pmid: "22445602"
title: "Os produtos naturais magnolol e honokiol são moduladores alostéricos positivos dos receptores GABA(A) sinápticos e extra-sinápticos."
authors: "Alexeev M, Grosenbaugh DK, Mott DD, Fisher JL"
journal: "Neuropharmacology"
pubdate: "2012 Jun"
doi: "10.1016/j.neuropharm.2012.03.002"
source: "PMC Full Text"

Os produtos naturais magnolol e honokiol são moduladores alostéricos positivos dos receptores GABA(A) sinápticos e extra-sinápticos.

Autores

Alexeev M, Grosenbaugh DK, Mott DD, Fisher JL

Periodico

Neuropharmacology (2012 Jun)

Conteudo

Os produtos naturais magnolol e honokiol são moduladores alostéricos positivos dos receptores GABAA sinápticos e extra-sinápticos

O National Center for Complementary and Alternative Medicine (NCCAM) estima que quase 40% dos adultos nos Estados Unidos utilizam medicinas alternativas, muitas vezes na forma de suplementos fitoterápicos. Extratos da casca de árvores do gênero Magnolia têm sido usados há séculos nas medicinas tradicional chinesa e japonesa para tratar diversas doenças neurológicas, incluindo ansiedade, depressão e convulsões. Os ingredientes ativos dos extratos foram identificados como os isômeros bifenólicos magnolol e honokiol. Foi demonstrado que esses compostos aumentam a atividade dos receptores GABAA, o que é consistente com seus efeitos biológicos. Os receptores GABAA exibem uma heterogeneidade substancial de subunidades, o que influencia tanto suas propriedades funcionais quanto farmacológicas. Examinamos a atividade do magnolol e do honokiol em diferentes populações de receptores GABAA neuronais e recombinantes para caracterizar seu mecanismo de ação e determinar se a sensibilidade à modulação dependia da composição de subunidades do receptor. Descobrimos que o magnolol e o honokiol potencializam tanto a neurotransmissão GABAérgica fásica quanto a tônica em neurônios granulares do giro denteado do hipocampo. Além disso, todos os receptores recombinantes examinados foram sensíveis à modulação, independentemente da identidade do subtipo da subunidade α, β ou γ, embora os compostos tenham mostrado eficácia particularmente alta em receptores contendo δ. Essa modulação positiva direta de ambas as populações sinápticas e extra-sinápticas de receptores GABAA sugere que suplementos contendo magnolol e/ou honokiol seriam ansiolíticos, sedativos e anticonvulsivantes eficazes. No entanto, esperam-se também efeitos colaterais significativos e risco de interações medicamentosas.

1. Introdução
   Os transtornos de ansiedade estão entre as condições neurológicas mais comuns, com estimativa de 15 a 26 milhões de americanos sofrendo de sintomas relacionados à ansiedade anualmente. Embora os benzodiazepínicos e outros medicamentos prescritos continuem sendo o padrão clínico para tratamento, as propriedades ansiolíticas potenciais de suplementos naturais derivados de plantas têm recebido atenção crescente. Quase 40% dos adultos nos Estados Unidos relataram o uso de medicina complementar e alternativa (MCA) em uma pesquisa de 2007 realizada pelo National Center for Complementary and Alternative Medicine. Nessa pesquisa, duas das dez principais condições tratadas com MCA tanto para adultos quanto para crianças foram ansiedade/estresse e insônia.
   Uma fonte promissora de produtos naturais neurologicamente ativos é a casca de árvores de Magnólia. Extratos da casca de Magnolia officinalis e outras espécies têm sido usados na medicina tradicional chinesa e japonesa por séculos como sedativos e ansiolíticos. Esses extratos possuem atividade ansiolítica em modelos roedores e em dois estudos clínicos foram encontrados para reduzir a ansiedade temporária e melhorar o sono em humanos. Os isômeros magnolol (5,5′-diallyl-2,2′-dihydroxybiphenyl) e honokiol (3,5′-diallyl-4,2′-dihydroxybiphenyl) são os principais componentes ativos do extrato de casca de magnólia, tipicamente constituindo 1–10% da casca seca, dependendo da espécie e dos métodos de isolamento. Esses dois compostos também foram identificados como agentes neurologicamente ativos, com ações ansiolíticas, sedativas, neuroprotetoras e anticonvulsivantes em modelos animais (; ver revisão de).

Embora esses efeitos comportamentais possam ser mediados por uma variedade de alvos, muitos medicamentos usados clinicamente para tratar ansiedade, insônia e convulsões atuam potencializando a neurotransmissão GABAérgica, e tanto o magnolol quanto o honokiol demonstraram se ligar e modular positivamente os receptores GABAA. Os receptores GABAA pentaméricos são estruturalmente heterogêneos e podem ser montados a partir de uma combinação de mais de dezesseis subtipos diferentes de subunidades. Os níveis de expressão das subunidades variam por todo o cérebro e a composição de subunidades influencia as propriedades funcionais e farmacológicas do receptor, bem como seu tráfego e localização sináptica. Os receptores GABAA pós-sinápticos podem mediar tanto uma inibição fásica rápida quanto uma inibição tônica duradoura. A população de receptores extra-sinápticos responsável pela inibição tônica é um alvo potencialmente importante para a modulação da atividade neuronal, e é caracterizada por uma composição de subunidades e perfil farmacológico distintos em comparação com os receptores sinápticos.

Como esses produtos naturais estão amplamente disponíveis com supervisão regulatória limitada, é importante determinar se podem ser usados de forma segura e eficaz. Além disso, a identificação de compostos de plantas medicinais que atuam por meio de novos sítios pode fornecer novas opções de tratamento para distúrbios neurológicos. Os objetivos principais deste estudo foram comparar a atividade do magnolol e do honokiol em populações de receptores GABAA sinápticos e extra-sinápticos, determinar se a sensibilidade à modulação é dependente da subunidade e investigar seu mecanismo e sítio de ação.
2. Materiais e Métodos
2.1. Registros de fatias hipocampais
Fatias de cérebro foram preparadas de ratos anestesiados com isoflurano (20–25 dias de idade). Fatias transversais de 300 μm de espessura foram cortadas usando um vibrátomo (Leica VT1000S, Nussloch, Alemanha) e preparadas em fluido cerebrospinal artificial (aCSF) de 'corte' frio (4°C), oxigenado (95% O2/5% CO2), à base de sacarose, contendo (em mM): 248 sacarose, 2 KCl, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 glicose, 0,5 CaCl2 e 5 MgS04 (350 mOsm). As fatias foram então incubadas por aproximadamente uma hora à temperatura ambiente em aCSF oxigenado (95% O2/5% CO2) contendo (em mM): 125 NaCl, 2,7 KCl, 1,25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 10 glicose, 0,5 CaCl2, 7 MgSO4, 0,02 D-APV e 1 ácido quinurênico (pH 7,4; 305–312 mOsm). Para registro de patch-clamp em célula inteira, as fatias foram colocadas em uma câmara submersa perfundida com aCSF aquecido (30–32°C), oxigenado (95% O2/5% CO2) contendo (em mM): 125 NaCl, 2,7 KCl, 1,25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 10 glicose, 2 CaCl2 e 1 MgSO4 (pH 7,4; 305 mOsm). Os registros foram feitos a partir de células granulares do giro denteado (DGCs) localizadas na lâmina infrapiramidal do giro denteado, identificadas visualmente com óptica de contraste de interferência diferencial infravermelha. IPSCs foram evocados por estimulação no estrato molecular do giro denteado próximo ao eletrodo de registro. Os estímulos foram pulsos de corrente constante, retangulares, monofásicos, catódicos, de 0,1 ms (10–100 μA) entregues através de eletrodos de estimulação monopolares de platina-irídio (FHC Inc, Bowdoin, ME). Os IPSCs foram registrados usando eletrodos de vidro borossilicato (5–8 MΩ) preenchidos com uma solução interna contendo (em mM): 130 ácido D-glicônico, 130 CsOH, 7 CsCl, 10 HEPES, 3 QX-314, 2 MgATP, 0,3 Na2GTP, gerando um potencial de reversão do cloreto de −42 mV. Registros de mIPSC e tônicos foram realizados usando uma solução interna contendo (em mM): 140 CsCl, 10 HEPES, 3 QX-314, 4 MgATP, 0,3 Na2GTP, gerando um potencial de reversão do cloreto de 0 mV. As células foram fixadas em potencial a −20 mV para IPSCs evocados e −60 mV para corrente tônica e mIPSCs. A resistência de entrada e de série foi monitorada durante todo o experimento, e registros nos quais qualquer uma mudou mais de 25% foram descartados.

Em todos os experimentos, os IPSCs foram isolados farmacologicamente bloqueando os receptores NMDA usando ácido D-2-amino-5-fosfonopentanóico (D-APV, 50 μM) ou maleato de MK-801 (10 μM) e receptores AMPA/cainato usando 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX, 50 μM). As correntes tônicas e mIPSCs foram isolados com a adição de tetrodotoxina (TTX, 1 μM). Bicuculina metoclorida (20 μM) foi adicionada ao final de cada experimento para confirmar que o IPSC registrado era inteiramente GABAérgico. Os fármacos foram perfundidos por no mínimo 20 minutos para obter uma linha de base estável. Honokiol e magnolol (Sigma-Aldrich, St Louis MO) foram preparados como soluções estoque em DMSO e diluídos em aCSF no dia do experimento, com uma concentração final de DMSO não superior a 0,06%.
2.2.
cDNAs de comprimento total codificando receptores GABAA de mamíferos em vetores de expressão pCMVNeo foram transfectados (2 μg de cada subunidade) na linhagem celular de rim embrionário humano HEK-293T (GenHunter, Nashville, TN) usando precipitação com fosfato de cálcio. Os clones de subunidades foram gentilmente fornecidos pelo Dr. Robert Macdonald (Vanderbilt University, Nashville, TN) e pelo Dr. David Weiss (University of Texas Health Sci. Center, San Antonio, TX). Para seleção de células transfectadas, 1 μg do plasmídeo pHook™-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo cDNA codificando o anticorpo de superfície sFv também foi transfectado nas células. Após uma incubação de 4–6 horas a 3% de CO2, as células foram tratadas com uma solução de 15% de glicerol em tampão BBS (50 mM BES (ácido N,N-bis[2-hidroxietil]-2-aminoetanossulfônico), 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4) por 30 segundos. As células foram mantidas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) mais 10% de soro fetal bovino, 100 UI/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina. O procedimento de seleção para expressão de pHook foi realizado 44–52 horas depois. As células foram repicadas por incubação de 5 min com solução de 0,05% de tripsina/0,02% de EDTA em tampão fosfato-salino (10 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH=7,3) e misturadas com 3–5 μl de esferas magnéticas revestidas com antígeno para o anticorpo pHook (aproximadamente 6 × 10⁵ esferas). Após uma incubação de 30–60 min para permitir a ligação das esferas às células positivamente transfectadas, as esferas e as células revestidas por esferas foram isoladas usando um suporte magnético. As células selecionadas foram ressuspensas em DMEM, plaqueadas em lamínulas de vidro tratadas com poli-L-lisina e revestidas com colágeno, e utilizadas para registros 18–28 horas depois.

Para registros de células HEK-293T, a solução externa consistiu em (em mM): 142 NaCl, 8,1 KCl, 6 MgCl2, 1 CaCl2 e 10 HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico) com pH = 7,4 e osmolaridade ajustada para 295–305 mOsm. Os eletrodos de registro foram preenchidos com uma solução interna de (em mM): 153 KCl, 1 MgCl2, 5 K-EGTA (ácido etilenoglicol-bis(β-aminoetil éter) N,N,N′,N′-tetraacético), 2 MgATP e 10 HEPES com pH = 7,4 e osmolaridade ajustada para 295–305 mOsm. O GABA foi diluído em solução externa a partir de estoques recém-preparados ou congelados em água. Magnolol e honokiol foram diluídos a partir de estoques em DMSO e a concentração final de DMSO para esses experimentos não foi superior a 0,01%. As pipetas de patch foram puxadas a partir de vidro borossilicato com um filamento interno (World Precision Instruments, Sarasota, FL) em um puxador de dois estágios (Narishige, Japão) até uma resistência de 5–10 MΩ. Para registros de célula inteira, o GABA foi aplicado às células usando um trocador de soluções em degrau com um tempo de troca completo de <50 ms (ponteira aberta, SF-77B, Warner Instruments, Hamden, CT). Para registros de macropatch, o vidro quadrado de 3 barril foi puxado até um tamanho final próximo de 200 μm, o que proporcionou tempos de subida de 10–90% na ponteira aberta consistentemente mais rápidos que 400 μs.

2.3. Construção de cDNAs de subunidades mutadas
Mutações pontuais foram geradas utilizando o procedimento e os produtos QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA). Os oligonucleotídeos iniciadores foram sintetizados e o sequenciamento de DNA foi realizado pela instalação central de DNA da Universidade da Carolina do Sul (Columbia, SC). A numeração dos sítios de mutação é baseada na sequência madura de rato.
2.4. Análise de dados
Fatia hipocampal de cérebro
As correntes de célula inteira foram registradas utilizando um amplificador MultiClamp700B e filtradas a 1 kHz. As respostas foram digitalizadas utilizando uma placa A–D Digidata 1440A e analisadas utilizando os programas Clampfit (pacote pClamp10.3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e Origin 7.5 (OriginLab, Northampton, MA). A potenciação das IPSCs evocadas foi avaliada medindo o tempo de decaimento de 50% e a amplitude de pico da IPSC, enquanto as mIPSCs foram identificadas e analisadas utilizando o software MiniAnalysis (Synaptosoft, Inc., Fort Lee, NJ). O tamanho da corrente inibitória tônica foi determinado subtraindo a corrente de manutenção sob condições basais da corrente de manutenção na presença de bicuculina (20 μM). Para experimentos medindo a corrente GABAérgica tônica, qualquer célula com uma corrente tônica basal < 15 pA foi descartada.
Receptores recombinantes
As correntes foram registradas com um amplificador de patch clamp Axon 200B e analisadas utilizando os programas Clampfit e Prism (Graphpad, San Diego, CA). Os dados de concentração-resposta foram ajustados com uma equação logística de quatro parâmetros (Corrente = [Corrente mínima + (Corrente máxima − Corrente Mínima)]/1+(10^(log CE50 – log [GABA])*n) onde n representa o número de Hill. Todos os ajustes foram feitos para dados normalizados com a corrente expressa como uma porcentagem da resposta máxima ao GABA para cada célula. As correntes de macropatch foram digitalizadas a 10 kHz e analisadas com o pacote de programas pClamp. A taxa de desativação foi determinada ajustando a corrente de decaimento com o método dos mínimos quadrados de Levenberg-Marquardt com duas funções exponenciais.
Testes t de Student pareados ou não pareados, ANOVA e testes de comparações múltiplas de Tukey-Kramer foram realizados utilizando o programa Instat (Graphpad) ou Origin 7.5 (OriginLab, Northampton, MA) com um nível de significância de p<0,05. Os logs das medições de CE50 para GABA, magnolol e honokiol foram utilizados para comparação estatística.
3. RESULTADOS
3.1. Modulação da neurotransmissão GABAérgica
Embora existam evidências indicando que magnolol e honokiol possam interagir com receptores GABAA, o efeito desses compostos na neurotransmissão GABAérgica em neurônios ainda não foi relatado. Portanto, utilizamos registros de célula inteira para medir o efeito do honokiol e do magnolol nas CPSEs mediadas por receptores GABAA e na corrente tônica em células granulares do giro denteado. CPSEs monossinápticas foram eliciadas por estimulação de neurônios GABAérgicos em uma intensidade que evocou uma CPSE que era 50% da máxima. Essas correntes foram completamente bloqueadas por 20 μM de bicuculina (n = 10), indicando que foram mediadas por receptores GABAA. O tempo de decaimento de 50% teve média de 20,1 ± 1,7 ms (n = 10), em concordância com relatos anteriores. Magnolol (30 μM) e honokiol (60 μM) foram aplicados em banho e seu efeito na amplitude e no tempo de decaimento da CPSE foi medido. Tanto magnolol (267,7±7,9%, p<0,001, n=5) quanto honokiol (299,5±16,6%, p<0,001, n=5) retardaram significativamente o tempo de decaimento (Figura 1A). Em contraste, a amplitude da CPSE não foi significativamente afetada por nenhum dos compostos (magnolol: 105,7±11,2%, p>0,05, n=5; honokiol: 113,3±25,0%, p>0,05, n=5; Figura 1A).

Em neurônios granulares do giro denteado, a inibição tônica é mediada por uma população de receptores GABAA extra-sinápticos distintos daqueles que produzem a CPSE. Examinamos se os moduladores poderiam afetar esses receptores GABAA analisando seu efeito na inibição tônica. A corrente GABAérgica tônica foi registrada na presença de CNQX (50 μM), D-APV (50 μM) e TTX (1 μM) e teve média de 36,1±4,7 pA (n=13). Ambos os moduladores causaram uma potencialização semelhante dessa corrente (Figura 1B). O magnolol aumentou a corrente tônica em 402,5±61,7% (p<0,001, n=7), enquanto o honokiol aumentou a corrente tônica em 351,2±79,0% (p<0,05, n=6). Esses achados sugerem que os moduladores podem potencializar tanto os receptores GABAA extra-sinápticos quanto os sinápticos.

Também examinamos se esses compostos poderiam afetar a neurotransmissão GABAérgica por meio de mecanismos pré-sinápticos. Para investigar essa possibilidade, analisamos a frequência das CPSEs miniatura (mCPSEs) na presença de 1 μM de TTX. Tanto magnolol (476,2±108,5%, p<0,01, n=7) quanto honokiol (378,9±46,8%, p<0,01, n=6) aumentaram significativamente a frequência das mCPSEs (Figura 1C). A amplitude das mCPSEs não foi afetada, sugerindo que o aumento na frequência das mCPSEs reflete uma ação pré-sináptica de ambos os moduladores para aumentar a liberação de GABA. Esse efeito pré-sináptico pode contribuir para a capacidade dos moduladores de prolongar o decaimento da CPSE e de aumentar a corrente tônica, uma vez que a liberação de GABA dependente de potencial de ação é conhecida por contribuir para os níveis basais de GABA no hipocampo.

3.2. Modulação de receptores recombinantes
Uma grande variedade de mecanismos diferentes poderia produzir o aumento na neurotransmissão GABAérgica fásica e tônica observada nas gravações de fatias cerebrais. Para determinar se o magnolol e o honokiol modulam diretamente os receptores GABAA e caracterizar qualquer dependência de subunidade em sua ação, examinamos sua capacidade de modular receptores GABAA recombinantes expressos em células de mamíferos. As populações de receptores GABAA sinápticos e extra-sinápticos têm composições de subunidades distintas. A maioria dos receptores sinápticos em neurônios granulares do giro denteado contém a subunidade γ2, enquanto uma grande proporção de receptores extra-sinápticos contém a subunidade δ. Portanto, primeiro comparamos a modulação dos receptores recombinantes α1β3γ2 e α1β3δ.

Células HEK-293T transfectadas transitoriamente foram fixadas em potencial de membrana a −50 mV e magnolol ou honokiol foi coaplicado por 5 seg. com uma concentração submáxima (CE5–10) de GABA (Figura 2). Cada modulador aumentou a resposta ao GABA em ambos os receptores contendo γ2 e δ de maneira dependente da concentração. Nos receptores α1β3γ2, a potência e a potencialização máxima foram semelhantes para ambos os compostos, com CE50s médias (e aumento máximo) de 1,24±0,21 μM (467,6±24,6%, n=5) para magnolol e 1,17±0,2 μM (483,4±64,4%, n=3) para honokiol (Figura 2A). Os receptores α1β3δ também responderam tanto ao magnolol quanto ao honokiol (Figura 2B). Novamente, os dois moduladores foram comparáveis entre si, com CE50s médias (e aumento máximo) de 3,40±0,70 μM (1130,8±179,1%, n=3) para magnolol e 3,80±0,41 μM (1053,4±192,6%, n=5) para honokiol (Figura 2B). Em comparação com os receptores α1β3γ2, os receptores contendo δ foram significativamente menos sensíveis à modulação (p≤0,05 para CE50 do magnolol e p≤0,01 para CE50 do honokiol), mas exibiram potencialização máxima substancialmente maior, mais que o dobro daquela dos receptores contendo γ (p≤0,05 tanto para magnolol quanto para honokiol). A capacidade desses moduladores de aumentar a atividade de ambos os receptores contendo γ2 e δ é consistente com o aumento da neurotransmissão fásica e tônica que observamos em neurônios hipocampais (Figura 1).

3.3. Efeito do magnolol e do honokiol nas respostas a níveis saturantes de GABA

Embora estudos com baixas concentrações de agonista representem condições apropriadas para populações extra-sinápticas, é provável que os receptores sinápticos sejam ativados por níveis saturantes de GABA. Para determinar o impacto do magnolol e do honokiol nessas condições, examinamos a resposta dos receptores a concentrações maximamente eficazes de GABA (Figura 3). Primeiro, comparamos a resposta de receptores contendo γ2 e δ em gravações de células inteiras (Figura 3A, 3B). Nos receptores α1β3γ2, 10 μM de magnolol ou honokiol não tiveram efeito na amplitude de pico da resposta a 1 mM de GABA. Em contraste, eles quase dobraram a resposta de pico dos receptores α1β3δ. Essa capacidade de aumentar a resposta máxima de receptores contendo δ é compartilhada por vários moduladores de receptores GABAA, incluindo neuroesteroides e anestésicos gerais.
Embora os moduladores não tenham alterado a resposta máxima de célula inteira dos receptores α1β3γ2, eles pareceram retardar a taxa de decaimento após a remoção do agonista. Para quantificar melhor esse efeito na cinética de desativação do receptor, utilizamos aplicações breves (5 ms) de 1 mM de GABA em macropatches outside-out (Figura 3C). Todos os decaimentos de corrente foram ajustados com a soma de duas distribuições exponenciais e tanto magnolol quanto honokiol retardaram a desativação. A coaplicação de 10 μM de magnolol aumentou significativamente a taxa média ponderada de desativação em 171,8%, de uma média de 60,7±10,6 ms para 104,3±16,2 ms (n=4 patches, p≤0,05, teste t pareado). O retardamento da taxa média ocorreu por meio de uma combinação de um aumento no τ lento (de 161,1±29,6 para 228,4±41,3 ms) e um aumento na % de área do componente mais lento (de 31,5±5,0 para 41,8±8,1%). Um efeito semelhante foi observado com a coaplicação de 10 μM de honokiol, que aumentou a média ponderada em 147,2%, de 77,1±13,6 ms para 113,5±21,0 ms (n=3 patches, p≤0,05, teste t pareado).

Esses resultados com 1 mM de GABA são consistentes com os efeitos que observamos em registros de fatias de hipocampo, onde magnolol e honokiol não tiveram impacto na amplitude de pico do IPSC evocado, mas retardaram significativamente a taxa de decaimento (Figura 1A). Além disso, a capacidade dos moduladores de aumentar a resposta de receptores contendo δ (mas não contendo γ2) além daquela produzida apenas por GABA saturante poderia explicar a diferença observada na potencialização máxima nos receptores α1β3γ2 e α1β3δ (Figura 2).

3.4. Efeito da composição de subunidades de receptores recombinantes

Os receptores GABAA são notáveis por sua diversidade estrutural e pelo grande número de subunidades que podem contribuir para a formação de receptores neuronais. Por exemplo, os neurônios granulares do giro denteado do hipocampo produzem uma população heterogênea de receptores GABAA e expressam a subunidade δ juntamente com todas, exceto uma, dos doze subtipos de subunidades α, β e γ. A composição de subunidades pode alterar substancialmente as propriedades farmacológicas dos receptores, e estudos anteriores sugeriram que magnolol ou honokiol podem modular preferencialmente receptores contendo subunidades α2 ou α3. Examinamos a resposta de receptores recombinantes com composição variável de subunidades para determinar se a modulação por magnolol ou honokiol é influenciada pelo subtipo α, β ou γ.
Os seis diferentes subtipos α foram expressos com β3 e γ2, os três subtipos β com α1 e γ2, e os três subtipos γ com α1 e β3. 10 μM de magnolol ou honokiol foi coaplicado com uma concentração EC5–10 de GABA para cada isoforma. Todos esses isoformas de receptores foram potencializados em grau semelhante, sem aparente seletividade entre os subtipos (Figura 4). Como a subunidade δ é comumente associada ao subtipo α4 em neurônios hipocampais, também comparamos a sensibilidade dos receptores α4β3δ e encontramos um grande aumento, semelhante ao do α1β3δ (Figura 4C). Como as subunidades γ e δ conferiram diferenças tão substanciais na potencialização máxima, examinamos a resposta dos receptores α1β3 e descobrimos que eles responderam em nível comparável aos receptores contendo γ (Figura 4C). Esse padrão é distinto daquele de anestésicos gerais como etomidato e propofol, que têm maior eficácia em receptores contendo δ em comparação com receptores contendo γ, mas potencializam tanto receptores αβ quanto αβδ em grau semelhante.
3.5. Efeito de mutações que alteram a sensibilidade a outros moduladores do receptor GABAA
Várias outras classes de moduladores do receptor GABAA, incluindo neuroesteroides, álcool e anestésicos gerais, também demonstraram atuar na maioria dos receptores, independentemente da composição das subunidades e, como o magnolol e o honokiol, apresentam eficácia particularmente alta em receptores contendo δ. Para determinar se o magnolol e o honokiol atuam por meio de um sítio alostérico previamente identificado, criamos mutações pontuais na subunidade α1 ou β3 que reduzem a sensibilidade a outros moduladores (Figura 5A).
A modulação positiva por neuroesteroides como o tetraidrodesoxicorticosterona (THDOC) e o alopregnanolol poderia ser eliminada por meio da mutação de um resíduo de glutamina conservado localizado no primeiro domínio transmembrana de todas as subunidades α. Descobrimos que os receptores α1(Q240W)β3γ2 apresentaram sensibilidade aumentada ao GABA (EC50 médio = 1,8±0,6 μM, n=3, p≤0,001) em comparação com o receptor do tipo selvagem (EC50 = 12,5±0,8 μM, n=4), mas que essa mutação não teve impacto na modulação pelo magnolol ou pelo honokiol (Figura 5).
Resíduos dentro do 2º, 3º e 4º domínios transmembrana das subunidades α e β contribuem para a atividade de uma ampla gama de moduladores e foram propostos como formadores de uma grande bolsa de ligação compartilhada por anestésicos gerais, álcoois e outras moléculas relacionadas (; veja revisão de). Criamos mutações em resíduos dentro de cada um desses domínios (Figura 5A). Dentro do 2º domínio transmembrana, examinamos o papel da serina269 na subunidade α1 (homóloga à S270 na sequência humana). A mutação desse resíduo para isoleucina diminui a modulação por vários anestésicos inalatórios e etanol, mas não afeta a resposta a anestésicos intravenosos, como propofol e etomidato. Também examinamos a metionina286 dentro do 3º domínio transmembrana da subunidade β, que contribui amplamente para a atividade dos anestésicos gerais. A mutação desse resíduo para triptofano reduz ou elimina a sensibilidade a anestésicos inalatórios e intravenosos, etanol e mentol. Por fim, examinamos um resíduo conservado de tirosina no 4º domínio transmembrana que contribui para a sensibilidade tanto ao propofol quanto aos anestésicos inalatórios.

Essas mutações tiveram uma variedade de efeitos na sensibilidade ao GABA do receptor. Ambas as mutações na subunidade β3 aumentaram significativamente (p≤0,001) a sensibilidade ao GABA, com EC50s médios de 1,6±0,2 μM (n=3) para α1β3(M286W)γ2 e 2,9±0,8 μM (n=3) para α1β3(Y442W)γ2. Os receptores α1(S269I)β3γ2 também apresentaram aumento significativo na sensibilidade ao GABA (EC50 = 2,2±0,2 μM, n=3, p≤0,001), enquanto os receptores α1(Y410W)β3γ2 não foram significativamente diferentes do tipo selvagem (EC50 = 27,8±2,3 μM, n=3, p>0,05). Em todos os casos, no entanto, os receptores mantiveram a potenciação do tipo selvagem em resposta ao magnolol e ao honokiol (Figura 5).

Estudos anteriores utilizando ligantes radiomarcados sugeriram que o magnolol e o honokiol podem agir alostericamente próximo ao sítio de ligação da picrotoxina. Portanto, examinamos o efeito da mutação do resíduo conservado de treonina localizado na posição 6' dentro do 2º domínio transmembrana, que demonstrou eliminar a sensibilidade à picrotoxina. A mutação desse resíduo para fenilalanina não alterou significativamente a sensibilidade ao GABA para α1(T260F)β3γ2 (EC50 médio = 19,3±1,6 μM, n=3) ou α1β3(T256F)γ2 (EC50 médio = 16,4±2,7 μM, n=3) em comparação com o receptor do tipo selvagem, e nenhuma dessas mutações teve qualquer impacto na modulação pelo magnolol ou honokiol (Figura 5).

Esses resultados sugerem que os sítios de ligação do magnolol e do honokiol não compartilham requisitos estruturais comuns com neuroesteroides, anestésicos, etanol ou picrotoxina, e, em vez disso, parecem agir por meio de um sítio único e ainda não descrito nos receptores GABAA.

4. Discussão
   Dada a ampla popularidade de suplementos fitoterápicos e outros produtos naturais na medicina complementar e alternativa (CAM), é importante caracterizar seus mecanismos de ação para que possam ser usados de forma segura e eficaz. Examinamos as propriedades do magnolol e do honokiol, os dois compostos isoméricos que são os ingredientes neurologicamente ativos no extrato da casca de magnólia e que foram previamente relatados como moduladores dos receptores GABAA. Nossos resultados, tanto de receptores neuronais quanto recombinantes, mostram efeitos modulatórios positivos nas duas principais populações de receptores GABAA. Em receptores sinápticos, que podem conter uma variedade de subtipos α ou β em combinação com uma subunidade γ2, o efeito do magnolol ou do honokiol foi retardar a taxa de desativação sem aumentar a resposta de pico. Na população extra-sináptica, que é ativada por uma concentração submáxima de GABA e inclui receptores contendo δ, esses compostos produziram um grande aumento na amplitude da corrente.

Descobrimos que a modulação pelo magnolol ou pelo honokiol mostrou pouca dependência do subtipo α do receptor. Esses resultados contrastam com dois estudos anteriores que examinaram receptores GABAA recombinantes. examinaram o aumento da ligação de muscimol ou flunitrazepam radiomarcados a membranas celulares transfectadas, comparando a resposta de receptores contendo os subtipos α1, α2, α3 e α5. Em concordância com nossos resultados, eles descobriram que uma subunidade γ não era necessária para a modulação, mas também descobriram que o maior aumento foi observado com a subunidade α2, e o menor com a subunidade α5. examinaram a atividade do honokiol em receptores GABAA recombinantes usando registros eletrofisiológicos de oócitos de Xenopus. Eles também compararam as subunidades α1, α2, α3 e α5, mas descobriram que o honokiol mostrou maior eficácia em receptores contendo α3, com pouco efeito da composição da subunidade sobre a potência. Em ambos os estudos, as concentrações usadas para produzir os efeitos foram substancialmente maiores do que as EC50s de 1–3 μM que encontramos. No relatório de, as diferenças dependentes da subunidade tornaram-se aparentes apenas em concentrações superiores a 100 μM, e os autores reconheceram que concentrações muito mais altas eram necessárias para observar efeitos na ligação do muscimol do que para aumentar a atividade de receptores recombinantes contendo α3 quando medida por registro eletrofisiológico. Da mesma forma, as EC50s relatadas por variaram de 23–60 μM. Em nossos estudos, observamos que, em concentrações acima de 10 μM, tanto o magnolol quanto o honokiol apresentaram atividade agonista e puderam ativar diretamente os receptores GABAA na ausência de GABA. Portanto, pode ser que o sítio modulatório de maior afinidade não dependa do subtipo da subunidade α, mas que o sítio agonista de menor afinidade seja influenciado pela composição da subunidade α.
Nossos resultados mostraram que o maior impacto do magnolol ou honokiol pode estar nos receptores que contêm δ, que contribuem para a corrente tônica extra-sináptica no hipocampo, tálamo e cerebelo. Esses receptores possuem uma série de características funcionais e farmacológicas únicas, incluindo insensibilidade à modulação por benzodiazepínicos, e, como tal, constituem alvos farmacológicos promissores. A interrupção da corrente tônica é observada em diversos distúrbios, incluindo epilepsia. O GABA é um agonista de alta afinidade, mas baixa eficácia, nos receptores que contêm δ. Nossos resultados sugerem que o magnolol e o honokiol estão entre os moduladores que podem aumentar a eficácia do GABA nesses receptores e, assim, produzir uma potencialização significativa da resposta máxima. Outros moduladores clinicamente relevantes ou endógenos com atividade semelhante incluem os neuroesteroides, etanol, anestésicos inalatórios e intravenosos, e as pirazolopiridinas.

Embora seja razoável atribuir as ações ansiolíticas, sedativas e anticonvulsivantes associadas ao magnolol e honokiol ao aumento dos receptores GABAA, também foi demonstrado que esses compostos atuam em outros locais do sistema nervoso (ver revisão em). Estudos anteriores relataram que extratos contendo magnolol e honokiol podem inibir modestamente a atividade do transportador de dopamina e reduzir a ligação aos receptores de dopamina (D5) e serotonina (5HT6). Há também evidências de que o magnolol e o honokiol podem inibir os receptores de glutamato e que derivados do honokiol podem aumentar a atividade dos receptores GABAC. Além disso, nossos resultados mostraram que tanto o magnolol quanto o honokiol aumentaram significativamente a frequência de mIPSCs GABAérgicos em fatias de hipocampo, o que não seria esperado como resultado do aumento da atividade do receptor GABAA. Curiosamente, também foi relatado que os neuroesteroides aumentam a frequência de mIPSC GABA, embora o mecanismo pelo qual isso ocorre não seja conhecido (ver revisão em). Outros estudos relataram potenciais efeitos pré-sinápticos, pois o honokiol aumentou a liberação evocada de acetilcolina em fatias de hipocampo e tanto o magnolol quanto o honokiol aumentaram a liberação de acetilcolina do hipocampo de ratos, conforme medido por microdiálise in vivo. Esses outros alvos podem contribuir para os efeitos benéficos relatados desses compostos em modelos animais de depressão, dor e neurodegeneração e podem representar ações terapeuticamente importantes para esses compostos, distintas de sua atividade nos receptores GABAA.
Além dos efeitos neurológicos, o magnolol e/ou o honokiol também foram amplamente estudados quanto à atividade anti-inflamatória, antioxidante e anticancerígena (ver revisão de). Foi demonstrado que eles induzem apoptose e inibem o crescimento tumoral e a metástase, e reduzem a inflamação por meio da inibição da via do NF-κB ou da produção de óxido nítrico. Alguns desses efeitos sistêmicos podem ser mediados pela atividade nos receptores GABAA, uma vez que uma ação inibitória nos linfócitos foi bloqueada pela bicuculina. Os efeitos anticancerígenos e antioxidantes foram tipicamente observados em faixas de concentração de 50–100 μM, enquanto os efeitos anti-inflamatórios foram observados em níveis de 1–10 μM.
O uso de CAM continua comum entre adultos nos EUA, e quase 15 bilhões de dólares foram gastos em produtos naturais não vitamínicos e não minerais em 2007. Nossos resultados sugerem que extratos da casca de magnólia ou os princípios ativos purificados magnolol e honokiol seriam sedativos e ansiolíticos eficazes. No entanto, como moduladores potentes e eficazes dos receptores GABAA, esses compostos também apresentam potencial para sérias preocupações de segurança, incluindo efeitos colaterais e interações medicamentosas. Mais estudos são necessários para determinar os efeitos da coadministração desses compostos com álcool e com medicamentos prescritos, como os benzodiazepínicos, que são comumente usados para tratar insônia e ansiedade. A possibilidade de que o magnolol e o honokiol possam se tornar fisicamente viciantes, induzir tolerância cruzada ou produzir sintomas de abstinência após uso crônico também deve ser cuidadosamente examinada.
Uso de animais - Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal, reduzir o número de animais necessários e utilizar alternativas in vitro.
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Honokiol e magnolol interagem seletivamente com subtipos de receptores GABAA in vitro
Uso de medicina complementar e alternativa entre adultos e crianças: Estados Unidos
Neuroesteroides alteram a ativação de agonistas parciais dos canais de receptores GABAA de padrões de baixa para alta eficácia
Receptores GABAA extra-sinápticos: sua função no SNC e implicações para doenças
Magnolol protege contra lesão isquêmica cerebral em ratos com insolação
Magnolol, um importante constituinte bioativo da casca de Magnolia officinalis, exerce efeitos antiepilépticos por meio do complexo receptor GABA/benzodiazepínico em camundongos
Isolamento seletivo de células transfectadas transitoriamente de uma população de células de mamíferos com vetores que expressam um anticorpo de cadeia única ancorado na membrana
Diferentes mecanismos regulam a cinética das IPSC em células granulares do hipocampo no início da vida pós-natal e em juvenis
Variações sobre um tema inibitório: ativação fásica e tônica dos receptores GABAA
Ação anestésica geral sobre os receptores GABAA
A principal fonte de GABA ambiente responsável pela inibição tônica no hipocampo de camundongos
O impacto econômico dos transtornos de ansiedade na década de 1990
Mutações pontuais na região M2 das subunidades α, β ou γ do canal GABAA que abolem o bloqueio pela picrotoxina
Modulação neuroesteroide dos receptores GABAA sinápticos e extra-sinápticos
Controle GABAérgico tônico de células granulares do giro denteado de camundongos durante o desenvolvimento pós-natal
Neuroesteroides endógenos regulam os receptores GABAA através de dois sítios transmembrana discretos
Sítio conservado para modulação neuroesteroide dos receptores GABAA
Honokiol e magnolol aumentaram a liberação de acetilcolina no hipocampo de ratos em livre movimento
Um agente ansiolítico, dihidrohonokiol-B, inibe os aumentos induzidos por amônia no Cl− intracelular de neurônios hipocampais de ratos em cultura via receptores GABAC
Evidência de uma cavidade de ligação comum para três anestésicos gerais dentro do receptor GABAA
Mutagênese por varredura de triptofano no TM4 da subunidade α1 do receptor GABAA: implicações para a modulação por anestésicos inalatórios e estrutura do canal iônico
Modulação dos receptores GABA ionotrópicos por produtos naturais de origem vegetal
Efeito de um extrato proprietário de Magnolia e Phellodendron nos níveis de estresse em mulheres saudáveis: um ensaio clínico piloto, duplo-cego, controlado por placebo
Corrente e abertura de canal único dependentes de agonista em receptores GABAA α4β2δ e α1β2γ2S
Interações de extratos de Magnolia e Ziziphus com receptores selecionados do sistema nervoso central
Interações medicamentosas em receptores GABAA
Metionina 286 no domínio transmembrana 3 da subunidade β do receptor GABAA controla uma cavidade de ligação para propofol e outros anestésicos gerais alquilfenólicos
Características farmacológicas comportamentais do honokiol, um agente ansiolítico presente em extratos da casca de Magnolia, avaliadas pelo teste do labirinto em cruz elevado em camundongos
O efeito ansiolítico de duas drogas fitoterápicas orientais no Japão atribuído ao honokiol da casca de Magnolia
Suplementos nutricionais e fitoterápicos para ansiedade e transtornos relacionados à ansiedade: revisão sistemática
Efeito inibitório do extrato etanólico de Magnolia officinalis e do 4-O-metilhonokiol no comprometimento da memória e na toxicidade neuronal induzidos por beta-amiloide
Aplicações terapêuticas de compostos da família Magnolia
Efeitos inibitórios diferenciais do honokiol e do magnolol sobre os sinais catiônicos evocados por aminoácidos excitatórios e convulsões induzidas por NMDA
Ações antinociceptivas do honokiol e do magnolol na dor glutamatérgica e inflamatória
Honokiol protege o cérebro de ratos da lesão de isquemia-reperfusão cerebral focal ao inibir a infiltração de neutrófilos e a produção de espécies reativas de oxigênio
Agente ansiolítico, dihidrohonokiol-B, recupera a neurotoxicidade induzida pela proteína beta-amiloide em neurônios hipocampais de ratos em cultura
Magnolol potencializa comportamentos de sono induzidos por pentobarbital: possível envolvimento dos sistemas GABAérgicos
Identificação de magnolol e honokiol como agentes ansiolíticos em extratos de saiboku-to, uma medicina herbal oriental
Magnolol e honokiol previnem o comprometimento da aprendizagem e memória e o déficit colinérgico em camundongos SAMP8
Etomidato, propofol e o neuroesteroide THDOC aumentam a eficácia GABA de receptores GABAA recombinantes α4β3δ e α4β3 expressos em células HEK
Sítios de ação do álcool e anestésicos voláteis nos receptores GABAA e de glicina
Atividades distintas de agonistas GABA em receptores GABAA sinápticos e extra-sinápticos
Isoflavonas de soja, lactobacilos, extrato de casca de Magnólia, vitamina D3 e cálcio. Estudo clínico controlado na menopausa
Efeitos anti-inflamatórios do agonista de neurotransmissor honokiol em um modelo murino de asma alérgica
Metabólitos do extrato de Magnolia officinalis administrado por via oral em ratos e humanos e seus efeitos semelhantes aos antidepressivos em camundongos
Expectativas de compostos biologicamente ativos do gênero Magnolia na biomedicina
Uma tirosina conservada no segmento M4 da subunidade β2 é um determinante da sensibilidade do receptor de ácido gama-aminobutírico tipo A ao propofol
Honokiol e magnolol aumentam o número de sítios de ligação de [3H]muscimol em três vezes nas membranas do prosencéfalo de ratos in vitro usando um ensaio de filtração, aumentando alostericamente as afinidades dos sítios de baixa afinidade
Esteroides neuroativos reduzem a excitabilidade neuronal ao potencializar seletivamente a inibição tônica mediada por receptores GABAA contendo a subunidade δ
Modulação de receptores GABAA por honokiol e derivados: seletividade de subtipo e relação estrutura-atividade
Efeitos do honokiol e magnolol na liberação de acetilcolina de fatias hipocampais de ratos
Mutações em subunidades afetam as ações do etanol em receptores GABAA expressos em oócitos de Xenopus
Propriedades farmacológicas do magnolol e honokiol extraídos de Magnolia officinalis: efeitos depressores centrais
O mentol compartilha atividade anestésica geral e sítios de ação no receptor GABAA com o agente intravenoso, propofol
Diversidade molecular e funcional da família de genes do receptor GABAA em expansão
A distribuição de 13 mRNAs de subunidades do receptor GABAA no cérebro de ratos. I Telencéfalo, diencéfalo, mesencéfalo
Efeitos semelhantes aos antidepressivos de uma mistura de honokiol e magnolol das cascas de Magnolia officinalis em roedores estressados
Sinergismo semelhante aos antidepressivos de extratos de casca de magnólia e rizoma de gengibre isoladamente e em combinação em camundongos
Função e modulação de receptores GABAA contendo δ
Magnolol e honokiol potencializam correntes GABAérgicas sinápticas e extra-sinápticas em neurônios granulares do giro denteado hipocampal
A. Registros de célula inteira de IPSCs monossinápticos evocados registrados em neurônios granulares do denteado. Esquerda: 30 μM de magnolol (mag) prolongou o decaimento do IPSC evocado, mas não alterou sua amplitude em comparação com um registro antes do tratamento com magnolol (Con, traço cinza). Direita: 30–60 μM de magnolol (barra branca, n=5) ou honokiol (barra preta, n=5) retardaram o tempo de decaimento de 50%, mas não a amplitude do IPSC evocado. B. Registros de célula inteira da corrente tônica em neurônios granulares do denteado. Esquerda: 30 μM de magnolol (Mag) potencializou fortemente a corrente GABAérgica tônica, que foi completamente bloqueada por 20 μM de bicuculina (Bic). A linha pontilhada indica a linha de base na ausência de corrente GABAérgica tônica. Direita: 30–60 μM de magnolol (barra branca, n=7) ou magnolol (barra preta, n=6) potencializaram significativamente a corrente GABAérgica tônica. C. IPSCs miniatura (mIPSCs) foram medidos antes (Controle) ou durante (Mag) o tratamento com magnolol ou honokiol. Esquerda: Traços de amostra mostrando o aumento na frequência de mIPSC produzido por 30 μM de magnolol. Direita: 30–60 μM de magnolol (barra branca, n=7) ou honokiol (barra preta, n=6) aumentaram significativamente a frequência de mIPSC. Todas as barras mostram média ± EPM com o número de células indicado entre parênteses. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 indicam uma diferença estatisticamente significativa em comparação com a resposta controle antes da aplicação do fármaco.
Magnolol e honokiol potencializam receptores GABAA recombinantes
A. Respostas ao GABA foram registradas de células HEK-293T transfectadas transitoriamente com voltage clamp a −50 mV. 0,3 μM (α1β3δ) ou 1 μM (α1β3γ2) de GABA foi coaplicado por 5 segundos conforme indicado pela linha sólida com concentrações variadas de magnolol ou honokiol. A resposta apenas ao GABA (traço cinza) é sobreposta pela resposta ao GABA + modulador (traço preto).
B. Relações de concentração-resposta foram construídas dividindo o pico de resposta ao GABA mais 0,01 – 30 μM de magnolol ou honokiol pela resposta apenas ao GABA para cada célula. Os dados médios (n=3–5 células) foram ajustados com uma curva dose-resposta sigmoidal indicada pelas linhas sólida (+ magnolol) ou tracejada (+ honokiol).
Modulação da resposta de receptores GABAA recombinantes a uma concentração saturante de GABA
A. Traços de corrente representativos de receptores recombinantes em resposta a uma aplicação de 5 segundos de 1 mM de GABA (cinza) ou 1 mM de GABA coaplicado com 10 μM de honokiol ou magnolol (preto). As células foram mantidas em voltage clamp a −50 mV
B. O pico de resposta a 1 mM de GABA + magnolol ou honokiol foi dividido pela resposta apenas ao GABA. As barras mostram a média ± EPM e o valor de n é dado pelo número entre parênteses. A linha tracejada indica a resposta apenas ao GABA (100%). **(p<0,01) e ***(p<0,001) indicam uma diferença significativa na amplitude de pico em relação à resposta apenas ao GABA (teste t de Student pareado).
C. Patches outside-out foram excisados de células transfectadas com α1β3γ2 e mantidos em voltage clamp a −70 mV. 1 mM de GABA foi aplicado por 5 ms, seja sozinho (traço cinza) ou coaplicado com 10 μM de magnolol ou honokiol (traço preto).
Efeito do subtipo de subunidade na modulação por magnolol e honokiol
Células foram transitoriamente transfectadas com as combinações de subunidades indicadas e clampadas a −50 mV na configuração de patch-clamp de células inteiras. GABA foi coaplicado por 5 seg com 10 µM de magnolol ou honokiol. Receptores recombinantes foram expressos com diferentes composições de subunidades conforme indicado, variando (A) o subtipo α, (B) o subtipo β, ou (C) a subunidade terciária (α β sozinhas ou com subunidades δ ou γ). A resposta de pico foi medida e dividida pela resposta ao GABA sozinho. As barras mostram a média ± EPM e o valor de n é dado pelo número entre parênteses. A linha tracejada indica a resposta ao GABA sozinho (100%). *(p≤0,05) e ***(p≤0,001) indicam diferença significativa em relação à resposta de α1β3γ2 (teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer).

Efeito de mutações pontuais em sítios regulatórios alostéricos conhecidos
A. Os resíduos alvo dentro dos quatro domínios transmembrana (TM1–TM4) são indicados em negrito. A sequência de aminoácidos e a numeração são das subunidades maduras de rato α1 e β3.
B. A resposta de pico foi medida e dividida pela resposta ao GABA sozinho. As barras mostram a média ± EPM e o valor de n é dado pelo número entre parênteses. A linha tracejada indica a resposta ao GABA sozinho (100%). Não houve diferenças significativas em comparação com a resposta do receptor selvagem α1β3γ2 (p>0,05, teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer).

Magnolol e honokiol são moduladores alostéricos positivos dos receptores GABAA
Eles potencializam tanto a neurotransmissão fásica quanto a tônica em neurônios hipocampais
Sua atividade mostra pouca dependência da composição de subunidades do receptor GABAA
O maior aumento é observado em receptores contendo δ