pico em ~650 nm) foram usados como fonte de luz, fornecendo aproximadamente 3500 µmol de fótons m−2 s−1 na superfície da folha. O HandyPEA mediu a intensidade de fluorescência emitida em resposta à luz actínica. Nenhuma luz de medição foi usada e entre os pulsos não havia luz. Para corrigir diferenças na intensidade de fluorescência devido a diferenças na intensidade da luz actínica, os valores de fluorescência medidos foram divididos por F0 (= F20µs). Plantas de tabaco foram retiradas da câmara de crescimento ao final da noite e mantidas em escuridão quase total por pelo menos uma hora antes de clipes foliares serem fixados em um conjunto de 10 folhas. Essas folhas foram medidas repetidamente durante o experimento, com 10–15 minutos de escuro entre as medições. Dois tipos de medições foram realizados. Para estimar o tamanho efetivo da antena do PSII, as folhas foram iluminadas com intensidades de luz de 3500 a 200 µmol de fótons m−2 s−1, começando na intensidade de luz mais alta. Para caracterizar as propriedades de reoxidação do PSII e do restante da cadeia de transporte de elétrons fotossintético, dois pulsos fortes de luz (0,5 s, 3500 µmol de fótons m−2 s−1) foram dados às folhas com um intervalo Δt, com Δt entre 0,1 e 200 s.
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Este artigo foi apoiado pelas seguintes bolsas:
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para Roberta Croce.
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10.7554/eLife.58984.sa1
Carta de decisão
Kramer
David M
Kramer
David M
Tiede
David
Telfer
Alison
No interesse da transparência, a eLife publica as solicitações de revisão mais substantivas e as respostas dos autores que as acompanham.
Resumo de aceitação:
Conforme indicado por todos os revisores, o trabalho é muito interessante e tem amplas implicações para a importância do caroteno e dos carotenoides na fotossíntese. A versão revisada abordou todas as questões e quase todas as sugestões propostas pelos revisores. Antecipa-se que esta publicação inspirará trabalhos adicionais que cubram as incógnitas restantes.
Carta de decisão após revisão por pares:
Obrigado por submeter seu artigo "β-caroteno não é essencial para a fotossíntese em plantas superiores" para consideração pela eLife. Seu artigo foi revisado por três revisores pares, incluindo David M Kramer como Editor Revisor e Revisor
#1, e a avaliação foi supervisionada por Christian Hardtke como Editor Sênior. Os seguintes indivíduos envolvidos na revisão da sua submissão concordaram em revelar sua identidade: David Tiede (Revisor #2); Alison Telfer (Revisor #3).
Os revisores discutiram as revisões entre si e o Editor Revisor redigiu esta decisão para ajudá-lo a preparar uma submissão revisada.
Gostaríamos de chamar sua atenção para as mudanças em nossa política de revisão que fizemos em resposta à COVID-19 (https://elifesciences.org/articles/57162). Especificamente, quando os editores julgam que um trabalho submetido como um todo pertence à eLife, mas que algumas conclusões requerem uma quantidade modesta de dados novos adicionais, como é o caso do seu artigo, estamos pedindo que o manuscrito seja revisado para limitar as alegações àquelas suportadas pelos dados em mãos, ou para declarar explicitamente que as conclusões relevantes requerem dados adicionais de suporte.
Nossa expectativa é que os autores eventualmente realizem os experimentos adicionais e relatem como eles afetam as conclusões relevantes, seja em um preprint no bioRxiv ou medRxiv, ou, se apropriado, como um Avanço de Pesquisa na eLife, qualquer um dos quais seria vinculado ao artigo original.
As avaliações foram entusiasmadas quanto à novidade deste trabalho e suas potenciais implicações para a compreensão dos papéis dos carotenoides na fotossíntese. No entanto, houve um consenso de que as afirmações são excessivamente amplas. Não foi demonstrado que as plantas transgênicas são totalmente desprovidas de β-caroteno e que outras espécies de carotenoides também foram deslocadas. Além disso, embora possam crescer em condições de laboratório, não competiriam em campo. Também não está claro se houve uma substituição clara de Asta por outros carotenoides, ou se certos sítios foram deixados vazios. Por fim, há uma questão não resolvida quanto à identificação do processo de NPQ observado nas plantas com Asta. Ele é realmente equivalente ao qE? Essa última questão poderia ser abordada com experimentos relativamente simples. No entanto, considerando a dificuldade de realizar trabalhos mais extensos, os revisores acreditam que uma versão modificada do artigo poderia ser aceitável, se refletir de forma mais realista as possíveis interpretações dos resultados e eliminar exageros, incluindo a reformulação do título e da Discussão. Mais especificamente, o foco poderia estar nos efeitos surpreendentemente pequenos da substituição de carotenoides específicos por outros, em vez da essencialidade de um caso específico.
Revisor #1:
Este manuscrito descreve a caracterização de uma planta de tabaco transgênica muito interessante na qual a síntese de astaxantina (asta) foi introduzida. A Asta se acumula a tal ponto que supera a maioria, senão todos, os carotenoides nativos nos complexos fotossintéticos. A descoberta surpreendente é que o aparato fotossintético parece funcionar relativamente normalmente, colocando em dúvida a visão clássica de que o β-caroteno é "essencial" para a fotossíntese. No geral, essa conclusão é bastante importante para a área e incentivaria os autores a enfatizar o perigo de usar dados de mutantes knockout para fazer afirmações de "essencialidade". Seus dados mostram claramente que a fotossíntese pode operar enquanto o β-caroteno é amplamente substituído (ênfase nestas três palavras) por Asta. Por outro lado, o texto atual também faz uma afirmação exagerada ao declarar (no título e ao longo do texto) que o β-caroteno não é necessário para a fotossíntese. Há dois pontos importantes que precisam ser claramente explicitados. Primeiro, eles não mostram realmente que o β-caroteno não é necessário. Eles poderiam fazer isso resgatando um mutante que não possui β-caroteno através da superexpressão de Asta, mas esses resultados não são apresentados. Segundo, o título não é preciso porque, em vez de mostrar que o β-caroteno não é necessário, um composto diferente pode substituí-lo. Que isso seja possível é, no entanto, importante e interessante. Embora enquadrar a história dessa maneira forneça um título atraente e chamativo, isso distrai muito do que é, de fato, interessante e importante neste trabalho. O componente sobre NPQ é bastante interessante, mas poderia ser melhorado com alguns experimentos ou análises adicionais.
"Esses dados não apenas mostram que o PSII é estável na ausência de β-caroteno, mas também demonstram que os complexos são funcionais mesmo quando alguns dos sítios de ligação de carotenoides estão vazios, conforme indicado pela maior razão Chl/car nos complexos Asta em comparação com os complexos WT."
Não estou convencido de que essa conclusão possa ser afirmada com certeza. Se a Asta estiver mais fracamente ligada, parte dela pode ter sido perdida durante o isolamento, resultando nos sítios aparentemente vazios.
"Curiosamente, a composição alterada de carotenoides praticamente não tem efeito sobre as propriedades de ligação e espectroscópicas das Chls associadas aos LHCs e ao núcleo do PSII, conforme revelado pela alta similaridade dos espectros de absorção (Figura 3—suplemento da figura 3A) e dicroísmo circular (Figura 3—suplemento da figura 3B) dos complexos WT e mutante nas regiões de absorção de Chl..."
Isso parece exagerado. Existem diferenças, então depende da definição de "praticamente nenhum efeito". Seria melhor suavizar um pouco. Há tantos casos em que a eliminação de um gene não tem efeito aparente no laboratório, mas tem efeitos fortes no campo.
"Nossos dados mostram que a diferença na composição entre os complexos WT e mutante tem apenas um pequeno impacto (5-10 °C) em sua estabilidade (Figura 3A)."
Da mesma forma, questiono se 5-10 °C é "apenas um pequeno impacto" na estabilidade. O WT seria capaz de viver muito bem após um pico transitório de temperatura, como experimentado no mundo real, mas a planta asta certamente morreria.
"Em seguida, investigamos o efeito da ausência de carotenos nas propriedades de captação de luz e aprisionamento dos complexos fotossintéticos in vivo, realizando medições de fluorescência resolvida no tempo em folhas intactas (Figura 4 e Figura 4—suplemento da figura 1)."
Parece sugerir que não há carotenoides nas folhas, o que obviamente não é verdade. Isso é aparente em muitos lugares do texto, e ainda mais no título, que parece implicar que os carotenoides não são necessários. Na verdade, eles não desapareceram, apenas foram amplamente (com ênfase) substituídos por Asta. Que tal mudar a redação para algo como: "...investigamos os efeitos de superar os carotenos com Ast...?"
"Verificamos que as plantas mutantes exibem um sinal de ECS e determinamos seu espectro de ação, que concordou com a previsão de que a astaxantina é a única responsável por esse efeito Stark in vivo (Figura 5—suplemento da figura 1)." Os dados apresentados na Figura 5—suplemento da figura 1 não são um espectro de ação. É o espectro de diferença induzido pela luz. Um espectro de ação seria interessante e diria algo sobre a eficiência da captação de luz e da transferência de excitons da Asta para os centros de reação.
"De fato, a comparação dos rendimentos fotoquímicos em estado estacionário do PSII e do PSI revelou que, em todas as intensidades luminosas, tanto em plantas WT quanto mutantes, o equilíbrio entre a fotoquímica do PSII e do PSI é mantido (Figura 5A e Figura 5—suplemento da figura 3), o que significa que as plantas são capazes de compensar a forte redução no tamanho da antena funcional do PSII diminuindo a razão PSI/PSII."
Discordo da interpretação desses resultados em vários níveis. Primeiro, o cálculo do NPQ utilizado no trabalho assume que o FM (rendimento de fluorescência relativa medido no escuro) ocorre na ausência de qualquer NPQ. Na verdade, o que é indicado como NPQ é impreciso porque as plantas foram "pré-suprimidas" pela presença de Asta, então o NPQ é fortemente subestimado. Isso, é claro, é reconhecido no texto: "Observe que a diferença no nível de NPQ (1,8 no WT vs. 0,3 no mutante) pode ser totalmente atribuída à presença do supressor estático no mutante, que reduz fortemente a fluorescência máxima tanto no escuro (FM) quanto na luz (FM')." Seria interessante tentar o parâmetro NPQ(t), que não faz essa suposição.
Segundo, em um estado estacionário de fluxo linear de elétrons, as eficiências quânticas aparentes do PSI e do PSII devem, por definição, ser iguais, então a figura não é surpreendente. Por exemplo, os gráficos de φII versus PAR são muito semelhantes em plantas selvagens e mutantes deficientes em NPQ, como npq4, que carece da resposta qE. O que é diferente é que, no tipo selvagem, o NPQ desempenha um papel mais forte na diminuição de φII, enquanto no npq4, é o acúmulo de elétrons na QA. Dados os dados na Figura 5B, eu esperaria que algo semelhante ocorresse nas plantas Asta, e seria importante mostrar isso.
Terceiro, o parâmetro qP não é um bom indicador linear do estado redox da QA, nem o chamado parâmetro φI são indicadores lineares da eficiência quântica do PSI. O parâmetro qL pode ser um indicador mais linear do estado redox da QA, e um gráfico de qL versus a fração de P700 em seu estado oxidado pode ser uma abordagem melhor.
"É provável que a alta quantidade de PsbS no mutante (Figura 2—suplemento da figura 1) possa compensar a falta do ciclo das xantofilas, ou que a astaxantina também possa ser responsável pela supressão dinâmica." Foi demonstrado por Li et al. (2009, Plant Cell 21, 1798-1812) que, em mutantes que carecem do ciclo das xantofilas, a luteína poderia restaurar a qE. Esta referência fornece algum precedente para a persistência observada de NPQ rápido em linhagens que carecem de Z.
Os resultados sobre NPQ não são muito aprofundados e alguns experimentos adicionais são justificados e, com mínimo esforço, tornam o artigo mais robusto. Em trabalhos anteriores, vários ensaios foram utilizados para determinar se um NPQ observado é qE, incluindo adição de nigericina para inibir alterações do pH do lúmen, eliminação da atividade de VDE ou ZE (por exemplo, mutação ou adição de DTT), mutação de PsbS ou observação do espectro deslocado característico associado ao processo qE. Provavelmente não é prático solicitar a geração de mutantes de PsbS/VDE/ZE no background Asta. No entanto, é relativamente fácil realizar os outros experimentos, e os resultados seriam muito úteis na interpretação dos dados. Por exemplo, Li et al., 2009, mencionado acima, descobriram que a substituição de Lut por Z levou a um deslocamento no sinal de absorbância associado ao qE, mostrando que o início do qE na linhagem modificada ainda envolvia alteração das propriedades espectrais de um carotenoide ligado.
Revisor #2:
Este é um excelente manuscrito que fornece novas informações sobre a função in vivo do β-caroteno na montagem e função do PSII, PSI e LHC em plantas superiores. O manuscrito é notável por fornecer uma demonstração muito clara de que, contrariamente à convenção amplamente aceita, o β-caroteno não é essencial para a montagem e função do PSII e de outros complexos de captação de luz em tabaco. Os resultados fornecem um contraponto importante aos únicos outros dados mutantes disponíveis de Chlamydomonas. Como tal, este manuscrito terá um impacto significativo e será um marco de referência. O manuscrito está bem contextualizado cientificamente, documentado com habilidade por uma ampla gama de ferramentas espectroscópicas de diagnóstico e, em geral, muito bem escrito.
Revisor #3:
Este é um artigo muito interessante que desafia a crença de que os carotenos são essenciais para a estabilização dos complexos do núcleo do PSII e PSI e, portanto, essenciais para a atividade fotossintética em organismos oxigênicos. Plantas de tabaco mutantes, totalmente desprovidas de β-caroteno e das xantofilas normais, mas produzindo a xantofila astaxantina em seu lugar, podem crescer fotossinteticamente, embora a uma taxa mais lenta que o tipo selvagem. O mutante é caracterizado neste artigo e é demonstrado que ambos os fotossistemas e seus respectivos complexos de captação de luz ligam astaxantina. O artigo é bem escrito e adequado para publicação após tratar dos seguintes pontos.
Nota – Numerei as páginas a partir da página de título ao longo da revisão.
- Resumo – última frase. O texto do artigo não me parece sustentar este ponto.
- Figura 1 e Tabela 1: A figura mostra uma planta muito alaranjada/vermelha, mas é dito que ela tem 20 semanas de idade – enquanto a tabela diz que plantas maduras (Materiais e métodos – 20 semanas) têm uma relação Chl/Car muito semelhante ao WT e, portanto, eu suponho que seriam mais verdes. Certamente a planta Asta na Figura 1 é mais jovem que 21 semanas? No entanto, a astaxantina pode estar deslocada para o vermelho em comparação ao β-caroteno e às xantofilas normais, e assim todas as plantas são muito mais vermelhas que o WT? Esclarecer o texto.
- Um resultado notável no artigo é que o mutante Asta, em todos os complexos, liga astaxantina, mas quase metade dos sítios estão vazios tanto nos complexos do centro de reação do PSI quanto do PSII em Asta, enquanto os LHCs têm apenas ~20% dos sítios não preenchidos em Asta em comparação ao WT (Tabela 2). O fato de as plantas crescerem em condições de laboratório não significa que a substituição do caroteno por uma xantofila não tenha um efeito drástico na atividade fotossintética. Isso deve ser discutido com mais detalhes do que a breve menção nos Resultados e Discussão.
- É mencionado que os complexos de PSI do mutante são mais estáveis que os complexos de PSII (Resultados e Discussão e Figura 3), mas não há menção de que o PSII é intrinsecamente menos estável que o PSI. É bem conhecido que, no PSII, os carotenoides não podem proteger suprimindo o oxigênio singlete formado via tripleto P680 devido ao potencial oxidante muito alto do PSII.
- Resultados e Discussão e Tabela 3 sobre a relação PSII/PSI: O texto é muito confuso e inconsistente. Os dados não mostram que essa relação é a mesma seja medida por ECS ou por níveis de proteína. A ECS é 2,6 vezes maior, enquanto por níveis de proteína, a relação PSI/PSII é dita ser 6 vezes menor (Resultados e Discussão). Discutir essa diferença e usar a mesma relação PSII/PSI ao relatar dados e discutir no texto.
10.7554/eLife.58984.sa2
Resposta do autor
Revisor #1:
Este manuscrito descreve a caracterização de uma planta de tabaco transgênico muito interessante na qual a síntese de astaxantina (asta) foi introduzida. A asta se acumula a tal ponto que supera a maioria, senão todos, os carotenoides nativos nos complexos fotossintéticos. A descoberta surpreendente é que o aparato fotossintético parece funcionar relativamente normalmente, colocando em dúvida a visão clássica de que o β-caroteno é "essencial" para a fotossíntese. No geral, essa conclusão é bastante importante para a área, e incentivaria os autores a enfatizar o perigo de usar dados de mutantes knockout para fazer afirmações de "essencialidade". Seus dados mostram claramente que a fotossíntese pode operar enquanto o β-caroteno é amplamente substituído por (ênfase nestas três palavras) asta. Por outro lado, o texto atual também faz uma afirmação exagerada ao afirmar (no título e ao longo do texto) que o β-caroteno não é necessário para a fotossíntese. Há dois pontos importantes que precisam ser claramente declarados. Primeiro, eles realmente não mostram que o β-caroteno não é necessário. Eles poderiam fazer isso resgatando um mutante que carece de β-caroteno superexpressando asta, mas esses resultados não são mostrados. Segundo, o título não é preciso porque eles, em vez de mostrar que o β-caroteno não é necessário, um composto diferente pode substituí-lo. Que isso seja possível é, no entanto, importante e interessante. Embora enquadrar a história dessa maneira forneça um título bonito e chamativo, isso distrai muito do que é, de fato, interessante e importante neste trabalho. O componente sobre NPQ é bastante interessante, mas poderia ser melhorado com alguns experimentos ou análises adicionais.
Estamos felizes que o revisor considera nosso trabalho importante para a área. Alteramos o título para "Fotossíntese sem β-caroteno". Achamos que este título capta a essência do nosso trabalho. Concordamos que, a menos que possamos demonstrar que não há nem mesmo uma única molécula de β-caroteno por planta, não podemos excluir completamente seu papel na fotossíntese. No entanto, o papel canônico do β-caroteno está ligado à sua associação com PSI e PSII. O que podemos concluir com segurança é que, em nossas plantas, a grande maioria dos complexos não contém moléculas de β-caroteno.
Esses dados não apenas mostram que o PSII é estável na ausência de β-caroteno, mas também demonstram que os complexos são funcionais mesmo quando alguns dos sítios de ligação de carotenoides estão vazios, conforme indicado pela maior razão Clorofila/carotenoide nos complexos Asta em comparação com os complexos WT.
Eu não estou convencido de que essa conclusão possa ser afirmada com certeza. Se a Asta estiver mais fracamente ligada, parte dela pode ter sido perdida durante o isolamento, resultando nos sítios aparentemente vazios.
Agora adicionamos uma frase para explicar que não podemos excluir a perda de astaxantina durante a purificação e também reformulamos essa frase para deixar mais claro que ela se refere ao complexo isolado no qual alguns dos sítios de ligação estão “vazios”, no sentido de não estarem ocupados por carotenoides. Isso agora também é mencionado explicitamente.
“Curiosamente, a composição alterada de carotenoides praticamente não tem efeito sobre as propriedades de ligação e espectroscópicas das Chls associadas aos LHCs e ao núcleo do PSII, como revelado pela alta similaridade dos espectros de absorção (Figura 3—suplemento da figura 3A) e dicroísmo circular (Figura 3—suplemento da figura 3B) dos complexos WT e mutante nas regiões de absorção das Chls…”
Parece ser exagerado. Existem diferenças, então depende da definição de “praticamente nenhum efeito”. Seria melhor suavizar um pouco. Há muitos casos em que a eliminação de um gene não tem efeito aparente no laboratório, mas tem efeitos fortes no campo.
Reformulamos a frase e remetemos o leitor à Figura 3—suplemento da figura 3, onde fornecemos uma explicação mais detalhada dos espectros.
“Nossos dados mostram que a diferença na composição entre os complexos WT e mutante tem apenas um pequeno impacto (5-10 °C) na sua estabilidade (Figura 3A).”
Da mesma forma, questiono se 5-10 °C é “apenas um pequeno impacto” na estabilidade. O WT seria capaz de viver bastante feliz após um pico transitório de temperatura, como experimentado no mundo real, mas a planta asta quase certamente morreria.
Reformulamos esta frase para deixar mais claro que medimos complexos isolados e que os resultados dessas medições são válidos apenas para os complexos isolados.
“Em seguida, investigamos o efeito da ausência de carotenos nas propriedades de captação de luz e aprisionamento dos complexos fotossintéticos in vivo, realizando medições de fluorescência resolvida no tempo em folhas intactas (Figura 4 e Figura 4—suplemento da figura 1).”
Parece sugerir que não há carotenoides nas folhas, o que obviamente não é verdade. Isso é aparente em muitos lugares do texto, e ainda mais no título, que parece implicar que os carotenoides não são necessários. Na verdade, eles não desapareceram, apenas foram amplamente (com ênfase) substituídos por Asta. Que tal mudar a redação para algo como: “…investigamos os efeitos de superar os carotenos com Ast…”?
Alteramos a frase para “Em seguida, investigamos o efeito da substituição dos carotenos por astaxantina”…. Também alteramos uma frase semelhante no final da Discussão. Mencionamos ao longo do manuscrito que nossos complexos contêm astaxantina e a definição de “carotenos” já foi introduzida no Resumo. O título mencionava explicitamente β-caroteno, e isso foi feito para evitar criar confusão entre leitores que talvez não estejam familiarizados com a diferença entre “carotenoides” e “carotenos”.
"Verificamos que as plantas mutantes exibem um sinal de ECS e determinamos seu espectro de ação, que concordou com a previsão de que a astaxantina é a única responsável por este efeito Stark in vivo (Figura 5—suplemento da figura 1)." Os dados apresentados na Figura 5—suplemento da figura 1 não são um espectro de ação. É o espectro de diferença induzido pela luz. Um espectro de ação seria interessante e diria algo sobre a eficiência da captação de luz e da transferência de excitons da Asta para os centros de reação.
Reformulamos a frase conforme sugerido.
"De fato, a comparação dos rendimentos fotoquímicos de estado estacionário do PSII e do PSI revelou que, em todas as intensidades de luz, tanto em plantas WT quanto mutantes, o equilíbrio entre a fotoquímica do PSII e do PSI é mantido (Figura 5A e Figura 5—suplemento da figura 3), o que significa que as plantas são capazes de compensar a forte diminuição no tamanho da antena funcional do PSII diminuindo a razão PSI/PSII."
Discordo da interpretação desses resultados em vários níveis. Primeiro, o cálculo do NPQ usado no trabalho assume que o FM (rendimento de fluorescência relativa medido no escuro) ocorre na ausência de qualquer NPQ. Na verdade, o que é indicado como NPQ é impreciso porque as plantas foram "pré-suprimidas" pela presença de Asta, então o NPQ é fortemente subestimado. Isso é, obviamente, reconhecido no texto: "Note que a diferença no nível de NPQ (1,8 no WT vs. 0,3 no mutante) pode ser totalmente atribuída à presença do supressor estático no mutante, o que reduz fortemente a fluorescência máxima tanto no estado escuro (FM) quanto no estado claro (FM' )." Seria interessante tentar o parâmetro NPQ(t), que não faz essa suposição.
Agora usamos o parâmetro NPQ(t), que mostra que o nível é ainda maior no mutante do que no WT, de acordo com a maior quantidade de PsbS no primeiro. Os dados são mostrados na Figura 5—suplemento da figura 7.
Segundo, em um estado estacionário de fluxo de elétrons linear, as eficiências quânticas aparentes do PSI e do PSII devem, por definição, ser iguais, portanto a figura não é surpreendente. Por exemplo, os gráficos de φII versus PAR são muito semelhantes em plantas selvagens e mutantes deficientes em NPQ, como npq4, que não possui a resposta qE. O que é diferente é que, no tipo selvagem, o NPQ desempenha um papel mais forte na diminuição de φII, enquanto no npq4, é o acúmulo de elétrons em QA. Dados os dados na Figura 5B, eu esperaria que algo semelhante ocorresse nas plantas Asta, e seria importante mostrar isso.
Concordamos com o revisor que os rendimentos quânticos aparentes em estado estacionário (e no regime de fluxo linear de elétrons) responderão da mesma forma às mudanças na intensidade luminosa, assim como as ETRs do PSII e do PSI. Isso é demonstrado em nosso trabalho: como o revisor aponta, os parâmetros globais relacionados ao PSII (qL) e ao PSI (phi PSI) ambos mostram dependência luminosa virtualmente idêntica em plantas asta e WT. Crucialmente, a similaridade na amplitude e na cinética do parâmetro NPQ(t) entre asta e WT (Figura 5—suplemento da figura 7) mostra que a presença de extinção estática pode explicar completamente a diferença no NPQ aparente. Consequentemente, dado que as plantas asta exibem um NPQ(t) de ~2,3 já no escuro, compartilhamos da opinião do revisor de que, em estado estacionário, com todos os outros parâmetros inalterados (como no exemplo do npq4 utilizado), a extinção estática seria de longe a maior razão para uma alteração/redução na dependência da intensidade luminosa da ETR do PSII. O revisor observa que no mutante npq4 mais QA se torna reduzido. Na Figura 5—suplemento da figura 3, mostra-se que em plantas asta isso não ocorre, em concordância com a forte extinção estática e NPQ nessas plantas.
Em vez disso, fundamentamos, medindo a razão de CR e os tamanhos das antenas por PS, que a otimização da fotossíntese no mutante é alcançada através da regulação das estequiometrias relativas dos fotossistemas. Infelizmente, isso torna a situação significativamente mais complexa do que para WT-npq4. Acreditamos que a quantificação da partição do efeito do NPQ e da taxa de renovação do b6f para essa diferença seria difícil devido à superposição da extinção estática, alterações nas estequiometrias dos PS, tamanhos de antenas alterados, etc.
No entanto, em nossa opinião, essas pequenas diferenças nos gráficos de qL/phi PSI/intensidade luminosa destacam o quão notavelmente bem o mutante se adapta à sua engenharia genética e leva em conta a necessidade de manter as ETRs do PSII e do PSI equilibradas, bem como a capacidade de ETR do b6f, de modo que exiba dependência de pH (e, portanto, a extensão do controle fotossintético) semelhante à do WT.
Terceiro, o parâmetro qP não é não é um bom indicador linear do estado redox de QA, nem o chamado parâmetro φI são indicadores lineares da eficiência quântica do PSI. O parâmetro qL pode ser um indicador mais linear do estado redox de QA, e um gráfico de qL versus a fração de P700 em seu estado oxidado pode ser uma abordagem melhor.
Calculamos o qL e agora o mostramos na Figura 5. Ainda mostramos o qP na Figura 5—suplemento da figura 4, para destacar a dependência semelhante dos dados em relação a fPSI ou PAR. As frações de centros do PSII abertos/fechados após um pulso foram calculadas na Figura 5—suplemento da figura 5.
É provável que a alta quantidade de PsbS no mutante (Figura 2—suplemento da figura 1) possa compensar a falta do ciclo das xantofilas, ou que a astaxantina também possa ser responsável pela extinção dinâmica." Foi demonstrado por Li et al. (2009, Plant Cell 21, 1798-1812) que, em mutantes sem o ciclo das xantofilas, a luteína poderia restaurar o qE. Esta referência fornece algum precedente para a persistência observada de NPQ rápido na linhagem sem Z.
Tanto a luteína quanto a zeaxantina são explicitamente mencionadas no Resumo e nos Resultados e Discussão. Agora adicionamos a referência a Li et al., 2009.
Os resultados sobre NPQ não são muito completos e alguns experimentos adicionais são justificados e, com esforço mínimo, tornariam o artigo mais robusto. Em trabalhos anteriores, vários ensaios foram usados para estabelecer se um NPQ observado é qE, incluindo a adição de nigericina para inibir as mudanças de pH do lúmen, a eliminação da atividade de VDE ou ZE (por exemplo, mutação ou adição de DTT), a mutação de PsbS ou a observação do espectro característico deslocado associado ao processo qE. Provavelmente não é prático solicitar a geração de mutantes PsbS/VDE/ZE no background Asta. No entanto, é relativamente fácil realizar os outros experimentos, e os resultados seriam muito úteis para interpretar os resultados. Por exemplo, Li et al., 2009, veja acima, descobriram que a substituição de Lut por Z levou a uma mudança no sinal de absorbância associado ao qE, mostrando que o início do qE na linhagem modificada ainda envolvia alteração das propriedades espectrais de um carotenóide ligado.
Isso infelizmente não é possível, pois devido à Covid-19, tivemos que esvaziar todas as nossas câmaras de crescimento e levará meses até que tenhamos plantas no estágio adequado para essas medições. No entanto, estamos confiantes de que observamos qE, porque o relaxamento do NPQ é muito rápido, com cinética idêntica à do WT (veja o detalhe na Figura 5B), apesar da presença de extinção estática. Também estamos agora relatando o parâmetro NPQ(t), que mostra que a extinção induzida é substancial.
Revisor #3:
Este é um artigo muito interessante que desafia a crença de que os carotenos são essenciais para a estabilização dos complexos do centro de reação do PSII e PSI e, portanto, essenciais para a atividade fotossintética em organismos oxigênicos. Plantas mutantes de tabaco, totalmente desprovidas de β-caroteno e das xantofilas normais, mas produzindo a xantofila astaxantina em seu lugar, podem crescer fotossinteticamente, embora a uma taxa mais lenta que o tipo selvagem. O mutante é caracterizado neste artigo e é demonstrado que ambos os fotossistemas e seus respectivos complexos de captura de luz se ligam à astaxantina. O artigo é bem escrito e adequado para publicação após a abordagem dos seguintes pontos.
Nota – Numere as páginas a partir da página de título ao longo da revisão.
- Resumo – última frase. O texto do artigo não me parece fazer este ponto.
Referimo-nos aqui à grande mudança na razão PSI/PSII entre o tipo selvagem (WT) e o mutante, que é discutida na última parte do manuscrito. Adicionamos uma frase para tornar a ligação com o Resumo mais clara. - Figura 1 e Tabela 1: A figura mostra uma planta muito alaranjada/vermelha, mas diz-se que tem 20 semanas de idade – enquanto a tabela indica que plantas maduras (Materiais e métodos – 20 semanas) têm uma razão Chl/Car muito semelhante à do WT, então eu suponho que seriam mais verdes. Certamente a planta Asta na Figura 1 é mais jovem que 21 semanas? No entanto, a astaxantina pode ser deslocada para o vermelho em comparação com o β-caroteno e as xantofilas normais, então todas as plantas são muito mais vermelhas que o WT? Esclarecer no texto.
Estamos nos referindo à idade das folhas. As folhas mais velhas são mais verdes que as jovens. Isso agora é mencionado na legenda. Também adicionamos a Figura 1—suplemento da figura 1 com fotografias de plantas de diferentes idades. - Um resultado notável no artigo é que o mutante Asta, em todos os complexos, liga astaxantina, mas quase metade dos sítios estão vazios tanto nos complexos do centro de reação do PSI quanto do PSII do Asta, enquanto os LHCs têm apenas ~20% dos sítios não preenchidos no Asta em comparação com o WT (Tabela 2). O fato de as plantas crescerem em condições laboratoriais não significa que a substituição de caroteno por uma xantofila não tenha um efeito drástico na atividade fotossintética. Isso deve ser discutido com mais detalhes do que a breve menção nos Resultados e Discussão.
Esses resultados são baseados em complexos purificados; agora esclarecemos melhor esse ponto e mencionamos que não podemos excluir que algumas moléculas de astaxantina sejam perdidas durante a purificação. Também adicionamos uma frase na Introdução, mencionando que essas plantas podem crescer sem β-caroteno, pelo menos em condições laboratoriais. - É mencionado que os complexos de PSI do mutante são mais estáveis que os complexos de PSII (Resultados e Discussão e Figura 3), mas não há menção de que o PSII é intrinsecamente menos estável que o PSI. É bem sabido que, no PSII, os carotenoides não podem proteger ao suprimir o oxigênio singlete formado via tripleto P680 devido ao potencial oxidante muito alto do PSII.
Esse era exatamente o ponto que queríamos destacar: que o PSI com poucos carotenoides ainda é melhor protegido que o PSII. Agora enfatizamos esse ponto conforme sugerido. - Resultados e Discussão e Tabela 3 sobre a razão PSII/PSI: O texto está muito confuso e inconsistente. Os dados não mostram que essa razão é a mesma quando medida por ECS ou por níveis de proteína. O ECS é 2,6 vezes maior, enquanto por níveis de proteína a razão PSI/PSII é dita ser 6 vezes menor (Resultados e Discussão). Discuta essa diferença e use a mesma razão PSII/PSI ao relatar dados e discutir no texto.
Obrigado. Agora corrigimos isso e discutimos a diferença.