pmid: "40098911"
title: "Polygala Tenuifolia e Magnolia Officinalis Baseadas no Eixo Intestino-Cérebro Melhoram o Comprometimento Cognitivo Induzido por D-gal em Camundongos Através das Vias de Sinalização cAMP e NF-κB."
authors: "Yang D, Li W, Chen Q, Liu S, Peng C, Deng F, Meng Y, Yang Y, Yan P, Ao H, Huang L"
journal: "Drug design, development and therapy"
pubdate: "2025"
doi: "10.2147/DDDT.S506545"
source: "PMC Full Text"

Polygala Tenuifolia e Magnolia Officinalis Baseadas no Eixo Intestino-Cérebro Melhoram o Comprometimento Cognitivo Induzido por D-gal em Camundongos Através das Vias de Sinalização cAMP e NF-κB.

Autores

Yang D, Li W, Chen Q, Liu S, Peng C, Deng F, Meng Y, Yang Y, Yan P, Ao H, Huang L

Periodico

Drug design, development and therapy (2025)

Conteudo

Eixo Intestino-Cérebro: Polygala Tenuifolia e Magnolia Officinalis Melhoram o Comprometimento Cognitivo Induzido por D-gal em Camundongos por Meio das Vias de Sinalização cAMP e NF-κB
Objetivo
A Polygala tenuifolia Willd. (PT) é comumente utilizada para tratar o comprometimento cognitivo (CC), enquanto a Magnolia officinalis Rehd. et Wils (MO) é frequentemente prescrita para problemas gastrointestinais, bem como para CC. Este estudo busca explorar os impactos e mecanismos por trás da terapia combinada de PT e MO (PM) no tratamento do CC, com base no conceito do eixo intestino-cérebro.
Métodos
Os componentes característicos de PT, MO e PM foram identificados usando cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas em triplo quadrupolo em tandem (UPLC-MS/MS). Um modelo de camundongo foi estabelecido por indução com D-gal, e os efeitos de PT, MO e PM sobre o CC foram avaliados por meio de testes comportamentais, coloração patológica e ensaio imunoenzimático (ELISA). Posteriormente, a farmacologia de rede foi utilizada para analisar os mecanismos potenciais pelos quais a PM melhora o CC, seguida de validação por Western blotting (WB), microscopia eletrônica de transmissão (MET), imunofluorescência (IF) e sequenciamento do gene 16S rRNA.
Resultados
PT, MO e PM podem, cada um, aliviar o declínio cognitivo e os danos neuropatológicos em camundongos tratados com D-gal em graus variados, reduzir a expressão de fatores pró-inflamatórios (TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ, LPS) no soro ou tecido hipocampal e aumentar os níveis de SOD e GSH. A análise de farmacologia de rede e experimentos moleculares confirmaram que a PM regula positivamente a expressão de junções estreitas (TJs), aumenta a expressão de proteínas na via do cAMP e inibe a expressão de p-NF-κB-p65. A PM reverte a disbiose da microbiota intestinal induzida por D-gal, aumenta a abundância de bactérias produtoras de SCFA e diminui a abundância de bactérias produtoras de LPS.
Conclusão
A PM alivia o CC reduzindo a inflamação e o estresse oxidativo, protegendo a barreira hematoencefálica (BHE) e a barreira intestinal, inibindo a via do NF-κB, ativando a via do cAMP e regulando a microbiota intestinal.
Resumo Gráfico
Introdução
CC denota um ou vários déficits nas habilidades cognitivas de uma pessoa, que podem incluir memória, atenção, funções executivas, linguagem e habilidades visuoespaciais. A faixa de gravidade inclui comprometimento cognitivo leve, além de formas moderadas e graves de demência. Atualmente, mais de 55 milhões de indivíduos em todo o mundo são afetados pela demência, com cerca de 10 milhões de novos casos reconhecidos anualmente. Os efeitos da demência são significativos tanto para os indivíduos diagnosticados quanto para suas famílias, representando desafios consideráveis para a sustentabilidade dos cuidados aos idosos e da assistência médica.
O CC pode surgir de uma infinidade de fatores, incluindo notavelmente o envelhecimento, a doença de Alzheimer (DA) e a depressão, sendo a DA uma das formas mais prevalentes de CC. Pesquisas acadêmicas recentes indicam que um desequilíbrio na microbiota intestinal, denominado disbiose, pode desempenhar um papel no início do CC. Estudos em animais utilizando modelos de camundongos mostraram que, quando a microbiota intestinal de camundongos com Alzheimer é transplantada ou quando probióticos são administrados, ocorrem mudanças observáveis na patologia da beta-amiloide (Aβ). Essa descoberta reforça a ideia de que a microbiota intestinal pode influenciar significativamente os processos fundamentais associados à DA. Além disso, numerosos estudos caso-controle observaram mudanças na composição da microbiota intestinal em pessoas diagnosticadas com comprometimento cognitivo leve e DA. O microbioma intestinal serve como um componente essencial da via de comunicação intestino-cérebro, que é uma rede sofisticada que facilita interações entre o cérebro e o sistema digestivo. Através de várias vias e mecanismos, a microbiota intestinal se comunica com o cérebro, o que pode influenciar significativamente a saúde geral do hospedeiro. Estudos recentes destacaram a importância da conexão intestino-cérebro no controle de vários mecanismos fisiológicos e patológicos, incluindo regulação do humor, funcionalidade cognitiva e respostas inflamatórias. O funcionamento desse eixo é influenciado pela microbiota intestinal através da produção de metabólitos específicos, incluindo AGCCs, ácidos biliares secundários e metabólitos derivados do triptofano. Esses metabólitos podem, por sua vez, ter efeitos profundos nas funções cognitivas e nos estados emocionais. Esses resultados indicam coletivamente uma conexão significativa entre a microbiota intestinal e o comprometimento cognitivo, sugerindo que a microbiota intestinal pode ser fundamental no desenvolvimento e na progressão do comprometimento cognitivo, potencialmente facilitada pelos mecanismos do eixo intestino-cérebro.
Atualmente, há uma escassez de opções terapêuticas eficazes para a IC, destacando a importância do diagnóstico precoce e da intervenção oportuna para melhorar o prognóstico e a qualidade de vida geral. Embora existam numerosos estudos sobre medicamentos para tratar o comprometimento cognitivo, fármacos comumente utilizados, como memantina e donepezila, mostraram eficácia limitada na melhora das habilidades cognitivas. A medicina tradicional chinesa oferece múltiplos efeitos-alvo e apresenta poucos efeitos colaterais, o que a torna um método frequentemente utilizado tanto para prevenir quanto para tratar o comprometimento cognitivo, incluindo o uso de extrato de Ginkgo biloba e huperzina A. A PT refere-se à raiz seca de Polygala tenuifolia Willd. da família Polygalaceae, e a MO refere-se à casca da raiz seca e casca dos ramos de Magnolia Officinalis Rehd. et Wils da família Magnoliaceae. Tanto a PT quanto a MO estão registradas inicialmente no "Shennong's Materia Medica", onde a PT é destacada por suas habilidades de acalmar, melhorar a cognição, aliviar o catarro e atuar como antidepressivo. Isso indica que a PT tem um impacto positivo na função cognitiva. Pesquisas contemporâneas mostraram que a PT oferece benefícios protetores para o sistema nervoso central e tem o potencial de aliviar sintomas como déficits de memória, insônia e neurastenia. O componente da PT, Tenuifolina (TEN), demonstrou uma melhora significativa na IC e no aprendizado de memória, sugerindo sua utilidade potencial como agente terapêutico no tratamento da IC. A TEN influencia vários processos biológicos, como impedir o acúmulo de Aβ relacionado a danos neurodegenerativos, diminuir os níveis de acetilcolina, reduzir as respostas neuroinflamatórias, mitigar danos oxidativos às células e bloquear a apoptose dos neurônios. A MO é conhecida por secar a umidade, eliminar o catarro e aliviar a plenitude, razão pela qual é frequentemente usada na medicina tradicional chinesa para tratar distúrbios gastrointestinais. Na medicina tradicional chinesa, a MO também tem sido usada para regular o qi e o sangue, bem como desobstruir os meridianos. Na teoria da Medicina Tradicional Chinesa, o fluxo suave de qi e sangue e os meridianos harmoniosos estão intimamente associados ao estado cognitivo do cérebro. Pesquisas recentes mostraram que a MO tem um efeito substancial no sistema nervoso, exibindo propriedades como atividades antiepilépticas, antidepressivas, antidemência e anti-isquemia cerebral. Os principais ingredientes ativos, magnolol e honokiol, podem penetrar facilmente na BHE. Pesquisas mostraram que a MO pode melhorar os comprometimentos cognitivos em camundongos com DA, estimulando a SIRT3 mitocondrial, sugerindo sua promessa como uma opção de tratamento versátil para distúrbios neurodegenerativos.
O manejo da IC utilizando PM tem sido praticado por muitos anos. Um exemplo é a Decocção Zhu Li, registrada pelo estimado médico da Dinastia Tang, Sun Simiao, em "Qianjin Yaofang", e aplicada para tratar sinais como confusão e dificuldades na fala. De forma similar, a Pílula Wuxie mencionada em "Wai Tai Mi Yao" de Wang Tao tem como alvo sintomas de agitação e confusão mental, ambos indicadores importantes de IC. Ambas as formulações contêm PT e MO, que tradicionalmente têm sido usados para tratar condições neurológicas, esclarecendo assim a aplicação tradicional da PM. Pesquisas anteriores indicaram que a PM pode aumentar a motilidade gastrointestinal, promover o crescimento e a proliferação de células estromais gástricas, reduzir os níveis de NO no antro gástrico, diminuir a expressão de VIP, dificultar a absorção de glicosídeos derivados de PT, facilitando sua eliminação, e regular a microbiota intestinal, inibindo a ativação da via de sinalização PI3K/AKT/NF-κB para aliviar o dano intestinal causado pelo PT. Além disso, a combinação de PT com MO não apenas mantém as propriedades sedativas e expectorantes, mas também as amplifica, resultando em um efeito sinérgico e minimizando os efeitos colaterais. Esta pesquisa explora os mecanismos e efeitos da PM na melhora da IC, conforme informado pelo eixo cérebro-intestino, oferecendo suporte experimental para a aplicação segura e racional da PM. O resumo gráfico ilustra o design geral da pesquisa e os principais achados.
Materiais e Métodos
Produtos Químicos e Reagentes
D-gal (Lote No. 2023042601), metanol especificamente designado para cromatografia (Lote No. 2022032801) e ácido fórmico (Lote No. 2022112001) foram adquiridos da Chengdu Cologne Chemical Co., Ltd. (Sichuan, China). Além disso, acetonitrila grau cromatográfico (Lote No. RBXA1H) foi obtida da SK Chemicals (Gyeonggi-do, Coreia do Sul). Paraformaldeído a 4% (Lote No. GP231030112930) e soro de cabra (Lote No. GA2403012) foram ambos adquiridos da Wuhan Service Biotechnology Co., Ltd. (Wuhan, China). Solução de Nissl (Lote No. 0704A24) foi obtida da Jiangsu Edison Biotechnology Co., Ltd. (Jiangsu, China). TEN (Lote No. 111849–202,207), Poligalaxantona III (Lote No. 111850–202,207), 3,6'-diferuloil sacarose (Lote No. 111848–202,307) e Ácido poligálico (Lote No. 111939–201201) foram adquiridos do Instituto Nacional para Controle de Alimentos e Medicamentos (Pequim, China). Honokiol (Lote No. MUST-17031102) e Magnolol (Lote No. MUST-17020205) foram ambos obtidos da Chengdu Master Biotechnology Co., Ltd. (Sichuan, China). Os kits de TNF-α de camundongo (Lote No. 202402), IL-1β (Lote No. 202402), IL-6 (Lote No. 202405), IFN-γ (Lote No. 202402), LPS (Lote No. 202402), superóxido dismutase (SOD, Lote No. 202402), GSH (Lote No. 202402), cAMP (Lote No. 202405) e SCFA (Lote No. 202405) foram obtidos da Shanghai Fankwei Industrial Co., Ltd. (Xangai, China). O kit de ensaio de proteína BCA (Lote No. 037C1500) foi obtido da Shanghai EpiZyme Biotechnology Co., Ltd. (Xangai, China). Occludina (Catálogo#272260-1-AP), ZO-1 (Catálogo#21773-1-AP), p65 (Catálogo#10745-1-AP) e p-p65 (Catálogo#82335-1-AP) foram todos adquiridos da Wuhan San Ying Biotechnology Co., Ltd. (Wuhan, China). p-PKA (Catálogo#HA721864), PKA (Catálogo#ER64618), p-CREB (Catálogo#ET7107-93), CREB (Catálogo#ET-1601-15), GAPDH (Catálogo#ET1601-4), HRP de cabra anti-coelho (Catálogo#HA1001) e iFluor™ 488 (Catálogo#HA1121) foram todos obtidos da Hangzhou Hua'an Biotechnology Co., Ltd. (Hangzhou, China).

Preparação de Materiais Vegetais e Extratos Aquosos
PT (número do lote: 221101, número do relatório: 5–273-02-221101) e MO (número do lote: 221201, número do relatório: 5–259-02-221201) foram adquiridos da Sichuan Guoqiang Traditional Chinese Medicine Products Co., Ltd. (Sichuan, China). As especificações descritas na edição de 2020 da Farmacopeia da República Popular da China são atendidas tanto pela PT quanto pela MO. As metodologias de extração e a proporção do PM combinado foram baseadas em pesquisas anteriores realizadas por nossa equipe. Utilizamos 50 g de PT juntamente com 100 g de MO. PT e MO foram combinados com dez vezes o seu volume de água destilada, deixados de molho por 30 minutos e então levados à fervura. Após atingir a fervura, o fogo foi reduzido; PT foi cozido em fogo baixo por uma hora, então filtrado e concentrado sob pressão reduzida para produzir 50 mL, enquanto MO continuou a cozinhar em fogo baixo por mais 15 minutos, foi filtrado e concentrado para obter 100 mL.
Além disso, 50 g de PT foram obtidos e misturados com 500 mL de água destilada, deixando de molho por meia hora, levados a fervura alta e depois cozidos em fogo baixo por 45 minutos. Os 100 g de MO que haviam sido previamente embebidos foram incorporados à infusão de PT, que foi aquecida por 45 minutos, levada a fervura e depois cozida em fogo baixo por mais 15 minutos. Após filtração, a mistura foi concentrada sob pressão reduzida, resultando em um rendimento de 50 mL. Esta solução final foi então armazenada separadamente a −80°C.
Análise dos Componentes
Os métodos de análise foram derivados de estudos anteriores conduzidos pela equipe de pesquisa. Uma solução de metanol a 70% foi utilizada para dissolver PT, MO e PM, seguida de filtração através de uma membrana microporosa de 0,22 μm. Um sistema UPLC (Vanquish, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) foi utilizado para os procedimentos analíticos. Este sistema UPLC foi efetivamente combinado com um espectrômetro de massa triplo quadrupolo (TSQ Fortis, Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). Notavelmente, o espectrômetro de massa apresentava capacidades avançadas de ionização por eletrospray. As amostras foram separadas usando uma coluna C18 (3×100 mm, 2,6 μm) mantida a uma temperatura de 40°C, com uma vazão de 0,2 mL/min e um volume de injeção de 5 μL. O perfil de eluição gradiente foi projetado da seguinte forma: 0–5 minutos, 2%-10% B; 5–15 minutos, 10%-30% B; 15–20 minutos, 35%-50% B; 20–25 minutos, 50%-70% B; 25–30 minutos, 70%-95% B; 30–35 minutos, 95% B. No processo de espectrometria de massa, a configuração incluiu ionização positiva a 4000 V, ionização negativa ajustada a 3500 V, pressão do gás de bainha a 35 kPa, pressão do gás auxiliar a 10 kPa e uma temperatura do gás mantida a 350°C. Para a coleta e análise de dados, foi empregado o Thermo Scientific Xcalibur (versão 4.2).
Animais e Experimentos
Camundongos KM machos com oito semanas de idade, pesando entre 18 e 22 gramas, foram obtidos da Sibeifu Biotechnology Co., Ltd. (nº 110324231107055163, Pequim, China) e alojados em uma instalação para observação de pequenos animais, onde a umidade foi mantida a 65 ± 5% e a temperatura regulada a 22 ± 2°C com ciclo claro/escuro de 12 h/12 h. Antes do início do estudo, todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os princípios de ética animal e os Regulamentos para a Administração de Animais Experimentais estabelecidos pela República Popular da China. Esses experimentos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Bem-Estar e Ética Animal da Universidade de Chengdu de Medicina Tradicional Chinesa, com o número de aprovação 2024046.
Os camundongos foram divididos aleatoriamente em múltiplos grupos, com cada grupo consistindo em 8 indivíduos: o grupo Controle e o grupo D-gal, grupo Donepezila (0,75 mg/kg, designado como Don + D-gal), grupo PT de baixa dose (0,25 g/kg, referido como P L + D-gal), grupo PT de dose média (0,5 g/kg, rotulado P M + D-gal), grupo PT de alta dose (1 g/kg, denotado P H + D-gal), grupo MO de baixa dose (0,5 g/kg, M L + D-gal), grupo MO de dose média (1 g/kg, M M + D-gal), grupo MO de alta dose (2 g/kg, M H + D-gal), grupo PM de baixa dose (0,25 + 0,5 g/kg, PM L + D-gal), grupo PM de dose média (0,5 + 1 g/kg, PM M + D-gal) e grupo PM de alta dose (1 + 2 g/kg, PM H + D-gal). Durante um período de 42 dias consecutivos, todos os camundongos, exceto aqueles do grupo controle, receberam injeções subcutâneas de D-gal dissolvido em solução salina na dosagem de 500 mg/kg·d para criar um modelo de comprometimento cognitivo. Em contraste, os camundongos do grupo controle receberam um volume equivalente de solução salina. Com base na dosagem humana, as doses dos medicamentos para camundongos foram determinadas usando o método de conversão baseado na área de superfície corporal. Após as injeções de D-gal, cada grupo de tratamento recebeu os respectivos medicamentos por via oral durante 42 dias, enquanto os camundongos controle e tratados com D-gal receberam diariamente água destilada a uma taxa de 10 mL/kg·d.
Diagrama do fluxo experimental.
No 43º dia, os camundongos foram submetidos à anestesia usando uma solução de uretano a 10%. Em seguida, tecidos cerebrais, juntamente com tecidos intestinais e seus respectivos conteúdos, foram obtidos dos camundongos. Um segmento tanto do tecido cerebral quanto do intestinal foi preservado em uma solução de paraformaldeído a 4% e subsequentemente corado com coloração H&E ou Nissl. O tecido hipocampal restante foi isolado do cérebro e preservado em glutaraldeído a 3% para exame via microscopia eletrônica de transmissão. Adicionalmente, o tecido hipocampal extra, juntamente com o tecido intestinal e seu conteúdo, foi mantido a −80°C. O tecido hipocampal foi destinado para estudos de ELISA e WB, enquanto o tecido intestinal foi designado para análise de Western blot, e o conteúdo intestinal foi preparado para avaliação metagenômica do rRNA 16S. Todos os procedimentos experimentais foram realizados seguindo o protocolo estabelecido (Figura 1).
A função cognitiva em camundongos foi avaliada usando o PAT (TechMan Soft, Sichuan, China) e o MWM (WMT-100S, Sichuan, China). O teste com o PAT ocorreu no dia seguinte ao treinamento adaptativo dos camundongos no aparato. O sistema de análise de vídeo PAT-8 capturou sistematicamente tanto a latência de fuga quanto o número de erros cometidos. Durante a avaliação de navegação espacial do MWM, todos os camundongos participaram de um dia de treinamento adaptativo com uma plataforma visível, seguido por quatro dias de tentativas envolvendo uma plataforma oculta no aparato MWM, com cada tentativa durando 60 segundos. No sexto dia, a plataforma foi removida e uma avaliação de exploração espacial foi realizada no MWM. O sistema de análise de imagem por vídeo WMT-100S registrou automaticamente a distância nadada no quadrante designado, o número de cruzamentos da plataforma e o tempo gasto na área alvo.
Exame Histológico
Após fixação em solução de paraformaldeído a 4% por um período de 48 horas, as amostras de cérebro e intestino foram submetidas a desidratação, inclusão e corte. Secções de tecido cerebral e intestinal de camundongos foram preparadas com espessura uniforme de 5 μm. Essas secções, que haviam sido embebidas em parafina, foram coradas pelo método H&E. Após o processo de coloração, as secções foram examinadas e visualizadas usando um microscópio (Sunny, Hong Kong, China). As secções de tecido cerebral foram coradas pela técnica de coloração de Nissl e digitalizadas com um sistema de digitalização de patologia digital (HS6, Zhejiang, China).
Para IF, as secções de parafina foram incubadas em estufa a 60°C por uma hora, desparafinizadas usando um gradiente de etanol e submetidas à recuperação antigênica com solução de EDTA. As secções foram permeabilizadas com Triton a 0,5% por trinta minutos e subsequentemente bloqueadas à temperatura ambiente com soro de cabra por uma hora. Em seguida, foram incubadas durante a noite com um anticorpo primário específico para p-CREB (1:100) e depois tratadas com um anticorpo secundário (1:200) à temperatura ambiente por mais uma hora. Todas as secções foram então contracoradas com DAPI para permitir a visualização dos núcleos. Imagens fluorescentes foram capturadas empregando um microscópio de fluorescência (Zeiss Axio Imager 2, Alemanha), e a intensidade da fluorescência foi medida utilizando o software ImageJ.
Para TEM, os tecidos foram submetidos a uma solução de glutaraldeído a 3%, fixados com tetróxido de ósmio a 1%, desidratados em acetona e infiltrados com resina epóxi (Epox) 812 por um período prolongado. Uma vez finalizada a inclusão, secções ultrafinas foram cortadas usando uma faca de diamante, coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo, e examinadas com um MET JEM-1400-FLASH (JEOL, Japão).
Ensaio de ELISA
Pese o tecido cerebral do camundongo e homogeneíze-o utilizando uma proporção de 1:10 com solução salina fisiológica. Após a centrifugação, colete o sobrenadante para medir a concentração de proteínas. Transfira o sangue do camundongo para um tubo de centrífuga e deixe-o em repouso à temperatura ambiente por um período de duas horas. Após esse intervalo, isole o soro utilizando centrifugação de alta velocidade em baixas temperaturas. Em seguida, transfira-o para um novo tubo de centrífuga e armazene-o a −80°C. Na sequência, avalie os níveis de TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ e LPS no soro do camundongo, e avalie as concentrações de TNF-α, IL-1β, SOD, GSH, cAMP e SCFA no tecido cerebral do camundongo seguindo as diretrizes fornecidas pelos kits de ELISA do fabricante.

Farmacologia de Rede

Os alvos dos fármacos foram identificados por meio da utilização de vários bancos de dados, que incluem CNKI (https://www.cnki.net/), PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/), Herb (http://herb.ac.cn/), SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/), TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/) e BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php/Home/Index/index). Além disso, genes que estão ligados à IC foram discernidos usando os bancos de dados GeneCards (https://www.genecards.org/) e OMIM (https://omim.org/), permitindo uma investigação mais focada nos fatores genéticos que contribuem para a IC. Para refinar ainda mais a análise, a interseção entre os potenciais alvos dos fármacos para MO e PT com os genes relacionados à IC foi estabelecida usando a ferramenta Venny 2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/). Esse cruzamento permitiu o reconhecimento de alvos comuns que poderiam estar envolvidos nos usos terapêuticos de MO e PT em contextos de IC. A análise foi aprofundada utilizando o banco de dados STRING 12.0 (https://string-db.org/) para avaliar potenciais alvos terapêuticos, a partir do qual uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi desenvolvida usando o Cytoscape 3.7.2. Essa rede serve como uma representação visual das interações entre as proteínas identificadas, fornecendo assim insights sobre suas relações funcionais. Para maior visualização e profundidade analítica, ferramentas adicionais foram empregadas, incluindo uma plataforma de nuvem de análise e visualização online de bioinformática (https://www.bioinformatics.com.cn/). Através desta plataforma, gráficos de bolhas de enriquecimento da via KEGG e gráficos de barras de enriquecimento funcional GO foram gerados, destacando vias biológicas e funções significativas associadas às ações terapêuticas de PT. As 20 principais vias, selecionadas de acordo com seus valores de P, foram deliberadamente identificadas para destacar vias essenciais relacionadas ao tratamento da IC. Por fim, a ferramenta Cytoscape 3.7.2 foi empregada para criar um diagrama de rede abrangente ilustrando as relações entre fármacos, doenças, alvos-chave e vias importantes. Este diagrama não apenas ilustra as inter-relações, mas também contribui para uma compreensão mais profunda do panorama terapêutico para o comprometimento cognitivo.

Sequenciamento do 16S rRNA da Microbiota Intestinal
Meça o DNA total extraído com um espectrofotômetro Nanodrop. Empregue PCR para amplificar as regiões variáveis dos genes de rRNA ou fragmentos genéticos específicos, e posteriormente purifique os produtos de PCR resultantes com Vazyme VAHTS™ DNA Clean Beads, eluindo-os em tampão. Use o Illumina TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit para gerar a biblioteca de sequenciamento. Realize o sequenciamento paired-end no sequenciador MiSeq empregando o MiSeq Reagent Kit V3 (600 ciclos). Implemente a desnoising de sequências ou agrupamento de OTUs conforme o protocolo de análise QIIME2 DADA2. Use o software QIIME2 (versão 2019.4) para anotação de espécies.
Análise de Western Blot
As amostras foram lisadas usando tampão RIPA, após o que o sobrenadante foi obtido por centrifugação. A concentração de proteína total nas amostras foi medida utilizando o método de ensaio de proteína BCA. Para separar as proteínas alvo, foi utilizada SDS-PAGE, e essas proteínas foram então transferidas para membranas de PVDF. Anticorpos primários, incluindo Ocludina (1:5000), ZO-1 (1:10.000), NF-κB-p65 (1:1000), p-NF-κB-p65 (1:2000), PKA (1:1000), p-PKA (1:1000), CREB (1:1000), p-CREB (1:1000) e GAPDH (1:5000), foram utilizados para incubar as membranas durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as membranas foram tratadas com um anticorpo secundário diluído a 1:50.000. A visualização e a semiquantificação das bandas foram realizadas através de um sistema de imagem e análise de quimioluminescência (GelView 6000Plus, Guangzhou, China).
Análise Estatística
Os resultados são apresentados como média ± EPM. As análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism 8. Para comparar os grupos, foi executada uma análise de variância (ANOVA) de uma via, juntamente com testes post hoc adequados. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultado
Determinação dos Componentes Característicos em PT, MO e PM
Exame por UPLC-MS/MS de PT, MO e PM. (A) Constituintes típicos na mistura padrão de PM, (B) amostra de PT, (C) amostra de MO, (D) amostra de PM.
Os achados ilustram uma comparação das razões massa-carga juntamente com amostras padrão (Figura 2A). Em PT, componentes como TEN, Poligalaxantona III, 3,6’-disinapoilsacarose e ácido poligálico foram identificados (Figura 2B). Em MO, os componentes Honokiol e Magnolol foram observados (Figura 2C). Adicionalmente, esses componentes específicos também foram encontrados na combinação PM (Figura 2D).
Efeitos de PT, MO e PM na Disfunção Cognitiva e Neuropatologia Induzidas por D-gal em Camundongos
PT, MO e PM Aliviam os Déficits Cognitivos Induzidos por D-gal. Resultados do PAT mostrando (A) latência de fuga e (B) número de erros. Resultados do MWM mostrando (C) latência de fuga, (D) distância acumulada de natação no quadrante alvo do teste de exploração espacial, (E) vezes de cruzamento do quadrante alvo, (F) tempo no quadrante alvo e (G) trajetórias representativas de natação. n = 8. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Grupo Controle; *P < 0.05, **P < 0.01 vs grupo D-gal, ○P < 0.05, ○○P < 0.01 vs grupo PT, ΔP < 0.05, ΔΔP < 0.01 vs grupo MO.
Os achados do estudo PAT demonstraram que, quando comparados ao grupo D-gal, todas as categorias de dosagem de PT e PM, em conjunto com os grupos M M e M H, prolongaram significativamente a latência de fuga enquanto reduziram o número de erros (P < 0.05 ou P < 0.01, Figura 3A e B). Além disso, em comparação com cada grupo de dose de MO, PM aumentou significativamente a latência de fuga dos camundongos (P < 0.01, Figura 3A e B). Quando comparados aos grupos P M e P H, ambos os grupos PM M e PM H aumentaram significativamente a latência de fuga dos camundongos (P < 0.05 ou P < 0.01, Figura 3A e B).
Diferenças Significativas entre PT, MO e PM em Testes Comportamentais, Coloração Patológica e ELISA
Métrica do Grupo Diferença Significativa Controle D-gal Don+ D-gal P L+ D-gal P M+ D-gal P H+ D-gal M L+ D-gal M M+ D-gal M H+ D-gal PM L+ D-gal PM M+ D-gal PM H+ D-gal PAT Latência de fuga # ** ** ** ** ** ** **,ΔΔ **,○,ΔΔ **,○○,ΔΔ Número de erros # ** * ** ** ** ** ** **,Δ ** MWM Latência de fuga ## ** * ** * * ** ** Distância acumulada de natação no quadrante alvo ## ** ** ** **,○○,ΔΔ **,○,ΔΔ **,○○,ΔΔ Número de cruzamentos do quadrante alvo ## ** * ** * **,Δ **,○,ΔΔ ** Tempo no quadrante alvo ## ** * ** * **,○,ΔΔ **,ΔΔ **,○,ΔΔ Coloração H&E Razão de neurônios em CA1 ## ** ** ** ** * ** ** ** ** ** Razão de neurônios em CA3 ## * * Coloração de Nissl Razão de Nissl+ em CA1 ## ** ** ** ** * ** ** ** **,○,ΔΔ **,○○,ΔΔ Razão de Nissl+ em CA3 ## ** * * ** ** **,Δ **,ΔΔ ELISA Hipocampo TNF-α ## ** ** * ** IL-1β ## * * ** SOD ## * **,○,Δ GSH ## **,○○,ΔΔ Soro TNF-α ## * * * IFN-γ ## ** ** **,ΔΔ IL-1β ## ** ** * **,Δ IL-6 ## ** ** * **,○○,ΔΔ LPS # * *,○,Δ
Notas: #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Grupo Controle; *P < 0.05, **P < 0.01 vs grupo D-gal, ○P < 0.05, ○○P < 0.01 vs grupo PT, ΔP < 0.05, ΔΔP < 0.01 vs grupo MO.
Quando comparados aos camundongos tratados com D-gal, houve uma redução notável na latência de fuga durante o teste de navegação do MWM para os grupos P M, P H, M H e todas as dosagens de PM (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 3C). Na fase de exploração espacial do MWM, houve um aumento significativo na distância total de natação dentro do quadrante alvo para os grupos P M, P H e todas as dosagens de PM (P < 0,01, Figura 3D). Em comparação com cada grupo de dose correspondente de PT e MO, o PM aumentou significativamente a distância de natação dos camundongos no quadrante alvo (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 3D). Além disso, houve um aumento notável na frequência de cruzamentos da plataforma observada nos grupos P M, P H, M H e todos os grupos de tratamento com PM (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 3E). Em comparação com P M, M L e M M, a dose correspondente de PM aumentou significativamente o número de vezes que os camundongos cruzaram o quadrante alvo (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 3E). Nos grupos P M, P H, M H e todos os grupos de tratamento com PM, foi observado um tempo prolongado gasto no quadrante alvo (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 3F). Em comparação com P L, P H e cada grupo de dose de MO, o PM aumentou significativamente o tempo de permanência dos camundongos no quadrante alvo (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 3F). Vale destacar que o tratamento com PM produziu melhores resultados comportamentais do que os tratamentos com PT ou MO (Tabela 1).

PT, MO e PM Aliviam o Dano Neuropatológico Induzido por D-gal. (A–C) Imagens representativas e análise quantitativa da coloração HE nas regiões CA1 e CA3 do hipocampo (barra de escala: 200 μm e 50 μm). (D–F) Imagens representativas e análise quantitativa da coloração de Nissl nas regiões CA1 e CA3 do hipocampo. Setas pretas indicam neurônios encolhidos (barra de escala: 500 μm e 50 μm). n = 5. ##P < 0,01 vs Grupo Controle; *P < 0,05, **P < 0,01 vs Grupo D-gal, ○P < 0,05, ○○P < 0,01 vs Grupo PT, ΔP < 0,05, ΔΔP < 0,01 vs Grupo MO.
Além disso, as intervenções com PT, MO e PM atenuaram significativamente as alterações neuropatológicas no hipocampo de camundongos idosos, que incluíam encolhimento citoplasmático neuronal, disposição desordenada e diminuição na contagem de neurônios (Figura 4A). Em comparação com o grupo D-gal, a administração de PT, MO e todas as dosagens de PM resultou em um aumento significativo de células neuronais na região CA1 (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 4B), enquanto o grupo PM H exibiu um aumento substancial no número de neurônios na região CA3 (P < 0,05, Figura 4C). Os resultados da coloração de Nissl mostraram que a taxa de neurônios Nissl+ no grupo D-gal foi significativamente reduzida em comparação com o grupo Controle (P < 0,01, Figura 4D–F). Na região CA1, PT, MO e PM em todas as doses restauraram significativamente a taxa de neurônios Nissl+ reduzida por D-gal (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 4E). Em comparação com P M, P H, M M e M H, as doses correspondentes de PM aumentaram significativamente a taxa de neurônios Nissl+ na região CA1 dos camundongos (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 4E). Na região CA3, PT e PM em todas as doses aumentaram significativamente a taxa de neurônios Nissl+ (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 4F). Em comparação com M M e M H, os grupos de dose correspondentes de PM aumentaram significativamente a taxa de neurônios Nissl+ na região CA3 (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 4F). Os resultados da coloração de Nissl demonstraram ainda o efeito neuroprotetor do PM. Notavelmente, o PM exibiu recuperação superior da patologia neuronal em comparação com PT ou MO isoladamente (Tabela 1). Esses resultados indicam que PT, MO e PM podem melhorar os déficits cognitivos em modelos induzidos por D-gal ao reduzir o dano neuronal.
Os Tratamentos com PT, MO e PM aliviaram a Inflamação e o Estresse Oxidativo Induzidos por D-gal
PT, MO e PM aliviam a inflamação e o estresse oxidativo em camundongos D-gal. Níveis de (A) TNF-α, (B) IL-1β, (C) SOD e (D) GSH no hipocampo dos camundongos, e (E) TNF-α, (F) IFN-γ, (G) IL-1β, (H) IL-6 e (I) LPS no soro dos camundongos. n = 6. #P < 0,05, ##P < 0,01 vs grupo Controle; *P < 0,05, **P < 0,01 vs grupo D-gal, ○P < 0,05, ○○P < 0,01 vs grupo PT, ΔP < 0,05, ΔΔP < 0,01 vs grupo MO.
Pesquisas neuropatológicas envolvendo camundongos sugerem que o PM é eficaz em diminuir o dano neuronal, com o PM H apresentando a melhora mais notável. Considerando que o estresse oxidativo e a inflamação contribuem para o dano neuronal, investigamos os efeitos do P H, M H e P M H sobre marcadores de estresse oxidativo e fatores pró-inflamatórios no soro e no tecido cerebral. Na área hipocampal, a administração de P H, M H e PM H resultou em uma diminuição notável nos níveis de TNF-α em comparação ao grupo D-gal (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 5A). Além disso, tanto P H quanto PM H induziram uma redução significativa no nível de IL-1β (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 5B), enquanto o PM H aumentou especificamente os níveis de SOD e GSH (P < 0,01, Figura 5C e D). Adicionalmente, em comparação com P H e M H, o PM H aumentou significativamente os níveis de SOD e GSH no hipocampo dos camundongos (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 5C e D). A análise sérica revelou que P H e PM H reduziram significativamente os níveis de TNF-α e IFN-γ também (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 5E e F). Em comparação com M H, o PM H diminuiu significativamente o nível de IFN-γ (P < 0,01, Figura 5F). Além disso, P H, M H e PM H reduziram efetivamente os níveis de IL-1β e IL-6 (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 5G e H), com o PM H também diminuindo significativamente a concentração de LPS (P < 0,05, Figura 5I). Em comparação com M H, o PM H diminuiu significativamente os níveis de IL-1β, IL-6 e LPS (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 5G–I). Em comparação com P H, o PM H reduziu significativamente os níveis de IL-6 e LPS (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 5H e I). Esses resultados indicam que, em comparação com P H e M H, o PM H exibe efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes mais potentes (Tabela 1).

Análise de Farmacologia de Redes

Análise de farmacologia de redes do PM. (A) Diagrama de Venn, (B) Diagrama de rede de interação proteína-proteína (PPI) dos principais alvos dos efeitos medicinais do PM, (C) Análise de enriquecimento GO, (D) Análise de enriquecimento KEGG, (E) Diagrama de rede alvo proteico principal - via principal do PM para doença CI, (F) Diagramas das vias KEGG cAMP e NF-κB. A caixa vermelha representa a via de sinalização validada em nosso estudo.
Usando a ferramenta Venny 2.1 para analisar a interseção entre PM pulmonar e CI, um total de 232 alvos sobrepostos foram identificados, os quais poderiam atuar como possíveis opções terapêuticas para lidar com a CI no contexto da PM (Figura 6A). Essa descoberta ressalta a relevância desses alvos na busca por tratamentos eficazes. Além disso, em nosso exame da rede de interação proteína-proteína (PPI), observamos que os nós maiores e com cores mais escuras correspondem a valores de grau mais elevados, enfatizando assim sua importância dentro da rede geral de interações. Nossa análise abrangente de dados indicou que, entre todos os nós identificados, os cinco nós centrais com os maiores valores de grau foram INS, TNF, PPKACA, CASP3 e IL1B (Figura 6B). Esses nós centrais são cruciais para a compreensão das vias bioquímicas em ação e podem ser centrais para o desenvolvimento de intervenções direcionadas para o gerenciamento do comprometimento cognitivo associado à metástase pulmonar.
Os dados foram subsequentemente inseridos no banco de dados Metascape para realizar uma análise de enriquecimento, resultando em um total de 2730 anotações da Gene Ontology (GO). O total inclui 2269 processos biológicos (BP), 189 componentes celulares (CC) e 272 funções moleculares (MF). Para cada categoria, as dez entradas mais bem classificadas foram selecionadas com base em seus valores de P e visualizadas usando a ferramenta online disponível no site Microbioinformatics. Em termos de BP, as principais funções identificadas incluíram a regulação do potencial de membrana, regulação de processos do sistema, função de sinapse química e os processos de sinalização sináptica. No contexto de CC, os principais componentes reconhecidos incluíram a membrana sináptica, o complexo de canais iônicos monoatômicos, o complexo de transporte e o conjunto de transportadores transmembrana. Dentro da categoria MF, as principais funcionalidades englobaram atividades relacionadas a transportadores transmembrana de íons monoatômicos, transporte transmembrana de substâncias inorgânicas, atividade de transporte transmembrana de cátions monoatômicos e funções associadas a canais iônicos monoatômicos (Figura 6C).
A análise KEGG prosseguiu selecionando as vinte vias que apresentaram os menores valores de P e as maiores contagens de enriquecimento gênico para fins de visualização, conforme ilustrado (Figura 6D). Nessa representação, as vias caracterizadas por cores vermelhas mais intensas indicam a presença de menores valores de P, maiores contagens de enriquecimento gênico e uma significância correspondentemente mais forte das próprias vias. Os dados visuais sugerem que o impacto terapêutico de PM sobre CI pode estar intimamente ligado a certas vias biológicas, particularmente a via de sinalização de cAMP e a via de sinalização de NF-κB (Figura 6F). Para elucidar melhor essas relações, importamos as vinte principais vias, juntamente com seus alvos relevantes, para o software Cytoscape 3.7.2. Essa ação nos permitiu construir um diagrama de rede abrangente que destaca as interconexões entre a doença, os alvos biológicos significativos e as vias críticas (Figura 6E). Nessa rede, os nós vermelhos significam os alvos biológicos cruciais, enquanto os nós azuis representam as vias importantes, e o nó amarelo designa a própria doença. No total, o diagrama abrange 149 nós e 607 arestas, ressaltando que o mecanismo pelo qual PM atua contra CI envolve uma complexa interação de vários componentes, alvos biológicos e vias significativas.
PM Melhorou o Dano de Barreira Induzido por D-gal
PM regula a integridade da barreira. (A) Coloração H&E de tecidos intestinais de camundongos (barra de escala = 200 μm), (B e C) Análise de WB de Ocludina e ZO-1 no intestino, (D) Imagens representativas de TEM da região hipocampal (barra de escala = 200 nm), (E e F) Análise de WB de Ocludina e ZO-1 no hipocampo. Seta vermelha indica quebra de vilosidades, seta preta indica descolamento apical de vilosidades e setas laranja indicam junções oclusivas. n = 3. ##P < 0,01 vs Grupo Controle; *P < 0,05, **P < 0,01 vs Grupo D-gal.
A indução por D-gal tem potencial para causar danos aos intestinos, o que inclui comprometer a barreira intestinal. Avaliações histológicas utilizando coloração H&E revelaram que o tratamento com PM melhorou acentuadamente o dano patológico induzido por D-gal, incluindo arquitetura das vilosidades desorganizada, fraturas e descolamento apical (Figura 7A). Para aprimorar a compreensão da integridade da barreira intestinal, foi realizada análise de WB para avaliar os níveis das proteínas TJs, particularmente Ocludina e ZO-1. Em comparação com o grupo Controle, uma redução notável nos níveis de Ocludina e ZO-1 foi observada após o tratamento com D-gal. Importante, a administração de PM nas doses média e alta aumentou notavelmente os níveis dessas proteínas no hipocampo (P < 0,01, Figura 7B e C). Além disso, o tratamento com D-gal resultou em danos à BHE, o que causou disfunção das junções apertadas; no entanto, esse efeito foi atenuado pelo tratamento com PM (Figura 7D). Ademais, os níveis das proteínas Ocludina e ZO-1 no hipocampo sofreram uma redução significativa após o tratamento com D-gal, enquanto o tratamento com PM levou a um aumento notável em sua expressão (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 7E e F).
O Tratamento com PM Modula as Vias de Sinalização NF-κB e cAMP no Hipocampo de Camundongos CI Induzidos por D-gal
PM Regula as Vias de Sinalização NF-κB e cAMP. (A–C) Análise de WB de p-NF-κB-p65, p-PKA e p-CREB no hipocampo, n=3, (D) Expressão de SCFA e cAMP no hipocampo de camundongos, n=6, (E e F) Análise de imunofluorescência e quantificação de p-CREB (S133) nas regiões CA1 e CA3 (barra de escala = 20 μm), n = 3. ##P < 0,01 vs grupo Controle; *P < 0,05, **P < 0,01 vs grupo D-gal.
Os achados da análise de WB indicaram que, quando contrastados com o grupo D-gal, houve uma redução significativa nos níveis de expressão relativa de p-NF-κB-p65 no tecido hipocampal (P < 0,01, Figura 8A–C). Em contraste, houve uma elevação notável nos níveis de p-PKA e p-CREB (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 8A–C). Avaliações adicionais por ELISA revelaram que o tratamento com PM resultou em um aumento significativo tanto das concentrações de cAMP quanto de SCFA no hipocampo em comparação com o grupo D-gal (P < 0,01, Figura 8D). Além disso, estudos de IF demonstraram que o tratamento com PM aumentou significativamente os níveis de expressão de p-CREB nas regiões CA1 e CA3 (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 8E e F). Esses resultados sugerem que o PM está envolvido na inibição da via de sinalização inflamatória NF-κB no hipocampo, ao mesmo tempo em que promove a via de sinalização cAMP.
O Tratamento com PM Modula a Microbiota Intestinal em Camundongos CI Induzidos por D-gal
PM Alivia a Disbiose da Microbiota Intestinal Induzida por D-gal. (A) Curva de rarefação da diversidade, (B) Índices de diversidade baseados em níveis de OTU, (C) β-diversidade da microbiota intestinal baseada na Análise de Coordenadas Principais (PCoA) e no algoritmo UniFrac não ponderado, (D) Gráfico de pizza do número de OTUs para cada grupo, (E) Gráfico de barras no nível de filo, (F) Comparação da abundância relativa de diferentes filos entre os grupos, (G) Razão Firmicutes/Bacteroidetes, (H) Gráfico de barras no nível de famílias, (I) Comparação da abundância relativa de diferentes famílias entre os grupos, (J) Gráfico de barras no nível de gênero, (K) Comparação da abundância relativa de diferentes gêneros entre os grupos. (L) Histograma de distribuição dos valores de LDA e árvore filogenética circular do LEfSe. n = 5. #P < 0,05, ##P < 0,01 vs Grupo Controle; *P < 0,05, **P < 0,01 vs grupo D-gal.
A curva de rarefação para α-diversidade, que é derivada da contagem de unidades taxonômicas operacionais (OTUs) em várias amostras, estabiliza-se à direita, sugerindo que a saturação foi alcançada nos dados de sequenciamento (Figura 9A). A avaliação da α-diversidade, utilizando os índices de Shannon e Simpson, revelou que o grupo PM demonstrou uma redução na riqueza de espécies em comparação ao grupo D-gal (P > 0,05, Figura 9B). Os resultados da Análise de Coordenadas Principais (PCoA) mostraram claramente separações distintas entre os grupos D-gal, Controle e PM, destacando diferenças significativas na estrutura da microbiota intestinal do grupo PM (Figura 9C). Além disso, o diagrama de Venn representa a quantidade de OTUs compartilhadas e distintas entre os grupos, revelando que existem 497 OTUs comuns a todos os três grupos (Figura 9D).
Uma análise mais aprofundada da diversidade de espécies em diferentes níveis taxonômicos revelou mudanças notáveis no microbioma intestinal. No nível de filo, a introdução de MP resultou em diferenças substanciais na abundância relativa de Bacteroidetes e Proteobacteria em comparação com o grupo tratado com D-gal (P < 0,05, Figura 9E e F). Além disso, foi observada uma tendência notável indicando um aumento em Actinobacteria (P > 0,05, Figura 9E e F). Por outro lado, o tratamento com MP correspondeu a um declínio significativo na abundância relativa de Firmicutes (P < 0,01, Figura 9E e F), juntamente com uma menor razão Firmicutes/Bacteroidetes, o que sugere uma modificação na composição da microbiota (P < 0,05, Figura 9G). No nível taxonômico de família, a abundância relativa de Desulfovibrionaceae diminuiu com o tratamento com MP em comparação com o grupo D-gal (P > 0,05, Figura 9H e I). Em contraste, uma redução acentuada na abundância relativa de Enterobacteriaceae foi observada após o tratamento com MP (P < 0,05, Figura 9H e I). Ao analisar os dados no nível de gênero, houve uma tendência observada com o tratamento com MP que indicou um aumento na abundância relativa de Bacteroides e Coprococcus em comparação com o grupo D-gal (P > 0,05, Figura 9J e K). Notavelmente, o MP levou a abundâncias relativas significativamente maiores de Prevotella, Anaeroplasma e Clostridium (P < 0,05 ou P < 0,01, Figura 9J e K). Esses resultados demonstram o impacto significativo do material particulado na composição da microbiota intestinal em vários níveis taxonômicos.
Os resultados sugerem que o MP influencia significativamente a disbiose e modifica as alterações na microbiota intestinal causadas por D-gal. Biomarcadores com um escore LDA maior que 4 foram identificados empregando-se a análise de tamanho de efeito por discriminante linear (LEFSE) (Figura 9L). Para o grupo MP, os biomarcadores identificados compreenderam Parabacteroides e Gemmiger, enquanto o grupo D-gal apresentou biomarcadores como [Ruminococcus] e Ruminococcus. Além disso, o grupo MP mostrou a presença de outros biomarcadores, incluindo Bifidobacterium e Desulfovibrio.
Discussão
Tanto PT quanto MO melhoram notavelmente o CI e mostram-se promissores como opções de tratamento; seus efeitos farmacológicos sinérgicos podem trabalhar em harmonia, resultando em melhores resultados terapêuticos. A combinação de PT e MO amplifica os benefícios calmantes e de melhora cognitiva do PT, enquanto MO contribui com seus atributos de secagem da umidade e eliminação de catarro para apoiar as ações expectorantes do PT. Juntos, eles equilibram mais eficazmente as funções cardíaca e renal, aliviando assim os sintomas associados ao CI.

Em relação às interações e efeitos sinérgicos dos componentes bioativos de PT e MO, estudos mostraram que, após sua combinação, ocorrem mudanças significativas no conteúdo e na proporção de composição dos componentes químicos, estabelecendo uma base material para os efeitos sinérgicos. MO pode aliviar eficazmente a inibição da motilidade gastrointestinal induzida por PT, e o mecanismo pode estar relacionado às mudanças no conteúdo dos componentes. Na regulação do músculo liso gastrointestinal, sua combinação pode aumentar significativamente a amplitude de contração, reduzir a taxa de inibição da frequência e enfraquecer a inibição sobre os músculos intestinais.

Os polissacarídeos de PT aliviam a disbiose da microbiota intestinal e a neuroinflamação em modelos de DA ao aumentar a abundância de bactérias produtoras de SCFA (por exemplo, Bacteroides) e diminuir as bactérias pró-inflamatórias (por exemplo, Proteobacteria). PT elimina radicais livres e reduz o aumento da permeabilidade intestinal induzido pelo estresse oxidativo. O extrato etanólico de MO alivia a inflamação intestinal e os danos à barreira ao inibir a via PI3K/AKT/NF-κB. Além disso, o magnolol, principal componente de MO, pode reverter o desequilíbrio da microbiota intestinal (por exemplo, aumentando Ruminococcaceae e diminuindo Firmicutes) e melhorar os distúrbios do metabolismo lipídico (por exemplo, reduzindo o LPS sérico e regulando o metabolismo dos ácidos biliares), protegendo assim a barreira intestinal.

PT e MO têm focos diferentes no eixo intestino-cérebro. Sua combinação pode otimizar a estrutura da microbiota, visar o estresse oxidativo e as cascatas inflamatórias simultaneamente, apoiando de forma abrangente a hipótese do tratamento multi-alvo da PM para o CI. Essas interações podem explicar os efeitos aprimorados da PM.
O princípio fundamental pelo qual a D-gal induz a IC é simular as alterações bioquímicas da IC por meio da injeção de D-gal a longo prazo ou em altas doses. Durante o processo metabólico nos animais, uma quantidade substancial de espécies reativas de oxigênio (ERO) é gerada. Isso leva a um aumento nos níveis de estresse oxidativo, à ocorrência de neuroinflamação, danos neuronais e declínio da função cognitiva, imitando assim o processo de declínio cognitivo humano. A indução por D-gal também pode levar à ativação da inflamação intestinal. Citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IFN-γ podem entrar no sistema nervoso central através da circulação sanguínea. Essas citocinas atuam sobre as células nervosas e células da glia no cérebro, desencadeando neuroinflamação, afetando a síntese, liberação e metabolismo de neurotransmissores, interferindo na transdução de sinais neurais e, subsequentemente, levando ao comprometimento cognitivo. Após o LPS entrar na circulação sanguínea, ele pode ativar o sistema imunológico e as vias de sinalização inflamatória, exacerbando ainda mais a resposta inflamatória sistêmica e afetando indiretamente a função cerebral, formando assim uma via de sinalização intestino-imune-cérebro.
O desequilíbrio da microbiota intestinal causado pela indução por D-gal pode levar a um aumento no nível de estresse oxidativo intestinal, uma diminuição na atividade da SOD e uma redução no conteúdo de GSH. Os produtos oxidativos gerados pelo estresse oxidativo podem atingir o cérebro através da circulação sanguínea, danificando neurônios e células da glia e afetando a plasticidade neural e a função dos neurotransmissores. Enquanto isso, a resposta ao estresse oxidativo no cérebro também pode afetar o estado redox do intestino através do feedback de sinais neuroendócrinos, formando uma interação entre intestino, estresse oxidativo e cérebro. A pesquisa indicou que camundongos tratados com D-gal apresentaram déficits na aprendizagem e memória quando submetidos a avaliações comportamentais, enquanto que PM atenuou significativamente esses prejuízos. Além disso, a coloração patológica indicou que PM combateu efetivamente a redução na contagem de neurônios e os danos neuronais associados ao tratamento com D-gal. Como reação ao estresse oxidativo e à resposta inflamatória sistêmica desencadeada pela D-gal, PM reduziu significativamente os níveis de mediadores pró-inflamatórios como TNF-α e IL-1β no soro e no hipocampo de sujeitos tratados com D-gal. Adicionalmente, PM aumentou significativamente a atividade da SOD e elevou os níveis de GSH no hipocampo, mitigando assim o estresse oxidativo nesses camundongos. Além disso, PM reduziu o conteúdo de substâncias pró-inflamatórias no soro. Através dessas investigações farmacológicas, estabelecemos que PM foi mais eficaz do que PT ou MO individualmente em melhorar as funções cognitivas, resultados patológicos e marcadores moleculares em camundongos tratados com D-gal. Isso destaca que a combinação de PT e MO produz uma sinergia farmacológica, levando a melhores resultados terapêuticos.
A organização e o funcionamento adequados da barreira intestinal estão associados a diversas doenças que afetam o sistema nervoso central, incluindo a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson. No modelo de CI, a D-gal induz danos à barreira intestinal. O mecanismo subjacente pode envolver a produção de uma grande quantidade de ROS, que desencadeia estresse oxidativo. Em última análise, isso leva à apoptose de células epiteliais ou danos à estrutura das junções oclusivas (TJs), comprometendo assim a integridade da barreira intestinal. Pesquisas demonstraram que os princípios ativos da medicina tradicional chinesa podem regular a microbiota intestinal, reduzir significativamente o teor de LPS no soro de camundongos modelo, melhorar a apoptose e o arranjo desordenado das células epiteliais intestinais, regular positivamente os níveis de expressão de mRNA de ZO-1, Ocludina e Claudina-1 e contribuir para a restauração das TJs entre as células. Isso, por sua vez, ajuda a manter a integridade e a permeabilidade da barreira epitelial intestinal. Os SCFAs são produzidos por bactérias intestinais específicas durante a fermentação de fibras alimentares. Eles fornecem energia para as células epiteliais intestinais, promovem seu crescimento e diferenciação e são cruciais para manter a integridade da barreira intestinal. Em nosso estudo, o PM aumentou a abundância de bactérias produtoras de SCFAs, como Actinobactérias, Bacteroides, Prevotella, Anaeroplasma e Clostridium, melhorando assim a função da barreira intestinal e mantendo a estabilidade do eixo intestino-cérebro. O LPS é o principal componente da parede celular de bactérias Gram-negativas. Nossa pesquisa indica que o PM pode diminuir a abundância de bactérias produtoras de LPS. Quando a barreira intestinal está comprometida, o LPS gerado por essas bactérias entra na corrente sanguínea, ativando o sistema imunológico e desencadeando uma resposta inflamatória sistêmica. Subsequentemente, citocinas inflamatórias podem atingir o cérebro através da corrente sanguínea, ativando a micróglia e os astrócitos no cérebro. Essas células ativadas liberam um grande número de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α, IL-1β, etc., levando assim à neuroinflamação. A neuroinflamação pode danificar os neurônios, afetar a síntese e liberação de neurotransmissores, interromper a transdução de sinais neurais e, em última análise, levar ao comprometimento cognitivo. O PM reduz a abundância de bactérias produtoras de LPS, como Proteobactérias, Desulfovibrionaceae e Enterobacteriaceae, diminuindo assim a liberação de LPS. Isso alivia tanto a inflamação sistêmica quanto a neuroinflamação, e melhora ainda mais a função cognitiva. Isso demonstra o impacto da microbiota intestinal e seus produtos no estado inflamatório do cérebro dentro do eixo intestino-cérebro.
A BBB é uma estrutura protetora fundamental que protege o cérebro de substâncias nocivas, e a integridade da BBB está intrinsecamente ligada à função cognitiva. O dano à BBB induzido por D-gal pode decorrer de diferentes fatores, como a liberação de citocinas inflamatórias, alterações na ativação de astrócitos e uma diminuição na expressão de proteínas de junção oclusiva entre as células endoteliais. Essas alterações podem aumentar significativamente a permeabilidade da BBB, permitindo que LPS e moléculas patogênicas da corrente sanguínea entrem no tecido cerebral, potencialmente levando à neuroinflamação e neurodegeneração. Uma vez no cérebro, o LPS estimula as células endoteliais cerebrais e ativa a via de sinalização caspase-4/11-GSDMD. Isso leva à ruptura inflamatória da BBB, facilitando a entrada de substâncias nocivas no cérebro, exacerbando ainda mais a neuroinflamação e o dano neuronal. Além disso, o LPS ativa células imunológicas no cérebro, como a micróglia, desencadeando uma resposta inflamatória no cérebro. Ele também se liga ao receptor Toll-like 4, ativando a via de sinalização NF-κB a jusante, que gera citocinas inflamatórias como TNF-α, IL-1β e IL-6, contribuindo assim para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. Embora existam certas diferenças na estrutura tecidual e nas funções fisiológicas entre a BBB e a barreira intestinal, elas compartilham requisitos biológicos semelhantes na manutenção da estabilidade do ambiente interno do corpo e na resistência à invasão de substâncias nocivas externas. Além disso, ambas dependem das junções oclusivas (TJs) para garantir a integridade e a permeabilidade seletiva das barreiras. Nesta pesquisa, a PM atenuou a lesão patológica no intestino de camundongos tratados com D-gal e restaurou a redução nos níveis de Ocludina e ZO-1 tanto no intestino quanto no hipocampo induzida por D-gal, protegendo assim tanto a barreira intestinal quanto a BBB. Isso sugere que a PM pode ter o potencial de proteger amplamente as funções de barreira do corpo. Por um lado, a PM fortalece a BBB, reduz a entrada de substâncias nocivas no SNC, diminui a neuroinflamação e o dano nervoso, e melhora a função cognitiva. Por outro lado, ela protege a barreira intestinal, previne a translocação de LPS e patógenos, e mantém a homeostase do ambiente intestinal. Assim, influencia as funções e a saúde do cérebro através do eixo intestino-cérebro.
AGCCs são metabólitos gerados pela microbiota intestinal durante a fermentação de fibras alimentares. Eles podem alcançar o cérebro através da corrente sanguínea e estão intimamente ligados ao início e à progressão da função cognitiva e de doenças neurodegenerativas por meio do eixo intestino-cérebro. Em doenças neurodegenerativas como DA e DP, observou-se uma redução na quantidade de bactérias produtoras de AGCC e uma diminuição na concentração de AGCC nas fezes. Os AGCC exercem suas funções fisiológicas por meio de GPCRs, especialmente GPR41 e GPR43. A ativação desses receptores pode desencadear a ativação de múltiplas vias de sinalização intracelular, incluindo a da adenilato ciclase, aumentando assim o nível intracelular de AMPc e ativando a via de sinalização do AMPc. Os AGCC podem impactar a síntese e o metabolismo de neurotransmissores, como ácido gama-aminobutírico e serotonina, que estão intimamente associados à função cognitiva. Os AGCC também possuem propriedades imunomoduladoras. Eles inibem a produção de fatores inflamatórios e promovem a secreção de citocinas anti-inflamatórias, mantendo assim o equilíbrio do sistema imunológico. A PM aumenta o número de bactérias produtoras de AGCC, influencia e regula a resposta imune cerebral através do eixo intestino-cérebro, mitiga a ocorrência e o desenvolvimento da neuroinflamação, protege os neurônios de danos inflamatórios e, por fim, melhora a função cognitiva.

O fator de transcrição NF-κB é essencial para as respostas imunes celulares, inflamação, crescimento celular e morte celular programada. A ativação da via de sinalização do NF-κB leva à liberação de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β e IL-6, todas as quais desempenham papéis significativos na neuroinflamação e na IC. A inibição dessa via de sinalização do NF-κB pode reduzir a ativação microglial e diminuir a neuroinflamação, o que pode subsequentemente melhorar a função cognitiva. Além disso, o comprometimento da barreira hematoencefálica tem sido associado ao desencadeamento da via de sinalização do NF-κB, o que pode exacerbar o comprometimento cognitivo. Esta pesquisa indica que a PM reduziu substancialmente os níveis de p-NF-κB-p65 na região hipocampal de camundongos, juntamente com uma diminuição nas citocinas pró-inflamatórias tanto no hipocampo quanto no soro. Esses achados sugerem que a PM poderia mitigar a IC induzida por D-gal por meio da inibição da via de sinalização do NF-κB.
A via de sinalização do cAMP desempenha um papel essencial como mecanismo intracelular que participa de inúmeras funções fisiológicas, como memória e aprendizado, resposta imune, regulação motora e processos metabólicos. O CREB, um importante fator de transcrição localizado no núcleo, é encontrado predominantemente no cérebro, especialmente em áreas relacionadas à memória e ao aprendizado, incluindo o córtex e o hipocampo. Alterações nos níveis de expressão do CREB podem estar associadas a déficits cognitivos. Por exemplo, na DA, interrupções na via de sinalização do cAMP podem resultar em níveis mais baixos de fosforilação do CREB, afetando negativamente a saúde neuronal e prejudicando as capacidades de aprendizado e memória. O cAMP desempenha um papel crucial no suporte à sobrevivência e regeneração neuronal via PKA, o que contribui para o aprimoramento das habilidades cognitivas. A neuroinflamação representa uma característica patológica significativa da DA, e influenciar a via de sinalização do cAMP pode auxiliar na regulação da inflamação associada a essa condição. Em nossa pesquisa, a administração de PM aumentou notavelmente os níveis de p-PKA e p-CREB na região do hipocampo de camundongos tratados com D-gal, além de causar um aumento significativo nas concentrações de cAMP nessa área. Essas descobertas sugerem que o PM estimula a via de sinalização do cAMP no hipocampo de camundongos tratados com D-gal e pode mitigar déficits cognitivos por meio desse mecanismo.
Indivíduos com DC frequentemente encontram disbiose em sua microbiota intestinal. Numerosas preparações probióticas podem modular a estrutura da microbiota intestinal, aumentando a abundância relativa de bactérias benéficas como Bifidobacterium e Lactobacillus. Além disso, podem aliviar a inflamação intestinal e influenciar o metabolismo de neurotransmissores. A razão entre Firmicutes e Bacteroidetes serve como uma medida amplamente utilizada para avaliar o equilíbrio da microbiota intestinal. Em indivíduos saudáveis, o microbioma intestinal consiste predominantemente em Firmicutes e Bacteroidetes, que juntos representam uma fração considerável das bactérias intestinais. A presença relativa desses dois filos pode indicar a condição da microbiota intestinal, e qualquer desequilíbrio nessa razão pode estar associado a uma série de doenças. Uma razão elevada de Firmicutes/Bacteroidetes está ligada a respostas inflamatórias e pode impactar tanto o intestino quanto órgãos adicionais. Nosso estudo encontrou uma diminuição notável na razão Firmicutes/Bacteroidetes em camundongos submetidos ao tratamento com D-gal, em comparação com aqueles do grupo Controle. Essa alteração foi associada a níveis elevados de marcadores inflamatórios tanto no soro quanto no hipocampo, e a administração de PM atenuou significativamente esse efeito. Além disso, o tratamento com D-gal resultou em níveis mais baixos de SCFAs no hipocampo e em uma elevação das concentrações de LPS no soro. Esses efeitos podem estar ligados à perturbação do equilíbrio da microbiota intestinal pelo D-gal, resultando em comprometimento da barreira e aumento da permeabilidade da BHE, o que permite que o LPS de bactérias intestinais específicas penetre o revestimento intestinal e entre na corrente sanguínea, agravando assim o comprometimento da BHE e entrando no cérebro para exacerbar a resposta inflamatória. Esse desequilíbrio microbiano reduz a população de bactérias benéficas que sintetizam SCFAs, levando a níveis diminuídos de SCFAs disponíveis no hipocampo por meio da circulação e, consequentemente, inibindo a via de sinalização do cAMP. Em conclusão, o PM tem efeitos semelhantes às preparações probióticas. Ao restaurar a microbiota intestinal, inibir a via NF-κB e ativar a via de sinalização do cAMP, o PM alivia o comprometimento cognitivo (CC). Este estudo tem limitações. Experimentos mecanísticos não compararam diretamente o PM com PT ou MO individualmente, impedindo uma distinção clara entre efeitos sinérgicos e aditivos. Os impactos de longo prazo do PM não foram avaliados, e as limitações do sequenciamento do gene 16S rRNA podem enviesar a análise da relação entre microbiota intestinal e CC. Pesquisas futuras devem estender o período de observação e usar multi-ômicas e mais técnicas para analisar os mecanismos do PM. Para validar os efeitos sinérgicos e explorar o potencial terapêutico do PM em humanos, são necessários experimentos para esclarecer as contribuições do PT e do MO, juntamente com ensaios celulares e ensaios clínicos em pequena escala.
Nesta pesquisa, mostramos que a PM supera tanto a PT quanto a MO individualmente na melhora da CI. A PM reduziu notavelmente a deterioração do aprendizado e da memória, a lesão neuronal, a inflamação e o estresse oxidativo causados pela D-gal. Nossos resultados sugerem que a PM mitiga a CI ao estimular as cascatas de sinalização cAMP-PKA e NF-κB, restaurando a integridade da BBB e da barreira gastrointestinal, bem como ajustando a microbiota intestinal.
Abreviaturas
AD, doença de Alzheimer; BBB, barreira hematoencefálica; CI, comprometimento cognitivo; cAMP, monofosfato de adenosina cíclico; D-gal, D-galactose; ELISA, Ensaio de Imunoabsorção Enzimática; GPCRs, receptores acoplados à proteína G; GSH, glutationa; H&E, Hematoxilina e Eosina; IF, Imunofluorescência; IFN-γ, Interferon-γ; IL-1β, interleucina-1β; IL-6, interleucina-6; LEFSE, análise de tamanho de efeito por discriminante linear; LPS, lipopolissacarídeo; MWM, Labirinto Aquático de Morris; NF-κB, fator nuclear kappa-B; ANOVA, análise de variância de uma via; OTU, unidade taxonômica operacional; PAT, teste de esquiva passiva; CREB, proteína de ligação ao elemento de resposta ao monofosfato de adenosina cíclico; PCoA, análise de coordenadas principais; PKA, proteína quinase A; ROS, espécies reativas de oxigênio; SCFAs, ácidos graxos de cadeia curta; SOD, superóxido dismutase; TJs, junções estreitas; TEM, microscopia eletrônica de transmissão; TNF-α, fator de necrose tumoral α; UPLC-MS/MS, cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas em triplo quadrupolo; WB, Western blotting; ZO-1, proteína Zonula occludens 1; Aβ, proteína β.
Declaração de Compartilhamento de Dados
Os conjuntos de dados PRJNA1191803 deste estudo podem ser encontrados no National Center for Biotechnology Information (NCBI). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA1191803.
Divulgação
Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho.
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