pmid: "40904544"
title: "Mecanismos do Óleo Volátil da Casca de Magnolia officinalis no Alívio da Mucosite Induzida por 5-Fluorouracil via Abordagens Multi-ômicas"
authors: "Zhang JN, Li KD, Cao ZJ, Xu LY, Zhao XL, Tang F, Peng F, Peng C, Ao H"
journal: "Drug design, development and therapy"
pubdate: "2025"
doi: "10.2147/DDDT.S515605"
source: "PMC Full Text"

Mecanismos do Óleo Volátil da Casca de Magnolia officinalis no Alívio da Mucosite Induzida por 5-Fluorouracil via Abordagens Multi-ômicas

Autores

Zhang JN, Li KD, Cao ZJ, Xu LY, Zhao XL, Tang F, Peng F, Peng C, Ao H

Periodico

Drug design, development and therapy (2025)

Conteudo

Mecanismos do Óleo Volátil da Casca de Magnoliae Officinalis no Alívio da Mucosite Induzida por 5-Fluorouracil via Abordagens Multi-Ômicas

Objetivo
A mucosite induzida por quimioterapia (MIQ) causa sintomas gastrointestinais graves em pacientes com câncer. A casca de Magnoliae Officinalis, uma medicina tradicional, demonstrou potencial terapêutico na mitigação da mucosite intestinal e distúrbios gastrointestinais, com vantagens incluindo eficácia marcante e baixo perfil de efeitos adversos em comparação com farmacoterapias convencionais. No entanto, o potencial terapêutico e os mecanismos do óleo volátil da casca de Magnoliae Officinalis (MagO) contra a MIQ permanecem elusivos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos protetores e os mecanismos do MagO contra a mucosite induzida por 5-Fluorouracil (5-FU) em camundongos por meio de abordagens integradas de multi-ômica.

Métodos
O modelo de MIQ foi estabelecido em camundongos ICR via injeção intraperitoneal de 5-FU. O efeito terapêutico do MagO na MIQ induzida por 5-FU foi avaliado monitorando o peso corporal, escore de diarreia, índice esplênico, histopatologia do íleo e medindo os níveis de DAO, D-LA e citocinas inflamatórias no soro. Metabólitos e microbiota intestinal foram analisados por meio de metabolômica não direcionada e sequenciamento de 16S rDNA. Além disso, mecanismos potenciais do MagO foram avaliados via GC-MS, farmacologia de rede, docking molecular, Western blot e RT-qPCR.

Resultados
O MagO melhorou a lesão da mucosa intestinal e a disfunção de barreira induzidas por 5-FU, evidenciado pelo aumento significativo da taxa de peso corporal, redução dos escores de diarreia e alívio do dano tecidual do íleo. Também diminuiu os níveis séricos de IL-1β, IL-6, TNF-α, D-LA e DAO. Além disso, o MagO restaurou a composição da microbiota intestinal e os perfis de metabólitos, modulando especificamente o metabolismo do ácido araquidônico ao promover a síntese de PGE2 e regular positivamente as expressões de EP2 e EP4. Estudos mecanísticos demonstraram que o MagO exerceu efeitos anti-MIQ através da inibição da via de sinalização PI3K/AKT, regulação positiva das expressões de Bcl-2 e proteínas de barreira intestinal (ZO-1, Ocludina) e regulação negativa da expressão de Bax.

Conclusão
O MagO mitigou a MIQ modulando a via de sinalização PI3K/AKT e o eixo PGE2/EP2/EP4, restaurando a composição da microbiota intestinal e dos metabólitos, reduzindo a apoptose e melhorando a permeabilidade intestinal.

Resumo Gráfico

Introdução
Mucosite induzida por quimioterapia (MIQ), uma condição comum caracterizada pela ruptura das barreiras mucosas, é uma reação adversa significativa observada em pacientes oncológicos submetidos à quimioterapia. Os sintomas da mucosite podem incluir diarreia, sangramento retal, dor, vômitos e anorexia, frequentemente exigindo interrupção ou redução da dose da quimioterapia, impactando negativamente os resultados de sobrevida dos pacientes. A diarreia é uma manifestação predominante da MIQ, afetando todo o trato gastrointestinal, com aproximadamente 10% dos pacientes com câncer avançado experimentando seus efeitos. O 5-Fluorouracil (5-FU) é comumente utilizado no tratamento do câncer colorretal, tumores gastrointestinais e câncer de mama. No entanto, 50% a 80% dos pacientes em uso de 5-FU desenvolvem mucosite, limitando sua segurança e uso clínico. O 5-FU tem como alvo células em proliferação, especialmente as células da mucosa intestinal que se dividem rapidamente, causando vacuolização epitelial, apoptose das células das criptas e secreção excessiva de mucina. Ele inibe a timidilato sintase, interrompe a síntese de DNA e induz apoptose das células epiteliais intestinais, levando à mucosite. Além disso, a mucosite induzida por 5-FU está frequentemente associada ao aumento da secreção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), agravando a condição.
Óleos voláteis de ervas chinesas são cada vez mais reconhecidos por seus benefícios farmacológicos no alívio da CIM e da diarreia. A Magnoliae Officinalis Cortex, comumente chamada de Houpo, uma erva chinesa tradicional, tem sido usada no tratamento de doenças gastrointestinais há séculos. Estudos mostraram que sua decocção teve um efeito significativo na colite ulcerativa induzida por ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico (TNBS). Além disso, regulou a microbiota intestinal, suprimiu a inflamação e promoveu a reparação da mucosa intestinal. Os principais componentes da Magnoliae Officinalis Cortex incluem magnolol, honokiol e óleo volátil. O magnolol demonstrou aliviar efetivamente a diarreia aguda induzida por óleo de rícino e melhorar a colite induzida por DSS, ativando o AHR colônico através do metabolismo do triptofano. Além disso, o honokiol regulou a motilidade gastrointestinal ao inibir o íleo isolado de cobaias tratadas com ACH ou CaCl2, proporcionando efeitos terapêuticos para distúrbios gastrointestinais. Estudos atuais demonstraram que o MagO exibe múltiplas atividades biológicas, incluindo efeitos anti-inflamatórios, antibacterianos, antioxidantes e reguladores gastrointestinais, demonstrando potencial no tratamento da CIM. Adicionalmente, Zhang et al demonstraram que o MagO protegeu contra a colite ulcerativa induzida por sulfato de dextrano sódico (DSS), restaurando a histopatologia intestinal, melhorando o índice esplênico e a massa do cólon por unidade de comprimento em camundongos, reduzindo os níveis colônicos de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-1β, TNF-α) e melhorando a função da barreira da mucosa intestinal através da expressão aumentada de proteínas de junção apertada (claudina-1 e ocludina). No entanto, a eficácia do MagO na melhora da barreira da mucosa intestinal e seus mecanismos permaneceram inconclusivos. Com base nesses resultados, projetamos experimentos para explorar os efeitos protetores do MagO contra a mucosite induzida por 5-FU e seus mecanismos. Avaliamos os efeitos terapêuticos medindo os escores de diarreia, alterações no peso corporal, índice esplênico e histopatologia do íleo. As alterações na microbiota intestinal foram analisadas via sequenciamento de 16S rDNA, e os metabólitos fecais por LC-MS/MS. A composição do MagO foi caracterizada usando GC-MS, e os alvos potenciais foram previstos através de análise de farmacologia de rede, validados por docking molecular, RT-qPCR e ensaios de Western Blot. Este estudo explora os efeitos protetores do MagO contra a mucosite induzida por 5-FU, visando fornecer uma base teórica para pesquisas futuras sobre o tratamento da CIM.
Materiais e Métodos
Reagentes e Produtos Químicos
Córtex de Magnoliae Officinalis, coletado em Dujiangyan, Sichuan (A230602), foi autenticado pela Professora Associada Lu Chen da Faculdade de Farmácia da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu como a casca seca de Magnolia officinalis Rehd. et Wils. (Número do espécime: R82-7). A injeção de 5-FU foi obtida da Tianjin Jin Yao Pharmaceutical Co., Ltd. (Tianjin, China). A carboximetilcelulose sódica foi adquirida da Macklin Biochemical Co., Ltd. (Xangai, China). O hexano grau cromatográfico foi fornecido pela Fábrica de Reagentes Químicos de Chengdu Kelong (Chengdu, China). A loperamida foi fornecida pela Xian Janssen Pharmaceutical Ltd. (Xian, China). O kit de ensaio de ácido D-láctico (D-LA) (Cat. No. ADS-F-T017) e o kit de ensaio de diamina oxidase (DAO) (Cat. No. ADS-W-YH007-96) foram adquiridos da Jiangsu Adison Biological Technology Co., Ltd. (Yancheng, China). Kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) para fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-6 (IL-6), interleucina-1 beta (IL-1β) e prostaglandina E2 (PGE2) foram adquiridos da Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (Yancheng, China).

Extração do MagO
O MagO foi extraído por destilação a vapor seguindo os procedimentos descritos na literatura relevante e na Farmacopeia Chinesa de 2020 (Volume IV, Método A). Inicialmente, o Córtex de Magnoliae Officinalis foi finamente moído em pó. Uma porção de 300 g desse pó foi colocada em um balão de fundo redondo de 3000 mL, e 2400 mL de água destilada foram adicionados. A mistura foi embebida por 2 horas para facilitar a extração inicial. Em seguida, o balão foi conectado a um aparelho de destilação a vapor, e a extração contínua foi realizada por 4 horas até que o rendimento de óleo se estabilizasse. O MagO extraído foi coletado e armazenado a 4 °C em um recipiente vedado. O rendimento da extração foi calculado usando a fórmula:
R = (V/m) × 100%. R representava a taxa de extração, V representava o volume e m representava a massa.

Análise por GC-MS do MagO
O MagO foi analisado por cromatografia gasosa-espectrometria de massas (CG-EM) em um instrumento Agilent 7890A-5975C (Agilent, EUA) equipado com uma coluna capilar HP-5MS (30 m × 250 μm × 0,25 μm). O hélio foi utilizado como gás de arraste a uma vazão de 1,0 mL·min⁻¹, e o volume de injeção foi de 1 μL. As amostras foram diluídas 1:100 em hexano e introduzidas com uma razão de divisão de 80:1. A ionização por elétrons foi realizada a 70 eV, com as temperaturas da fonte de íons e do quadrupolo ajustadas para 230 °C e 150 °C, respectivamente. Foi aplicado um atraso do solvente de 3 minutos. O programa de temperatura do forno do CG iniciou a 50 °C (mantido por 3 minutos), aumentou a 8,0 °C·min⁻¹ até 140 °C (mantido por 5 minutos), depois aumentou a 0,5 °C·min⁻¹ até 150 °C e, finalmente, elevou a 5 °C·min⁻¹ até 200 °C, resultando em um tempo total de corrida de 49,25 minutos. A identificação dos componentes do MagO foi realizada comparando seus espectros de massa com os do banco de dados do National Institute of Standards and Technology (NIST). A composição percentual de cada componente foi calculada normalizando sua área de pico para a corrente iônica total (TIC).

Animais e Tratamento
Camundongos ICR de grau livre de patógenos específicos (SPF) (pesando 20±2 g) foram obtidos da Chengdu Dossy Experimental Animals Co., Ltd. Os animais foram mantidos sob condições laboratoriais padrão: temperatura mantida a 23 ± 2 °C, umidade a 50% ± 5% e um ciclo claro/escuro de 12 horas, com acesso irrestrito a ração padrão e água. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Nº de Aprovação: 2022003021) e seguiram rigorosamente as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. Após um período de aclimatação de 3 dias, 48 camundongos machos foram aleatoriamente designados a seis grupos (n = 8 por grupo): Controle (Con), modelo 5-FU (Mod), loperamida (Lop) e grupos MagO de dose baixa, média e alta (MagO-L a 25 μL·kg⁻¹, MagO-M a 50 μL·kg⁻¹ e MagO-H a 100 μL·kg⁻¹, respectivamente). Os animais foram aleatoriamente designados a diferentes grupos. Os pesquisadores estavam cegos para as alocações dos grupos durante a coleta e análise dos dados. As emulsões de MagO em diferentes concentrações foram preparadas dissolvendo o composto em uma solução de carboximetilcelulose sódica a 0,3% para administração aos respectivos grupos de tratamento. Tanto o grupo Con quanto o grupo Mod receberam um volume equivalente da solução de carboximetilcelulose sódica a 0,3% uma vez ao dia por 10 dias consecutivos. Do dia 4 ao dia 10, os grupos Mod, Lop e MagO receberam injeções intraperitoneais de 5-FU na dose de 60 mg·kg⁻¹·dia⁻¹, enquanto o grupo Con recebeu o mesmo volume de solução salina normal. No último dia do experimento, amostras de fezes, soro e tecidos do íleo foram coletadas e armazenadas a −80 °C para análises posteriores.

Monitoramento do Peso Corporal, Escores de Diarreia e Índices Esplênicos
Ao longo do experimento, o peso corporal dos camundongos foi registrado diariamente em horário e local consistentes, e os escores de diarreia foram documentados sistematicamente. A gravidade da diarreia foi avaliada utilizando os critérios estabelecidos por Akinobu Kurita: A gravidade da diarreia foi avaliada por meio de um sistema de pontuação variando de 0 a 3: a pontuação 0 indicava fezes normais, sem diarreia; 1 significava diarreia leve, caracterizada por fezes úmidas ou moles; 2 correspondia a diarreia moderada, com fezes úmidas e não formadas e leve coloração perianal; e 3 denotava diarreia grave, com fezes aquosas e coloração perianal significativa. As razões diárias de peso corporal foram calculadas com base nos pesos dos camundongos registrados no terceiro dia do experimento. No último dia, os camundongos foram eutanasiados de forma humanitária por deslocamento cervical, e seus baços foram extraídos.
O índice esplênico foi determinado usando a fórmula:
Índice esplênico = peso do baço/peso corporal (mg·g⁻¹).
Coloração com Hematoxilina e Eosina (HE)
Um segmento de aproximadamente 2 cm do íleo distal dos camundongos foi excisado e fixado em paraformaldeído a 4%. Após a fixação, os tecidos foram incluídos e seções de 4 μm de espessura foram preparadas e coradas com hematoxilina e eosina (HE). As alterações patológicas nos tecidos intestinais foram então examinadas e avaliadas usando um microscópio equipado com um sistema de câmera digital (Olympus Optical Co., Ltd., Tóquio, Japão).
Permeabilidade Intestinal
Usando kits de ensaio comerciais e seguindo meticulosamente as instruções e protocolos do fabricante, medimos os níveis de D-LA e DAO no soro dos camundongos.
Análise por Ensaio de Imunoadsorção Enzimática (ELISA)
As concentrações de TNF-α, IL-6 e IL-1β no soro dos camundongos, bem como os níveis de PGE2 no tecido do íleo, foram determinadas usando kits de ELISA de acordo com as diretrizes do fabricante. Todos os ensaios foram realizados meticulosamente seguindo os protocolos fornecidos para garantir a confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados.
Análise de Sequenciamento do 16S rDNA
O DNA total foi extraído de amostras fecais de camundongos usando o Magnetic Soil and Stool DNA Kit (TianGen, China), e sua qualidade foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 1% antes de diluir para 1 ng/μL. A região V3-V4 do 16S rDNA bacteriano foi amplificada usando Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs, EUA). Posteriormente, os produtos de PCR foram extraídos de géis de agarose a 2%, e os produtos de PCR que passaram no teste foram misturados e purificados. Esses produtos purificados foram submetidos à construção de bibliotecas e sequenciados na plataforma Illumina NovaSeq. Os dados brutos de sequenciamento foram então processados por meio de procedimentos de montagem, filtragem e desruído para obter variantes de sequência de amplicon (ASVs). Finalmente, a anotação de espécies das ASVs foi realizada usando o software QIIME2.
Análise de Metabolômica Não Direcionada
Amostras fecais (100 mg) foram trituradas em nitrogênio líquido, misturadas com 500 µL de solução metanol-água a 80%, vortexadas, resfriadas em gelo por 5 minutos e centrifugadas a 15.000 g por 20 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi diluído com água grau LC-MS para atingir 53% de metanol, centrifugado novamente e coletado para análise por LC-MS. Os metabólitos foram analisados usando LC-MS/MS, com separação cromatográfica realizada em um Vanquish UHPL (Thermo Fisher, Alemanha) e uma coluna Hypesil Gold (100 mm × 2,1 mm, 1,9 μm) (Thermo Fisher, EUA). As análises foram realizadas usando um espectrômetro de massa Q Exactive™ HF-X (Thermo Fisher, Alemanha). Compostos com coeficiente de variação (CV) acima de 30% nas amostras de Controle de Qualidade (CQ) foram excluídos, finalizando a identificação e quantificação dos metabólitos. A anotação de metabólitos empregou os bancos de dados KEGG (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html), HMDB (https://hmdb.ca/metabolites) e LIPIDMaps (http://www.lipidmaps.org/). Análises multivariadas, incluindo análise de componentes principais (PCA) e análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA), foram realizadas usando o software metaX para calcular os valores de importância da variável na projeção (VIP). Testes t univariados avaliaram a significância estatística (valores de P) e as mudanças de dobra (FC) dos metabólitos entre os grupos. Os metabólitos foram considerados diferencialmente expressos se atendessem aos critérios: VIP > 1, P < 0,05 e FC >1,2 ou < 0,833.
Com base na análise de GC-MS, constatou-se que o MagO contém 20 componentes ativos. As representações SMILES desses compostos foram obtidas do banco de dados PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Os alvos potenciais foram previstos usando esses formatos SMILES por meio do banco de dados SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) e convertidos em nomes de genes utilizando o banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org/), removendo quaisquer duplicatas. Além disso, os bancos de dados GeneCards (https://www.genecards.org/) e Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) (https://omim.org/) foram utilizados para obter os alvos relacionados à DII com as palavras-chave "enterite", "colite", "doença inflamatória intestinal" e "diarreia". Os alvos comuns ao MagO e à DII foram identificados como potenciais alvos terapêuticos contra a mucosite induzida por 5-FU. Uma rede de interação "componente-alvo" foi construída usando o Cytoscape 3.9.0. As interações entre os alvos previstos foram analisadas usando o banco de dados STRING (https://cn.string-db.org/), selecionando Homo sapiens como a espécie para análise de interação proteína-proteína (PPI). O arquivo TSV resultante foi importado para o Cytoscape 3.9.0 para criar uma rede PPI. Os alvos-chave foram identificados usando o plugin CentiScaPe 2.2 no Cytoscape, com base em parâmetros como grau, intermediação e proximidade. Adicionalmente, análises de enriquecimento Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) foram realizadas nos alvos potenciais do MagO usando a ferramenta "Functional Annotation" na plataforma Metascape (https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1), com significância definida em P < 0,05. Os resultados foram visualizados usando gráficos de bolhas e gráficos de barras gerados na plataforma MicrobiomeAnalyst. Na análise combinada de farmacologia de rede e metabolômica, foi utilizada a função "Joint-Pathway Analysis" do banco de dados MetaboAnalyst 6.0. Genes compartilhados e metabólitos diferenciais foram inseridos simultaneamente no banco de dados para identificar as vias que eles influenciam em conjunto. As vias nomeadas em homenagem a outras doenças foram excluídas, e as 25 principais vias classificadas foram apresentadas.
Docking Molecular
JAK2, PIK3CA, PRKCA e RXRA foram escolhidos como os principais alvos de docking molecular. Os modelos disponíveis de Homo sapiens para esses alvos, incluindo 6VN8, 2RD0, 2GZV e 4PP3, foram recuperados do Protein Data Bank (PDB, https://www.rcsb.org/). O docking virtual foi conduzido usando o software AutoDock Vina, selecionando ligantes com a menor energia de ligação e a melhor orientação. Os resultados do docking foram então visualizados usando o software PyMOL 2.6.0.
Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa em Tempo Real Quantitativa (RT-qPCR)
O RNA foi transcrito reversamente em cDNA utilizando o mix de reação M-MLV RT com gDNAse (Accurate Biotechnology, China), seguindo as instruções do fabricante. A RT-qPCR quantitativa foi realizada em um sistema Archimed X4 (ROCGENE, China) usando SYBR Green Pro Taq HS Premix (Accurate Biotechnology, China). Os níveis de expressão de mRNA relativos foram determinados pelo método 2−ΔΔCt. As sequências de iniciadores utilizadas neste estudo estão listadas na Tabela Suplementar S1.
Análise de Western Blot
Para avaliar os níveis de expressão das proteínas ZO-1, Ocludina, Bax, Bcl-2, P-PI3K/PI3K e P-AKT/AKT no tecido ileal, foi realizada a análise de Western blot. Amostras de tecido do íleo foram inicialmente homogeneizadas em tampão de lise RIPA usando um homogeneizador de tecido operado em baixas temperaturas (−20 °C) e uma frequência de 65 Hz. A homogeneização foi executada três vezes, cada uma com duração de 120 segundos, com uma pausa de 10 segundos entre os ciclos. Após a homogeneização, os lisados foram centrifugados a 12.000 g por 15 minutos a 4 °C para coletar o sobrenadante. As concentrações totais de proteína foram medidas usando um kit de ensaio de proteína BCA (Oriscience, China). As amostras foram adicionadas com tampão de carregamento após o ajuste da concentração de proteína e aquecidas em banho metálico a 95 °C por 5 minutos. As amostras de proteína foram então separadas em um gel de SDS-PAGE a 10% e transferidas para membranas de PVDF. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários direcionados a ZO-1, Ocludina (ambos na diluição de 1:1000; Affinity), Bax, Bcl-2, P-PI3K, PI3K, P-AKT, AKT (todos na diluição de 1:2000; Affinity), β-actina (diluição de 1:6000; Bioss) e GAPDH (diluição de 1:6000; Bioss). Subsequentemente, as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário (IgG de cabra anti-coelho conjugado com HRP; diluição de 1:5000) a 37 °C por 2 horas. Os sinais quimioluminescentes foram desenvolvidos usando um kit ECL (Oriscience, China), e as intensidades das bandas foram analisadas usando o software Image J.
Coloração por Imuno-histoquímica (IHC)
Para avaliar os níveis de expressão de ZO-1, Ocludina, EP2 e EP4 (Affinity, China), a coloração por IHC foi realizada em seções de tecido do íleo. As imagens foram adquiridas usando um microscópio equipado com uma câmera digital (Olympus Optical Co., Ltd., Tóquio, Japão) e analisadas quantitativamente com o software ImageJ. Para garantir a confiabilidade dos dados, três campos de visão aleatórios de cada seção foram selecionados, e a densidade óptica média (MOD) foi calculada.
Análise Estatística
Todos os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM), e as análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism (versão 8.0.1). As diferenças entre múltiplos grupos foram avaliadas usando análise de variância unidirecional (ANOVA), seguida por testes post hoc de Dunnett para comparações múltiplas. P < 0,05 foi considerado como significância estatística.
Resultados
Composições Químicas do MagO
O diagrama de fluxo iônico total do MagO analisado por GC-MS. O eixo y representa a intensidade do sinal (em partes por mil do sinal real), e o eixo x denota o tempo.
Os resultados da análise GC-MS foram apresentados na Figura 1 e na Tabela Suplementar S2. A proporção de cada componente foi obtida por normalização da área do pico. Um total de 20 compostos foram identificados, correspondendo a 96,99% da área de todos os picos cromatográficos detectados em MagO, incluindo β-eudesmol (39,085min, 26,75%), α-eudesmol (39,655min, 23,20%), γ-eudesmol (35,378min, 9,82%), p-Cimeno (8,312min, 7,13%), (-)-β-Cariofileno epóxido (24,041min, 4,73%), (+)-calareno (35,899, 4,43%), α-selineno (16,012min, 1,74%) e aristolocheno (36,655min, 0,59%).

MagO Melhorou as Alterações na Taxa de Peso Corporal, Pontuações de Diarreia e Índice Esplênico em Camundongos com Mucosite Induzida por 5-FU

MagO melhorou camundongos com mucosite induzida por 5-FU (n=8). (A) Estrutura experimental e tratamentos. (B) Taxa de peso corporal. (C) Pontuações de diarreia. (D) Índice esplênico. (E) Microestrutura histológica do íleo (aumento de 10×) por coloração H&E. Em (E), a seta azul indicou o comprimento das vilosidades e a profundidade das criptas, a seta vermelha indicou a cavitação, a seta preta indicou lesão e perda das vilosidades intestinais; barra de escala, 250 μm. (F) DAO. (G) D-LA. (H) IL-1β. (I) TNF-α. (J) IL-6. Os dados foram expressos como média ± EPM. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs grupo Mod; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs grupo Con.

O fluxo de trabalho experimental foi implementado de acordo com os procedimentos descritos na seção de materiais e métodos e representado na Figura 2A. Conforme representado nas Figuras 2B e C, a partir do dia 5 do experimento (segundo dia após a administração de 5-FU), observou-se uma diminuição consistente no peso corporal dos camundongos. No dia 10, o peso corporal do grupo 5-FU foi significativamente reduzido em comparação ao grupo Con (P < 0,001). Em contraste, ambos os grupos Lop e MagO-H apresentaram reduções de peso corporal significativamente menores em comparação ao grupo 5-FU (P < 0,05), enquanto não foram observadas diferenças significativas nos grupos MagO-L e MagO-M. Além disso, as pontuações de diarreia no grupo 5-FU mostraram um aumento sustentado em relação ao grupo Con (P < 0,01). Notavelmente, os grupos Lop e MagO-H demonstraram uma redução significativa nas pontuações de diarreia em comparação ao grupo Mod (P < 0,05), sem alterações significativas observadas nos grupos MagO-L e MagO-M. Adicionalmente, o índice esplênico foi significativamente elevado no grupo 5-FU em relação ao grupo Con (P < 0,001). Ambos os grupos Lop e MagO-H foram eficazes em reduzir marcadamente o índice esplênico em comparação ao grupo 5-FU (P < 0,001, P < 0,01), enquanto os grupos MagO-L e MagO-M não mostraram diferenças significativas (Figura 2D). Esses achados sugeriram que MagO-H atenuou efetivamente a perda de peso corporal induzida por 5-FU, o aumento das pontuações de diarreia e a elevação do índice esplênico, demonstrando assim seu potencial terapêutico.

MagO Inibiu as Alterações Patológicas do Íleo em Camundongos com Mucosite Induzida por 5-FU
Conforme mostrado na Figura 2E, a mucosa intestinal, as vilosidades e as estruturas das criptas no grupo Con permaneceram intactas, sem danos observados ou infiltração inflamatória. Em contraste, alterações patológicas significativas foram observadas no íleo dos camundongos induzidos por 5-FU, incluindo encurtamento das vilosidades, descamação, danos nas criptas, vacuolização e infiltração de células inflamatórias. Em comparação ao grupo Mod, os grupos Lop, MagO-M e MagO-H mostraram eficácia significativa em aliviar os danos intestinais, sendo o grupo Mag-H o mais eficaz. Em contraste, o grupo MagO-L não inibiu de forma proeminente as alterações patológicas no íleo.
MagO Inibiu a Permeabilidade Intestinal e os Níveis de Citocinas Inflamatórias no Soro de Camundongos com Mucosite Induzida por 5-FU
Conforme mostrado nas Figuras 2F e G, em comparação ao grupo Con, o 5-FU aumentou significativamente os níveis séricos de DAO e D-LA (P < 0,001), indicando um aumento acentuado na permeabilidade intestinal nos camundongos. Em comparação ao grupo Mod, o grupo Lop, bem como os grupos MagO-M e MagO-H, restauraram significativamente os níveis de DAO e L-DA. As Figuras 2H e J demonstraram que o 5-FU elevou evidentemente os níveis séricos de IL-1β, IL-6 e TNF-α (P < 0,001) em comparação ao grupo Con, indicando uma resposta inflamatória aumentada. Em comparação ao grupo Mod, o grupo Lop e o grupo MagO-H foram capazes de suprimir significativamente os níveis dessas citocinas inflamatórias.
Efeitos do MagO na Composição da Microbiota Intestinal em Camundongos com Mucosite Induzida por 5-FU
Papel regulador do MagO na composição da microbiota intestinal em camundongos com mucosite induzida por 5-FU (n=5). (A) Diagrama de Venn mostrando ASVs em cada grupo. (B e C) Análise de diversidade beta da microbiota intestinal utilizando gráfico PCoA e gráfico NMDS. (D-F) Análise de diversidade alfa da microbiota intestinal utilizando os índices Chao1, Shannon e Simpson. (G e H) Mapa da abundância relativa de espécies nos níveis de filo e gênero de cada grupo. (I) Espécies perturbadas pelo 5-FU, mas restauradas pelo MagO no nível de gênero. (J) Cladograma taxonômico gerado pela análise de efeito de tamanho da análise discriminante linear (LDA) (LEfSe) da microbiota intestinal entre os três grupos. O tamanho do círculo foi proporcional à abundância do táxon. Os dados foram expressos como média ± EPM. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. grupo Mod; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. grupo Con.
Com base nos indicadores farmacológicos acima, o MagO-H foi selecionado para análise de sequenciamento do gene 16S rDNA. O impacto do MagO na composição da microbiota intestinal em amostras fecais de camundongos induzidos por 5-FU foi investigado. Um diagrama de Venn foi utilizado para representar as OTUs da microbiota intestinal entre os diferentes grupos. Conforme mostrado na Figura 3A, 1410 OTUs foram compartilhadas entre os três grupos, com 439, 213 e 238 OTUs únicas nos grupos Con, Mod e MagO, respectivamente. A análise de diversidade β foi empregada para comparar a composição da comunidade microbiana entre diferentes amostras; distâncias mais próximas entre as amostras indicam composição de espécies mais semelhantes. Conforme representado nas Figuras 3B e C, as análises de PCoA e NMDS demonstraram separação significativa entre os grupos Con e Mod, enquanto o grupo MagO mostrou uma tendência de convergência com o grupo Con. A análise de diversidade α foi realizada para avaliar a riqueza e diversidade de espécies dentro de cada grupo. Conforme mostrado nas Figuras 3D-F, o 5-FU reduziu significativamente os índices Chao1, Shannon e Simpson (P < 0,01, P < 0,001, P < 0,001), enquanto o grupo de tratamento com MagO reverteu claramente esses declínios (P < 0,05, P < 0,01, P < 0,01). A abundância relativa da microbiota intestinal nos níveis de filo e gênero é mostrada nas Figuras 3G e H. No nível de filo, em comparação com o grupo Con, o 5-FU aumentou as abundâncias relativas de Proteobacteria, Verrucomicrobiota e Desulfobacterota e diminuiu as abundâncias relativas de Bacteroidota, Firmicutes, Actinobacteriota e Patescibacteria. No nível de gênero, o 5-FU aumentou a abundância relativa de Escherichia-Shigella, enquanto diminuiu as abundâncias relativas de Lactobacillus, Bacteroides, Alloprevotella e outros. O MagO reverteu com sucesso as alterações na abundância relativa microbiana tanto no nível de filo quanto de gênero.

Além disso, a análise MetaStat foi empregada para identificar táxons com significância estatística, focando naqueles perturbados pelo 5-FU e restaurados pelo tratamento com MagO (Figura 3I). Um total de 11 táxons foram identificados. O 5-FU aumentou significativamente a abundância relativa de Escherichia-Shigella, enquanto diminuiu significativamente as abundâncias relativas de Lactobacillus, Bacteroides, Alloprevotella, Erysipelatoclostridium, Parasutterella, Alistipes, Enterorhabdus, Colidextribacter e Candidatus_Arthromitus. O tratamento com MagO reverteu significativamente essas alterações. A análise LEfSE identificou adicionalmente táxons com diferenças significativas (score LDA >3), revelando espécies dominantes em cada grupo (Figura 3J). No grupo Con, os táxons dominantes incluíram Bacteroidales, Bacteroidota, Bacteroidia, Muribaculaceae, Bacilli e Lactobacillaceae; no grupo MagO, os táxons dominantes incluíram Prevotellaceae, Ruminococcus_torques_group, Butyricimonas_synergistica e Blautia; mas no grupo Mod, os táxons dominantes incluíram Enterobacterales, Escherichia_Shigella, Gammaproteobacteria, Proteobacteria e Acidaminococcaceae. Esses resultados indicaram que o MagO reverteu efetivamente a disbiose intestinal induzida por 5-FU.
Efeito do MagO nos Metabólitos Fecais em Camundongos com Mucosite Induzida por 5-FU
Efeito do MagO nos metabólitos fecais em camundongos com mucosite induzida por 5-FU (n=5). (A) Gráfico de escore PCA. (B) Gráfico de escore PLS-DA entre os grupos Con e Mod. (C) Gráfico de escore PLS-DA entre os grupos MagO e Mod. (D) Gráfico de vulcão dos metabólitos diferenciais no grupo Mod vs grupo Con. (E) Gráfico de vulcão dos metabólitos diferenciais no grupo MagO vs grupo Mod. (F) Enriquecimento de vias dos metabólitos diferenciais alterados pelo MagO.1: Metabolismo do ácido araquidônico.2: Metabolismo do ácido linoleico. 3: Biossíntese de fenilalanina, tirosina e triptofano.4: Biossíntese de ácidos graxos insaturados.5: Metabolismo da tirosina.6: Metabolismo da fenilalanina. (G) Mapa de calor dos metabólitos diferenciais envolvidos nas vias metabólicas. (H) As vias do metabolismo do ácido araquidônico e do metabolismo da síntese de PGE2. (I) Os níveis de PGE2 nas fezes foram determinados por kits de ELISA. (J e K) A localização celular e as expressões de EP2 e EP4 foram avaliadas por imuno-histoquímica (n = 3 por grupo); barra de escala, 250µm. Os dados foram expressos em média ± EPM. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs grupo Mod; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs Con.
Nesta seção do estudo, foi realizada uma análise metabolômica não direcionada de amostras fecais dos grupos Con, Mod e MagO utilizando a tecnologia LC-MS/MS. Foram identificados um total de 995 metabólitos em modo de íons positivos e 683 metabólitos em modo de íons negativos. A análise de componentes principais (PCA) foi utilizada para observar a distribuição metabólica geral entre os grupos. Conforme mostrado na Figura 4A, houve diferenças metabólicas significativas entre o grupo Mod e o grupo Con, e o grupo MagO ainda apresentou separação significativa do grupo Mod, com tendência em direção ao grupo Con. Isso sugeriu que o MagO poderia exercer efeitos terapêuticos na mucosite induzida por 5-FU através da modulação da composição de metabólitos. Da mesma forma, a análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) foi adicionalmente conduzida para selecionar metabólitos diferenciais entre os grupos. As Figuras 4B e C mostram clara separação entre os grupos Con e Mod, bem como entre os grupos Mod e MagO, indicando que o modelo não foi superajustado e que o método estabelecido demonstrou boa estabilidade e reprodutibilidade. Os metabólitos diferenciais foram então selecionados usando os critérios de VIP > 1,0, FC > 1,2 ou FC < 0,833, com P < 0,05. Os gráficos de vulcão fornecem uma representação visual da distribuição geral dos metabólitos diferenciais. Conforme mostrado nas Figuras 4D e E, em comparação com o grupo Con, os níveis de 146 metabólitos foram regulados negativamente e os níveis de 37 metabólitos foram regulados positivamente nas fezes de camundongos tratados com 5-FU e com mucosite. Em comparação com o grupo Mod, o grupo de tratamento com MagO regulou negativamente os níveis de 35 metabólitos e regulou positivamente os níveis de 195 metabólitos. Notavelmente, os níveis de 68 metabólitos foram simultaneamente afetados tanto pelo 5-FU quanto pelo MagO, com o 5-FU regulando negativamente os níveis de 61 metabólitos e regulando positivamente os níveis de 7 metabólitos, todos revertidos com sucesso pelo MagO. Para investigar melhor os mecanismos pelos quais o MagO melhora a mucosite induzida por 5-FU, os 68 metabólitos diferenciais foram submetidos à análise de enriquecimento da via KEGG. Conforme mostrado na Figura 4F, o MagO regulou significativamente várias vias metabólicas, incluindo o metabolismo do ácido araquidônico, o metabolismo do ácido linoleico, a biossíntese de fenilalanina, tirosina e triptofano, a biossíntese de ácidos graxos insaturados, o metabolismo da tirosina e o metabolismo da fenilalanina, com o metabolismo do ácido araquidônico identificado como a via mais crítica. Além disso, as mudanças nos metabólitos diferenciais envolvidos nessas vias metabólicas foram visualizadas através de um mapa de calor normalizado. Como mostrado na Figura 4G, o 5-FU regulou significativamente os níveis de 3 metabólitos (ácido palmítico, fosfatidilcolina, piritiona) e regulou negativamente os níveis de 26 metabólitos, incluindo Araquidonato, 13,14-di-hidro-15-ceto-prostaglandinaE2, prostaglandinaF2α e prostaglandina A2.
Com base nos resultados de metabolômica acima, a principal rede de vias metabólicas do tratamento com MagO para mucosite induzida por 5-FU foi mostrada na Figura 4H. O metabolismo do ácido araquidônico emergiu como a via metabólica mais significativa no tratamento da mucosite induzida por 5-FU com MagO. O 5-FU aumentou significativamente três metabólitos (ácido palmítico, fosfatidilcolina, piritionina) e diminuiu 26 metabólitos, incluindo araquidonato, 13,14-diidro-15-ceto-prostaglandina E2, prostaglandina F2α e prostaglandina A2. Além disso, investigamos se o MagO exerce seus efeitos modulando a expressão da prostaglandina E2 (PGE2) e seus receptores EP2 e EP4; medimos os níveis de PGE2 em tecidos do íleo e avaliamos a expressão de EP2 e EP4 por imuno-histoquímica. Conforme mostrado na Figura 4I, o 5-FU diminuiu significativamente o nível de PGE2 em comparação ao grupo Con (P <0,001), enquanto o MagO restaurou significativamente esses níveis (P <0,01). Além disso, o 5-FU suprimiu marcadamente as expressões de EP2 e EP4 (P <0,01), o que foi efetivamente revertido pelo MagO (P <0,01, P <0,05) (Figura 4J e K).
Análise de Correlação
A análise de correlação foi realizada entre os metabólitos relacionados à via identificados nas fezes, fenótipos (PT) e dados da microbiota intestinal. (A) Os resultados da análise de correlação entre a microbiota intestinal e os dados de PT. (B) Os resultados da análise de correlação entre os dados de metabolômica fecal e os dados de PT. (C) Os resultados da análise de correlação entre os dados de metabolômica fecal e os dados da microbiota intestinal. Os dados foram expressos como média ± EPM. *P < 0,05, **P < 0,01.
A análise da via KEGG identificou que o MagO modula significativamente vias incluindo o metabolismo do ácido araquidônico, o metabolismo do ácido linoleico e a biossíntese de fenilalanina, tirosina, triptofano e ácidos graxos insaturados. A análise do mapa de calor de correlação de Pearson foi utilizada para investigar as relações entre os metabólitos nessas vias, dados fenotípicos e microbiota intestinal (Figura 5A–C). A análise revelou correlações significativas, destacando particularmente Escherichia-Shigella, que foram positivamente associadas a marcadores inflamatórios e escores de diarreia, enquanto negativamente correlacionadas com o índice esplênico e a razão de peso corporal. Em contraste, Lactobacillus, Alistipes e Parasutterella exibiram correlações inversas, indicando seus papéis protetores. Além disso, o ácido palmítico e a fosfatidilcolina foram positivamente associados a marcadores inflamatórios e fenotípicos, enquanto outros metabólitos como prostaglandina F2a e ácido araquidônico foram negativamente correlacionados. Finalmente, investigamos as interações entre a microbiota e os metabólitos para avaliar sua influência na CIM. Escherichia-Shigella mostrou uma correlação positiva notável com ácido palmítico e fosfatidilcolina e uma correlação negativa com 7 metabólitos, incluindo 13,14-Diidro-15-ceto-prostaglandinaE2, Araquidonato e ProstaglandinaF2α. Em contraste, a abundância relativa de Lactobacillus demonstrou uma tendência oposta em sua correlação com os níveis de metabólitos em comparação com a de Escherichia-Shigella. Esses achados sugeriram que os efeitos terapêuticos do MagO podem estar intimamente associados ao metabolismo do ácido araquidônico, com Escherichia-Shigella, Lactobacillus, Alistipes e Parasutterella provavelmente desempenhando papéis cruciais nesse processo. Coletivamente, isso indicou que o MagO mitigou a inflamação intestinal induzida por 5-FU, dano mucosal e diarreia ao regular a microbiota e os metabólitos.

A Farmacologia de Rede Prevê Mecanismos Potenciais para o Tratamento da CIM com MagO

Para explorar mais os mecanismos subjacentes à eficácia anti-CIM do MagO, técnicas de farmacologia de rede foram empregadas para prever os alvos desses componentes-chave no MagO e sua associação com a CIM.

Análise de Farmacologia de Rede. (A) A rede de interação “componentes–alvos”. (B) Diagrama de Venn de alvos de interseção entre MagO e CIM. (C) Rede PPI de alvos potenciais. (D) Tabela.1 Análise de alvos-chave. (E) Análise de enriquecimento GO de alvos potenciais. (F) Análise de enriquecimento da via KEGG.
Uma rede “componente-alvo” foi construída, revelando que 20 componentes ativos do MagO estavam associados a 175 alvos (Figura 6A). Componentes ativos significativos foram identificados por meio da triagem do grau do nó. Notavelmente, componentes-chave do MagO, incluindo β-eudesmol, α-eudesmol, γ-eudesmol, aristolocheno e α-selineno, foram destacados, sugerindo seus papéis cruciais no tratamento da mucosite. Conforme ilustrado na Figura 6B, 51 alvos sobrepostos foram identificados entre os principais componentes do MagO e os alvos relacionados à CIM. Esses 51 genes foram posteriormente analisados usando o banco de dados STRING, e uma rede de interação proteína-proteína (PPI) foi construída no Cytoscape para elucidar os efeitos terapêuticos do MagO na mucosite induzida por 5-FU (Figura 6C e D). Além disso, utilizando o plugin CentiScaPe 2.2 e aplicando limiares (Degree > 8,7346939, Closeness > 0,0100395, Betweenness > 54,0000001), 12 alvos centrais foram identificados.
Posteriormente, a análise de enriquecimento GO foi realizada nas categorias Processo Biológico (BP), Componente Celular (CC) e Função Molecular (MF), resultando na identificação de 10 termos biológicos significativamente enriquecidos. Conforme mostrado na Figura 6E, a análise revelou fortes associações com processos biológicos como regulação do processo apoptótico de células epiteliais, regulação do transporte lipídico, regulação da resposta inflamatória e regulação positiva do processo metabólico de ácidos graxos. Além disso, a análise de enriquecimento KEGG identificou as 15 vias significativamente enriquecidas mais relevantes (Figura 6F), com vias notáveis incluindo vias no câncer, carcinogênese química - ativação de receptores, lipídios e aterosclerose, e a via de sinalização PI3K/AKT. Estudos recentes sugeriram que a via de sinalização PI3K/AKT estava intimamente relacionada à CIM, indicando que o MagO poderia exercer seus efeitos terapêuticos contra a mucosite induzida por 5-FU por meio dessa via. Portanto, a via de sinalização PI3K/AKT foi selecionada como foco para validação mecanicista adicional.
MagO Regulou Alvos-Chave na Via de Sinalização PI3K/AKT
Os resultados de docking e os resultados de validação dos alvos-chave no modelo de docking. (A) Mapa de calor da pontuação de docking molecular dos alvos-chave. (B) Diagrama de docking molecular da energia de ligação dos alvos-chave. (i) PIK3CA e α-eudesmol. (ii) JAK2 e β-eudesmol. (iii) JAK2 e γ-eudesmol. (iv) JAK2 e α-Selineno. (v) JAK2 e aristolocheno. (vi) PIK3CA e α-Selineno. (C)As expressões de mRNA de JAK2, PIK3CA, PRKCA e RXRA. Os dados foram expressos como média ± EPM. *P < 0,05, **P < 0,01 vs. grupo Mod; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs grupo Con.
Entre os 12 alvos principais, aqueles envolvidos na via de sinalização PI3K-AKT incluem JAK2, PIK3CA, PRKCA e RXRA. Portanto, este estudo utilizou métodos de docking molecular para analisar as interações entre os cinco componentes principais do MagO (β-eudesmol, α-eudesmol, γ-eudesmol, aristolochene e α-selinene) e esses quatro alvos principais. Menor energia de ligação indicou uma ligação ligante-receptor mais estável, conforme refletido nos escores de docking. Estudos anteriores sugeriram que um escore de ligação abaixo de −5,0 kcal/mol indicava boa atividade de ligação entre o ligante e o receptor. A Figura 7A apresentou um heatmap dos escores de docking, destacando forte atividade de ligação e formação de complexos estáveis. A Figura 7B exibiu as estruturas de docking com maiores escores de docking.
Para verificar ainda se o MagO exerceu seus efeitos através da regulação desses alvos-chave na resposta mediada por 5-FU, RT-qPCR foi utilizado para avaliar as expressões de mRNA desses alvos. Conforme mostrado na Figura 7C, em comparação ao grupo Con, as expressões de mRNA de JAK2, PIK3CA, PRKCA e RXRA foram significativamente reguladas negativamente após o tratamento com 5-FU (P <0,01, P <0,01, P <0,001 e P <0,01, respectivamente), enquanto o tratamento com MagO reverteu significativamente essas alterações. Esses resultados sugeriram que o MagO poderia exercer efeitos protetores no processo patológico induzido por 5-FU modulando as expressões desses genes principais.
Análise Integrativa de Farmacologia de Rede e Metabolômica
Análise Integrativa de Farmacologia de Rede e Metabolômica. O gráfico de barras mostrando as 25 vias KEGG enriquecidas mais importantes (Classificadas por -log10(valor p)).
Através da integração de 68 metabólitos diferenciais e 51 genes compartilhados, um total de 189 vias relacionadas foram enriquecidas. Após a triagem, as 25 vias mais significativamente enriquecidas foram retidas e visualizadas em um gráfico de barras (Figura 8). Essas vias incluíram a via de sinalização PI3K-AKT, via de sinalização HIF-1, via de sinalização JAK-STAT, via de sinalização de quimiocinas, diferenciação de células Th17 e via de sinalização VEGF. Entre estas, a via de sinalização PI3K-AKT demonstrou desempenhar um papel crucial não apenas na manutenção da função de barreira intestinal, mas também na ocorrência e regulação da inflamação da mucosa intestinal. Portanto, este estudo, combinado com os resultados da análise de farmacologia de rede, confirmou ainda o impacto crítico dos metabólitos diferenciais na inflamação intestinal, particularmente através da regulação da via de sinalização PI3K-AKT, contribuindo para o desenvolvimento e progressão da inflamação da mucosa intestinal.
MagO Inibiu a Via PI3K/AKT, Reduziu as Expressões de Proteínas de Junções Apertadas e Citocinas Relacionadas à Inflamação
MagO induziu a inibição da via PI3K/AKT e reduziu a expressão de proteínas de junção estreita e apoptose. (A) MagO regulou as expressões de ZO-1 e Ocludina no tecido do íleo (WB). (B) MagO regulou as expressões de Ocludina e ZO-1 (IHC, n = 3 por grupo); barra de escala, 250 µm. (C) MagO regulou as expressões de Bax e Bcl-2 no tecido do íleo. (D) MagO regulou as expressões de P-PI3K/PI3K e P-AKT e AKT no tecido do íleo. Os dados foram expressos como média ± EPM. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. grupo Mod; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. grupo Con.
Os resultados acima sugeriram que o 5-FU pode influenciar o reparo da mucosa e a regulação da apoptose ao inibir a via de sinalização PI3K/AKT. A análise de Western blot e imuno-histoquímica indicou que, nos tecidos do íleo de camundongos induzidos por 5-FU, o MagO reverteu significativamente as expressões de ZO-1 e Ocludina, mostrando uma diferença estatisticamente significativa em comparação ao grupo Mod (P < 0,001, P < 0,001; P < 0,01, P < 0,05) (conforme mostrado na Figura 9A e B). Conforme representado na Figura 9C, o grupo de tratamento com MagO reduziu significativamente a expressão de Bax (P < 0,05) enquanto aumentou significativamente a expressão de Bcl-2 (P < 0,01). Além disso, a Figura 9D mostrou que, em comparação ao grupo Mod, o MagO inibiu significativamente as expressões de P-PI3K/PI3K e P-AKT/AKT (P < 0,05, P < 0,05). Esses achados indicaram que o MagO poderia reduzir a apoptose e proteger a mucosa intestinal de danos ao inibir a via de sinalização PI3K/AKT.
Discussão
Este estudo estabeleceu com sucesso um modelo de mucosite induzida por 5-FU em camundongos. Considerando que perda de peso, redução do peso do baço e diarreia são efeitos colaterais comuns da quimioterapia com 5-FU, esses parâmetros foram utilizados para avaliar a gravidade da mucosite. Os resultados demonstraram que o MagO (100 μL·kg⁻¹) aumentou significativamente o peso corporal e o índice esplênico em camundongos com mucosite, reduziu os escores de diarreia e aliviou danos morfológicos no íleo induzidos por 5-FU, como atrofia das vilosidades, destruição das criptas e infiltração inflamatória. No entanto, a dose média (50 μL·kg⁻¹) e a dose baixa (25 μL·kg⁻¹) não melhoraram significativamente a mucosite intestinal. Embora uma tendência dose-dependente tenha sido observada, as diferenças não foram estatisticamente significativas em comparação ao grupo Mod. O dano à barreira epitelial intestinal é um fator patogênico crítico na mucosite induzida por 5-FU. O estudo descobriu que o MagO-H reduziu significativamente os níveis das citocinas inflamatórias TNF-α, IL-6 e IL-1β no soro de camundongos induzidos por 5-FU, bem como os níveis dos marcadores de permeabilidade intestinal DAO e D-LA. Isso indicou que o MagO-H aliviou efetivamente a permeabilidade intestinal e as respostas inflamatórias associadas à função prejudicada da barreira epitelial. Dado que apenas o MagO-H apresentou efeitos protetores significativos contra a mucosite induzida por 5-FU entre as três doses testadas, ele foi selecionado para estudos mecanísticos adicionais.
A microbiota intestinal desempenha um papel crítico na patogênese da mucosite intestinal. Estudos mostraram que o 5-FU influencia o desenvolvimento da mucosite alterando o microbioma intestinal. Para investigar se a microbiota intestinal está envolvida nos efeitos terapêuticos do MagO na CIM induzida por 5-FU, analisamos a composição da microbiota intestinal após o tratamento com 5-FU e MagO. Os resultados indicaram que o MagO reverteu a redução induzida por 5-FU na abundância e diversidade da microbiota intestinal, enriquecendo significativamente a abundância relativa de bactérias benéficas como Lactobacillus, Bacteroides, Alistipes, Alloprevotella e Parasuttella. O enriquecimento dessas bactérias contribui para a restauração da função de barreira intestinal e o alívio da inflamação. Por outro lado, bactérias patogênicas promovem a progressão da mucosite intestinal. Shigella, por exemplo, está associada a doenças bem definidas e desencadeia colite infecciosa. Em nosso estudo, o MagO reverteu significativamente o aumento induzido por 5-FU na abundância relativa de Escherichia-Shigella, sugerindo que o alívio da CIM pelo MagO poderia ser mediado pela inibição de bactérias patogênicas. Estudos anteriores demonstraram que os metabólitos desempenham um papel crucial no desenvolvimento da mucosite intestinal.
Através da análise metabolômica não direcionada de fezes de camundongos, descobrimos que o MagO influenciou significativamente os metabólitos nas fezes de camundongos tratados com 5-FU, particularmente aqueles relacionados a ácidos graxos e aminoácidos. Essas alterações afetaram várias vias metabólicas, incluindo o metabolismo do ácido araquidônico, o metabolismo do ácido linoleico e a biossíntese de fenilalanina, tirosina e triptofano. Dentre essas vias alteradas, o metabolismo do ácido araquidônico foi o mais proeminente e está intimamente associado à função e homeostase da barreira intestinal. Nossos achados indicaram que o MagO modulou a regulação na via metabólica do ácido araquidônico, incluindo o aumento dos níveis de ácido araquidônico, prostaglandinaF2α, prostaglandinaA2 e 13,14-Di-hidro-ceto-prostaglandinaE2, juntamente com a redução do nível de fosfatidilcolina. A PGE2 é uma molécula-chave de sinalização lipídica amplamente envolvida na regeneração e reparo tecidual, particularmente no intestino, onde desempenha um papel regulador na perfusão intestinal ao modular o fluxo sanguíneo e promover a homeostase, especialmente por meio de suas ações mediadas por receptores. Além disso, a PGE2 acelera o reparo do dano intestinal induzido por 5-FU ao aumentar a expressão de FOXM1 e a expressão das ciclinas D1 e D2. Estudos demonstraram que a PGE2 exerce efeitos protetores na mucosa gastrointestinal através de seus receptores EP. Especificamente, a ativação do receptor EP4 em células epiteliais intestinais contribui para a manutenção da homeostase intestinal. Em um modelo de camundongo com colite induzida por DSS, a PGE2 alivia a inflamação intestinal e promove a regeneração da barreira epitelial intestinal através da modulação do receptor EP4. Além disso, a PGE2 aumenta a cicatrização de lesões no intestino delgado ao aumentar a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e estimular a angiogênese por meio da ativação do receptor EP4. O receptor EP2 também é considerado um potencial alvo terapêutico para a inflamação intestinal. Pesquisas indicam que a PGE2, ao se ligar ao receptor EP2, reduz a apoptose induzida por radiação das células epiteliais do intestino delgado e aumenta a sobrevivência das criptas, um processo que envolve a via de sinalização PI3K/AKT. Nosso estudo demonstrou que a administração de MagO reverteu significativamente a redução induzida por 5-FU no nível de PGE2 e nas expressões proteicas de EP2 e EP4, indicando sua proteção da barreira epitelial intestinal através da modulação do eixo de sinalização PGE2/EP2/EP4.
Também realizamos análises de correlação de dados fenotípicos, da microbiota intestinal e metabolômicos para identificar associações significativas entre gêneros bacterianos chave e vias metabólicas. Os resultados mostraram que as abundâncias relativas de Lactobacillus, Alistipes, Parasuttella e Escherichia-Shigella foram significativamente correlacionadas com os níveis de metabólitos do ácido araquidônico e indicadores fenotípicos. Os achados indicaram que MagO aliviou a mucosite intestinal induzida por 5-FU ao restaurar a homeostase microbiota intestinal-metabólitos, permitindo que a microbiota chave melhore o dano mucosal através da regulação da via do ácido araquidônico.
Para investigar mais a fundo o mecanismo subjacente aos efeitos terapêuticos do MagO na CIM, este estudo também empregou abordagens de farmacologia de redes. A análise por GC-MS revelou que 20 componentes químicos do MagO foram identificados, correspondentes a alvos da CIM, resultando na identificação de 51 alvos sobrepostos. Uma rede "composto-alvo" foi posteriormente construída. Os resultados indicaram que β-eudesmol, α-eudesmol, γ-eudesmol, aristoloceno e α-selineno foram os principais componentes do MagO responsáveis pela melhora da CIM induzida por 5-FU. A análise de vias KEGG sugeriu que o MagO exerce seus efeitos modulando a via de sinalização PI3K/AKT. Para validar o impacto do MagO na via PI3K/AKT, foi realizada a ancoragem molecular para analisar as interações entre os cinco componentes principais e os alvos-chave envolvidos na via PI3K/AKT (JAK2, PIK3CA, PRKCA e RXRA). Além disso, a RT-qPCR foi utilizada para verificar as expressões desses alvos. Os resultados demonstraram que o MagO modulou a expressão desses genes centrais. A via de sinalização PI3K/AKT está intimamente associada ao desenvolvimento de mucosite intestinal. Estudos mostraram que a ativação dessa via pode induzir sinais pró-inflamatórios e pró-apoptóticos, enquanto regula negativamente a expressão de proteínas de junção ocludente, contribuindo assim para o dano à mucosa. A análise por Western blot e imunohistoquímica revelou que o MagO inibiu a via PI3K/AKT, regulou negativamente a expressão de Bax, regulou positivamente a expressão de Bcl-2 e aumentou as expressões de ZO-1 e Ocludina.

Notavelmente, o MagO-M apresentou eficácia nos índices de permeabilidade intestinal, mas não conseguiu melhorar outros índices farmacológicos. Isso pode ocorrer porque seus componentes lipofílicos se acumulam preferencialmente no intestino após administração oral, não atingindo o limiar para inibir a ação relacionada ao baço ou regular os fatores inflamatórios sistêmicos. Assim, aumentar a concentração do fármaco é essencial tanto para os efeitos terapêuticos locais quanto sistêmicos. Além disso, o MagO, uma mistura multicomponente contendo terpenoides como β-eudesmol, α-pineno e β-cariofileno, é rapidamente absorvido e distribuído após administração oral, com a maior exposição gastrointestinal. O metabolismo hepático converte seus componentes em metabólitos mais polares, e a excreção ocorre principalmente via urina e fezes. Devido à sua complexidade, volatilidade e lipofilicidade, a biodisponibilidade média do MagO é de 1,54% a 55%. O MagO é seguro e de baixa toxicidade dentro de uma certa faixa de dose, mas certos componentes em altas doses, como α-pineno, D-Limoneno e Linalol, podem causar hepatotoxicidade, e o uso prolongado pode resultar em desconforto gastrointestinal. É necessário cautela na determinação da dose e duração do tratamento para garantir a segurança clínica. Além disso, camundongos machos foram escolhidos para evitar a interferência do estrogênio no desenvolvimento da mucosite intestinal, garantindo a confiabilidade experimental.
Em resumo, o MagO, como componente ativo central da casca de Magnoliae Officinalis Cortex, uma erva tradicional chinesa, demonstrou pela primeira vez exercer efeitos de proteção da mucosa através de uma rede sinérgica multidimensional de “microbiota-metabolismo-via de sinalização”. Especificamente, o MagO não apenas enriqueceu seletivamente bactérias benéficas associadas à mucosite intestinal, enquanto suprimiu bactérias patogênicas, mas também remodelou a rede metabólica do ácido araquidônico e inibiu concomitantemente a via de sinalização PI3K/AKT. Isso estabeleceu uma rede protetora tripla envolvendo remodelação microbiana, regulação metabólica e intervenção na sinalização celular. Metodologicamente, nossa análise integrada de multi-ômicas combinada com perfil GC-MS revelou, pela primeira vez, que os componentes centrais do MagO tinham como alvo direto as vias das células hospedeiras, enquanto promoviam indiretamente a reparação da mucosa através de metabólitos derivados da microbiota. Essas descobertas forneceram evidências científicas para a aplicação clínica dos componentes de Magnoliae Officinalis Cortex na medicina moderna e abrem uma nova via para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas de longa duração e seguras contra a CIM.

Conclusão

O MagO exerceu seus efeitos inibitórios contra os danos à barreira epitelial causados pelo 5-FU. Primeiramente, o MagO restaurou as alterações induzidas pelo 5-FU na microbiota intestinal, aumentando as abundâncias relativas de bactérias benéficas como Lactobacillus, Alistipes e Parasuttella, enquanto reduzia a de Escherichia-Shigella patogênica. Em segundo lugar, o MagO influenciou várias vias metabólicas, particularmente o metabolismo do ácido araquidônico, e descobriu-se que ele regula positivamente o nível de PGE2 e as expressões de EP2 e EP4. Além disso, o MagO teve como alvo JAK2, PIK3CA, PRKCA e RXRA para inibir a via PI3K/AKT, regulando assim positivamente a expressão de Bcl-2 e negativamente a expressão de Bax. Essas ações melhoraram, em última análise, as expressões das proteínas de junção estreita ZO-1 e Ocludina.

Em suma, elucidamos os efeitos farmacológicos e os mecanismos moleculares pelos quais o MagO melhora a mucosite intestinal induzida por 5-FU por meio de análise integrada da microbiota intestinal, metabolômica e farmacologia de rede. Mecanisticamente, o MagO restaurou o equilíbrio da microbiota intestinal e dos metabólitos. Além disso, o MagO aumentou a expressão de proteínas de junção estreita, atenuou os danos à barreira epitelial intestinal, reduziu a permeabilidade intestinal e suprimiu a apoptose. Vale ressaltar que os efeitos do MagO podem ser mediados pela inibição da via PI3K/AKT e ativação da via PGE2/EP2/EP4 (Figura 10). Essas abordagens integradas fornecem evidências robustas para o papel protetor do MagO contra a CIM através da modulação de vias biológicas chave e da microbiota intestinal, estabelecendo uma base para a tradução clínica e exploração mecanicista.
CIM, mucosite induzida por quimioterapia; MagO, óleo volátil da casca de Magnoliae Officinalis; 5-FU, 5-fluorouracil; DAO, diamina oxidase; D-LA, ácido D-láctico; OUT, unidades taxonômicas operacionais; PCA, Análise de Componentes Principais; PLS-DA, análise discriminante por mínimos quadrados parciais; VIP, Importância da Variável na Projeção; FC, Mudança de Vezes; PPI, interação proteína-proteína; ZO-1, zonula occludens 1; PGE2, prostaglandina E2; EP, receptor de prostaglandina.
Declaração de Compartilhamento de Dados
Os conjuntos de dados PRJNA1198729 deste estudo podem ser encontrados no National Center for Biotechnology Information (NCBI). Os registros SRA estarão acessíveis através do seguinte link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA1198729.
Declaração de Ética
O Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu aprovou todos os procedimentos seguindo as 391 recomendações apresentadas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (2022007021).
Contribuições dos Autores
Todos os autores fizeram uma contribuição significativa para o trabalho relatado, seja na concepção, delineamento do estudo, execução, aquisição de dados, análise e interpretação, ou em todas essas áreas; participaram da redação, revisão ou revisão crítica do artigo; deram a aprovação final da versão a ser publicada; concordaram com o periódico ao qual o artigo foi submetido; e concordam em ser responsáveis por todos os aspectos do trabalho.
Declaração
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Referências
Caracterização de um novo modelo murino duplo de mucosite oral e intestinal induzida por quimioterapia
Manejo da mucosite durante a quimioterapia: da fisiopatologia à terapêutica pragmática
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