pmid: "30287800"
title: "Análogos bioinspirados de Honokiol e sua avaliação para atividade no transportador de norepinefrina."
authors: "Stout K, Bernaskova M, Miller GW, Hufner A, Schuehly W"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2018 Oct 04"
doi: "10.3390/molecules23102536"
source: "PMC Full Text"

Análogos bioinspirados de Honokiol e sua avaliação para atividade no transportador de norepinefrina.

Autores

Stout K, Bernaskova M, Miller GW, Hufner A, Schuehly W

Periodico

Molecules (Basel, Switzerland) (2018 Oct 04)

Conteudo

Bioinspired Honokiol Analogs and Their Evaluation for Activity on the Norepinephrine Transporter
Em sistemas medicinais tradicionais asiáticos, preparações da casca da raiz e do caule de espécies de Magnolia são amplamente utilizadas para tratar ansiedade e outros distúrbios nervosos. Os neolignanos do tipo bifenila, honokiol e magnolol, são os principais constituintes dos extratos da casca de Magnolia. No sistema nervoso central, acredita-se que as preparações de casca de Magnolia que contêm honokiol interajam principalmente com os receptores de ácido gama-aminobutírico A (GABAA). No entanto, as respostas ao estresse envolvem inerentemente o sistema noradrenérgico, que não foi investigado no mecanismo farmacológico do honokiol. Apresentamos aqui as interações do honokiol e de outros neolignanos do tipo bifenila e análogos de difenilmetano sintetizados com o transportador de norepinefrina (NET), que é responsável pela depuração sináptica da norepinefrina e alvo de muitos ansiolíticos. Dos compostos sintetizados, 16 são novas entidades químicas, totalmente caracterizadas. Os 52 compostos testados mostram interações leves e não potentes com o NET (IC50 > 100 µM). É, portanto, provável que os efeitos ansiolíticos observados de, por exemplo, preparações de Magnolia, não sejam devidos à interação direta com o sistema noradrenérgico.

1. Introdução
   Por séculos, preparações medicinais tradicionais chinesas e japonesas da casca de Magnolia têm sido usadas para tratar doenças neurológicas, incluindo ansiedade e distúrbios do sono. O estudo dessas preparações levou à identificação dos neolignanos bifenila honokiol (H) e magnolol (M) como os principais constituintes ativos. Embora esses compostos atuem promiscuamente na periferia, a atividade no sistema nervoso central de H e M foi apenas associada à interação com receptores GABAA.

É possível que esses neolignanos do tipo bifenila exerçam atividade farmacológica em outros alvos do SNC. Na medicina ocidental, terapêuticas ansiolíticas e antidepressivas (por exemplo, inibidores da recaptação de norepinefrina, inibidores da recaptação de norepinefrina-dopamina ou antidepressivos tricíclicos) geralmente aumentam os níveis de noradrenalina ao inibir o transportador de norepinefrina (NET). O NET se localiza na membrana pré-sináptica, onde atua para eliminar a norepinefrina sináptica, terminando assim a sinalização e reciclando o neurotransmissor para liberação subsequente. Dada a eficácia ansiolítica de H e M, levantamos a hipótese de que os neolignanos bifenila podem inibir similarmente o NET, uma questão que não foi abordada no contexto de ingredientes ativos de preparações contendo Magnolia. Além do tratamento ansiolítico, os inibidores do NET são eficazes no tratamento da depressão e do transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH). Também é considerado um alvo para terapêuticas contra doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer e Parkinson, e na regulação do sono. Assim, esses compostos podem oferecer eficácia terapêutica para uma miríade de distúrbios do SNC.
Os bifenilos são considerados estruturas privilegiadas devido à sua atividade biológica desproporcionalmente frequente. Em nossas investigações anteriores, focamos nas diversas atividades biológicas de H, M e seus derivados, como COX-1/2, 5-LOX e formação de LTB4, atividade do receptor GABAA, atividade do receptor CB2 e toxicidade em várias linhagens de células cancerígenas. Neste artigo, focamos na atividade dos compostos no NET. Testamos 32 compostos de nossa biblioteca de compostos já existente e 16 compostos adicionais, dos quais 14 são novas substâncias químicas (ver Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Tabela 4 e Tabela 5). No total, 52 compostos foram avaliados em um ensaio de captação de norepinefrina (NE) usando uma linhagem de células renais embrionárias humanas que expressam de forma estável o NET humano (hNET) e o transportador vesicular de monoaminas 2 humano (VMAT2); o VMAT2 humano (hVMAT2) foi adicionado além do hNET para recapitular mais fielmente os neurônios noradrenérgicos in vitro (ver caracterização na Figura 1).

2. Resultados e Discussão

Estudos anteriores indicaram um aumento significativo na atividade farmacológica quando grupos funcionais contendo nitrogênio foram introduzidos em H e outros compostos. Ampliamos nossa biblioteca de compostos existente com mais derivados de honokiol contendo nitrogênio com polaridade significativamente alterada, seja por N-acilação do 3-amino-4′-O-metilhonokiol (H1) com um ácido graxo de cadeia longa (H2) ou um aminoácido (H3, H4), pela substituição formal do grupo metoxi de H1 por um grupo etoxi (H5), ou por di-O-alquilação sem ou com N-acetilação (H6, H7). Em contraste com a amida H8 de nossa biblioteca original, em H9 os grupos acetamido e O-metil estão localizados em C-5′ e C-2, respectivamente. Durante as sínteses, os intermediários foram totalmente caracterizados por suas propriedades químicas e físicas, mas não testados no ensaio biológico. Os dados dos compostos são fornecidos para todos os produtos químicos sintetizados, incluindo compostos mencionados na literatura para os quais os dados químicos e físicos não foram totalmente fornecidos.

Todos os compostos sintetizados foram testados quanto à atividade farmacológica no NET e comparados com o inibidor seletivo do NET, desipramina (Figura 1). Compostos com qualquer atividade farmacológica aparente foram posteriormente caracterizados por captação radioativa e imageamento de alto conteúdo. Nenhum composto apresentou atividade robusta no NET (Tabela 1).

Conforme descrito no Esquema 1, as N-acilações de H1 foram realizadas usando os cloretos de ácido carboxílico correspondentes. Um grupo de proteção Fmoc foi usado para a preparação das amidas do tipo peptídeo H3 e H4 (ver Esquema 1). A N-acilação de H6 resultou em H7 (ver Esquema 2).
Conforme descrito no Esquema 2, H5 foi preparado de forma análoga a H1 a partir de 4′-O-etilhonokiol (H10) via nitração com ácido nítrico seguida de redução com SnCl2 × 2H2O. Para evitar a N-alquilação na síntese da amina di-O-alquilada H6, a O-alquilação do grupo hidroxila de 4′-O-metilhonokiol honokiol (H11) teve que ser realizada após a nitração e antes da redução com SnCl2 × 2 H2O. A N-acetilação de H6 com anidrido acético resultou em H7 . H9 foi preparado por uma N-acetilação similar da amina correspondente H12.
Para ir um passo adiante, testamos vários difenilmetanos dioxigenados para ver se a inserção de um grupo metileno entre as duas porções aromáticas afeta a atividade biológica. Conforme descrito no Esquema 3, a síntese começou a partir de bis(2-hidroxifenil)metano (B1) e 2,4′-di-hidroxidifenilmetano (B1), que estão disponíveis comercialmente, mas também foram preparados a partir de álcool salicílico e fenol. A dupla O-alilação e o rearranjo de Claisen de acordo com Chattopadhyay et al. renderam principalmente os produtos de rearranjo orto (B2 e C2, respectivamente) juntamente com pequenas quantidades dos produtos de rearranjo para (B3 e C3, respectivamente). B2 e C2 foram submetidos a O-metilação incompleta para render os monoéteres B4a, C4b e C4c juntamente com o respectivo diéter B4a ou C4a.
3. Experimental
3.1. Geral
As reações de micro-ondas foram realizadas em um forno de micro-ondas laboratorial CEM Corp. Discover equipado com uma unidade Explorer (CEM Corp. Matthews, NC, EUA). Os espectros de infravermelho foram registrados em um espectrômetro Bruker Alpha Platinum ATR (Bruker, Kennewick, WA, EUA) ou como pastilhas de KBr em um espectrômetro Perkin-Elmer 281 B (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA). Os espectros de RMN de 1H e 13C foram registrados em um espectrômetro Varian 400 MHz UnityINOVA (400 e 100 MHz, respectivamente, Varian, Palo Alto, CA, EUA) e, salvo indicação em contrário, em CDCl3 com solvente não deuterado como padrão interno (7,26 ppm e 77,0 ppm, respectivamente). Por conveniência, os átomos foram numerados de acordo com as estruturas nas Tabelas 1, 4 e 5, com números de linhas duplas para substituintes no anel A e números de linhas triplas para substituintes no anel B, respectivamente. Os espectros de ESI-MS foram registrados nos modos positivo e negativo de ESI em um LC Ultimate 3000 (Thermo, San José, CA, EUA) com detecção DAD em linha com um espectrômetro de massas Thermo Scientific LTQ XL. Coluna: Knauer (Berlim, Alemanha) RP-18 (1,8 μm; 125 × 2,1 mm) com uma pré-coluna a uma vazão de 150 μL/min. Os espectros de ESI-MS foram registrados em um instrumento Agilent Technologies HP 7890A equipado com detector HP 5975C VL MSD (70 eV, fonte de íons 250 °C, temperatura do quadrupolo 150 °C, Santa Clara, CA, EUA). Uma coluna Agilent HP-5MS (30 m, DI 0,25 mm, filme 5% fenil 95% metilpolissiloxano 0,25 μm) foi utilizada. A temperatura do forno foi mantida a 45 °C por 2 min e programada para aumentar para 300 °C a uma taxa de 3 °C/min, depois mantida constante a 300 °C por 20 min, com um tempo total de corrida de 64,5 min. Hélio foi utilizado como gás de arraste. O volume de injeção foi de 1 μL (≈0,5% de solução) e uma razão de divisão de 1:50.
Para espectrometria de massa de alta resolução, foi utilizado um instrumento Waters GCT Premier com ionização por impacto de elétrons (70 eV) a uma temperatura da fonte de íons de 200 °C.
Informações Gerais sobre Sínteses
Os compostos foram sintetizados conforme descrito abaixo. Os solventes eram de qualidade analítica, salvo indicação em contrário. A pureza de todos os compostos sintetizados foi verificada por RMN e CLAE analítica. A cromatografia em camada fina analítica (CCF) foi realizada utilizando folha de alumínio revestida com sílica 60 F254 (Merck, Darmstadt, Alemanha). A cromatografia em camada fina preparativa (CCFP) foi realizada utilizando placas de vidro revestidas com sílica 60 F254 (Merck). A detecção foi feita usando UV/254 nm e pulverização com ácido molibdofosfórico e subsequente aquecimento. As misturas de compostos foram separadas por cromatografia em coluna (CC) em gel de sílica 60 (63–200 µm, Merck) usando misturas de cicloexano/acetato de etila. A purificação adicional foi realizada por CLAE preparativa (Varian Prepstar com detector Dynamax Rainin; coluna SepServ, Berlim, Alemanha, 250 × 21 mm, RP-18, 7 μm, fluxo de 15 mL). Honokiol (pureza > 98%) foi adquirido da APIChem Technology Co. (Hangzhou, China). Espectros de RMN de próton dos compostos recentemente descritos são fornecidos em "Materiais Suplementares".
3-Dodecanoilamino-4′-O-metilhonokiol (H2)
Cloreto de dodecanoíla (0,34 mmol, 80 μL) foi adicionado com agitação intensa à temperatura ambiente (TA) a uma solução de 100 mg (0,34 mmol) de H1 e piridina (0,41 mmol, 33 μL) em Et2O abs. (4 mL). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente durante a noite e filtrada. O precipitado foi extraído com Et2O (4 mL). NaHCO3 (1 M, 10 mL) foi adicionado ao filtrado combinado e às lavagens. A fase orgânica foi separada, e a fase aquosa foi extraída com Et2O (3 × 10 mL). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (10 mL), secas sobre Na2SO4, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por CC (sílica, cicloexano/AcOEt 5:1), resultando em 107 mg (59%) de um sólido marrom claro (H2).
Composto H2: IV (ATR, νmáx, cm−1): 3304, 2956, 2919, 2847, 2485, 1639, 1606, 1539, 1499, 1467, 1411, 1243, 906, 725, 577; 1H-RMN (CDCl3) δ 7,57 (sl, 1H, NH), 7,40 (d, J = 1,5 Hz, 1H, H-4), 7,34 (dd, J = 8,4, 2,3 Hz, 1H, H-6′), 7,27 (d, J = 2,1 Hz, 1H, H-2′), 7,17 (s, 1H, OH), 6,94 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-5′), 6,89 (d, J = 1,9 Hz, 1H, H-6), 6,01 (ddt, J = 16,8, 10,2, 6,6 Hz, 1H, H-2‴), 5,96 (ddt, J = 16,8, 10,0, 6,7 Hz, 1H, H-2″), 5,02–5,13 (m, 4H, H-3‴, H-3″), 3,87 (s, 3H, OCH3), 3,43 (d, J = 6,6 Hz, 2H, H-1‴), 3,33 (d, J = 6,7 Hz, 2H, H-1″), 2,42 (t, J = 7,5 Hz, 2H, Acil-Hα), 1,74 (quint, J = 7,3 Hz, 2H, Acil-Hβ), 1,21–1,42 (m, 16H, Acil-Hγ a Hω-1), 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 3H, Acil-Hω), 13C-RMN (CDCl3) δ 172,7 (CO), 156,8 (C-4′), 142,3 (C-2), 137,5 (C-2″), 136,7 (C-2‴), 132,2 (C-5), 130,7 (C-2′), 130,7 (C-1), 129,6 (C-1′), 129,0 (C-3′), 128,1 (C-6′), 126,7 (C-6), 126,2 (C-3), 120,3 (C-4), 115,8 (C-3″), 115,6 (C-3‴), 110,5 (C-5′), 55,5 (OCH3), 39,5 (C-1″), 37,5 (Acil-Cα), 34,3 (C-1‴), 31,9 (Acil-Cω-2), {2 × 29,6, 29,4, 2 × 29,3, 29,2 (Acil-Cγ a Cω-3)}, 25,7 (Acil-Cβ), 22,7 (Acil-Cω-1), 14,1 (Acil-Cω), ESI+ calcd. para C31H43NO3: [M]+ 477,324; encontrado ESI-MS m/z (int. rel.): 478,63 [M + H]+ (100). Do mesmo lote, o composto foi testado em paralelo quanto à atividade agonística dos receptores CB1/CB2 por Bertini et al.; no entanto, os dados espectroscópicos e a síntese são fornecidos apenas aqui.
3-(N-l-Alanil)-4′-O-metilhonokiol (H3)
Cloreto de l-N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)alanila, Fmoc-l-Ala-Cl: Fmoc-l-Ala-OH · H2O foi primeiramente desidratado a 50 °C sobre P2O5 a vácuo por 12 h. Sob condições secas, 400 mg (1,28 mmol) de ácido l-N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)alânico foram suspensos em 5 mL de diclorometano, cloreto de tionila (recém-destilado, 1,23 mL, 17,7 mmol) foi adicionado, e a mistura foi sonicada à TA. Após 7 min, a mistura reacional tornou-se uma solução homogênea e foi sonicada por mais 15 min. Diclorometano e o excesso de cloreto de tionila foram removidos a vácuo para obter 404 mg (96%) de Fmoc-l-Ala-Cl como um sólido cinza, que foi usado sem purificação adicional para uma segunda etapa.
l-3-(N-(9-Fluorenilmetoxicarbonil)alanil)-4′-O-metilhonokiol (H3a): Zn (em pó) foi tratado com HCl (2 M, solução aquosa), lavado subsequentemente com água, EtOH e éter dietílico, seco a vácuo e armazenado sob argônio. Sob argônio, H1 (259 mg, 0,841 mmol), Fmoc-l-Ala-Cl (279 mg, 0,846 mmol) e Zn em pó (55 mg, 0,841 mmol) foram suspensos em THF anidro (50 mL) e agitados à TA durante a noite. Ao longo de duas horas, a cor da reação mudou de acastanhada para amarelada. O término da reação foi comprovado por análise em CCD (ciclohexano/AcOEt = 5:3). O Zn em pó foi filtrado e o filtrado foi evaporado a vácuo. O resíduo foi dissolvido em diclorometano (15 mL), lavado com salmoura (2 × 5 mL) e seco sobre Na2SO4. A evaporação do solvente a vácuo e CC (sílica, ciclohexano/AcOEt = 5:1) produziu H3a (428 mg; 96%).
3-(N-l-Alanil)-4′-O-metil-honokiol (H3): H3a (401 mg, 0,682 mmol) foi dissolvido em éter dietílico (3 mL) e adicionou-se piperidina (1 mL, 1 mmol). A mistura foi agitada à TA por 1 h. A mistura reacional foi evaporada sob pressão reduzida e adicionou-se diclorometano (5 mL) ao resíduo. O precipitado resultante foi filtrado e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida até a secura. O resíduo (377 mg) foi purificado por CC (sílica, diclorometano/MeOH, gradiente: 0–10% v/v de metanol) para obter 220 mg (88%) de H3 como um óleo alaranjado.
Composto H3: IV (ATR, νmáx, cm−1): 3272, 3075, 2974, 2929, 2834, 1638, 1606, 1590, 1530, 1500, 1460, 1440, 1244, 1029, 993, 910, 813, 594; 1H-RMN (CDCl3 + D2O) δ 7,35 (dd, J = 8,1; 1,8 Hz, 1H, H-6′), 7,29 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-2′), 7,18 (s, 1H, H-4), 6,92 (s, 1H, H-6), 6,91 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-5′), 6,01 (ddt, J = 16,8; 9,8; 6,6 Hz, 1H, H-2‴), 5,95 (ddt, J = 16,9; 9,9; 6,6 Hz, 1H, H-2″), 5,01–5,13 (m, 4H, H-3″, H-3‴), 3,85 (s, 3H, O–CH3), 3,73 (q, J = 6,2 Hz, 1H, CH3CH(NH2)CO), 3,42 (d, J = 6,6 Hz, 2H, H-1‴), 3,32 (d, J = 6,2 Hz, 2H, H-1″), 2,03 (s, 2H, NH2), 1,45 (d, J = 6,6 Hz, 3H, CH3CH(NH2)CO); 13C-RMN (CDCl3 + D2O) δ 174,6 (CO), 156,7 (C-4′), 143,2 (C-2), 137,5 (C-2″), 136,8 (C-2‴), 131,9 (C-5), 131,0 (C-1), 130,8 (C-2′), 130,1 (C-1′), 128,6 (C-3′), 128,2 (C-6′), 127,5 (C-6), 125,6 (C-3), 120,6 (C-4), 115,7 (C-3″), 115,5 (C-3‴), 110,3 (C-5′), 55,5 (O–CH3), 50,5 (CH3CH(NH2)CO), 39,4 (C-1″), 34,3 (C-1‴), 21,1 (CH3CH(NH2)CO); ESI+ calc. para C22H26N2O3: [M]+ 366,194; encontrado EM-ESI m/z (int. rel.): 367,18 [M + H]+ (100).
3-(N-l-Fenilalanil)-4′-O-metil-honokiol (H4)
l-N-(9-Fluorenilmetoxicarbonil)fenilalanilcloreto, Fmoc-l-Fe-Cl: Em condições secas, 300 mg (0,774 mmol) de l-N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)fenilalanina foram suspensos em diclorometano seco (4 mL), adicionou-se cloreto de tionila (recentemente destilado, 0,776 mL, 10,7 mmol), e a mistura foi sonicada à TA por 45 min. O banho de sonicação foi aquecido a 40 °C durante esse período. O diclorometano e o excesso de cloreto de tionila foram removidos a vácuo para obter 294 mg (94%) de Fmoc-l-Fe-Cl como um sólido cinza, que foi utilizado sem purificação adicional na etapa seguinte.
3-(N-l-Fenilalanil)-4′-O-metilhonokiol (H4): Pó de zinco foi tratado com HCl aquoso (2 M), lavado subsequentemente com água, etanol e éter dietílico, seco a vácuo e armazenado sob argônio. Sob argônio, H1 (75 mg, 0,25 mmol), Fmoc-l-Phe-Cl (103 mg, 0,254 mmol) e pó de zinco (17 mg, 0,25 mmol) foram suspensos em THF seco (10 mL) e agitados por 4 h. A conclusão da reação foi comprovada por análise em CCD (cicloexano/AcOEt = 5:3). Piperidina (0,5 mL, 5 mmol) foi adicionada e a mistura reacional foi agitada por 20 min à TA, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o resíduo foi diluído com diclorometano (5 mL), filtrado e evaporado sob pressão reduzida. O resíduo (170 mg) foi purificado por CC (sílica, cicloexano/AcOEt, gradiente: 0–100% v/v AcOEt) para render 50 mg (45%) de H4 como um óleo alaranjado.

Composto H4: IV (ATR, νmáx, cm−1): 3270, 3073, 2974, 2834, 1638, 1605, 1530, 1500, 1453, 1439 s, 1244, 1028, 910; 1H-RMN (CDCl3) δ 9,69 (sl, 1H, CONH), 7,39 (dd, J = 8,4, ≈2 Hz, 1H, H-6′), 7,30–7,36 (m, 3H, Ph-Hmeta Ph-Hpara), 7,22–7,30 (m, 3H, H-2′, Ph-Horto), 7,10 (s, 1H, H-4), 6,95 (s, 1H, H-6), 6,92 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-5′), 6,01 (ddt, J = 16,9, 9,9, 6,6 Hz, 1H, H-2‴), 5,97 (ddt, J = 16,9, 10,2, 6,6 Hz, 1H, H-2″), 5,02–5,14 (m, 4H, H-3″, H-3‴), 3,86 (s, 3H, OCH3), 3,82 (m, 1H, PhCH2CH(NH2)CO), 3,43 (d, J = 6,6 Hz, 2H, H-1‴), 3,34 (m, 1H, PhCH2CH(NH2)CO), 3,33 (d, J = 6,9 Hz, 2H, H-1″), 2,84 (dd, J = 13,6, 9,2 Hz, 1H, PhCH2CH(NH2)CO); 13C-RMN (CDCl3) δ 173,7 (CO), 156,6 (C-4′), 143,5 (C-2), 139,1 (Ph-Cipso), 137,5 (C-2″), 136,8 (C-2‴), 131,8 (C-5), 131,2 (C-1), 130,8 (C-2′), 130,2 (C-1′), 129,3 (Ph-Corto), 128,8 (Ph-Cmeta), 128,6 (C-3′), 128,2 (C-6′), 127,6 (C-6), 127,0 (Ph-Cpara), 125,7 (C-3), 120,5 (C-4), 115,7 (C-3″), 115,5 (C-3‴), 110,3 (C-5′), 56,3 (PhCH2CH(NH2)CO), 55,5 (OCH3), 40,5 (PhCH2CH(NH2)CO), 39,3 (C-1″), 34,3 (C-1‴); ESI+ calculado para C28H30N2O3: [M]+ 442,226; encontrado ESI-MS m/z (int. rel.): 442,20 [M + H]+ (100).

3-Amino-4′-O-etilhonokiol (H5)
4′-O-Etil-3-nitro-honokiol (H5a): Ácido nítrico aquoso (65%, 0,474 mL, 6,79 mmol) foi adicionado sob agitação intensa em ≈5 s a uma solução de H10 (200 mg, 0,679 mmol; síntese ver suplemento de Schuehly et al.; cpd 16b) em AcOEt (5 mL) à TA. A mistura reacional foi agitada por 60 s e interrompida com NaHCO3 (1 M, 10 mL). A fase orgânica foi separada, e a fase aquosa foi extraída com AcOEt (3 × 10 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (10 mL), secas sobre Na2SO4, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por CC (sílica, cicloexano/AcOEt 99:1) para render 120 mg (50%) de 4′-O-etil-3-nitro-honokiol (H5a) como um óleo amarelo escuro.
Composto H5a: IV (ATR, νmáx, cm−1): 3177, 3078, 2978, 2903, 1638, 1607, 1537, 1502, 1314, 1244, 1045, 912, 672, 555 cm−1; 1H-RMN (CDCl3) δ 11,03 (s, 1H, OH), 7,90 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-4), 7,45 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-6), 7,38 (dd, J = 8,4, 2,2, 1H, H-6′), 7,33 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-2′), 6,92 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-5′), 6,03 (ddt, J = 16,9, 10,3, 6,6 Hz, 1H, H-2‴), 5,96 (ddt, J = 16,5, 10,3, 6,6 Hz, 1H, H-2″), 5,03–5,17 (m, 4H, H-3″ e H-3‴), 4,10 (q, J = 7,2 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,45 (d, J = 6,4 Hz, 2H, H-1‴), 3,40 (d, J = 6,6 Hz, 2H, H-1″), 1,46 (t, J = 6,9 Hz, 3H, OCH2CH3); 13C-RMN (CDCl3) δ 156,6 (C-4′), 151,3 (C-2), 138,9 (C-6), 136,8 (C-2‴), 136,0 (C-2″), 133,8 (C-3), 132,9 (C-1), 131,7 (C-5), 130,7 (C-2′), 128,5 (C-3′), 128,2 (C-6′), 127,4 (C-1′), 122,8 (C-4), 117,1 (C-3‴), 115,6 (C-3″), 111,0 (C-5′), 63,7 (OCH2CH3), 38,9 (C-1″), 34,5 (C-1‴), 14,9 (OCH2CH3); ESI– calc. para C20H21NO4: [M]− 339,147; encontrado EM-ESI m/z (int. rel.): 338,21 ([M − H]− (100).
3-Amino-4′-O-etil-honokiol (H5): SnCl2×2H2O (1,62 g, 7,16 mmol) foi adicionado a uma solução de H5a (270 mg, 0,796 mmol) em MeOH absoluto (10 mL). A mistura reacional foi agitada por 48 h à TA, concentrada sob pressão reduzida e diluída com AcOEt (15 mL). O precipitado espumoso resultante da adição de NaHCO3 aquoso (1 M, 20 mL) foi filtrado em Celite® (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça) e enxaguado com AcOEt (30 mL). A fase orgânica foi separada do filtrado e das lavagens combinados, seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo (127 mg) foi purificado por CLPP (sílica, cicloexano/AcOEt = 5:1) para obter 65 mg (26%) de H5 como um óleo marrom.
Composto H5: IV (ATR, νmáx, cm−1): 3544, 3370, 3075, 2977, 2900, 1637, 1607, 1503, 1486, 1474, 1242, 1215, 1122, 1044, 908, 808; 1H-RMN (CDCl3) δ 7,26 (d ≈ 9 Hz, 1H, H-6′), 7,25 (s, 1H, H-2′), 6,93 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-5′), 6,61 (s, 1H, H-4), 6,51 (s, 1H, H-6), 6,00 (ddt, J = 16,9, 9,9, 6,6 Hz, 1H, H-2‴), 5,96 (ddt, J = 17,0, 9,9, 6,9 Hz, 1H, H-2″), 5,02–5,14 (m, 4H, H-3″, H-3‴), 4,19 (sl, 2H, NH2), 4,09 (q, J = 7,0 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,43 (d, J = 6,6 Hz, 2H, H-1‴), 3,28 (d, J = 6,9 Hz, 2H, H-1″), 1,46 (t, J = 7,0 Hz, 3H, OCH2CH3); 13C-RMN (CDCl3) δ 156,4 (C-4′), 139,0 (C-2), 137,9 (C-2″), 136,6 (C-2‴), 133,6 (C-3), 132,4 (C-5), 130,3 (C-2′), 129,9 (C-3′), 129,0 (C-1′), 127,9 (C-1), 127,7 (C-6′), 120,5 (C-6), 115,8 (C-3‴), 115,7 (C-4), 115,4 (C-3″), 111,9 (C-5′), 63,7 (OCH2CH3), 39,6 (C-1″), 34,5 (C-1‴), 14,9 (OCH2CH3); ESI+ calc. para C20H23NO2: [M]+ 309,173; encontrado EM-ESI m/z (int. rel.): 310,11 [M + H]+ (100).
3-Amino-2-O-etil-4′-O-metil-honokiol (H6)
Em um frasco de processo para micro-ondas, KOH (132 mg, 2,36 mmol) foi adicionado a uma solução de 4′-O-metil-3-nitro-honokiol (síntese ver) (192 mg, 0,590 mmol) em MeOH abs. (2 mL) e a mistura foi agitada à TA por 10 min. Dietil sulfato (155 μL, 2,36 mmol) foi adicionado e a mistura reacional foi irradiada em um forno de micro-ondas a 90 °C por 60 min. Após resfriamento à TA, a mistura reacional foi neutralizada com HCl aquoso (2 M). O MeOH foi evaporado sob pressão reduzida (40 °C, 100 mbar). O resíduo foi extraído com diclorometano (3 × 2 mL), a fase orgânica foi lavada com água (3 × 5 mL), seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida, resultando em 198 mg de 2-O-etil-4′-O-metil-3-nitro-honokiol bruto, que foi utilizado sem purificação adicional.
SnCl2×2H2O (1,09 g, 4,84 mmol) foi adicionado a uma solução de 2-O-etil-4′-O-metil-3-nitro-honokiol bruto (190 mg, 0,54 mmol) em EtOH abs. (10 mL). A mistura reacional foi agitada à TA por 48 h. O precipitado espumoso resultante da adição de NaHCO3 aquoso (1 M, 20 mL) foi filtrado usando Celite®, o resíduo foi extraído com EtOH (50 mL). As camadas orgânicas combinadas foram evaporadas sob pressão reduzida (100 mbar). O resíduo foi extraído com diclorometano (3 × 10 mL), que foi lavado com salmoura (3 × 5 mL), seco sobre Na2SO4 e concentrado sob pressão reduzida para fornecer 107 mg de um produto bruto, que após purificação usando PTLC (sílica, cicloexano/AcOEt = 5:1), rendeu 26 mg (14%) de H6.
Composto H6: IV (ATR, νmáx, cm−1): 3417, 3310, 3076, 2975, 2928, 2836, 1674, 1638, 1607, 1522, 1502, 1435, 1245, 1026, 910, 812, 600, 523; 1H-RMN (CDCl3) δ 7,47 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-2′), 7,46 (dd, J = 8,1, 2,2 Hz, 1H, H-6′), 6,92 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-5′), 6,60 (s, 2H, H-4, H-6), 6,07 (ddt, J = 16,6, 10,2, 6,2 Hz, 1H, H-2‴), 6,00 (ddt, J = 16,9, 9,9, 6,9 Hz, 1H, H-2″), 5,04–5,17 (m, 4H, H-3″, H-3‴), 3,96 (bs, 2H, NH2), 3,89 (s, 3H, OCH3), 3,57 (q, J = 6,9 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,46 (d, J = 6,6 Hz, 2H, H-1‴), 3,33 (d, J = 6,9 Hz, 2H, H-1″), 1,16 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3); 13C-RMN (CDCl3) δ 156,4 (C-4′), 142,1 (C-2), 140,0 (C-3), 137,6 (C-2″), 137,0 (C-2‴), 136,0 (C-5), 134,4 (C-1), 131,0 (C-1′), 130,5 (C-2′), 128,0 (C-3′), 127,6 (C-6′), 120,5 (C-6), 115,5 (C-3″), 115,2 (C-3‴), 114,7 (C-4), 109,9 (C-5′), 67,6 (C–OCH2CH3), 55,4 (OCH3), 39,9 (C-1″), 34,3 (C-1‴), 15,7 (OCH2CH3); ESI+ calcd para C21H25NO2: [M]+ 323,189; encontrado ESI-MS m/z (int. rel.): 324,23 [M + H]+ (100).
3-Acetilamino-2-O-etil-4′-O-metil-honokiol (H7)
Em um balão de fundo redondo de 10 mL, H6 (34 mg, 0,105 mmol) foi misturado com água (0,3 mL) e adicionou-se anidrido acético (0,21 mmol, 20 μL). O balão foi rotacionado a 80 °C por cerca de 10 min em banho-maria. Após resfriamento à TA, a mistura reacional foi extinta com NaHCO3 aquoso (1 M, 2 mL) e extraída com diclorometano (3 × 2 mL). Os extratos combinados foram lavados com NaHCO3 aquoso (1 M, 2 mL), água (2 mL), secos sobre Na2SO4 e concentrados sob pressão reduzida. O produto bruto (27 mg) foi purificado por PTLC (cicloexano/AcOEt = 5:3), obtendo-se 21 mg (55%) de H7 como um óleo acastanhado.
Composto H7: IV (ATR, νmáx, cm−1): 3469, 3368, 3075, 2974, 2928, 2903, 2834, 1638, 1606, 1504, 1438, 1243, 1209, 1030, 909, 810, 596; 1H-RMN (CDCl3) δ 8,17 (s, 1H, H-4), 7,96 (sl, 1H, NH), 7,38 (s, 1H, H-2′), 7,37 (dd, J ≈ 8, 2,2 Hz, 1H, H-6′), 6,90 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-5′), 6,86 (d, J = 1,1 Hz, 1H, H-6), 6,03 (ddt, J = 16,8, 9,9, 6,9 Hz, 1H, H-2‴), 5,98 (ddt, J = 16,9, 9,9, 6,6 Hz, 1H, H-2″), 5,02–5,15 (m, 4H, H-3″, H-3‴), 3,87 (s, 3H, OCH3), 3,52 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,42 (d, J = 6,6 Hz, 2H, H-1‴), 3,38 (d, J = 7,0 Hz, 2H, H-1″), 2,21 (s, 3H, CH3CO), 1,14 (t, J = 7,0 Hz, 3H, OCH2CH3); 13C-RMN (CDCl3) δ 168,09 (CO), 156,7 (C-4′), 143,1 (C-2), 137,3 (C-2″), 136,9 (C-2‴), 136,2 (C-5), 133,5 (C-1), 131,9 (C-3), 130,4 (C-1′), 130,3 (C-2′), 128,4 (C-3′), 127,6 (C-6′), 125,3 (C-6), 118,7 (C-4), 115,8 (C-3″), 115,4 (C-3‴), 110,2 (C-5′), 68,7 (O–CH2–CH3), 55,4 (OCH3), 40,0 (C-1″), 34,3 (C-1‴), 24,9 (CH3–C=O), 15,6 (OCH2CH3); ESI+ calcd para C23H27NO3: [M]+ 365,199; encontrado ESI-MS m/z (rel. int.): 366,29 [M + H]+ (100).
5′-(N-Acetilamino)-2-O-metil-honokiol (H9)
Em um balão de fundo redondo de 10 mL, H12 (para síntese, ver Referência) (37 mg, 0,125 mmol) foi suspenso com água (1 mL) e adicionou-se anidrido acético (0,21 mmol, 20 μL). O balão foi deixado rotacionar por 10 min a 80 °C em banho-maria. Após resfriamento à TA, a mistura reacional foi extinta com NaHCO3 aquoso (1 M, 1 mL) e extraída com diclorometano (3 × 1,5 mL). Os extratos combinados foram lavados com NaHCO3 aquoso (1 M, 1,5 mL) e água (1,5 mL), secos sobre Na2SO4 e concentrados sob pressão reduzida. O produto bruto (29 mg) foi purificado por PTLC (sílica, cicloexano/AcOEt 5:3), obtendo-se 16 mg (39%) de H9, um óleo acastanhado.
Composto H9: IV (ATR, νmax, cm−1): 3276, 3075, 3001, 2917, 2848, 1750, 1637, 1595, 1540, 1480, 1239, 1239, 1139, 1025, 910, 873, 809; 1H-RMN (CDCl3) δ 7,62 (s, br 1H, NH), 7,18 (s, 1H, H-2′), 7,10 (d ≈ 8 Hz, 1H, H-4), 7,07 (s, 2H, H-6, H-6′), 6,89 (d, J = 8 Hz, 1H, H-3), 6,06 (ddt, J = 16,9, 10,3, 6,6 Hz, 1H, H-2‴), 5,97 (ddt, J ≈ 17, 9,9, 6,9 Hz, 1H, H-2″), 5,03–5,16 (m, 4H, H-3″, H-3‴), 3,77 (s, 3H, OCH3), 3,50 (d, J = 5,9 Hz, 2H, H-1‴), 3,35 (d, J = 6,6 Hz, 2H, H-1″), 2,22 (s, 3H, CO-CH3); 13C-RMN (CDCl3) δ 170,5 (CO), 154,7 (C-2), 146,0 (C-4′), 137,7 (C-2″), 136,8 (C-2‴), 132,3 (C-5), 130,9 (C-6), 130,4 (C-5′), 130,2 (C-3′), 129,6 (C-1), 128,8 (C-2′), 128,2 (C-4), 125,2 (C-1′), 121,4 (C-6′), 115,7 (C-3‴), 115,6 (C-3″), 111,4 (C-3), 55,8 (OCH3), 39,4 (C-1″), 35,9 (C-1‴), 23,7 (CO–CH3); ESI+ calcd para C21H23NO3: [M]+ 337,168; found ESI-MS m/z (int. rel.): 338,08 [M + H]+ (100).
Bis(2-Aliloxifenil)-metano (B1a)
B1 (400 mg, 2,0 mmol) foi O-alilado com brometo de alila (968 mg, 0,70 mL, 8,0 mmol) e K2CO3 (2,21 g, 16 mmol) em acetona (10 mL). A mistura reacional foi agitada por 5 h sob refluxo, e mais 12 h à TA e filtrada. O resíduo foi extraído com acetona (50 mL) e as soluções orgânicas combinadas foram evaporadas sob pressão reduzida, obtendo B1a (559 mg, 73%).
Composto B1a: IV (ATR, νmax, cm−1): 3025, 2920, 2905, 1595, 1584, 1491, 1450, 1421, 1248, 1116, 1103, 1022, 924, 751 cm−1; 1H-RMN (CDCl3) δ 7,19 (td, J = 7,6, 1,5 Hz, 2H, H-4), 7,14 (dd, J = 7,5, 1,2 Hz, 2H, H-6), 6,90 (t, J ≈ 8 Hz, 2H, H-5), 6,89 (d, 2H, J = 7,5 Hz, H-3), 6,02–6,13 (m, 2H, CH2–CH=CH2), 5,42 (dquint, J = 17,2, 4,3 Hz, 2H, CH2–CH=CH2), 5,27 (dquint, J = 10,5, 1,4 Hz, 2H, CH2–CH=CH2), 4,58 (dq, J = 5,0, 1,5 Hz, 2H, CH2–CH=CH2), 4,10 (s, 2H, Ar–CH2–Ar); 13C-RMN (CDCl3) δ 156,5 (C-2), 133,6 (CH=CH2), 130,5 (C-6), 129,6 (C-1), 126,9 (C-4), 120,5 (C-5), 116,8 (CH=CH2), 111,6 (C-3), 30,8 (O–CH2), 29,8 (Ar–CH2–Ar); EI+ calcd para C19H20O2: [M]+ 280,1463; found EI-MS m/z (int. rel.): 280,1465 [M]+ (100). O composto B1a foi mencionado em várias patentes; no entanto, dados químicos não foram fornecidos nesses documentos.
2-Alil-6-(3-alil-2-hidroxibenzil)-fenol (B2) e 4-Alil-2-(3-alil-2-hidroxibenzil)-fenol (B3)
O rearranjo de Claisen de B1a (561 mg, 2 mmol) em N,N-dietilanilina (4 mL) seguindo o procedimento de Chattopadhyay et al. resultou em B2 (410 mg; 73%) e B3 (89 mg; 15%) como sólidos brancos semelhantes a cera.
O
Composto B2: IV (KBr, νmax, cm−1): 3407 (lv, OH), 3073, 3035, 2975, 2937, 1639, 1590, 1461, 1448, 1372, 1294, 1234, 1210, 1192, 1086, 999, 922, 912, 754 cm−1; 1H-RMN (CDCl3) δ 7,20 (dd, J = 7,7; 1,5 Hz, 2H, H-6), 7,02 (d, J = 7,7 Hz, 2H, H-4), 6,88 (t, J = 7,7 Hz, 2H, H-5), 6,43 (s, lv, 2H, OH), 6,06 (ddt, J = 16,8; 10,3; 6,2 Hz, 2H, CH2–CH=CH2), 5,18–5,24 (m, 4H, CH2–CH=CH2), 3,97 (s, 2H, Ar–CH2–Ar), 3,45 (d, J = 6,6 Hz, 4H, CH2–CH=CH2); 13C-RMN (CDCl3) δ 151,4 (C-2), 136,6 (CH2–CH=CH2), 129,1 (C-6), 128,7 (C-4), 127,1 (C-1), 125,8 (C-3), 121,1 (C-5), 116,6 (CH2–CH=CH2), 35,4 (CH2–CH=CH2), 30,8 (Ar–CH2–Ar); IE+ calculado para C19H20O2: [M]+ 280,1463; encontrado IE-EM m/z (int. rel.): 280,1469 [M]+ (58). O composto B2 foi mencionado em várias patentes; no entanto, os dados químicos não foram fornecidos nelas.
Composto B3: IV (KBr, νmax, cm−1): 3387 (OH), 3077, 2853, 1638, 1611, 1592, 1506, 1465, 1434, 1256, 1232, 1215, 1107, 996, 914, 759 cm−1. 1H-RMN (CDCl3) δ 7,17 (dd, J = 7,8; 1,5 Hz, 1H, H-6), 7,06 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-6′), 6,98 (dd, J = 7,3; 1,5 Hz, 1H, H-4), 6,91 (dd, J = 8,4; 2,2 Hz, 1H, H-4′), 6,84 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-5), 6,74 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-3′), 6,31 (s, vl, 2H, OH), 6,02 (ddt, J = 16,8; 10,3; 6,2 Hz, 1H, 2″-H), 5,92 (ddt, J = 16,9; 10,3; 6,6 Hz, 1H, H-2″), 5,19 (dq, J ≈ 16; 1,7 Hz, 1H, H-3″), 5,18 (dq, J ≈ 9; 1,5 Hz, 1H, H-3″), 5,03 (dq, J ≈ 17; 1,8 Hz, 1H, H-3‴), 5,04 (dq, J ≈ 9; 1,3 Hz, 1H, H-3‴), 3,89 (s, 2H, Ar–CH2–Ar), 3,41 (d, J = 6,2 Hz, 2H, H-1″), 3,28 (d, J = 7,0 Hz, 2H, H-1‴); 13C-RMN (CDCl3) δ 151,3 (C-2), 151,2 (C-2′), 137,8 (C-2‴), 136,5 (C-2″), 132,8 (C-5′), 130,8 (C-6′), 129,1 (C-6), 128,8 (C-4), 128,0 (C-4′), 127,1 (C-1), 126,6 (C-1′), 125,6 (C-3), 121,2 (C-5), 116,9 (C-3″), 116,0 (C-3′), 115,4 (C-3‴), 39,4 (C-1‴), 35,6 (C-1″), 30,8 (Ar–CH2–Ar); IE+ calculado para C19H20O2: [M]+ 280,1463; encontrado IE-EM m/z (int. rel.): 280,1464 [M]+ (100).
2,4′-Dialiloxi-difenilmetano (C1a)
C1 (3,77 g, 18,8 mmol) foi alilado com brometo de alila (8,97 g, 6,5 mL, 74,1 mmol) e K2CO3 (20,8 g, 0,15 mol) em acetona (100 mL) conforme descrito acima, resultando no dialiloxi-difenilmetano (4,12 g, 78%).
Composto C1a: IV (ATR, νmax, cm−1): 3077, 3022, 2915, 2860, 1610, 1599, 1584, 1508, 1490, 1451, 1237, 1221, 1020, 996, 921, 749 cm−1; 1H-RMN (CDCl3) δ 7,22 (td, J ≈ 8, 1,3 Hz, 1H, H-4), 7,21 (d, J ≈ 8 Hz, 2H, H-2′ e H-6′), 7,14 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-6), 6,94 (t, J = 7,3 Hz, 1H, H-5), 6,90 (d, 1H, J ≈ 8 Hz, H-3), 6,89 (d, 2H, J = 8,4 Hz, H-3′ e H-5′), 6,03–6,17 (m, 2H, H-2″ e H-2‴), 5,45 (dq, J = 17,2, 1,5 Hz, 1H, H-3‴), 5,44 (dq, J = 17,3, 1,5 Hz, 1H, H-3″), 5,32 (dq, J = 10,5, 1,5 Hz, 1H, H-3‴), 5,31 (dq, J = 10,5, 1,5 Hz, 1H, H-3″), 4,58 (dt, J = 5,1, 1,5, 2H, H-1″), 4,55 (dt, J = 5,1, 1,5, 2H, H-1‴), 4,02 (s, 2H, Ar–CH2–Ar); 13C-RMN (CDCl3) δ 156,7 (C-4′), 156,2 (C-2), 2 × 133,5 (2 × CH=CH2), 133,3 (C-1′), 130,4 (C-1), 130,2 (C-6), 129,8 (C-2′ e C-6′), 127,2 (C-4), 120,6 (C-5), 117,4 (C-3‴), 116,9 (C-3″), 114,5 (C-3′ e C-5′), 111,7 (C-3), 68,8 e 68,7 (2 × O–CH2), 35,1 (Ar–CH2–Ar); EI+ calc. para C19H20O2: [M]+ 280,1463; encontrado EM-IE m/z (int. rel.): 280,1 [M]+ (45), 133,1 [C6H4–O–alila]+ (100).

2-Alil-4-(3-alil-2-hidroxibenzil)-fenol (C2) e 2-Alil-4-(5-alil-2-hidroxibenzil)-fenol (C3)

O rearranjo de Claisen de C1a (14,5 g, 51,7 mmol) em N,N-dietilanilina (115 mL) seguindo o procedimento de Chattopadhyay et al. resultou em C2 (10,6 g; 73%) e C3 (1,2 g; 8,3%)

Composto C2: IV (ATR, νmax, cm−1): 3507 (br, OH), 3076, 3009, 2977, 2906, 1637, 1609, 1591, 1501, 1461, 1432, 1328, 1255, 1182, 996, 911, 751 cm−1; 1H-RMN (CDCl3) δ 6,95–7,06 (m, 4H, H-4, H-6, H-2′, H-6′), 6,86 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-5), 6,74 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-5′), 5,94–6,09 (m, 2H, H-2″, H-2‴), 5,12–5,20 (m, 4H, H-3″, H-3‴), 4,99 (s, l, 2H, OH), 3,92 (s, 2H, Ar–CH2–Ar), 3,41 (d, J = 6,2 Hz, 2H, H-1″), 3,38 (d, J = 6,2 Hz, 2H, H-1‴); 13C-RMN (CDCl3) δ 152,6 (C-4′), 152,4 (C-2), 136,5 (C-2″), 136,4 (C-2‴), 132,1 (C-1′), 130,7 (C-2′), 129,1 (C-6), 128,6 (C-4), 128,0 (C-6′), 127,6 (C-1), 125,6 (C-3, C-3′), 120,6 (C-5), 116,4 (C-3″, C-3‴), 116,0 (C-5′), 35,7 (Ar–CH2–Ar), 35,3 (C-1″), 35,1′ (C-1‴); EI+ calc. para C19H20O2: [M]+ 280,1463; encontrado EM-IE m/z (int. rel.): 280,1465 [M]+ (100).

Composto C3: IV (ATR, νmax, cm−1): 3277 (br, OH), 3078, 3013, 2977, 2902, 1638, 1608, 1502, 1434, 1341, 1247, 1207, 1094, 992, 793, 634, 617 cm−1; 1H-RMN (CDCl3) δ 6,90–7,04 (m, 4H, H-4, H-6, H-2′, H-6′), 6,68–6,78 (m, 2H, H-3, H-5′), 5,88–6,07 (m, 2H, H-2″, H-2‴), 5,10–5,20 (m, 2H, H-3‴), 4,99–5,10 (m, 2H, H-3″), 4,87 (s, 1H, OH), 4,57 (s, 1H, OH), 3,89 (s, 2H, Ar–CH2–Ar), 3,38 (d, J = 6,2 Hz, 2H, 1‴-H), 3,30 (d, J = 6,6 Hz, 2H, H-1′); 13C-RMN (CDCl3) δ 152,6 (C-4′), 152,1 (C-2), 137,9 (C-2″), 136,4 (C-2‴), 132,2 (C-5), 132,0 (C-1′), 131,0 (C-6), 130,2 (C-2′), 127,9 (C-6′), 127,7 (C-4), 127,1 (C-1), 125,6 (C-3′), 116,3 (C-3‴), 116,0, 115,8 (C-3, C-5′), 115,3 (C-3″), 39,3 (C-1″), 35,7 (Ar–CH2–Ar), 35,1 (C-1‴) EI+ calc. para C19H20O2: [M]+ 280,1463; encontrado EM-IE m/z (int. rel.): 280,1 [M]+ (100), 147,1 [CH2–C6H4–O–alila]+ (100).
Procedimento Geral para a Metilação de Dihidroxi-Difenilmetanos
O diol correspondente (1 eq) foi dissolvido em KOH aquoso (10%, 2,5 eq) e agitado por 10 min. Me2SO4 (1,2 eq) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada por 20 min à TA e por 1 h a 95 °C. Após resfriamento à TA, a mistura foi acidificada com HCl aquoso (2M) e extraída com clorofórmio (3×). As camadas orgânicas foram secas sobre Na2SO4 e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi cromatografado em sílica com cicloexano/AcOEt = 5:1.
Bis(3-alil-2-metoxifenil)metano (B4a) e 6-alil-2-(3-alil-2-metoxibenzil)-fenol (B4b)
A metilação de 420 mg (1,5 mmol) de B2 resultou em 39 mg de material de partida, 40 mg de B4a (8,6%) e 249 mg de B4b (57%).
Composto B4a: IV (ATR, νmáx, cm−1): 3001, 2978, 2941, 2827, 1463, 1427, 1291, 1164, 1080, 1009, 911, 766 cm−1; 1H-RMN (CDCl3) δ 7,09 (dd, 2H, J = 7,6 e 1,3 Hz, H-4), 7,00 (t, 2H, J = 7,5 Hz, H-5), 6,93 (dd, 2H, J = 7,4 e 1,3 Hz, H-6), 5,97–6,09 (m, 2H, -CH=CH2), 5,06–5,21 (m, 4H, -CH=CH2), 4,10 (s, 2H, Ar–CH2–Ar), 3,72 (s, 6H, OCH3), 3,46 (d, 4H, J = 6,6 Hz, CH2-CH=CH2); 13C-RMN (CDCl3) δ 154,4 (C-2), 137,3 (-CH=CH2), 134,0 (C-1), 132,9 (C-3), 128,9 (C-6), 128,5 (C-4), 124,1 (C-5), 115,8 (-CH=CH2), 34,0 (-CH2-CH=CH2), 29,6 (Ar–CH2–Ar). EI+ calculado para C21H24O2: [M]+ 308,1776; encontrado EI-EM m/z (int. rel.): 308,1776 [M]+ (100).
Composto B4b: IV (ATR, νmáx, cm−1): 3320 (br, OH), 3001, 2978, 2975, 2944, 2908, 1641, 1632, 1591, 1462, 1446, 1430, 1220, 1086, 998, 910, 780, 604 cm−1; 1H-RMN (CDCl3) δ 7,35 (s, 1H, OH), 7,18 (dd, J = 7,1, 1,8 Hz, 1H, H-6′), 7,13 (d, J = 7,1 Hz, 1H, H-6), 7,08 (dd, J ≈ 7, ≈ 2 Hz, 1H, H-4′), 7,06 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-5′), 7,00 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-4), 6,81 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-5), 5,92–6,08 (m, 2H, H-2″ e H-2‴), 5,03–5,15 (m, 4H, H-3″ e H-3‴), 3,92 (2 × s, 5H, Ar–CH2–Ar e OCH3), 3,47 (d, J = 6,3 Hz, 2H, H-1‴), 3,40 (d, J = 6,6 Hz, 2H, H-1″); 13C-RMN (CDCl3) δ 154,2 (C-2′), 151,2 (C-2), 137,0 (C-2″), 136,8 (C-2‴), 2 × 133,0, (C-1′ e C-3′), 129,1 (C-4′), 128,9 (C-6′), 128,6 (C-4), 128,4 (C-6), 127,2 (C-3), 126,6 (C-1), 125,3 (C-5′), 120,1 (C-5), 116,2 (C-3‴), 115,4 (C-3″), 62,3 (OCH3), 34,7 (C-1″), 33,8 (C-1‴), 31,4 (Ar–CH2–Ar); EI+ calculado para C21H24O2: [M]+ 294,1620; encontrado EI-EM m/z (int. rel.): 294,1619 [M]+ (100).
3,3′-Dialil-2,4′-dimetoxi-difenil-metano (C4a), 6-alil-2-(3-alil-4-metoxibenzil)-fenol (C4b) e 2-alil-4-(3-alil-2-metoxibenzil)-fenol (C4c)
A metilação de 2,10 g (7,5 mmol) de C2 resultou em 143 mg de material de partida, 318 mg de C4a (14%), 665 mg de C4b (30%) e 442 mg de C4c (20%).
Composto C4a: IV (ATR, νmax, cm−1): 3001, 2977, 2939, 2833, 1638, 1500, 1463, 1429, 1248, 1125, 1080, 1033, 1010, 910, 768 cm−1; 1H-RMN (CDCl3) δ 7,07 (dd, J = 7,3, 1,5 Hz, 1H, H-4), 6,98–7,02 (m, 3H, H-2′, H-5 e H-6′), 6,96 (dd, J = 7,6, 1,3 Hz, 1H, H-6), 6,78 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-5′), 5,92–6,07 (m, 2H, H-2″ e H-2‴), 5,06–5,13 (m, 2H, H-3″), 4,99–5,06 (m, 2H, H-3‴), 3,96 (s, 2H, Ar–CH2–Ar), 3,80 (s, 3H, C4′-OCH3), 3,68 (s, 3H, C2-OCH3), 3,46 (d, J = 6,3 Hz, 2H, H-1″), 3,36 (d, J = 6,6 Hz, 2H, H-1‴); 13C-RMN (CDCl3) δ 156,3 (C-2), 155,6 (C-2′), 137,3 (C-2″), 137,1 (C-2‴), 134,7 (C-1), 133,0 (C-3), 132,8 (C-1′), 130,2 (C-2′), 129,0 (C-6), 128,5 (C-4), 128,4 (C-3′), 127,5 (C-6′), 120,5 (C-5), 115,8 (C-3″), 115,3 (C-3‴), 110,3 (C-5′), 61,2 (C2-OCH3), 55,4 (C4′-OCH3), 34,9 (Ar–CH2–Ar), 34,3 (C-1‴), 34,0 (C-1″); EM (ESI+) m/z (%): calculado para C21H24O2: [M]+ 308,178; encontrado: EI-EM m/z (int. rel.): 308,4 [M]+ (100).
D4b: IV (ATR, νmax, cm−1): 3526 (br, OH), 3003, 2976, 2905, 2834, 1637, 1608, 1592, 1499, 1461, 1247, 1182, 1032, 996, 910, 752 cm−1; 1H-RMN (CDCl3) δ 6,97–7,02 (m, 4H, H-4, H-6, H-2′ e H-6′), 6,82 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-5), 6,76 (d, J = 8,8 Hz, 1H, H-5′), 5,90–6,05 (m, 2H, H-2″ e H-2‴), 5,11–5,17 (m, 2H, H-3″), 4,98–5,05 (m, 2H, H-3‴), 4,94 (s, 1H, OH), 3,91 (s, 2H, Ar–CH2–Ar), 3,78 (s, 3H, OCH3), 3,38 (d, J = 6,2 Hz, 2H, H-1″), 3,34 (d, J = 6,5 Hz, 2H, H-1‴); 13C-RMN (CDCl3) δ 152,9 (C-4′), 152,4 (C-2), 136,9 (C-2‴), 136,5 (C-2″), 131,4 (C-1′), 130,2 (C-2′), 129,1 (C-6′), 128,8 (C-3′), 128,6 (C-4), 127,6 (C-1), 127,2 (C-6), 125,5 (C-3), 120,5 (C-5), 116,4 (C-3″), 115,3 (C-3‴), 55,4 (OCH3), 35,8 (Ar–CH2–Ar), 35,3 (C-1″), 34,3 (C-1‴); EM (EI) m/z (%): calculado para C20H22O2: [M]+ 294,162; encontrado: EI-EM m/z (int. rel.): 294,4 [M]+ (80), 253,2 (65).
D4c: IV (ATR, νmax, cm−1): 3393 (br, OH), 3005, 2977, 2940, 2911, 2830, 1638, 1610, 1591, 1505, 1464, 1428, 1251, 1198, 1080, 996, 910, 768 cm−1; 1H-RMN (CDCl3) δ 7,09 (dd, J = 7,3, 1,7 Hz, 1H, H-4), 7,01 (t, J = 7,3 Hz, 1H, H-5), 6,93–6,99 (m, 3H, H-2′, H-6 e H-6′), 6,73 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-5′), 5,94–6,08 (m, 2H, H-2″ e H-2‴), 5,06–5,20 (m, 4H, H-3″ e H-3‴), 4,95 (s, 1H, OH), 3,96 (s, 2H, Ar–CH2–Ar), 3,68 (s, 3H, OCH3), 3,46 (d, J = 6,6 Hz, 2H, H-1″), 3,38 (d, J = 6,5 Hz, 2H, H-1‴), 13C-RMN (CDCl3) δ 156,3 (C-2), 152,3 (C-4′), 137,3 (C-2″), 136,5 (C-2‴), 134,6 (C-1), 133,3 (C-1′), 133,0 (C-3), 130,1 (C-2′), 129,0 (C-6), 128,6 (C-4), 128,2 (C-6′), 125,1 (C-3′), 124,1 (C-5), 116,3 (C-3″), 115,8 (C-3‴), 115,7 (C-5′), 61,2 (OCH3), 35,2 (C-1‴), 34,9 (Ar–CH2–Ar), 33,9 (C-1″); EM (EI) m/z (%): calculado para C20H22O2: [M]+ 294,162; encontrado: EI-EM m/z (int. rel.): 294,4 [M]+ (75), 253,2 (40).
3.2. Ensaios Biológicos
Linhagem celular: Toda a triagem foi realizada em uma linhagem de células embrionárias humanas renais que expressam de forma estável o transportador de norepinefrina humano e o transportador vesicular de monoaminas 2 (HEK-hNET-hVMAT2-mCherry). A expressão de VMAT2 humano, além de hNET, recapitula mais completamente um fenótipo neuronal em cultura celular. As células foram imageadas e totalmente caracterizadas quanto à funcionalidade (Figura 1). Para imageamento, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% e a expressão proteica de NET foi determinada por imunomarcação (anticorpo primário: Novus, anti-transportador de norepinefrina, 1:1000; anticorpo secundário: Thermo Fisher, Alexafluor goat anti-rabbit-488, 1:5000) seguida por imageamento confocal (Nikon A1R, Nikon Instruments, Melville, NY, EUA). Triagem: Os compostos sintetizados foram testados quanto à interação com NET por meio de um processo de três etapas. Primeiro, todos os compostos foram testados usando um ensaio fluorescente comercialmente disponível (kit de captação de transporte de neurotransmissores, Molecular Devices, San Jose, CA, EUA) para avaliação da capacidade de transporte de monoaminas plasmalemais. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços revestidas com poli-d-lisina (PDL) (Corning Inc., Corning, NY, EUA) até 100% de confluência. No dia seguinte, o meio celular (DMEM, 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina/estreptomicina) foi removido e o meio experimental (solução salina balanceada de Hank, Sigma-Aldrich) foi adicionado. Após uma incubação de 30 min a 37 °C, o corante foi adicionado a todos os poços, com ou sem compostos (concentração final de 3 nM–100 μM) ou inibidor seletivo de NET, desipramina (concentração final de 3 nM–10 μM, controle). As placas foram incubadas por 1 h e, em seguida, lidas em um leitor de placas fluorescente (Thermo Fisher). Os experimentos foram realizados em triplicata. Segundo, os moduladores mais potentes da atividade de transporte (C4a, H8, H11, H16, H20 e M6) foram posteriormente avaliados quanto à captação de dopamina radiomarcada na mesma linhagem celular, uma vez que a dopamina é um substrato de NET. As células foram plaqueadas até confluência em placas de 48 poços revestidas com PDL no dia anterior ao experimento. Para os experimentos, o meio foi removido, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubadas com ou sem compostos ou desipramina (10 nM a 10 μM, captação não específica medida pela adição de 100 μM de desipramina) por dez minutos a 37 °C. A dopamina (concentração total de 1 μM com 200 nM de traçador 3H-dopamina) foi adicionada e a captação prosseguiu por 10 min a 37 °C. As células foram então lavadas três vezes com PBS, lisadas com NaOH 0,1 N e medidas por contagem de cintilação líquida (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA).
Finalmente, cada composto selecionado foi visualizado por imageamento de alto conteúdo usando o Array Scan VTI HCS (Cellomics). Células foram semeadas a 80% de confluência em placas de 96 poços com fundo de vidro revestidas com PDL. O meio foi removido e DMEM sem vermelho de fenol, com ou sem compostos ou desipramina (10 nM a 10 μM), foi adicionado. Após uma hora de incubação, as células foram imageadas. Quarenta e nove campos contíguos por poço foram capturados e a fluorescência total no canal verde foi registrada. Nenhum composto demonstrou atividade potente no NET (IC50 > 100 µM), em comparação com o inibidor seletivo de NET, desipramina, que inibiu a captação fluorescente (leitor de placas: IC50 = 125,3 nM; imageamento: IC50 = 65,7 nM, Figuras 1.1 e 3) e radioativa (IC50 = 52,1 nM, Figura 1.2). As curvas de dose-resposta (medidas como fluorescência) para os compostos testados podem ser encontradas nos "Materiais Suplementares".
4. Conclusões
No total, testamos uma série de 52 neolignanas bifenílicas e derivados (incluindo análogos de difenil-metano) encontrados em preparações biológicas usadas para tratar ansiedade e insônia na medicina oriental, quanto à eficácia farmacológica no NET. Nenhum composto testado inibiu potentemente a captação via NET, sugerindo agudamente que esses compostos podem atuar exclusivamente através da modulação do receptor GABAA. Também é possível que esses compostos ainda modulem o sistema noradrenérgico; o tratamento de longo prazo com os compostos poderia alterar a expressão tecidual de receptores ou afetar o nível tecidual de norepinefrina, potencialmente modulando enzimas que produzem e metabolizam o neurotransmissor. Experimentos futuros são necessários para determinar se a administração crônica de fármacos pode alterar a sinalização noradrenérgica. No contexto desses experimentos, no entanto, não vemos evidências de modulação aguda da atividade do NET por neolignanas bifenílicas ou derivados. Também é digno de nota que a sinalização serotoninérgica também desempenha um papel importante na ansiedade e depressão. Embora além do escopo deste trabalho, a investigação de derivados de honokiol em receptores de serotonina pode fornecer mais informações sobre como esses compostos exercem seu efeito ansiolítico.
Disponibilidade de Amostras: Amostras dos compostos estão disponíveis com WS e AH. A disponibilidade só pode ser garantida para compostos que permanecem estáveis sob condições de armazenamento.
Materiais Suplementares
Espectros de RMN de próton dos novos compostos e curvas dose-resposta dos compostos testados estão disponíveis em "Materiais Suplementares".
Contribuições dos Autores
W.S. conceito, aquisição de financiamento, separação por HPLC, medições de GC-MS e controle de pureza dos compostos, análise de dados, redação do manuscrito. K.S. e G.W.M. desenho e execução da investigação farmacológica, análise de dados, redação e correção do manuscrito. M.B. desenho e realização das sínteses. A.H. Desenho das sínteses químicas, realização de pesquisa sintética, realização de experimentos espectroscópicos de RMN e análise de dados, redação do manuscrito.
Financiamento
Partes deste trabalho foram apoiadas pelo Fundo Austríaco para a Ciência (FWF) sob a bolsa "Síntese de novos moduladores do receptor GABAA" (P21241).
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Padrões de prescrição de produtos fitoterápicos chineses para pacientes com transtorno do sono e transtorno depressivo maior em Taiwan
Identificação de magnolol e honokiol como agentes ansiolíticos em extratos de saiboku-to, uma medicina herbal oriental
Visão geral das características farmacológicas do honokiol
Honokiol e Magnolol Interagem Seletivamente com Subtipos do Receptor GABAA in vitro
Regulação do transportador de norepinefrina pela administração crônica de antidepressivos
Direcionamento da norepinefrina no comprometimento cognitivo leve e na doença de Alzheimer
Boa noite e boa sorte: Norepinefrina na farmacologia do sono
Estruturas privilegiadas como líderes em química medicinal
Desenho e síntese de dez derivados de bifenil-neolignanas e seu potencial inibitório in vitro contra a atividade de ciclooxigenase-1/2 e formação de LTB4 mediada por 5-lipoxigenase
Modulação de Receptores GABAA por Honokiol e Derivados: Seletividade de Subtipo e Relação Estrutura-Atividade
Derivados nitrogenados de honokiol modulam alostericamente receptores GABAA e atuam como agonistas parciais fortes
Mecanismos de Inibição da Osteoclastogênese por uma Nova Classe de Agonistas Inversos do Receptor CB2 Canabinoide do Tipo Bifenil
Síntese de Derivados de Tetraidrohonokiol e sua Avaliação para Atividade Citotóxica contra Células de Leucemia CCRF-CEM, Glioblastoma U251 e Câncer de Cólon HCT-116
Algumas 2H-1,4-Benzoxazin-3(4H)-onas 2-Substituídas
Sobre a ação do éter cloroxicarbônico sobre a amido-fenol
Síntese de cloretos de aminoácidos Fmoc assistida por ultrassonicação, uma abordagem rápida
Síntese de peptídeos empregando cloretos de aminoácidos Fmoc e pó de zinco comercial
Síntese Enantioespecífica da Estrutura Proposta do Diterpenoide Marinho Antituberculose Pseudopteroxazol: Revisão da Estereoquímica
Avaliação de antagonistas de moléculas pequenas potentes e seletivos para o receptor de quimiocina CXCR2
A Reatividade do o-Hidroxibenzil Álcool e Derivados em Solução em Temperaturas Elevadas
Rearranjo duplo sequencial de Claisen e metátese de fechamento de anel bidirecional como rota para vários derivados de benzofundidos bisoxepina e bisoxocina
Síntese e avaliação farmacológica de novos derivados bifenílicos como ligantes do receptor CB2
Validação de um ensaio de alto rendimento baseado em fluorescência para a medição da atividade de captação do transportador de neurotransmissores
Um ensaio baseado em fluorescência para avaliação espacialmente resolvida em células vivas do transporte de neurotransmissores mediado pelo transportador vesicular de monoamina 2
Regulação da dopamina extracelular pelo transportador de norepinefrina
Transportadores de monoamina da membrana plasmática: Estrutura, regulação e função
Figuras, Esquemas e Tabelas
Ensaio fluorescente baseado em leitor de placas usando NET humano em um ensaio de validação da estratégia de triagem usando o inibidor conhecido de NET, desipramina, como controle positivo. Fluxo de trabalho de triagem de compostos: (A) Todos os compostos foram triados quanto à captação fluorescente em células HEK-hNET-hVMAT2 de rim embrionário humano (NET azul, VMAT2 vermelho) usando um corante que é um substrato para NET, conforme indicado pela inibição pela adição de um inibidor seletivo de NET, desipramina. (B) Em seguida, as contagens fluorescentes foram confirmadas com uma captação radiomarcada de dopamina, que também é um substrato de NET, conforme demonstrado pela falta de captação na presença de desipramina. (C) Finalmente, a captação foi visualizada usando imagens de alto conteúdo com o Array Scan VTI HCS (Cellomics, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) para visualizar núcleos (corados com DAPI), VMAT2-mCherry e corante. Todos os experimentos foram conduzidos em triplicata e analisados com análise de regressão não linear no GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). Escala: 10 nm.
Síntese de derivados de honokiol. Reagentes e condições: i) n-C11H23COCl, piridina; ii) Fmoc-l-Ala-Cl, Zn, THF; iii) Fmoc-l-Phe-Cl, Zn, THF; iv) piperidina.
Síntese de derivados de honokiol. Reagentes e condições: i) HNO3 (65%), AcOEt; ii) SnCl2×2 H2O, EtOH; iii) Irradiação MW 1. KOH, 2. Me2SO4 ou Et2SO4; iv) Ac2O, H2O.
Síntese de derivados de difenilmetano. Reagentes e condições: i) K2CO3, CH2=CH–CH2–Br, acetona; ii) Δ, Ph-NMe2; iii) 1. KOH, 2. Me2SO4.
Estruturas dos Compostos Baseados em Honokiol.
Cpd. R1 R2 R3 R4 R5 R6 H H H H alila alila H H1 H Me NH2 alila alila H H2 H Me NH-COC11H23 alila alila H H3 H Me NH-Ala alila alila H H4 H Me NH-Phe alila alila H H5 H Et NH2 alila alila H H6 Et Me NH2 alila alila H H7 Et Me NH-Ac alila alila H H8 H Me NH-Ac alila alila H H9 Me H H alila alila NH-Ac H10 H Et H alila alila H H11 H Me H alila alila H H12 Me H H alila alila NH2 H13 H H H alila 1-propenila H H14 H H H n-propila n-propila H H15 Me H H alila alila H H16 Me Me H alila alila H H17 H Me H alila 1-propenila H H18 H Me H 2,3-di-hidroxipropila 2,3-di-hidroxipropila H H19 H Me H n-propila n-propila H H20 Me Me H n-propila n-propila H H21 Et H H alila alila H H22 H Et H alila alila H H23 Et H H n-propila n-propila H H24 Et Et H n-propila n-propila H H25 H Me H 2-bromopropila alila H H26 Me H H alila alila NO2 H27 Me H H n-propila n-propila NO2 H28 H Me NO2 alila alila H H29 Me H H n-propila n-propila NH2 H30 H Me NH2 n-propila n-propila H H31 Me H H n-propila n-propila NH-Ac H32 H Me NH-Ac n-propila n-propila H
Estruturas dos Compostos Baseados em Bifenil-2,2′-diol.
Cpd. R1 R2 R3 R4 R5 R6 M H H H alila H alila M1 H H H H H H M2 H H H n-propila H n-propila M3 Me H H alila H alila M4 Me Me H alila H alila M5 H H H Me H Me M6 H H H t-butila H t-butila M7 H H alila H alila H
Estruturas dos Compostos Baseados em Bifenil-4,4′-diol.
Cpd. R A1 H A2 alila
Estruturas dos Compostos Baseados em Bis(2-hidroxifenil)metano.
Cpd. R1 R2 R3 R4 R5 R6 B1 H H H H H H B1a * alila alila H H H H B2 H H alila H alila H B3 * H H alila H H alila B4b Me H alila H alila H B4a Me Me alila H alila H

• Compostos não testados.
  Estruturas dos Compostos Baseados em 2,4′-Di-hidroxidifenilmetano.
  Cpd. R1 R2 R3 R4 R5 C1 H H H H H C1a * alila alila H H H C2 H H alila H alila C3 * H H H alila alila C4c Me H alila H alila C4b H Me alila H alila C4a Me Me alila H alila
• Compostos não testados.