pmid: "38867934"
title: ""
authors: "Hong R, Luo L, Wang L, Hu ZL, Yin QR, Li M, Gu B, Wang B, Zhuang T, Zhang XY, Zhou Y, Wang W, Huang LY, Gu B, Qi SH"
journal: "iMeta"
pubdate: "2023 Aug"
doi: "10.1002/imt2.116"
source: "PMC Full Text"

Autores

Hong R, Luo L, Wang L, Hu ZL, Yin QR, Li M, Gu B, Wang B, Zhuang T, Zhang XY, Zhou Y, Wang W, Huang LY, Gu B, Qi SH

Periodico

iMeta (2023 Aug)

Conteudo

Vesículas extracelulares derivadas de Lepidium meyenii Walp (Maca) melhoram a depressão promovendo a síntese de 5-HT através da modulação do eixo intestino-cérebro

Resumo

A depressão é uma condição comum e debilitante para a qual são necessários tratamentos eficazes. Lepidium meyenii Walp (Maca) é uma planta com potenciais efeitos medicinais no tratamento da depressão. Recentemente, tem havido um interesse crescente em vesículas extracelulares (EVs) derivadas de plantas devido à sua baixa toxicidade e capacidade de transporte para células humanas. Visar o eixo intestino-cérebro, uma nova estratégia para o manejo da depressão, pode ser alcançado através do uso de EVs derivadas de Maca (Maca-EVs). Neste estudo, isolamos com sucesso Maca-EVs usando ultracentrifugação em gradiente e caracterizamos sua forma, tamanho e marcadores (CD63 e TSG101). A imagem in vivo mostrou que as Maca-EVs marcadas com Dil atravessaram a barreira hematoencefálica e se acumularam no cérebro. Os testes comportamentais revelaram que as Maca-EVs recuperaram dramaticamente os comportamentos semelhantes à depressão em camundongos submetidos ao estresse crônico leve imprevisível (UCMS). As fezes dos camundongos UCMS foram caracterizadas por uma abundância elevada de g_Enterococcus, g_Lactobacillus e g_Escherichia_Shigella, que foram significativamente restauradas pela administração de Maca-EVs. Os efeitos das Maca-EVs na microbiota alterada e nos metabólitos fecais em camundongos UCMS foram mapeados para os metabolismos de biotina, pirimidina e aminoácidos (tirosina, alanina, aspartato e glutamato), que estavam intimamente associados à produção de serotonina (5-HT). As Maca-EVs foram capazes de aumentar os níveis de neurotransmissores monoaminérgicos séricos em camundongos UCMS, com a 5-HT apresentando as alterações mais significativas. Demonstramos ainda que a 5-HT melhorou a expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro, um regulador chave da plasticidade neuronal, e sua subsequente ativação da sinalização TrkB/p-AKT através da regulação da via GTP-Cdc42/ERK. Essas descobertas sugerem que as Maca-EVs aumentam a liberação de 5-HT, possivelmente modulando o eixo intestino-cérebro, para melhorar o comportamento depressivo. Nosso estudo lança luz sobre uma nova abordagem para o tratamento da depressão usando EVs derivadas de plantas.

Isolamos com sucesso Maca-EVs usando ultracentrifugação e testamos seus efeitos antidepressivos em camundongos submetidos ao estresse crônico leve imprevisível. As Maca-EVs aumentaram os níveis séricos de serotonina (5-HT) provavelmente através da modulação da microbiota intestinal e do metabolismo. A atividade antidepressiva das Maca-EVs pode ser atribuída ao aumento dos níveis séricos de 5-HT e à subsequente ativação das vias de sinalização GTP-Cdc42/ERK e BDNF/TrkB/AKT.

Destaques

Isolamos com sucesso Maca-EVs usando ultracentrifugação e testamos seus efeitos antidepressivos em camundongos submetidos ao estresse crônico leve imprevisível.
As Maca-EVs aumentaram os níveis séricos de serotonina (5-HT) provavelmente através da modulação da microbiota intestinal e do metabolismo.
A atividade antidepressiva das Maca-EVs pode ser atribuída ao aumento dos níveis séricos de 5-HT e à subsequente ativação das vias de sinalização GTP-Cdc42/ERK e BDNF/TrkB/AKT.

INTRODUÇÃO
A depressão é um transtorno mental que afeta 280 milhões de pessoas globalmente, incluindo 5,0% dos adultos e 5,7% dos idosos. A depressão grave pode levar ao suicídio, que é a quarta principal causa de morte em populações entre as idades de 15–29. Dados recentes divulgados pela OMS demonstraram um aumento de 25% na prevalência global de depressão devido à propagação da COVID-19. Verificou-se que a disfunção nas sinapses excitatórias, microglia, neurotransmissores, ações neuroimunes e neuroinflamatórias pode contribuir para o desenvolvimento da depressão. Consequentemente, medicamentos que regulam neurotransmissores como serotonina (5-HT), norepinefrina (NE), dopamina (DA) e outros estão incluídos no manejo clínico da depressão. Antidepressivos tradicionais como inibidores da monoamina oxidase, tricíclicos, inibidores seletivos da recaptação de 5-HT, 5-HT e inibidores da recaptação de noradrenalina demonstraram ter eficácia antidepressiva particular. No entanto, seus efeitos adversos como disfunção sexual, náusea/vômito, alterações de peso, distúrbios do sono e fácil dependência não podem ser ignorados. Além disso, quase 50% dos pacientes com depressão não respondem ao tratamento antidepressivo. Assim, há uma necessidade não atendida do desenvolvimento de antidepressivos seguros e eficazes.

Na última década, um crescente corpo de evidências destacou que a ação do eixo intestino-cérebro é essencial no desenvolvimento fisiopatológico da depressão. Este eixo refere-se às interações bidirecionais entre o intestino e o cérebro, facilitadas por sinais neurais (nervos entérico, simpático e vago), imunes (citocinas e células inflamatórias) e químicos (metabólitos da microbiota e neurotransmissores). Em indivíduos com depressão, a atividade dos sistemas nervosos entérico e simpático está elevada. Descobertas recentes mostraram que os comportamentos do tipo depressivo induzidos pela injeção de lipopolissacarídeo ou micróbios “relacionados à depressão” em camundongos puderam ser aliviados pela vagotomia subdiafragmática, demonstrando o potencial papel do nervo vago na depressão. Além disso, a depressão é caracterizada por níveis elevados de citocinas ou quimiocinas pró-inflamatórias periféricas, como fator de necrose tumoral (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e IL-1β, e ativação de células imunes como células neuronais no cérebro, células dendríticas e células linfoides inatas no intestino, monócitos e macrófagos na circulação sistêmica. Além disso, certas microbiotas intestinais podem produzir metabólitos específicos (por exemplo, metabólitos do triptofano, trimetilamina-N-óxido e ácidos graxos de cadeia curta), moduladores neuroativos (por exemplo, 5-HT, ácido aminobutírico, fator neurotrófico derivado do cérebro [BDNF] e fator neurotrófico derivado da glia), e outros fatores que são secretados por células intestinais ou a partir da decomposição de bactérias. Portanto, o eixo intestino-cérebro está emergindo como um novo alvo para o desenvolvimento de medicamentos para tratar a depressão.
Lepidium meyenii Walp, também conhecida como Maca, é cultivada na região andina há pelo menos 2000 anos e foi introduzida com sucesso na China desde 2002, incluindo as províncias de Yunnan, Xinjiang, Jilin e Tibete. A Maca é uma planta medicinal comestível tradicional, reconhecida por seus benefícios no equilíbrio hormonal, regulação da disfunção sexual e efeitos energizantes. A Maca é rica em nutrientes essenciais e componentes bioativos que variam de acordo com sua cor e tipo, resultando em diversas funções biológicas. Os três tipos mais utilizados e estudados são a Maca amarela, vermelha e preta. Recentemente, a Maca e seu extrato têm atraído atenção significativa devido aos seus potenciais efeitos neuroprotetores e antidepressivos. Estudos mostraram que a macamida da Maca repara os prejuízos hipocampais induzidos pela corticosterona por meio de suas características anti-inflamatórias, neurotróficas e de proteção sináptica. Além disso, a Maca amarela, vermelha e preta demonstraram atividade antidepressiva em camundongos ovariectomizados. Além disso, o extrato de éter de petróleo da Maca exibiu ação antidepressiva ao ativar os sistemas noradrenérgico e dopaminérgico e inibir o estresse oxidativo no cérebro de camundongos. No entanto, a capacidade limitada da Maca e de seu extrato de atravessar a barreira hematoencefálica (BHE) prejudica notavelmente seu potencial como agentes terapêuticos. Vesículas extracelulares derivadas de plantas (PDEVs), semelhantes às vesículas extracelulares (EVs) derivadas de animais, demonstraram participar da comunicação célula a célula humana, exercendo diversas funções biológicas, como imunidade inata e modulação da inflamação. O pequeno tamanho das EVs (<200 nm) permite que elas atravessem livremente a BHE, tornando-as novas candidatas promissoras para aplicações translacionais.

Neste estudo, isolamos e purificamos com sucesso EVs da Maca (Maca-EVs) com base no critério mínimo de caracterização de EVs. Experimentos comportamentais indicaram que as Maca-EVs tiveram efeitos antidepressivos notáveis em camundongos submetidos ao estresse crônico leve imprevisível (UCMS). A atividade antidepressiva das Maca-EVs pode ser atribuída ao aumento dos níveis séricos de 5-HT e à subsequente ativação do eixo BDNF/TrkB/AKT. Possíveis mecanismos para o aumento dos níveis séricos de 5-HT incluem a modulação do eixo intestino-cérebro, entre outros.

RESULTADOS
Isolamento e caracterização das Maca-EVs
Maca‐EVs foram isoladas do suco de Maca usando ultracentrifugação em gradiente, conforme descrito na Figura 1A. A imagem de microscopia eletrônica de transmissão e a análise de rastreamento de nanopartículas revelaram que as Maca‐EVs eram vesículas irregulares envoltas por membrana (Figura 1B) com um diâmetro médio de 134 nm (Figura 1C). Além disso, as Maca‐EVs expressaram marcadores de EVs mais elevados, CD63 e TSG101, em comparação ao meio Maca (Figura 1D), indicando o isolamento bem-sucedido de EVs do suco de Maca. Em seguida, investigamos a captação in vivo de Maca‐EVs em camundongos C57BL/6J usando um sistema de imagem IVIS Spectrum. Maca‐EVs marcados com Dil administrados por via intravenosa (Maca‐EVs‐Dil) acumularam-se no cérebro dos camundongos com sinais de fluorescência vermelha robustos em comparação com os camundongos que receberam Dil livre (Figura 1E). Esses camundongos foram mortos 12 h após a administração de Maca‐EVs‐Dil ou Dil livre, e secções congeladas do cérebro foram preparadas. A imunocoloração por fluorescência confirmou que as Maca‐EVs conseguiram atravessar a BHE e se acumular no cérebro (Figura 1F).

Isolamento e caracterização das Maca‐EVs. (A) Fluxograma do isolamento de EVs de Lepidium meyenii Walp (Maca). (B) Imagem de microscopia eletrônica de transmissão da estrutura das Maca‐EVs (seta vermelha). Barra de escala: 200 nm. (C) A análise de NTA revelou que o tamanho das Maca‐EVs era de aproximadamente 134 nm. (D) Análise de Western blot das expressões dos marcadores de EVs (CD63 e TSG101) no meio Maca e nas Maca‐EVs. (E) Imagens representativas da localização in vivo de Free-Dil ou Maca‐EVs‐Dil no cérebro de camundongos pelo sistema de imagem óptica IVIS. (F) Imagens representativas de imunofluorescência do tecido cerebral de camundongos mortos 12 h após a injeção de Free-Dil ou Maca‐EVs‐Dil. Barra de escala: 100 μm. DAPI, 4′,6-diamidino-2-fenilindol; EV, vesícula extracelular; IVIS, sistema de imagem in vivo; NTA, análise de rastreamento de nanopartículas; PBS, tampão fosfato-salino.

Maca‐EVs revertem os comportamentos do tipo depressivo em camundongos UCMS
Em seguida, avaliamos o efeito do tipo antidepressivo das Maca-EVs in vivo. Aplicamos UCMS diário em camundongos C57BL/6J por 8 semanas para estabelecer o modelo de depressão (Figura 2A). Camundongos tratados sem estresse foram incluídos como controles. O UCMS diminuiu dramaticamente o peso corporal (Figura S1A), aumentou o tempo de imobilidade no teste de suspensão pela cauda (Figura S1B) e no teste de natação forçada (Figura S1C), aumentou a latência para se lamber e comer (Figura S1D,E) e diminuiu o consumo de sacarose (Figura S1F) nos camundongos. Não houve alterações significativas no tempo do braço aberto e braço fechado, indicando um modelo de depressão, mas não um modelo de ansiedade (Figura S1G,H). Os camundongos controle foram divididos aleatoriamente em dois grupos: controle e controle injetado com Maca-EVs (100 μg/kg). Os camundongos UCMS foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: UCMS e UCMS injetados com diferentes doses de Maca-EVs (50, 100 e 200 μg/kg). As Maca-EVs foram administradas uma vez a cada 2 dias por um total de oito vezes em 2 semanas. Notavelmente, aplicamos continuamente UCMS diário nos camundongos durante o tratamento com Maca-EVs. Amostras fecais e de sangue foram coletadas dos camundongos, e os camundongos foram mortos após a conclusão dos testes comportamentais (Figura 2A). Os pesos corporais dos camundongos diminuíram continuamente nos camundongos UCMS, mas foram comparáveis aos camundongos controle administrados com Maca-EVs (200 μg/kg) (Figura 2B). A administração de Maca-EVs melhorou os comportamentos do tipo depressivo em camundongos UCMS, como mostrado pela redução no tempo prolongado de imobilidade no teste de suspensão pela cauda (Figura 2C) e no teste de natação forçada (Figura 2D). O teste de campo aberto (Figura 2E) mostrou que a administração de Maca-EVs melhorou o comportamento exploratório com distâncias percorridas elevadas (Figura 2F) e frequência de entrada na zona (Figura 2G) dos camundongos UCMS. O teste de consumo de sacarose demonstrou uma redução significativa na latência para comer (Figura 2H) ou se lamber (Figura 2I) e um aumento na preferência por sacarose (Figura 2J) em camundongos UCMS administrados com Maca-EVs em comparação com os camundongos UCMS não tratados. Esses dados sugeriram o potencial terapêutico das Maca-EVs no tratamento da depressão.
Efeitos antidepressivos das Maca‐EVs em camundongos UCMS. (A) Ilustração esquemática do estabelecimento do modelo UCMS e da administração de drogas no presente estudo. (B) Alterações de peso corporal de camundongos controle e UCMS com os tratamentos indicados de Maca‐EVs em diferentes momentos. Efeito das Maca‐EVs no tempo de imobilidade no teste de suspensão pela cauda (C) e no teste de natação forçada (D) de camundongos controle e UCMS com os tratamentos indicados de Maca‐EVs. (E) Fotos representativas do teste de campo aberto de camundongos controle e UCMS com os tratamentos indicados de Maca‐EVs. Quantificação da distância total percorrida (F) e entradas na zona (G) do teste de campo aberto. Efeito das Maca‐EVs na latência para comer (H) e para se lamber (I), e na porcentagem de preferência por sacarose (J) de camundongos controle e UCMS com os tratamentos indicados de Maca‐EVs. Todos os dados são apresentados como média ± EPM (n = 15–30 experimentos por grupo). A significância foi avaliada por ANOVA de duas vias de medidas repetidas (RM) seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey em (B), e a significância foi avaliada por ANOVA comum de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey em (C, F, G), testes ANOVA de Brown–Forsythe e Welch seguidos pelo teste de comparações múltiplas de Tamhane T2 em (D), e o teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunn em (H, I, J). Médias indicadas por uma letra diferente indicam diferenças significativas entre grupos (p < 0,05). EV, vesícula extracelular; RM, medida repetida; EPM, erro padrão da média; UCMS, estresse crônico imprevisível moderado.
Alterações na microbiota fecal em camundongos controle e UCMS tratados ou não com Maca‐EVs
Investigamos a seguir as mudanças dinâmicas da microbiota intestinal em camundongos dos quatro grupos (Controle, Controle + Maca‐EVs, UCMS e UCMS + Maca‐EVs), utilizando 12 amostras fecais. Um total de 718.971 sequências de alta qualidade do RNA ribossômico 16S (rRNA) foram obtidas, com uma média de 59.914 leituras por amostra. Após a rarefação das amostras para uma profundidade de sequenciamento igual (56.402 leituras por amostra) e agrupamento, 676.824 sequências foram agrupadas em 1.434 unidades taxonômicas operacionais (OTUs) para a análise subsequente. No nível de filo, Bacteroidota e Firmicutes (Figura 3A) foram os mais abundantes em todos os grupos, enquanto no nível de gênero, Muribaculaceae foi o mais abundante em todos os grupos (Figura 3B). O gênero Lactobacillus variou entre os grupos, com uma diminuição significativa nos grupos Controle, Controle + Maca‐EVs e UCMS + Maca‐EVs em comparação com o grupo UCMS (p < 0,05, Figura 3B). Em contraste, a abundância de Akkermansia, Dubosiella e Faecalibaculum foi significativamente menor no grupo UCMS do que nos outros grupos (Figura 3B). Esses dados indicaram que os gêneros Lactobacillus, Akkermansia, Dubosiella e Faecalibaculum podem estar associados ao efeito do UCMS e das Maca‐EVs.
Efeitos das Maca‐VEs na composição da microbiota em fezes de camundongos Controle e UCMS. Os camundongos foram sacrificados quando os testes comportamentais foram concluídos, e as fezes foram coletadas para análise de sequenciamento do 16S rRNA. Grupos Controle, Controle + Maca‐VEs, UCMS e UCMS + Maca‐VEs foram incluídos no presente estudo (n = 3 experimentos para cada grupo). Abundância relativa da microbiota (top 10) nos níveis de filo (A) e gênero (B) nos diferentes grupos. Diversidade alfa em relação ao índice da métrica de diversidade filogenética de Faith (pd) (C) e características observadas (D) nos diferentes grupos. (E) Análise de coordenadas principais (PCoA) baseada nas matrizes de distância de Bray‐Curtis entre os grupos amostrais. (F) Análise de tamanho do efeito da análise discriminante linear (LEfSe) foi realizada para comparar a composição microbiana no nível de unidade taxonômica operacional (OTU) do 16S rDNA entre os grupos amostrais. Um total de 11 OTUs que diferiram significativamente entre os grupos New_Control e UCMS (p < 0,05; análise discriminante linear [LDA] > 4,0) foram mostradas. (G–J) As mudanças na abundância de bactérias típicas que diferiram significativamente entre New_Control e UCMS entre os grupos amostrais. VE, vesícula extracelular; rDNA, DNA recombinante; rRNA, RNA ribossômico; UCMS, estresse crônico imprevisível leve.

Também investigamos o efeito das Maca‐VEs na diversidade microbiana e descobrimos que a riqueza microbiana, conforme indicada pelo índice Faith‐pd e características observadas, foi maior nos grupos Maca‐VEs (Controle + Maca‐VEs e UCMS + Maca‐VEs), em comparação com os grupos Controle e UCMS (Figura 3C,D). Apenas o índice Faith‐pd no grupo Controle + Maca‐VEs foi significativamente menor do que no grupo Controle (p < 0,05, Figura 3D). A riqueza da comunidade do grupo UCMS em relação ao grupo Controle diminuiu, mas não significativamente. Para avaliar as mudanças na β‐diversidade da microbiota intestinal entre diferentes grupos, realizamos uma análise de coordenadas principais baseada nas matrizes de distância de Bray‐Curtis (Figura 3E) e análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS‐DA) (Figura S2B). Descobrimos que os quatro grupos foram agrupados em grupos distintos com estimativas de β‐diversidade, conforme avaliado pelos testes ANOSIM (R = 0,772, p = 0,001).
Para obter uma visão mais aprofundada das alterações da microbiota após a administração de Maca‐EVs, realizamos a análise discriminante linear com tamanho do efeito (LEfSe) para comparar a composição microbiana no nível de OTU do DNA recombinante 16S. O diagrama de Venn (Figura S2A) mostrou que 444 OTUs foram compartilhadas entre os grupos Controle e Controle + Maca‐EVs, enquanto 494 foram exclusivas do grupo Controle e 222 do grupo Controle + Maca‐EVs. Entre os grupos Controle e UCMS, 578 OTUs foram compartilhadas, enquanto 360 foram exclusivas do grupo Controle e 375 do grupo UCMS. Entre os grupos UCMS e UCMS + Maca‐EVs, 471 OTUs foram compartilhadas, enquanto 382 foram exclusivas do grupo UCMS e 209 do grupo UCMS + Maca‐EVs. Agrupamos Controle, Controle + Maca‐EVs e UCMS + Maca‐EVs em um novo grupo chamado New_Control. Um total de 11 OTUs que diferiram significativamente entre os grupos New_Control e UCMS (p < 0,05; análise discriminante linear > 4,0) foram mostradas na Figura 3F, das quais 1 OTU foi enriquecida no grupo New_Control e 10 no grupo UCMS. Entre essas OTUs diferenciais, 2 OTUs pertencem à ordem Lactobacillales, que são Lactobacillaceae e Enterococcaceae no nível de família. Para investigar melhor quais OTUs estavam associadas a sintomas depressivos, selecionamos quatro bactérias típicas (Figura 3G–J) que diferiram significativamente entre os grupos New_Control e UCMS para observar suas mudanças de abundância entre os quatro grupos. Além disso, selecionamos quatro bactérias típicas que foram significativamente diferentes entre os grupos Controle e UCMS (Figura S2C–F).
Dado que o microbioma intestinal frequentemente modula a via metabólica do hospedeiro, aqui utilizamos metabolômica baseada em cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS) para comparar as características metabólicas dos quatro grupos. Para detectar mais metabólitos, a metabolômica não direcionada foi realizada em dois modos, íon positivo (pos) e íon negativo (neg). Análise de componentes principais e PLS-DA foram conduzidas para avaliar as mudanças nas assinaturas metabólicas fecais entre diferentes grupos (Figura S3A–D). Especificamente, a Figura S3A,S3B foi obtida a partir do modo pos, a Figura S3C,S3D foi obtida a partir do modo neg. No geral, os resultados mostraram separação espacial das assinaturas metabólicas entre os quatro grupos, particularmente entre o grupo New_Control e o grupo UCMS, indicando diferenças composicionais entre eles. No modo pos, 63 metabólitos diferenciais foram identificados entre os grupos New_Control e UCMS (importância variável na projeção [VIP] > 1, p < 0,05, |log FC| > 1) (Figura 4A). Estes incluíram Vanilina, l-5-hidroxitriptofano, ácido 4-(2,3-di-hidro-1,4-benzodioxin-6-il) butanoico, ácido 6-metóxi-2-naftoico enriquecidos no grupo New_Control, e Prostaglandina I2, Lisops 22:5, N-acetilornitina, ácido N-acetilaspártico enriquecidos no grupo UCMS. No modo neg (Figura S3G), 47 metabólitos diferenciais foram encontrados entre os grupos New_Control e UCMS (VIP > 1, p < 0,05, |log FC| > 1). Metabólitos enriquecidos no grupo New_Control incluíram N-isobutirilglicina, N-acetilalanina, ácido pantotênico, ácido 2-ceto-4-metiltiobutírico, entre outros, enquanto metabólitos enriquecidos no grupo UCMS incluíram lisofosfatidiletanolamina 18:1, Apigenina, Sacarina, ácido 5-metoxissalicílico, entre outros. Selecionamos quatro metabólitos típicos (Vanilina, l-5-hidroxitriptofano [5-HTP], ácido 4-(2,3-di-hidro-1,4-benzodioxin-6-il) butanoico e ácido 6-metóxi-2-naftoico) que diferiram significativamente entre os grupos New_Control e UCMS e analisamos suas mudanças entre os quatro grupos (Figura 4B–E). A análise de enriquecimento de vias indicou que o UCMS causou alterações importantes nas vias metabólicas relacionadas ao metabolismo de biotina, pirimidina, tirosina, alanina, aspartato e glutamato (Figura S3E). Pela ação da triptofano hidroxilase, o triptofano é convertido em 5-hidroxitriptofano (5-HTP), que é então convertido em 5-HT pela 5-HTP descarboxilase (Figura S3F). Em nossa análise metabolômica, descobrimos que a quantidade de 5-HTP nessa via foi significativamente menor no grupo UCMS, mas maior no grupo UCMS + Maca-EVs (Figura 4C), sugerindo que o UCMS pode afetar a biossíntese de 5-HT. Em conjunto, esses resultados sugerem que os metabólitos estão associados a grupos distintos.
Efeitos das Maca‐EVs na metabolômica das fezes de camundongos controle e UCMS. (A) Metabólitos diferenciais entre os grupos New_Control e UCMS (VIP > 1, p < 0,05, |log FC| > 1) no modo positivo. (B–E) Os níveis de quatro metabólitos típicos que diferiram significativamente entre os grupos New_Control e UCMS entre os grupos amostrais. (F) Interações recíprocas entre bactérias intestinais alteradas e metabólitos séricos identificadas por uma rede de coocorrência baseada na análise de correlação de Spearman no modo positivo. EV, vesícula extracelular; UCMS, estresse crônico imprevisível leve. VIP, importância da variável na projeção.

Análise de rede de coocorrência entre a microbiota intestinal e metabólitos fecais

Para investigar as potenciais interações recíprocas entre bactérias intestinais alteradas e metabólitos, uma rede de coocorrência foi construída com base na análise de correlação de Spearman (Figura 4F). No modo positivo, descobrimos que o gênero Lactobacillus formou uma forte relação de coocorrência com metabólitos fecais atribuídos a ácido 2‐piperidinobenzoico, R‐1 metanandamida fosfato, polifosfato quinase (PPK), ácido isohomovanílico e N6‐acetil‐l‐lisina. O gênero Enterococcus formou uma forte relação de coocorrência com metabólitos fecais atribuídos a lisofosfatidilcolina (LPC) 15:0, D‐(‐)‐Salicina, ACar 16:1, 4‐Pregneno‐17,20‐Diol‐3‐Ona, leucina (L)‐asparagina (N)‐lisina (K) (LNK), N6‐acetil‐l‐lisina. O gênero Escherichia_Shigella formou uma forte relação de coocorrência com metabólitos fecais atribuídos a pregnenolona, delta‐tridecalactona, estropipato, 2‐desoxiuridina e desoxicitidina. O gênero Lactobacillus foi positivamente correlacionado com PPK, N6‐acetil‐l‐lisina, e negativamente correlacionado com ácido 2‐piperidinobenzoico, R‐1 metanandamida fosfato e ácido isohomovanílico. O gênero Enterococcus foi positivamente correlacionado com 4‐Pregneno‐17,20‐Diol‐3‐Ona, LNK e N6‐acetil‐l‐lisina, e negativamente correlacionado com LPC 15:0, D‐(‐)‐Salicina e ACar 16:1. O gênero Escherichia_Shigella foi positivamente correlacionado com 2‐desoxiuridina e desoxicitidina, e negativamente correlacionado com pregnenolona, delta‐tridecalactona e estropipato. Em conjunto, os gêneros Enterococcus, Lactobacillus e Escherichia_Shigella alterados foram mapeados para o metabolismo da biotina e pirimidina no modo positivo. Também podemos ver a rede de coocorrência no modo negativo, que mostrou que os gêneros Enterococcus, Lactobacillus e Escherichia_Shigella alterados foram mapeados para o metabolismo da tirosina, alanina, aspartato e glutamato (Figura S3F,G). Notavelmente, esses achados indicam que a microbiota intestinal e os metabólitos alterados formaram uma rede de coocorrência sinérgica e relacionada a nós entre os grupos New_Control e UCMS.
Como os metabolismos alterados identificados foram intimamente associados à produção de 5‐HT, investigamos se os Maca‐EV modulam a produção de neurotransmissores monoaminérgicos. Coletamos o soro dos camundongos após a conclusão dos testes comportamentais para medir os níveis dos três principais neurotransmissores monoaminérgicos (5‐HT, NE e DA) via HPLC. Os sinais de NE e DA estavam muito baixos para quantificar. Observamos níveis séricos de 5‐HT significativamente reduzidos nos camundongos UCMS em comparação com os camundongos controle, confirmando o estabelecimento bem-sucedido do modelo UCMS (Figura 5A,B). A administração de Maca‐EV aumentou dramaticamente os níveis séricos de 5‐HT no modelo UCMS em todas as doses. Os níveis séricos de NE e DA significativamente elevados nos camundongos UCMS foram observados quando tratados com Maca‐EV a partir de doses de 100 a 200 μg/kg. Enquanto os níveis séricos das citocinas inflamatórias IL‐1β, IL‐6 e TNF‐α estavam aumentados nos camundongos UCMS em comparação com os camundongos controle, as diferenças não foram significativas (Figura 5C–E). Na dose de 200 μg/kg, Maca‐EV reduziu significativamente os níveis séricos de TNF‐α, enquanto a diminuição na expressão de IL‐1β e IL‐6 não foi estatisticamente significativa. Coletivamente, os níveis séricos de neurotransmissores monoaminérgicos, particularmente 5‐HT, podem contribuir para os efeitos antidepressivos dos Maca‐EV.
Análises das expressões de neurotransmissores monoaminérgicos e citocinas inflamatórias no soro. (A) Os cromatogramas UPLC‐MS/MS dos fatores monoaminérgicos, incluindo 5‐HT no padrão e no soro de camundongos controle e UCMS com os tratamentos indicados com Maca‐EV. (B) Dados quantitativos sobre as concentrações de 5‐HT no soro de camundongos controle e UCMS com os tratamentos indicados com Maca‐EV. Dados quantitativos sobre as concentrações das citocinas inflamatórias, incluindo IL‐1β (C), IL‐6 (D) e TNF‐α (E) no soro de camundongos controle e UCMS com os tratamentos indicados com Maca‐EV. Todos os dados são apresentados como média ± EPM (n = 3–11 experimentos para cada grupo). A significância foi avaliada por análise de variância (ANOVA) de uma via comum seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey em (B, C, E) e pelo teste de Kruskal‐Wallis seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunn em (D). As médias indicadas por uma letra diferente indicaram diferenças significativas entre os grupos (p < 0,05). 5‐HT, serotonina; EV, vesícula extracelular; IL, interleucina; MS, espectrometria de massas; EPM, erro padrão da média; UCMS, estresse crônico imprevisível moderado; UPLC, cromatografia líquida de ultraeficiência.
Maca‐EV atenuam a diminuição da expressão de BDNF ao ativar a via de sinalização GTP‐Cdc42/ERK no hipocampo e córtex de camundongos UCMS
A coregulação da sinalização de 5‐HT e BDNF é bem estabelecida, onde a 5‐HT ativa a expressão de BDNF, essencial para o crescimento e sobrevivência dos neurônios 5‐HT. Sinalizações anormais de 5‐HT e BDNF estão associadas à progressão da depressão. A administração de Maca‐EVs na dose de 200 μg/kg aumentou significativamente os níveis séricos de 5‐HT, levando-nos a investigar se isso aumentaria a expressão de BDNF nos camundongos UCMS. Usando imunofluorescência e análise de WB, confirmamos a redução da expressão de BDNF no hipocampo (Figura 6A,B) e córtex (Figura S4A,B) dos camundongos UCMS, que foi atenuada pela administração de Maca‐EVs. Para explorar melhor o mecanismo subjacente, examinamos a via de sinalização GTP‐Cdc42/ERK que regula a expressão de BDNF. A análise de WB revelou uma razão aumentada de GTP‐Cdc42/Cdc42 e p‐ERK/ERK no hipocampo (Figura 6C) e córtex (Figura S4C) dos camundongos UCMS tratados com Maca‐EVs em comparação com os camundongos UCMS tratados com solução salina. Esses resultados sugerem que Maca‐EVs atenuam a diminuição da expressão de BDNF ao acionar a sinalização de GTP‐Cdc42/ERK no hipocampo e córtex de camundongos UCMS.
Maca‐EVs modularam a sinalização de BDNF/GTP‐Cdc42/ERK e TrkB/AKT no hipocampo de camundongos via 5‐HT. (A) Imagens representativas de imunofluorescência das expressões de BDNF no hipocampo de camundongos controle, tratados com Maca‐EVs (200 μg/kg) ou camundongos UCMS não tratados. Barra de escala: 50 μm. Imagens de western blot e dados quantitativos das expressões de BDNF (B), atividade da enzima Cdc42, p‐ERK e ERK (C), TrkB, p‐AKT e AKT (D) no hipocampo de camundongos controle, camundongos UCMS não tratados ou tratados com Maca‐EVs (200 μg/kg). (E) Imagens representativas de imunofluorescência das células NeuN no hipocampo de camundongos controle, tratados com Maca‐EVs (200 μg/kg) ou camundongos UCMS não tratados. A caixa tracejada amarela indica a zona do giro denteado do hipocampo. Barra de escala: 50 μm. (F) Células PC12 foram tratadas com 5‐HT ou ML141 (um inibidor de GTP‐Cdc42) por 12 h e cultivadas por mais 24 h. Imagens de western blot e dados quantitativos das expressões de GTP‐Cdc42, Cdc42, p‐ERK e ERK em células PC12 são mostrados. Imunofluorescência (G) e análise de western blot (H) das expressões de BDNF em células PC12. Barra de escala: 50 μm. Imagens de western blot e dados quantitativos das expressões de TrkB (I), p‐AKT e AKT (J) em células PC12. Todos os dados são apresentados como média ± SEM (n = 3 experimentos para cada grupo). A significância foi avaliada por análise de variância (ANOVA) de uma via comum seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey em (B, C, D, F, H, I, J). ns, não significativo, p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 entre dois grupos indicados. 5‐HT, serotonina; BDNF, fator neurotrófico derivado do cérebro; DAPI, 4′,6‐diamidino‐2‐fenilindol; EV, vesícula extracelular; SEM, microscópio eletrônico de varredura; UCMS, estresse crônico leve imprevisível.
Maca‐EVs mitigam a diminuição do número de neurônios via modulação da sinalização TrkB/AKT no hipocampo e córtex de camundongos UCMS
Além disso, investigamos se a expressão aumentada de BDNF modula o crescimento de neurônios em camundongos UCMS. O BDNF interage com seu receptor tirosina quinase B (TrkB) e inicia a sinalização downstream de AKT para manter o crescimento neuronal. Observamos expressão reduzida de TrkB e aumento da razão p‐AKT/AKT nos camundongos UCMS, que foram significativamente resgatados pela administração de Maca‐EVs (Figuras 6D e S4D,E). A imunocoloração revelou que a administração de Maca‐EVs promoveu o crescimento de neurônios na zona do giro denteado de camundongos UCMS, que estava diminuído (Figuras 6E e S4F). Portanto, os dados demonstraram que Maca‐EVs mitigaram a diminuição do número de neurônios via modulação da sinalização TrkB/p‐AKT no córtex e hipocampo de camundongos UCMS.
A 5‐HT induz a expressão de BDNF e a subsequente ativação da sinalização TrkB/AKT via modulação da via GTP‐Cdc42/ERK in vitro
Para determinar se a ativação da 5‐HT regula a atividade da GTP‐Cdc42, tratamos células PC12 com ML141, um inibidor de GTP‐Cdc42, e observamos uma diminuição significativa na razão GTP‐Cdc42/Cdc42 e p‐ERK/ERK (Figura 6F). Também descobrimos que o aumento da expressão de BDNF induzido pela 5‐HT foi mitigado pelo tratamento com ML141 (Figura 6G,H), indicando que a 5‐HT estimula a expressão de BDNF através da modulação da via GTP‐Cdc42/ERK. Além disso, o tratamento com ML141 bloqueou a sinalização subsequente TrkB/AKT da 5‐HT, evidenciado pela diminuição da expressão de TrkB e da razão p‐AKT/AKT (Figura 6I,J). Esses dados sugerem que a 5‐HT ativa a via GTP‐Cdc42/ERK para estimular a expressão de BDNF e a subsequente ativação da sinalização TrkB/AKT.
DISCUSSÃO
Até onde sabemos, somos os primeiros a isolar e caracterizar com sucesso EVs de Maca. As Maca‐EVs exibiram características semelhantes às EVs derivadas de células animais e podem atravessar a BBB. A injeção intravenosa de Maca‐EVs reduziu notavelmente os comportamentos depressivos em camundongos UCMS. Nossa análise, utilizando 16S rRNA e metabolômica baseada em GC‐MS, identificou que Maca‐EVs alteraram a composição da microbiota fecal relacionada à depressão e melhoraram os metabolismos associados à produção de 5‐HT em camundongos UCMS. Isso sugere o potencial das Maca‐EVs em modular o eixo intestino–cérebro. Além disso, descobrimos que Maca‐EVs aumentaram significativamente os níveis séricos de 5‐HT, que estavam diminuídos em camundongos UCMS, conforme determinado por análise de HPLC. Experimentos in vivo e in vitro revelaram que a 5‐HT estimula a expressão de BDNF e a consequente ativação da sinalização BDNF/TrkB/AKT, o que pode contribuir para os efeitos antidepressivos das Maca‐EVs.
A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) tem sido amplamente utilizada no tratamento da depressão, especialmente na Ásia. Os mecanismos moleculares subjacentes à ação da MTC envolvem a regulação da transmissão monoaminérgica, do eixo hipotálamo‐hipófise‐adrenal, de neurotrofinas, como o BDNF, bem como do número e função das sinapses. O extrato de Maca tem sido relatado como possuindo efeitos neuroprotetores e antidepressivos atribuídos à sua atividade antioxidante. Estudos posteriores identificaram as macamidas como os constituintes ativos responsáveis pela neuroproteção ao inibir a hidrolase de amida de ácidos graxos, que regula a proliferação de células progenitoras neurais. Além disso, o extrato de Maca tem sido sugerido como tendo propriedades anti‐inflamatórias ao reduzir a citocina inflamatória IL‐6 em usuários de Maca. No entanto, os mecanismos moleculares precisos da Maca e de seu extrato no tratamento da depressão ainda precisam ser elucidados.

Nas últimas décadas, os PDEVs, que são vesículas esféricas, ovais ou em forma de taça contendo elementos biologicamente ativos, incluindo lipídios, proteínas, ácidos nucleicos e metabólitos secundários, ganharam atenção substancial no desenvolvimento de medicamentos terapêuticos. Estudos crescentes in vitro e in vivo têm mostrado que os PDEVs possuem atividades anticancerígenas, anti‐inflamatórias, antioxidantes e regenerativas. Notavelmente, Teng et al. identificaram que o microRNA (miRNA) de PDEVs derivados do gengibre pode ter como alvo o genoma da bactéria intestinal Lactobacillus rhamnosus para produzir mais indol‐3‐carboxaldeído, que promove a secreção de IL‐22, melhorando a função de barreira intestinal. Apesar de estudos pré‐clínicos promissores, a tradução dos PDEVs do laboratório para a prática clínica ainda está em estágio inicial. Atualmente, a Universidade de Louisville conduziu três ensaios clínicos (NCT04879810, NCT01668849 e NCT01294072) usando quatro tipos de PDEVs (curcumina, gengibre, babosa e uva). No entanto, os resultados completos desses ensaios clínicos ainda não foram relatados. Portanto, esforços significativos são necessários para focar no isolamento, purificação, caracterização físico‐química, controle de qualidade, segurança e vias de administração dos PDEVs.
Nosso grupo isolou anteriormente EVs de Momordica charantia, um fruto da planta Cucurbitaceae, e demonstrou seu potencial terapêutico no tratamento de isquemia/reperfusão cerebral e doença cardíaca induzida por radiação. Portanto, nosso objetivo foi isolar EVs de Maca preta e investigar seu potencial antidepressivo em um modelo de camundongos UCMS, juntamente com os mecanismos relevantes. Isolamos com sucesso as Maca-EVs por centrifugação em gradiente, que exibiram características semelhantes às EVs derivadas de células animais (Figura 1A–D). Usamos o corante fluorescente lipofílico Dil, amplamente utilizado para marcar EVs, para caracterizar e monitorar a captação celular ou distribuição tecidual das Mca-EVs. A imagem in vivo mostrou que as Dil-Maca-EVs atravessaram eficientemente a BHE e apresentaram maior densidade fluorescente no cérebro dos camundongos (Figura 1E,F). Além disso, demonstramos a eficácia das Maca-EVs no tratamento de camundongos UCMS deprimidos usando testes comportamentais, como teste de suspensão pela cauda, teste de natação forçada, teste de campo aberto e teste de consumo de sacarose, exceto pela regulação da preferência por sacarose (Figura 2).
O eixo intestino‑cérebro representa a comunicação bidirecional entre os sistemas nervoso central e digestivo, envolvendo neurotransmissores, vias neuroimunes, neuroendócrinas e neurais sensoriais. Uma grande quantidade de dados apoiou o papel da conexão do eixo intestino‑cérebro no contexto patológico da depressão. O transplante de microbiota fecal de pacientes deprimidos induziu comportamentos semelhantes à depressão e características fisiológicas em ratos com microbiota depletada, sugerindo um papel causal da microbiota intestinal no desenvolvimento da depressão. Adicionalmente, esforços crescentes têm sido dedicados a descrever as características da composição e do metabolismo da microbiota em pacientes deprimidos. Raes et al. descobriram que as bactérias produtoras de butirato Faecalibacterium e Coprococcus estavam ausentes em pacientes com depressão. Neste estudo, descobrimos que o gênero Lactobacillus apresentou maior abundância em camundongos UCMS, enquanto a abundância de Akkermansia, Dubosiella e Faecalibaculum foi maior em camundongos Controle do que em camundongos UCMS, sugerindo seu possível papel nos efeitos antidepressivos das Maca‑EVs (Figura 3A,B). Além disso, a α‑diversidade e a β‑diversidade da microbiota variaram nos quatro grupos (Figura 3C–E). Ao reagrupar Controle, Controle + Maca‑EVs e UCMS + Maca‑EVs em um novo grupo (New_Control), demonstramos ainda que a administração de Maca‑EVs reduziu a abundância de g_Enterococcus e g_Lactobacillus, que estavam aumentadas em camundongos UCMS (Figura 3G,H). A maioria das análises da microbiota intestinal humana identificou que a abundância de g_Enterococcus e g_Lactobacillus estava reduzida em pacientes deprimidos. No entanto, sua abundância em camundongos deprimidos não chegou a um consenso. A abundância de g_Enterococcus e g_Lactobacillus foi encontrada aumentada no estudo de Bharwani et al., mas diminuída nos estudos de Farshim et al. e Galley et al.. É preciso admitir que houve inconsistências na abundância, α‑diversidade e β‑diversidade da composição da microbiota intestinal devido a diferenças individuais e entre espécies. Yang et al. descreveram g_Bacteroides notavelmente elevado e g_Blautia e g_Eubacterium diminuídos, com metabolismo alterado de γ‑aminobutirato, fenilalanina e triptofano em pacientes com transtorno depressivo maior. Aqui, a análise de enriquecimento de vias indicou que as principais alterações do UCMS na via metabólica foram mapeadas para o metabolismo de biotina, pirimidina, tirosina, alanina, aspartato e glutamato (Figuras 4F e S3E). Além disso, o nível do produto relacionado ao metabolismo da tirosina, l‑5‑hidroxitriptofano, diminuiu em camundongos UCMS, mas aumentou com a administração de Maca‑EVs (Figura 4C). Estes achados sugerem que as Maca‑EVs aumentam os níveis séricos de 5‑HT através da modulação da composição e do metabolismo da microbiota intestinal.
Neurotransmissores excitatórios ou inibitórios desempenham um papel essencial na regulação homeostática da excitabilidade neuronal, conferindo funções cerebrais normais. A teoria de que níveis ou atividade reduzidos do neurotransmissor excitatório 5-HT estão associados à depressão continua influente. Recentemente, Moncrieff et al. sugeriram que níveis ou atividade reduzidos de 5-HT podem não ser a causa da depressão. No entanto, os medicamentos atualmente prescritos para tratar a depressão funcionam principalmente elevando os níveis dos neurotransmissores excitatórios 5-HT, NE e DA em todo o corpo. Rizzo et al. demonstraram que o inibidor seletivo da recaptação de serotonina, fluoxetina, aumentou as expressões de 5-HT, promovendo a proliferação de células-tronco neurais, o que foi revertido pelo antagonismo do receptor de 5-HT. Em nosso estudo, todas as doses de Maca-EVs aumentaram significativamente os níveis séricos de 5-HT nos camundongos UCMS (Figura 5B). Disfunções imunes inatas e adaptativas demonstraram estar envolvidas na fisiopatologia da depressão. Grosse et al. determinaram que a expressão gênica de monócitos estava relacionada à idade em pacientes com transtorno depressivo maior. Assim, investigamos se as Maca-EVs modularíam as respostas inflamatórias examinando três citocinas inflamatórias séricas específicas, IL-1β, IL-6 e TNF-α, que demonstraram estar positivamente associadas à depressão. Em nosso modelo, níveis séricos aumentados de IL-1β, IL-6 e TNF-α foram detectados nos camundongos UCMS, mas não foram estatisticamente significativos (Figura 5C–E). Isso pode ser porque testamos os fatores inflamatórios em uma fase tardia da indução da depressão. No entanto, as Maca-EVs diminuíram significativamente os níveis de IL-6 e TNF-α apenas na dose de 200 μg/kg. Esses dados sugeriram que a sinalização de 5-HT é mais sensível ao tratamento com Maca-EVs, e nos concentramos a seguir em sua ação no tratamento de camundongos UCMS deprimidos neste estudo.
Existem efeitos sinérgicos entre 5‐HT e BDNF na modulação da plasticidade sináptica, onde 5‐HT desencadeia as expressões de BDNF, e o BDNF melhora o crescimento e a sobrevivência dos neurônios 5‐HT e mantém a plasticidade sináptica no cérebro adulto. A ativação da sinalização de 5‐HT requer a interação com os receptores de 5‐HT, que não apenas estão acoplados, mas também ativam a via relacionada às proteínas G (Rho, Rac e Cdc42). Udo et al. demonstraram que o 5‐HT ativou GTP‐Cdc42 em neurônios sensoriais de aplysia, promovendo o crescimento sináptico relacionado ao aprendizado. Elena et al. identificaram que a ativação do receptor de 5‐HT leva à formação de filopódios através de uma via mediada por Cdc42, acompanhada de arredondamento celular relevante para RhoA em células de neuroblastoma. Errico et al. e Speranza et al. mostraram que a ativação da sinalização de 5‐HT aumentou a função neuronal através da via ERK. Outros também identificaram que o isômero (R)‐cetamina exerce efeitos antidepressivos através da ativação da via ERK‐NRBP1‐CREB‐BDNF. De fato, razões elevadas de GTP‐Cdc42/Cdc42 e p‐ERK/ERK, e expressão de BDNF foram observadas no córtex e hipocampo de camundongos UCMS injetados com Maca‐EVs (Figuras 6A–C e S4A–C). Evidências sugerem que a sinalização de BDNF através de seu receptor TrkB é necessária para os efeitos dos medicamentos antidepressivos. Adachi et al. descobriram que a ausência de TrkB, mas não a deleção de BDNF, causou capacidade reduzida no tratamento da depressão. He et al. mostraram que a Alpinia oxyphylla Miq. promoveu a neurogênese hipocampal através da ativação da via de sinalização BDNF/TrkB/AKT. Da mesma forma, também descobrimos que os Maca‐EVs aumentaram a expressão de TrkB e AKT fosforilada no córtex e hipocampo de camundongos UCMS (Figuras 6D e S4D,E). O ensaio in vitro confirmou ainda que 5‐HT aumentou a expressão de BDNF e a consequente estimulação da sinalização de TrkB/AKT através da via GTP‐Cdc42/ERK (Figura 6F–J).
Infelizmente, apenas isolamos inicialmente os Maca‐EVs e investigamos o efeito antidepressivo. Observamos que os Maca‐EVs poderiam influenciar a composição da microbiota fecal e elevar os níveis séricos de 5‐HT, levando ao aumento da expressão de BDNF através da ativação da via de sinalização GTP‐Cdc42/ERK. As células enterocromafins da mucosa intestinal são o local primário para a síntese, armazenamento e liberação de 5‐HT. Revelamos um papel potencial dos Maca‐EVs na modulação da microbiota fecal/metabólito para produzir 5‐HT, o que requer mais experimentos para esclarecer. No entanto, os EVs podem atravessar a BHE e podem exercer suas atividades terapêuticas antidepressivas afetando diretamente o cérebro ou através da via periférica. Neste estudo, focamos apenas nos efeitos dos Maca‐EVs na modulação do eixo intestino‐cérebro. A administração de Maca‐EVs por gavagem ou entrega direcionada ao cérebro será empregada em estudos futuros para elucidar os mecanismos subjacentes dos Maca‐EVs no tratamento da depressão.
Existem várias outras limitações no presente estudo. Primeiro, as Maca‐EVs produzem efeitos semelhantes aos antidepressivos, similares aos da Maca ou de seu extrato, possivelmente porque as Maca‐EVs os contêm. Notavelmente, o tamanho nanométrico das Maca‐EVs (<200 nm) permite que elas superem as desvantagens dos componentes do extrato de Maca, como polissacarídeos, proteínas e alcaloides (que são de alto peso molecular e insolúveis), permitindo assim que atravessem a barreira hematoencefálica (BHE) ou a barreira intestinal. No entanto, estudos ômicos completos devem ser realizados para compreender os constituintes biologicamente ativos, como ácidos nucleicos, proteínas, lipídios e metabólitos secundários, a fim de validar essa especulação. Além disso, os elementos-chave que conferem o mecanismo antidepressivo das Maca‐EVs permanecem inexplorados. Recentemente, EVs contendo miRNAs têm atraído enorme interesse em aplicações comerciais como a próxima geração de medicamentos. No entanto, um único miRNA pode não ser tão eficaz quanto múltiplos miRNAs. Ocasionalmente, mesmo que alguns miRNAs revelem excelente capacidade terapêutica, é desafiador desenvolvê-los como medicamentos devido à sua fácil degradação, múltiplos alvos e ao potencial risco de segurança biológica. Por exemplo, o ensaio clínico de Fase 1 (NCT02862145) sobre a avaliação da eficácia do MRX34 (miRNA‐34) no tratamento de melanoma foi retirado devido a eventos adversos graves relacionados ao sistema imunológico. Estudos emergentes apontaram que a atividade terapêutica das EVs se origina dos efeitos sinérgicos de seus conteúdos. Assim, parece ser menos importante identificar o elemento preciso que desempenha um papel essencial na função das EVs. Em segundo lugar, apenas desvendamos o papel da 5‐HT/BDNF na atividade antidepressiva das Maca‐EVs. Além do BDNF, outros fatores neurotróficos, incluindo fator de crescimento endotelial vascular, fator de crescimento de fibroblastos 2, fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 e Activina‐A, também são de interesse para estudo. Os mecanismos envolvidos em outros dois neurotransmissores monoaminérgicos elevados em efeitos antioxidantes ou anti-inflamatórios requerem investigação adicional. Por último, um teste de sacarose que pode afetar a composição da flora intestinal foi conduzido para avaliar o comportamento de depressão, embora nossos dados tenham mostrado que as Maca‐EVs não influenciaram o nível de preferência por sacarose. Em estudos futuros, evitaremos esses pontos técnicos ao investigar o mecanismo exato das Maca‐EVs na modulação do eixo intestino-cérebro e suas associações com a terapêutica das Maca‐EVs no tratamento da depressão.
CONCLUSÃO
Em conjunto, este estudo relata pela primeira vez o isolamento e a caracterização bem-sucedidos de Maca-EVs, que exibem efeitos antidepressivos em camundongos UCMS. Esses efeitos foram acompanhados por alteração na microbiota fecal relacionada à depressão e aumento do metabolismo intestinal de 5-HT, bem como elevação das concentrações séricas de 5-HT. Demonstramos que as Maca-EVs aumentam as expressões de BDNF reguladas por 5-HT ao ativar o eixo BDNF/TrkB/AKT. Esses dados sugerem que a regulação do eixo intestino-cérebro pelas Maca-EVs pode ser um elemento de seus mecanismos terapêuticos. Dada a capacidade dos PDEVs de atravessar a BHE, as Maca-EVs representam uma plataforma promissora para o tratamento da depressão. No entanto, são necessários estudos adicionais para avaliar completamente a segurança e eficácia dessa abordagem antes da aplicação clínica.
CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES
Su-Hua Qi e Bing Gu conceberam e delinearam este estudo. Rui Hong, Lan Luo, Liang Wang e Zhao-Li Hu realizaram experimentos com animais e/ou analisaram dados e/ou prepararam as figuras. Rong-Qi Yin, Ming Li, Bin Gu e Bin Wang analisaram dados. Tao Zhuang e Xin-Yue Zhang realizaram experimentos com animais. Wan Wang, Yuan Zhou e Lin-Yan Huang auxiliaram no estudo. Rui Hong, Lan Luo e Liang Wang escreveram a primeira versão do manuscrito com contribuições dos coautores. Su-Hua Qi e Bing Gu revisaram o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
DECLARAÇÃO DE CONFLITO DE INTERESSES
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
DECLARAÇÃO DE ÉTICA
O pedido de ética (No. 202006W037) foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Médica de Xuzhou.
Informações de suporte
DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS
Uma declaração de disponibilidade de dados confirma a presença ou ausência de dados compartilhados. Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo e em seus arquivos suplementares. Materiais suplementares (figuras, tabelas, scripts, resumo gráfico, slides, vídeos, versão traduzida para o chinês e materiais de atualização) podem ser encontrados no DOI online ou no iMeta Science http://www.imeta.science/.
REFERÊNCIAS
Prevalência Global e Carga de Transtornos Depressivos e de Ansiedade em 204 Países e Territórios em 2020 Devido à Pandemia de COVID-19
Uma Hipótese de Sinapse Excitatória da Depressão
Depressão como uma Doença Microglial
Mecanismos Neuroimunes da Depressão
O Papel dos Receptores de 5-HT na Depressão
Antidépresseurs et tolérance: déterminants et prise en charge des principaux effets indésirables
Impacto do Citalopram no Sistema HPA. Um Estudo do Teste Combinado DEX/CRH em 30 Pacientes com Depressão Unipolar
Eixo Cérebro-Intestino-Microbiota na Depressão: Uma Visão Geral Histórica e Direções Futuras
Um Papel Chave do Nervo Vago Subdiafragmático no Fenótipo Semelhante à Depressão e Composição Anormal da Microbiota Intestinal em Camundongos Após Administração de Lipopolissacarídeo
Ingestão de Lactobacillus intestinalis e Lactobacillus reuteri Causa Fenótipos Semelhantes à Depressão e Anedonia em Camundongos Tratados com Antibióticos Através do Nervo Vago
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BDNF e 5-HT: Uma Dupla Dinâmica na Plasticidade Neuronal Relacionada à Idade e nos Distúrbios Neurodegenerativos
Medicina Tradicional Chinesa no Tratamento da Depressão: Das Moléculas aos Sistemas
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O Antagonismo do Receptor 5-HT1A Reverte e Previne a Disfunção Sexual Induzida por Fluoxetina em Ratos
A Relação Bidirecional entre Depressão e Inflamação: Problema Duplo
Características Clínicas da Depressão Associada à Inflamação: A Expressão Gênica de Monócitos Está Relacionada à Idade no Transtorno Depressivo Maior
IL‐1β, IL‐6, TNF‐α e PCR em Pacientes Idosos com Depressão ou Doença de Alzheimer: Revisão Sistemática e Metanálise
Regulação Induzida pela Serotonina da Rede de Actina para o Crescimento Sináptico Relacionado ao Aprendizado Requer Cdc42, N‐WASP e PAK em Neurônios Sensoriais de Aplysia
O Receptor 5‐HT7 Está Acoplado às Subunidades Gα da Proteína G12 Heterotrimérica para Regular a Transcrição Gênica e a Morfologia Neuronal
Os Receptores 5‐HT7 Ativam a Quinase Relacionada ao Sinal Extracelular de Proteína Quinase Ativada por Mitógeno em Neurônios Hipocampais de Ratos Cultivados
O Receptor de Serotonina 7 Promove o Crescimento de Neuritos Através das Vias de Sinalização ERK e Cdk5
Sinalização Microglial ERK‐NRBP1‐CREB‐BDNF nas Ações Antidepressivas Sustentadas da (R)‐Cetamina
Efeitos Antidepressivos Independentes do Alvo Mecanístico da Rapamicina da (R)‐Cetamina em um Modelo de Estresse por Derrota Social
A Sinalização de TrkB no Núcleo Dorsal da Rafe é Essencial para a Eficácia Antidepressiva e o Comportamento de Agressão Normal
Avanços Terapêuticos dos miRNAs: Uma Atualização Pré‐Clínica e Clínica
Terapêuticas Baseadas em Vesículas Extracelulares: Direcionamento Natural Versus Modificado e Biodistribuição