pmid: "38222858"
title: "Óleo essencial de"
authors: "Chen G, Lv C, Nie Q, Li X, Lv Y, Liao G, Liu S, Ge W, Chen J, Du Y"
journal: "Clinical, cosmetic and investigational dermatology"
pubdate: "2024"
doi: "10.2147/CCID.S445008"
source: "PMC Full Text"
Óleo essencial de
Autores
Chen G, Lv C, Nie Q, Li X, Lv Y, Liao G, Liu S, Ge W, Chen J, Du Y
Periodico
Clinical, cosmetic and investigational dermatology (2024)
Conteudo
O Óleo Essencial de Matricaria chamomilla Alivia a Inflamação Cutânea Semelhante à Psoríase ao Inibir a Via de Sinalização PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK
Introdução
A tradicional Matricaria chamomilla L. tem sido usada para tratar dermatite há milhares de anos. Devido às tendências emergentes na medicina alternativa, os pacientes preferem remédios naturais para aliviar seus sintomas. Portanto, encontrar medicamentos vegetais seguros e eficazes para aplicações tópicas na pele é uma importante estratégia de tratamento para dermatologistas. A camomila alemã (Matricaria chamomilla L.) da família Compositae é uma planta medicinal famosa, frequentemente conhecida como a “estrela das espécies medicinais.” No entanto, a função do óleo essencial de Matricaria chamomilla na inflamação da pele não foi examinada minuciosamente em pesquisas anteriores.
Métodos
GC-MS analisou os componentes do MCEO, e este estudo explorou os efeitos anti-inflamatórios do MCEO na psoríase com previsão de via farmacológica de rede. Em seguida, utilizamos amostras clínicas de pacientes com psoríase para confirmar a característica secretora de marcadores inflamatórios relativos. O efeito terapêutico do MCEO na inflamação da pele foi detectado pelo exame de queratinócitos humanos HaCaT. Ao mesmo tempo, preparamos inflamação cutânea semelhante à psoríase induzida por imiquimode em camundongos para investigar minuciosamente as potenciais funções de inibição do MCEO na lesão e inflamação da pele psoriática.
Resultados
MCEO reduziu significativamente a elevação da inflamação das células HaCaT estimulada por interleucina-22/fator de necrose tumoral α/lipopolissacarídeo, o que foi correlacionado com a regulação negativa da ativação das vias PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK mediada por MCEO em células HaCaT tratadas com IL-22/TNF-α/LPS. A inflamação da pele foi avaliada com base no escore PASI, coloração HE e níveis relativos de citocinas inflamatórias. Os resultados mostraram que o MCEO poderia contribuir significativamente para o tratamento de doenças inflamatórias da pele.
Conclusão
MCEO inibiu a inflamação em queratinócitos HaCaT induzida por IL-22/TNF-α/LPS, os mecanismos potenciais associados à inibição da ativação excessiva e do diálogo cruzado entre as vias PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK. O MCEO melhorou a lesão cutânea na inflamação da pele semelhante à psoríase induzida por IMQ em camundongos ao reduzir os níveis de citocinas inflamatórias, mas não de IL-17A. Assim, medicamentos vegetais anti-inflamatórios com diferentes alvos e aplicações combinadas foram uma estratégia terapêutica potencial para a psoríase.
A psoríase é uma doença crônica imunomediada que afeta 100 milhões de indivíduos em todo o mundo. Portanto, é necessária uma ação para fornecer cuidados aos pacientes com psoríase e eliminar a discriminação. Está associada a múltiplas comorbidades e afeta seriamente a qualidade de vida dos pacientes. Manifesta-se principalmente como hiperplasia epidérmica, diferenciação anormal de queratinócitos, dilatação acentuada das artérias e infiltração de células inflamatórias ao redor dos capilares dérmicos na histomorfologia psoriática. A patogênese da psoríase é complexa e permanece não elucidada. A estimulação dos queratinócitos tem sido considerada como levando à geração de mediadores secundários, por exemplo, fatores celulares, quimiocinas e peptídeos antibacterianos. Assim, a psoríase pode ser induzida pela desregulação da diferenciação imune e dos queratinócitos, acompanhada por inflamação persistente. Atualmente, além dos imunossupressores tradicionais, por exemplo, metotrexato (MTX) e ciclosporina, novos avanços terapêuticos, incluindo inibidores seletivos, como inibidor da Fosfodiesterase 4 (PDE4), inibidor da Janus quinase (JAK) e anticorpos monoclonais, terapia anti-citocina/células T e terapia gênica relativa, foram aplicados à psoríase clínica. No entanto, com o aumento da frequência de uso clínico de agentes biológicos em pacientes com uso prolongado de medicamentos, os efeitos clínicos dos agentes biológicos podem ser reduzidos. Além disso, várias reações adversas limitam sua aplicação clínica. Além disso, como o custo do tratamento da psoríase é um grande desafio, necessitamos de terapias eficientes, seguras e econômicas.
Apesar dos avanços na aplicação de medicamentos, a terapia alternativa natural à base de ervas tornou-se um fator chave para a terapia de doenças de pele devido à crescente demanda por ervas, aos baixos custos associados e aos contínuos efeitos adversos dos medicamentos modernos. Além disso, os remédios fitoterápicos, especialmente aqueles derivados de plantas, são eficazes contra várias condições de pele. Algumas investigações descobriram que extratos de plantas naturais de Aloe vera, Mahonia aquifolium, Matricaria recutita, Silybum marianum, Gaultheria procumbens, e populações especiais são eficazes contra uma variedade de condições de pele.
A camomila-alemã (Matricaria chamomilla L.) da família Compositae é uma planta medicinal famosa chamada de “uma estrela das espécies medicinais.” Estas ervas têm sido usadas na Grécia, Roma e no Antigo Egito por milhares de anos. Dai et al descobriram que existem muitos tipos de constituintes químicos na camomila-alemã, incluindo ácidos orgânicos, flavonoides, cumarinas, óleo volátil, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos e triterpenos, etc. A camomila-alemã tem efeitos terapêuticos definidos no tratamento de problemas estomacais, cólicas, dermatite, infecções menores, atividades bactericidas e relaxantes musculares. Além disso, alguns estudos em animais certificaram propriedades ansiolíticas, anticancerígenas, redutoras de colesterol, cicatrizantes e antidiabéticas desta planta. No entanto, sua aplicação no campo das doenças inflamatórias da pele está apenas emergindo. Lin et al mostraram que, além de anti-inflamatório e antioxidante, o óleo essencial de M. chamomilla (MCEO) pode promover a cicatrização de feridas e reparar a barreira cutânea. Além disso, Wang et al descobriram que o MCEO reduziu os fatores pró-inflamatórios (TNF-α e IL-6) para inibir a diferenciação de células Th17 durante o eczema. Na China e no Japão, era normalmente usado externamente na área da pele, incluindo ação antipruriginosa e anti-inflamatória; proteção solar, alivia irritação da pele e antiviral ou previne doenças virais. Até o momento, nenhum relato experimental sobre a aplicação da camomila-alemã na psoríase foi publicado.
A farmacologia de redes é uma nova estratégia para estudar sistematicamente a relação entre doenças, medicamentos e alvos. Um corpo crescente de evidências apoia a farmacologia de redes como uma ferramenta eficaz para estudar os mecanismos moleculares de ervas contendo compostos múltiplos complexos. Os efeitos farmacológicos e os potenciais alvos do MCEO na psoríase foram sistematicamente discutidos utilizando a farmacologia de redes. O efeito anti-inflamatório do MCEO na inflamação cutânea semelhante à psoríase foi validado in vivo e in vitro com base na predição farmacológica de redes. Além disso, o Luminex avaliou os níveis de citocinas inflamatórias relativas em pacientes psoriáticos para identificar potenciais alvos para os efeitos anti-inflamatórios do MCEO em humanos. De acordo com os resultados da análise de farmacologia de redes, avaliamos os efeitos anti-inflamatórios e o mecanismo regulador do MCEO em queratinócitos humanos (HaCaT) estimulados por interleucina-22 (IL-22)/fator de necrose tumoral α (TNF-α)/lipopolissacarídeo (LPS) in vitro e em camundongos com modelo de inflamação cutânea psoriática induzida por imiquimod (IMQ) in vivo, para esclarecer o valor potencial do MCEO na aplicação clínica de doenças inflamatórias da pele sob a perspectiva anti-inflamatória.
Materiais e Métodos
Extração do MCEO e Análise por GC-MS
O MCEO foi obtido por destilação a vapor das flores de Matricaria chamomilla. Análises qualitativas do MCEO foram realizadas por cromatografia gasosa (CG) acoplada à espectrometria de massas (EM) usando um CG-EM do tipo 7890A-5975C (Agilent Technology Co., LTD, Califórnia, EUA). Condições cromatográficas: coluna capilar de quartzo HP-5MS (30m×0,25mm×0,25μm), temperatura do injetor 250°C; O gás de arraste foi hélio (99,999%), a razão de divisão foi 10:1, e o volume de injeção foi 1μL. Condições espectrométricas de massas: fonte de ionização por impacto de elétrons (EI), temperatura da fonte de íons 230°C, temperatura da interface 280°C; A energia do elétron é 70 eV, a temperatura do quadrupolo é 150°C, e a faixa de varredura de massas é 20–650 Amu. Procedimento de aquecimento: a temperatura inicial é 60°C; manter por 5 min, e elevar a 280°C a uma taxa de 5°C/min. Manter por 10 minutos.
Análise de Farmacologia de Redes
A rede MCEO foi construída com os compostos do MCEO. De acordo com os resultados da análise de CG-EM, genes relacionados aos compostos do MCEO foram pesquisados com o PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) e genes alvo usando um banco de dados de compostos. Genes relacionados à psoríase foram coletados usando o GeneCards (http://www.genecards.org/) com a palavra-chave “psoríase”. Genes comuns entre a rede MCEO e o conjunto de genes relacionados à psoríase foram organizados. Uma rede de interação proteína-proteína (PPIN) foi construída com genes alvo entre MCEO e psoríase usando o banco de dados STRING (https://string-db.org/) e então visualizada pelo Cytoscape (3.9.1). O banco de dados DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) foi utilizado para realizar a análise de anotação da Ontologia Genética (GO) e a análise de enriquecimento da via da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) dos alvos. As vias KEGG e os processos GO relacionados à psoríase foram organizados, e os critérios de corte foram valor-p < 0,05.
Paciente
Recrutamento de Pacientes e Amostras
Um total de 31 pacientes com psoríase vulgar, cujos diagnósticos foram baseados no Guia para o diagnóstico e tratamento da psoríase na China (edição de 2021) e que não haviam sido tratados com agentes biológicos, foram recrutados do Hospital Popular de Taizhou (Zhejiang, China) de fevereiro de 2021 a dezembro de 2021, juntamente com 35 pacientes apresentando condições cutâneas não inflamatórias como controles (Tabela Suplementar 1).
O trabalho de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Revisão Ética em Pesquisa Humana do Hospital Popular de Taizhou (tzey-ky202101) e executado com base nos Princípios da Declaração de Helsinque. O Hospital Popular de Taizhou (Taizhou) recrutou todos os participantes deste estudo. Todos os pacientes assinaram termos de consentimento informado.
Sangue venoso estéril foi obtido por punção venosa padrão e armazenado durante a noite em geladeira a 4°C. No dia seguinte, separamos o soro centrifugando as amostras de sangue a 1500g por 15 min a 4°C. Todas as amostras de soro foram mantidas congeladas a −80 °C até a análise.
Ensaio de Citocinas Inflamatórias por Luminex em Amostra Clínica
Análise multiplex de citocinas séricas foi executada usando Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-plex (M500KCAF0Y, Bio-rad systems), medindo as concentrações de Interleucina (IL)-1β, IL-10, IL-17A, IFN-γ e Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) em uma amostra ao mesmo tempo, seguindo as instruções do fabricante.
Produtos Químicos, Anticorpos e Reagentes
Os seguintes materiais foram utilizados no presente estudo: MCEO (Jiaxing Hanjiangfangcao Bioengineering Co. Ltd., Zhangjiang, China); DMSO (20220813); FBS (10099-141C, Gibco, Austrália); meio DMEM com alta glicose (Hyclone, EUA); Penicilina-Estreptomicina (Gibco, Austrália); 0,25% tripsina-EDTA (Gibco, Austrália); TNF-α humano recombinante (R&D system, América); IL-22 humana recombinante (R&D system, América); LPS (L2630, Sigma-Aldrich, Merck); Cell Counting Kit-8 (MedChemExpress, América); iodeto de propídio (BIO BASIC INC, Canadá); PMSF, tampão de lise RIPA, kit de ensaio de proteína BCA, BeyoECL Star, tampão de diluição de anticorpo primário, kit de coloração hematoxilina e eosina (Beyotime, China); escada de proteína multicolorida pré-corada (Shanghai Epizyme Biomedical Technology, China); Anticorpos para Phospho-mTOR (Ser2448)(D9C2) Rabbit mAb #2475, mTOR (7C10) Rabbit mAb #2983, Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (D3F9) Rabbit mAb #4511, p38 MAPK (D13E1) Rabbit mAb #8690, Phospho-Akt (Ser473) (D9E) Rabbit mAb #4060, Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691, Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Rabbit mAb #4370, p44/42 MAPK (Erk1/2) (137F5) Rabbit mAb #4695, Bcl-2 (124) Mouse mAb #15071, Caspase-3 Antibody #9662, β-Actin (D6A8) Rabbit mAb (HRP Conjugate) #12620, Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076, Anti-rabbit IgG, e HRP-linked Antibody #7074 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA); Caspase-8 Antibody, Caspase-9 Antibody, Bax Antibody, Goat anti-Mouse IgG HRP (TS0002), e Goat anti-Rabbit IgG HRP (TS0001)(Abmart Technology, Xangai, China); Anti-PI 3 Kinase p85 alpha (phospho Y607)(ab182651), Anti-PI 3 Kinase p85 alpha antibody [6G10] (ab189403)(Abcam Technology, Cambridge, Inglaterra); SAv HRP (Streptavidin-Horseradish Peroxidase Pre-diluted) (51–75477E) (BD Pharmingen); PrimeScript RT Reagent Kit (Perfect Real time, TaKaRa, Japão); SYBR Green Realtime PCR MasterMix (TOYOBO, Japão); Mouse ACTB Endogenous Reference Genes Primers (B661302), e Human ACTB Endogenous Reference Genes Primers (B661102) (Sangon Biotech, China); Água tratada com DEPC e Reagente TRIzol (Ambion, América).
Experimento Celular
Cultura Celular Geral e Tratamento
Obtivemos queratinócitos HaCaT humanos imortalizados do Wuhan University Cell Bank (Wuhan, China). Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), adicionado a 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 μg/mL de estreptomicina e 100 U/mL de penicilina, foram utilizados para cultura celular. As células foram incubadas a 37°C com 5% de CO2. Utilizamos rhIL-22 (20ng/mL), rhTNF-α (10ng/mL) ou LPS (10μg/mL) para tratar as células HaCaT. Preparamos a solução estoque de MCEO em dimetil sulfóxido (DMSO, 0,1%v/v) e, de acordo com o desenho experimental, diluímos a concentração diferencial no meio para tratar as células HaCaT. As células controle foram tratadas com a mesma quantidade de DMEM (DMSO 0,1%v/v); esta concentração de DMSO não afetou a viabilidade celular.
Para o esquema de tratamento com rhIL-22/rhTNF-α/LPS com ou sem MCEO, as células HaCaT foram divididas em grupo controle normal, grupo de tratamento com rhIL-22 (24h, 20ng/mL)/rhTNF-α (24h, 10ng/mL)/LPS (1h, 10 µg/mL) e grupo de tratamento com pré-MCEO (24h) + rhIL-22 (24h)/TNF-α (24h)/LPS (1h). Primeiro, MCEO tratou as células HaCaT por 24h, e então PBS lavou as células duas vezes. Subsequentemente, rhIL-22 (20ng/mL, 24h), rhTNF-α (10ng/mL, 24h) ou LPS (10μg/mL, 1h) foram adicionados, respectivamente. As células foram colhidas e lisadas para Western blot, e qRT-PCR foi realizada conforme descrito abaixo.
Ensaio de Viabilidade Celular
O método CCK-8 foi adotado para calcular a taxa de sobrevivência celular. As células HaCaT foram cultivadas em placas de 96 poços por 24h ou 48h. As células foram colhidas após atingirem 50–60% de confluência e foram tratadas com MCEO por 24h e 48h. Solução CCK-8 (10 μL) foi adicionada a cada poço e então incubada a 37 °C com 5% de CO2 por 2h. Utilizamos Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific, EUA) para medir a absorbância a 450 nm.
Análise por Citometria de Fluxo
Células (5×105/placa) foram semeadas e aderidas em placas de cultura de 60 mm por 24h. As células foram colhidas usando tripsina após tratamento com MCEO por 24h. Utilizamos PBS para lavar as células coletadas e etanol para fixá-las a 4 °C por 2h. Incubamos as células fixadas com RNase (10μg/mL) a 37 °C por 30min. Subsequentemente, PBS lavou as células fixadas duas vezes e então as corou com iodeto de propídio (PI, 10μg/mL) por 30 min no escuro. O ciclo celular foi monitorado usando CytoFLEX (BECKMAN CULTER, CA, EUA).
Animais
Fêmeas de camundongos BALB/c (com oito a nove semanas de idade; criados sob condições específicas livres de patógenos (SPF)) foram adquiridos da Shanghai Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Xangai, China). Os camundongos foram mantidos em condições constantes de temperatura e umidade com um ciclo de 12 horas claro/escuro. Alimento e água são fornecidos livremente. Todos os esquemas experimentais foram aprovados pelos Comitês de Ética da Universidade de Taizhou (Taizhou, China) (TZXY-2022-20221027). Todos os procedimentos com animais foram conduzidos em conformidade com os Regulamentos para a Administração de Assuntos Relativos a Animais Experimentais (1988.11.1) e tratados de forma humana. Os animais foram anestesiados com isoflurano (Riward Life Science Co., Ltd, Shenzhen, China) (3% para indução; 1–3% para manutenção) em uma mistura de 0,25% de ar e 0,5% de O2.
Camundongos BALB/c foram divididos aleatoriamente em três grupos (n=6): grupo óleo de oliva (Con), grupo IMQ (IMQ) e grupo IMQ+MCEO (IMQ+MCEO). MCEO (diluição 1:10 em óleo de oliva) foi aplicado no dorso depilado por sete dias consecutivos (duas vezes ao dia, uma vez pela manhã e uma vez à tarde; 200 μL/vez/camundongo). Subsequentemente, os camundongos receberam diariamente 62,5 mg de creme IMQ comercialmente disponível (5%) (Sichuan Mingxin Pharmaceutical Co. LTD, H20030128) no dorso depilado por sete dias consecutivos, concomitantemente com o tratamento com MCEO conforme mencionado acima. O grupo controle e o grupo IMQ receberam de forma semelhante um creme controle (óleo de oliva; fagron). No oitavo dia, todos os camundongos foram eutanasiados. Amostras de soro foram coletadas, e a pele do dorso foi obtida para detecção subsequente.
Medição dos Indicadores
Pontuação da Gravidade da Inflamação da Pele
As lesões cutâneas foram avaliadas pelo Índice de Área e Gravidade da Psoríase (PASI). Calculamos a pontuação total com base em eritema, descamação e espessamento, excluindo a área de pele afetada. De acordo com a gravidade de cada item, pontuado independentemente (de 0 a 4): 0, nenhum; 1, leve; 2, geral; 3, típico; 4, muito específico. A gravidade da inflamação foi determinada pela pontuação cumulativa (eritema, descamação e espessamento) (escala 0–12).
Exame Histológico
Fixamos os tecidos da pele usando uma solução de paraformaldeído a 4% e incluímos os tecidos da pele em parafina. Após a secção dos tecidos embebidos em parafina, foi realizada a coloração com hematoxilina e eosina (H&E) para avaliação histológica. Um microscópio Olympus sob um microscópio óptico de 100× obteve imagens, e a espessura da epiderme foi calculada pelo software Image J (NIH Image, EUA).
Ensaio de PCR em Tempo Real Quantitativo (qRT-PCR)
As expressões de mRNA de IL-6, IL-1β, TGF-β, IL-10, TNF-α, IL-17A e IL-22 em células HaCaT e secções de pele foram detectadas usando o método de qRT-PCR. Usamos o reagente TRIzol® para extrair RNA e um kit de transcrição reversa (Takara Bio, Inc.) para sintetizar cDNA. A qPCR foi operada usando SYBR premixed EX Taq™ cDNA e primers de genes específicos. Usamos o sistema LightCycler480 (Roche) para amplificar os genes alvo. Usamos o gene ACTIN padronizado para determinar a quantidade de expressão relativa de cada gene, calculada pelo método 2−ΔΔCq. Os seguintes primers foram utilizados: Human IL-6-forward, 5’-GACAGCCACTCACCT CTTCAGAAC’ e reverse, 5’-CCAGGCAAGTCTCCTCATTGAATCC’; Human IL-1β-forward, 5’-TACGAATCTCCGACCACCACTACAG’ e reverse, 5’-ACACCACTTGTTGCTCCATATC CTG-3’; Human TGF-β-forward, 5’-ACTACTACGCCAAGGAGGTCACC’ e reverse, 5’-TG AGGTATCGCCAGGAATTGTTGC-3’; Human IL-10-forward, 5’-GGACAACATACTGCTAAC CGACTCC-3’ e reverse, 5’-CTTCACCTGCTCCACTGCCTTG-3’; Human IL-17A-forward, 5’-GGTGTCACTGCTACTGCTGCTG-3’ e reverse, 5’-GGTCCTCATTGCGGTGGAGATTC −3’; Human ATCB-forward, 5’-GTGCTATGT TGCTCTAGACTTCG-3’ e reverse, 5’-ATGCC ACAGGATTCCATACC-3’; Mouse IL-6-forward, 5’-CTTCTTGGGACTGATGCTGGTGAC-3’ e reverse, 5’-CTCTCTGAAGGACTCTGGCTTTGTC-3’; Mouse IL-1β-forward, 5’-TTCAGG CAGGCAGTATCACTCATTG-3’ e reverse, 5’-TGTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTAC-3’; Mouse TGF-β-forward, 5’-ACCGCAACAACGCCATCTATGAG-3’ e reverse, 5’-AGCCCTG TATTCCGTCTCCTTGG-3’; Mouse IL-10-forward, 5’-GGACAACATACTGCTAACCGACTC C-3’ e reverse, 5’-CTTCACCTGCTCCACTGCCTTG-3’; Mouse TNF-α-forward, 5’-CACCA CGCTCTTCTGTCTACTGAAC-3’ e reverse, 5’-TGACGGCAGAGAGGAGGTTGAC-3’; Mouse IL-17A -forward, 5’-TGATGCTGTTGCTGCTGCTGAG-3’ e reverse, 5’-GGTCTTCA TTGCGGTGGAGAGTC-3’; Mouse ATCB-forward, 5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’, e reverse, 5’-GGGCCGGACTGCTCATAC-3’
Análise de Western Blot
As proteínas foram extraídas de células HaCaT, depois resolvidas por SDS-PAGE a 8 ou 10%, transferidas para membranas de PVDF (EMD Millipore). Após bloqueio das membranas com leite seco desnatado a 5%, foi incubado durante a noite com anticorpos primários contra Bax, Caspase 8, Caspase 9 (1:1000; Abmart); Caspase 3, Bcl-2, p-mTOR/mTOR, p-P38/P38, β-actina, p-P44/42/P44/42 e GAPDH (1:1000; CST); p-PI3K/PI3K (1:500; Abcam). Usamos IgG anti-coelho conjugado com HRP ou IgG anti-camundongo conjugado com HRP (1:8000; Abmart Biological Reagents Co., Ltd.) como anticorpos secundários para marcar os anticorpos acima.
Estudos de Imunofluorescência (IF)
Células HaCaT (2×104/poço) foram inoculadas em uma placa de vidro de 4 poços e submetidas à marcação direta por IF de p-Akt/Akt (1:200), p-P38/P38 (1:200) e p-mTOR/mTOR (1:100), seguidas de incubação com anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor 488 (OriGene Technologies, Inc.). DAPI (Beyotime Biotechnology, Inc.) foi usado para contracoloração dos núcleos. Usamos um microscópio confocal de varredura a laser (IX-83 FV1000; Olympus Corporation) para verificar a secção da marcação e obter as imagens.
Ensaio de Citocinas Inflamatórias por Luminex em Camundongos com Inflamação Cutânea Semelhante à Psoríase
Amostras de sangue foram coletadas de camundongos dos grupos Con, IMQ e IMQ+MCEO. O soro separado foi armazenado a -80°C. O Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 1 6plx EXP (17007935, Bio-rad systems) foi utilizado para analisar as concentrações de IL-1β, IFN-γ, IL-10, IL-17A e TNF-α em uma mesma amostra simultaneamente, seguindo as instruções do fabricante.
Análise Estatística
Analisamos todos os dados utilizando o GraphPad Prism versão 8.0 (GraphPad Software, Inc. CA, EUA). Todos os indicadores são representados como média ± desvio padrão, utilizando ANOVA de uma via ou teste t de Student não pareado bicaudal para calcular a diferença. Os valores de P foram ajustados para comparações múltiplas usando a correção de Bonferroni. Valores com P<0,05 foram definidos como estatisticamente significativos.
Resultados
Análise da Composição do Óleo Essencial de Matricaria Chamomilla
Composição do Óleo Essencial de Matricaria chamomilla
Pico Compostos Área do Pico (%) Tempo de Retenção (Min) 1 Benzeno,1,2,3,5-tetrametil- 0,97 13,205 2 1,3,6-Octatrieno, 3,7-dimetil- 5,70 14,698 3 Biciclo[4.1.0]hept-3-eno, 3,7,7-trimetil-, (1S)- 0,7 14,964 4 Triciclo[2.2.1.0(2,6)]heptano, 1,7,7-trimetil- 0,93 15,402 5 Bisabolol 0,409 23,32 6 1,5,5-Trimetil-6-metileno-ciclohexeno 1,76 28,452 7 Isocariofileno 13,82 37,269 8 Cedreno 10,37 38,595 9 1H-Cicloprop[e]azulen-7-ol, deca-hidro-1,1,7-trimetil-4-metileno-, [1ar-(1a.alfa.,4a.alfa.,7.beta.,7a.beta.,7b.alfa.)]- 29,16 40,181 10 Naftaleno, 1,2,3,5,6,8a-hexa-hidro-4,7-dimetil-1-(1-metiletil)-, (1S-cis)- 17,95 42,909 11 (E,Z)-.alfa.-Farneseno 13,25 43,883 12 Azuleno, 7-etil-1,4-dimetil- 88,90 46,795 13 Ciclohexanol, 2-metil-5-(1-metiletenil)-, (1.alfa.,2.alfa.,5.beta.)- 15,23 47,585 14 Ácido n-hexadecanoico 18,99 53,052 15 Dodecano 15,96 67,780
Os componentes do óleo essencial de Matricaria chamomilla foram analisados pelo método de GC-MS, que incluiu principalmente 15 componentes (Tabela 1). Entre eles, o Azuleno representou a maior quantidade, cerca de 88,9%.
Análise de Farmacologia de Rede
Análise de farmacologia de rede. (A) Diagrama de Venn dos genes de interseção entre MCEO e psoríase; (B) PPIN foi construída com genes alvo entre MCEO e psoríase; (C) Análise GO dos genes de interseção entre MCEO e psoríase; (D) Análise KEGG dos genes de interseção entre MCEO e psoríase.
Para explorar a relação entre o componente ativo do MCEO e a psoríase, os 12 componentes do MCEO foram analisados com o PubChem. Os genes de interseção correspondentes aos alvos do MCEO e da psoríase foram recuperados usando o banco de dados GeneCards. A rede de interação proteína-proteína (PPIN) “Drug-target-disease” foi construída usando o banco de dados STRING. Análises de enriquecimento GO e KEGG dos genes comuns entre MCEO e psoríase foram realizadas para estudo adicional. Como mostrado na Figura 1A, 130 termos sobre MCEO e psoríase foram incluídos, e a PPIN foi obtida usando um gene comum entre MCEO e psoríase (Figura 1B). De acordo com a análise GO de função molecular (Figura 1C), os alvos ativos estão conectados à resposta inflamatória e transdução de sinal. A análise KEGG incluiu a via de sinalização PI3K/Akt, via de sinalização MAPK e diferenciação de células Th17 (Figura 1D). Esses resultados orientaram ensaios adicionais de resposta inflamatória e regulação de vias de sinalização.
Análise do Fenótipo Inflamatório em Pacientes Psoriáticos
Para esclarecer a característica de expressão de citocinas inflamatórias em pacientes psoriáticos, coletamos amostras de sangue de 35 indivíduos saudáveis e 31 pacientes com psoríase vulgar e detectamos os níveis de IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-10 e IL-17A no sangue periférico por Luminex (Tabela Suplementar 1). Nossos resultados mostraram que os níveis de fatores inflamatórios relativos pareceram aumentar no sangue periférico dos pacientes, exceto pela IL-10 (Tabela Suplementar 1), que cresceu gradualmente com o prolongamento do curso da psoríase, exceto pela IL-10 (Figura Suplementar 1).
Verificação Regulada por Medicamento in vitro
Efeito do MCEO na Viabilidade das Células HaCaT
O tratamento com MCEO não teve efeito significativo no crescimento e viabilidade dos queratinócitos HaCaT. Números relativos de HaCaT viáveis tratados com ou sem MCEO (30–80 mg/mL) por 24 h (A) e 48 h (B) conforme determinado pelo ensaio CCK8. Porcentagem média de viabilidade de HaCaT plotada em relação às doses indicadas de MCEO. Os experimentos foram realizados três vezes com cada concentração em triplicata, e os valores de IC50 calculados a partir desses gráficos são mostrados.
A viabilidade das células HaCaT tratadas com MCEO por 24h e 48h foi testada usando o ensaio CCK-8. O MCEO não mostrou toxicidade óbvia após o tratamento, com concentrações variando de 30–60 μg/mL por 24h e 48h. Uma redução marcante na atividade das células HaCaT foi descoberta após o tratamento das células com MCEO em concentrações acima de 63,18 µg/mL por 24h e 82,66 µg/mL por 48h (Figura 2A e B).
Efeito do MCEO no Ciclo Celular e Apoptose em HaCaT
Efeitos do MCEO na porcentagem da população celular em diferentes fases do ciclo celular e na expressão de marcadores de apoptose. (A) Histograma e diagrama de colunas mostram os níveis ou porcentagens de distribuição das células tratadas com MCEO com base no ciclo celular, avaliado por análise de citometria de fluxo. (B) Níveis de expressão das proteínas caspase 3, caspase 8, caspase 9 e Bax, avaliados por Western blotting. A igualdade na carga proteica foi confirmada usando β-actina como controle de carga. Os gráficos de barras representam a média ± DP dos resultados obtidos em três experimentos independentes realizados em triplicata. *P<0,05 **P<0,01 vs. NC.
Para explorar se o efeito do MCEO na viabilidade celular estava correlacionado com a parada do ciclo celular ou apoptose, utilizamos análise citométrica de fluxo para medir a porcentagem de células contendo níveis diploides (sub-G1) de DNA por coloração com PI. Utilizamos diferentes concentrações de MCEO (30, 50, 60 e 70 µg/mL) para tratar HaCaT. O tratamento com 50 µg/mL e 60 µg/mL de MCEO aumentou a proporção de HaCaT na fase G1 (60,4±2,46% e 67,0±5,58%, respectivamente) em comparação com o controle normal (0 µg/mL) (41,3±2,7%)(P<0,01) (Figura 3A). A análise por Western blot (WB) revelou que, na concentração de 60 µg/mL, o tratamento com MCEO por 24h induziu a expressão da proteína apoptótica caspase 9 em células HaCaT. Na concentração de 50 µg/mL, o tratamento com MCEO por 24h não induziu apoptose em HaCaT, conforme evidenciado pela expressão das Caspases 3, 8 e 9, e pelos níveis da proteína Bax (Figura 3B).
O MCEO Regula a Proliferação e Inflamação Induzidas por IL-22 em HaCaT ao Inibir a Via PI3K/Akt/mTOR
O MCEO regula a proliferação induzida por IL-22 em HaCaT ao inibir a via PI3K/Akt/mTOR. (A) Células HaCaT tratadas com ou sem IL-22 e MCEO foram submetidas a Western blotting utilizando anticorpos específicos contra p-Akt, Akt, p-mTOR e mTOR. (B) Os níveis de expressão de mRNA de IL-6 e IL-1β foram analisados por qRT-PCR. (C) Células HaCaT tratadas com ou sem IL-22 e MCEO foram coradas com p-Akt, Akt, p-mTOR e mTOR e avaliadas por imunofluorescência. p-Akt, Akt, p-mTOR e mTOR (verde), núcleos (azul). Magnificação, ×2070. Os gráficos de barras representam a média ± DP dos resultados derivados de três experimentos independentes realizados em triplicata. **P<0,01 vs NC; #P<0,05 e ##P<0,01 vs grupo IL-22.
Nos últimos anos, os mecanismos imunológicos e patológicos foram esclarecidos, nos quais as células Th17 produzem várias citocinas, como IL-17 e IL-22, que podem induzir proliferação, migração ou invasão de queratinócitos, liberando um potencial papel na patogênese da psoríase. A IL-22 também pode ativar a via Akt/mTOR. A via PI3K/Akt/mTOR regula positivamente a diferenciação de Th17 ao promover a translocação nuclear de RORγt. Assim, medimos a expressão dos mRNAs de IL-6, IL-1β, IL-17A, IL-10 e TGF-β por qRT-PCR (Figura 4B, alguns dados inalterados não foram mostrados). O tratamento com MCEO diminuiu os níveis de mRNAs de IL-6 e IL-1β nas células HaCaT em comparação com os observados no grupo de tratamento com IL-22, conforme demonstrado por qRT-PCR (P<0,01; P<0,01). No entanto, o tratamento com MCEO não alterou a expressão do mRNA de IL-17A nas HaCaT. Para esclarecer o efeito anti-inflamatório exercido pelo MCEO, a expressão das proteínas PI3K, Akt e mTOR foi detectada por WB e IF em HaCaT tratadas com IL-22 (20ng/mL) por 24h após pré-tratamento com MCEO por 24h (Figura 4A e C). Os dados mostraram que o tratamento com MCEO suprimiu significativamente o aumento mediado por IL-22 na expressão das proteínas p-Akt (em Ser473) e p-mTOR (em Ser2448) em comparação com o grupo controle, conforme avaliado por WB e IF (P<0,05; P<0,01).
O MCEO Regula a Inflamação Induzida por TNF-α ao Inibir a Via de Sinalização PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK
O MCEO regula a inflamação induzida por TNF-α ao inibir as vias de sinalização PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK. (A) Células HaCaT tratadas com ou sem TNF-α e MCEO foram submetidas a Western blotting usando anticorpos específicos contra p-P38, P38, p-mTOR e mTOR. (B) Os níveis de expressão de mRNA de IL-6, IL-1β, IL-17A, IL-10 e TGF-β foram analisados por qRT-PCR. (C) Células HaCaT tratadas com ou sem TNF-α e MCEO foram coradas com p-Akt, Akt, p-mTOR e mTOR, e a imunofluorescência foi avaliada. p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR (verde), núcleos (azul). Ampliação, ×2070. Os gráficos de barras representam a média ± DP dos resultados derivados de três experimentos independentes realizados em triplicata. **P<0,01 vs NC; #P<0,05 e ##P<0,01 vs grupo TNF-α.
O TNF-α é considerado uma citocina chave que media a inflamação da pele durante o processo de desenvolvimento da psoríase. Ele pode acelerar a infiltração de linfócitos, monócitos e neutrófilos, ativados por células dendríticas e transferidos do sangue periférico para a pele. Isso está relacionado à ativação das vias Akt/mTOR e p38 MAPK. Células HaCaT foram pré-tratadas com 50µg/mL de MCEO por 24h antes da estimulação com 10ng/mL de rhTNF-α. Medimos a expressão dos mRNAs de IL-6, IL-1β, IL-17A, IL-10 e TGF-β por qRT-PCR (Figura 5B, alguns dados não alterados não foram mostrados). Simultaneamente, a ativação das vias PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK foi detectada por WB e IF (Figura 5A e C). Nossos resultados esclareceram que o tratamento com TNF-α aumentou a expressão dos mRNAs de IL-1β e TGF-β e das proteínas p-Akt, p-mTOR e p-P38 em comparação com o grupo controle (P<0,05; P<0,01). No entanto, o pré-tratamento com MCEO por 24h inibiu marcadamente esses efeitos mediados pelo TNF-α em HaCaT. Os resultados esclareceram que o MCEO possui um impacto anti-inflamatório específico, que está correlacionado com a regulação negativa da ativação das vias Akt/mTOR e p38MAPK.
O MCEO Regula a Inflamação Induzida por LPS ao Inibir as Vias de Sinalização PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK
O MCEO regula a inflamação induzida por LPS ao inibir as vias de sinalização PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK. (A) Células HaCaT tratadas com ou sem LPS e MCEO foram submetidas a Western blotting usando anticorpos específicos contra p-Akt, Akt, p-P38, P38, p-mTOR e mTOR. (B) Os níveis de expressão de mRNA de IL-6, IL-1β, IL-17A, IL-10 e TGF-β foram analisados por qRT-PCR. (C) Células HaCaT tratadas com ou sem LPS e MCEO foram coradas com p-P38, P38, p-mTOR e mTOR, e a imunofluorescência foi avaliada; p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR (verde), núcleos (azul). Ampliação, ×2070. Os gráficos de barras representam a média ± DP dos resultados derivados de três experimentos independentes realizados em triplicata. **P<0,01 vs NC; ##P<0,01 vs grupo TNF-α.
Culturas celulares estimuladas com LPS são rotineiramente usadas para elucidar mecanismos de imunidade molecular, e um modelo para avaliar as propriedades anti-inflamatórias de novos agentes foi desenvolvido. Em nosso estudo, usamos LPS (10μg/mL, 1h) para estimular células HaCaT pré-tratadas com 50µg/mL de MCEO por 24h. Em seguida, detectamos a expressão dos mRNAs de IL-6, IL-1β, IL-17A, IL-10 e TGF-β por qRT-PCR (Figura 6B, alguns dados não alterados não foram mostrados). Ao mesmo tempo, a atividade das vias PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK foi monitorada por WB e IF (Figura 6A e C). Nossos resultados esclareceram que o tratamento com LPS aumentou os níveis de mRNA de IL-6 e IL-1β e das proteínas p-Akt, p-mTOR e p-P38 em comparação com o observado no controle normal (P<0,01). No entanto, esses efeitos induzidos por LPS foram marcadamente suprimidos após o pré-tratamento com MCEO por 24h. Os resultados esclareceram que o MCEO possui um impacto anti-inflamatório específico, que está correlacionado com a regulação negativa da atividade das vias Akt/mTOR e p38MAPK.
Verificação da Regulação do Fármaco in vivo
MCEO Melhora a Inflamação Cutânea Semelhante à Psoríase Induzida por IMQ em Camundongos
O MCEO melhora a lesão cutânea semelhante à psoríase em camundongos induzidos por IMQ. (A) Camundongos foram pré-tratados com MCEO diariamente por sete dias consecutivos, seguido pelo tratamento com MCEO + IMQ diariamente por sete dias consecutivos e observação no oitavo dia. (B) Fotos da pele dorsal dos camundongos foram capturadas no oitavo dia após administração diária de IMQ+MCEO. (C) Os escores cumulativos de PASI de todos os grupos também foram calculados diariamente. (D) Coloração por H&E da pele dorsal (aumento: 100×, 400×), a distância entre as setas vermelhas representa a espessura da acantoderme e (E) espessura epidérmica da pele dorsal no oitavo dia (barra de escala: 100 μm). Os dados são apresentados como média ± DP (n=6), **P<0,01 e ***P<0,001 vs grupo modelo de psoríase. ##P<0,01 vs grupo IMQ+MCEO. Um representante de três experimentos separados é mostrado.
Para determinar a função do MCEO na inflamação cutânea, utilizamos um modelo de inflamação cutânea semelhante à psoríase induzida por IMQ em camundongos BALB/c, que foram tratados com ou sem MCEO (Figura 7A). Em comparação com o grupo IMQ, o tratamento com MCEO (16mg/vez/camundongo) aliviou os sintomas clínicos da dermatite psoriasiforme induzida por IMQ, incluindo eritema, espessamento e descamação (Figura 7B). A coloração por HE mostrou que o tratamento com MCEO melhorou significativamente as alterações histológicas mediadas por IMQ em comparação com aquelas observadas no grupo IMQ não tratado com MCEO (Figura 7D). Os escores de PASI no grupo IMQ+MCEO foram consistentemente menores do que no grupo IMQ (Figura 7C), enquanto o grupo IMQ apresentou maior espessamento epidérmico do que o observado no grupo IMQ+MCEO (Figura 7E).
O MCEO Regula a Inflamação Cutânea Induzida por IMQ ao Inibir as Vias de Sinalização PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK em Camundongos
Mecanismo do MCEO na melhora da inflamação cutânea semelhante à psoríase em camundongos induzidos por IMQ. (A) Os níveis de expressão de p-PI3K/PI3K, p-mTOR/mTOR e p-P38/P38 na pele de camundongos com psoríase foram analisados oito dias após o tratamento com MCEO por WB. (B) Os níveis de expressão de mRNA de IL-6, IL-1β, IL-17A, IL-10 e TGF-β na pele de camundongos com psoríase foram analisados oito dias após o tratamento com MCEO por qRT-PCR. (C) Os níveis de IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-17A no soro de camundongos com psoríase foram analisados oito dias após o tratamento com MCEO por Luminex. Os dados são apresentados como média ± DP (n=6), **P<0,01 e *P<0,05 vs grupo modelo de psoríase. #P<0,05 e ##P<0,01 vs grupo IMQ+MCEO. Um representante de três experimentos separados é mostrado.
Pesquisas comparativas esclareceram que a ativação das vias de sinalização PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK está correlacionada com a inflamação da pele. Neste estudo, a ativação da via PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK foi detectada por WB (Figura 8A), e os níveis de mRNA de IL-6, IL-1β, TNF-α, IL-17A, IL-10 e TGF-β foram analisados por qRT-PCR nos tecidos cutâneos de camundongos BALB/c (Figura 8B, alguns dados inalterados não foram mostrados). Para confirmar ainda mais os níveis de citocinas inflamatórias em camundongos com dermatite psoriasiforme induzida por IMQ, IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-17A e IL-10 foram detectados por Luminex no soro de camundongos BALB/c (Figura 8C). Nossos dados mostram que o pré-tratamento com MCEO reduziu as expressões das proteínas p-PI3K/PI3K, p-mTOR/mTOR, p-P38/P38 e p-ERK1/2/ERK1/2 em camundongos com inflamação cutânea. Ao mesmo tempo, descobrimos que a expressão dos mRNAs de IL-6, IL-1β, TNF-α, IL-10 e TGF-β no tecido cutâneo e os níveis de IL-1β, TNF-α e IFN-γ no soro foram reduzidos pelo pré-tratamento com MCEO. Esses resultados sugerem que o MCEO melhora a inflamação cutânea psoriasiforme induzida por IMQ em camundongos, o que está associado à inibição da ativação das vias de sinalização PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK.
Discussão
Nesta pesquisa, primeiro analisamos os componentes do MCEO por GC-MS; os genes de intersecção correspondentes aos alvos do MCEO e da psoríase foram recuperados usando o banco de dados GeneCards. As análises de enriquecimento GO e KEGG do MCEO para psoríase descobriram que os alvos ativos estavam essencialmente conectados à resposta inflamatória e à transdução de sinal, intimamente correlacionados com a via de sinalização PI3K/Akt, a via de sinalização MAPK e a diferenciação de células Th17 (Figura 1). Esses resultados orientaram ensaios adicionais de regulação de citocinas e vias. Em seguida, avaliamos os níveis de citocinas inflamatórias relativas em pacientes psoriáticos para definir alvos potenciais para os efeitos anti-inflamatórios do MCEO em humanos. Verificamos pela primeira vez o efeito anti-inflamação do MCEO em experimentos in vitro e in vivo de acordo com os resultados preditivos da farmacologia de redes. Os dados mostraram que o pré-tratamento com MCEO inibiu a inflamação dos queratinócitos humanos HaCaT induzida por TNF-α, IL-22 e LPS, o que estava, pelo menos em parte, correlacionado com a regulação da atividade da via PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK.
Além disso, o MCEO exerceu efeitos favoráveis na dermatite psoriática induzida por IMQ em camundongos BALB/c, refletidos principalmente na remissão de eritema, espessamento, endurecimento e descamação, e no alívio da lesão cutânea geral. O MCEO reduziu os níveis de IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-10, mas não de IL-17A. Esses resultados indicaram que o MCEO mostrou grande valor na prevenção e tratamento da psoríase. Além disso, o MCEO, combinado com diferentes fármacos vegetais anti-inflamatórios com alvos específicos, pode se tornar uma estrela no tratamento da inflamação cutânea psoriática. Embora o mecanismo específico de ação precise ser investigado mais a fundo, o MCEO pode ser um excelente agente para o tratamento da inflamação cutânea psoriasiforme.
Psoríase é uma doença autoimune; no entanto, sua patogênese exata permanece desconhecida. Atualmente, medicamentos sintéticos são comumente usados para tratar a psoríase, seja por injeção sistêmica ou administração tópica. No entanto, a aplicação de medicamentos sintéticos mostra muitos efeitos colaterais graves nos pacientes. Como resultado, novos medicamentos botânicos naturais, mais seguros e eficazes, têm despertado o interesse significativo de pesquisadores em todo o mundo. Plantas e seus metabólitos secundários têm uma vantagem única na descoberta de potenciais agentes antipsoríase. Além disso, plantas medicinais são fáceis de obter e são baratas e eficazes. O tratamento da psoríase depende delas globalmente. Matricaria chamomilla, um tipo de planta aromática antiga da família Asteraceae, cujo óleo volátil base, mostrou efeitos potentes em cosméticos, incluindo a eliminação de inflamação e irritação da pele e a redução da vermelhidão cutânea. Óleos essenciais são uma mistura natural complexa de metabólitos secundários voláteis isolados de plantas. Os principais componentes dos óleos essenciais são os terpenos, e os terpenos foram extensivamente estudados por suas propriedades anti-inflamatórias. O MCEO exibe uma vantagem única na cicatrização de feridas e reparo da barreira cutânea, o que está relacionado às suas propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e antibacterianas. Existem muitos tipos de ingredientes na camomila, como éter cíclico, flavonoides e óleo volátil total, que podem inibir o crescimento de fungos. Além disso, polissacarídeos nas inflorescências também mostraram efeitos anti-inflamatórios significativos, e o MCEO também demonstra efeitos antieczema. Infelizmente, o mecanismo específico e os ingredientes ativos funcionais do MCEO em dermatologia permanecem não elucidados.
A farmacologia de redes é uma nova estratégia para estudar sistematicamente a relação entre doenças, medicamentos e alvos. O MCEO inclui 16 componentes (Tabela 1). Obtivemos 130 genes de rede do MCEO combinados com o conjunto de genes da psoríase de acordo com os resultados da análise de GC-MS. A rede PPIN do MCEO foi posteriormente analisada com o Cytoscape para explorar as vias relacionadas à psoríase. A análise de rede usando a rede de compostos do MCEO e o conjunto de genes da psoríase demonstrou que o possível mecanismo molecular do MCEO estava altamente associado às vias de sinalização PI3K/Akt, MAPK e diferenciação de células Th17 (Figura 1).
Inflamação é uma das características patológicas importantes da psoríase. Nosso estudo utilizou amostras clínicas de pacientes para analisar o fenótipo inflamatório, incluindo IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-17A. Os níveis de citocinas inflamatórias aumentaram gradualmente com o prolongamento do curso da psoríase, mas não a IL-10 (Tabela Suplementar 1)(Figura Suplementar 1). A citocina IL-10 é um mediador anti-inflamatório fundamental que protege o hospedeiro da reação excessiva a patógenos e ao microbioma, enquanto desempenha um papel importante em outros contextos, como cicatrização estéril de feridas, autoimunidade, câncer e homeostase. Talvez a regulação negativa das citocinas anti-inflamatórias também seja uma causa da resposta inflamatória aumentada em pacientes com psoríase. Esses resultados indicaram que a inflamação é um fator determinante durante o progresso da psoríase. Portanto, a terapia anti-inflamatória tornou-se um ponto de entrada eficaz para explorar novos medicamentos terapêuticos.
Até agora, nenhuma pesquisa relativa analisou o efeito do MCEO na inflamação em queratinócitos. Primeiro, confirmamos a concentração ideal de MCEO e analisamos sua função na viabilidade e no ciclo celular das células HaCaT por CCK8 e citometria de fluxo. Nossos dados descobriram que MCEO (50µg/mL e 60µg/mL) não teve efeito citotóxico sobre HaCaT. Posteriormente, detectamos a expressão de proteínas apoptóticas relativas em células HaCaT tratadas com MCEO (Figuras 2 e 3). A expressão da proteína caspase 9 aumentou visivelmente em células HaCaT tratadas com MCEO (60µg/mL). Nosso objetivo foi eliminar efeitos de fundo para elucidar os mecanismos do MCEO subjacentes aos efeitos anti-inflamatórios. Portanto, selecionamos 50µg/mL de MCEO para experimentos subsequentes.
Utilizamos citocinas IL-22, TNF-α e LPS para estimular células HaCaT e estabelecer um modelo in vitro de queratinócitos inflamatórios. Neste estudo, a expressão de mRNA das citocinas IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-17A, TGF-β e IL-10 foi analisada por qRT-PCR. O tratamento com MCEO diminuiu significativamente os mRNAs de IL-1β, IL-6 e TGF-β induzidos pela estimulação com IL-22, TNF-α e LPS (Figuras 4B, 5B e 6B). Além disso, IL-22 pode ativar a via Akt/mTOR, TNF-α induz inflamação e o recrutamento de células imunes, o que está relacionado à ativação da via MAPK/Akt. Liu et al descobriram que LPS pode atuar como um simulador, induzindo a produção de citocinas inflamatórias em células HaCaT, o que está relacionado à indução da fosforilação de p38MAPK. A p38MAPK participa de um amplo espectro de respostas celulares induzidas por estímulos externos. Estímulos externos incluem fatores pró-inflamatórios e estresse, que medeiam a liberação de citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-1, IL-8 ou TNF-α. Consistentemente, nossos resultados esclareceram que o tratamento com MCEO reduziu a inflamação ao controlar a atividade das vias PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK e bloquear a entrada de p-mTOR e p-P38 no núcleo em células HaCaT induzidas por IL-22/TNF-α/LPS (Figuras 4, 5 e 6).
Inflamação em dermatologia está intimamente relacionada ao eixo de sinalização PI3K/AKT/mTOR, que está altamente associado à patogênese de distúrbios cutâneos. A via mTOR em doenças cutâneas patogênicas talvez participe do cruzamento de sinalização com outras vias de sinalização direta ou indiretamente, como MAPK, PTEN, AMPK e PKC. Consistentemente, também descobrimos que MCEO regulou de forma cruzada a ativação entre as vias PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK, o que suprimiu a inflamação de queratinócitos HaCaT, talvez por meio de citocinas relacionadas.
Desde 2009, o camundongo com inflamação cutânea semelhante à psoríase induzida por IMQ tem sido amplamente utilizado em estudos pré-clínicos de psoríase. Pesquisadores geralmente utilizam esse modelo animal para estudar a eficácia, o mecanismo molecular e a via de absorção de novos fármacos. O IMQ foi aplicado na pele dos camundongos para induzir sintomas semelhantes à psoríase. Muitos sintomas clínicos foram semelhantes à psoríase, incluindo erupção cutânea, escamas, hiperplasia da epiderme e infiltração de células inflamatórias nos camundongos modelo, que foram detectados. O pré-tratamento com MCEO amenizou significativamente esses sintomas (Figura 7A e B). Os escores PASI e a coloração H&E do tecido cutâneo mostraram que o tratamento com MCEO aliviou as lesões cutâneas dos camundongos BALB/c induzidos por IMQ (Figura 7C e D). Além disso, o tratamento com MCEO reduziu os níveis de IL-1β, TNF-α, IFN-γ e TGF-β, mas não de IL-17A, em camundongos com inflamação cutânea induzida por IMQ, conforme avaliado por ensaio de qRT-PCR e Luminex, correlacionando-se com a inibição da atividade das vias PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK (Figura 8A e B). Portanto, consideramos que o MCEO poderia amenizar a inflamação cutânea em camundongos com inflamação cutânea semelhante à psoríase induzida por IMQ, o que está envolvido na regulação negativa da atividade das vias PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK. Wang et al. descobriram que o óleo volátil de camomila-alemã regulava as subpopulações linfocitárias T para inibir a via de sinalização de diferenciação das células Th17, resultando em uma redução da interleucina 17 (IL-17), inibindo assim a ativação das vias NF-κB e MAPK, diminuindo a secreção dos fatores pró-inflamatórios TNF-α e IL-6 e reduzindo a inflamação. Além disso, extrato além do efeito anti-inflamatório dos extratos de Matricaria chamomilla, descobrimos que o extrato aquoso de MC tem efeitos como desequilibrar a relação Th1/Th2 para a regulação positiva de Th1. Curiosamente, a literatura acumulada esclareceu que o eixo IL-17/T-helper 17 (Th17), uma citocina pró-inflamatória bem estabelecida, está envolvido na fisiopatologia da psoríase. Detectamos o nível de IL-17A em amostras de pacientes clínicos por Luminex e descobrimos que o nível de secreção de IL-17A aumentou gradativamente com a prolongação do curso da doença (Figura Suplementar 1). Não encontramos a tendência de alteração do mRNA de IL-17A em células HaCaT tratadas com TNF-α, IL-22 e LPS em comparação com células controle normais. No entanto, no modelo de camundongos com inflamação cutânea semelhante à psoríase, observamos apenas que o nível de produção de IL-17A no soro aumentou.
O tratamento com MCEO reduziu significativamente a expressão de IL-1β, IFN-γ e TNF-α no tecido cutâneo e no soro, mas não de IL-17A. Esse fenômeno indica que a produção de IL-17A não está associada à ativação das vias de sinalização PI3K/Akt ou MAPK. A forma como o MCEO regula negativamente a resposta inflamatória não afeta a expressão de IL-17A. Existem relatos de que inibidores de IL-17 (ixequizumabe e secuquinumabe) são utilizados como fármacos de primeira linha no tratamento da psoríase. De acordo com a experiência clínica e relatos relacionados, o direcionamento da IL-17A obteve alguns efeitos terapêuticos surpreendentes na psoríase. Ho et al. descobriram que o ácido rosmarínico, um extrato vegetal natural, é um inibidor direcionado à IL-17A que pode bloquear o eixo IL-17A/IL-17RA para melhorar a inflamação cutânea psoriásica em camundongos. Essas novas descobertas nos trazem uma nova revelação: a combinação de fármacos vegetais anti-inflamatórios com diferentes alvos pode ser selecionada, o que pode representar uma nova abordagem potencial para o tratamento da psoríase no campo futuro da terapia da psoríase.
Deve-se mencionar que o Azuleno é um dos principais componentes do MCEO, que tem sido reconhecido por sua aplicação na terapia medicamentosa contra inflamações. O Azuleno é um desses compostos cujo potencial anti-inflamatório foi demonstrado por estudos anteriores, mas uma análise detalhada de seu efeito a nível celular em termos de produção de citocinas pró-inflamatórias ainda não foi estudada. Nos experimentos a seguir, investigaremos o efeito anti-inflamatório do Azuleno em células HaCaT in vitro e na inflamação cutânea psoriasiforme induzida por IMQ.
Conclusão
No presente estudo, descobrimos primeiramente que o MCEO, um óleo vegetal, possui uma vantagem natural em termos de reparo da barreira cutânea, cujo tratamento inibe a inflamação em queratinócitos HaCaT, os mecanismos potenciais correlacionados com a ativação e interação das vias PI3K/Akt/mTOR e p38MAPK. Além disso, o MCEO melhora as lesões cutâneas em camundongos com inflamação cutânea psoriasiforme induzida por IMQ, reduzindo os níveis de citocinas inflamatórias.
Encontrar agentes novos, seguros e potenciais a partir de plantas naturais para o tratamento de distúrbios inflamatórios da pele é uma estratégia inovadora para pesquisas futuras. Fármacos vegetais anti-inflamatórios com diferentes alvos e aplicações combinadas representam uma estratégia terapêutica potencial na psoríase. Nossas novas descobertas fornecem uma base experimental e teórica suficiente para a aplicação clínica do MCEO.
Aprovação Ética e Consentimento para Participação
O estudo em humanos foi aprovado pelo Comitê de Revisão Ética em Pesquisa Humana do Segundo Hospital Popular de Taizhou (tzey-ky202101). Os estudos com animais foram aprovados pelos Comitês de Ética da Universidade de Taizhou (Taizhou, China) (TZXY-2022-20221027).
Declaração
Os autores declaram não haver conflitos de interesse para este trabalho.
Referências
Atualização sobre a etiopatogênese da psoríase (Revisão)
Psoríase: mecanismos patológicos, terapias farmacológicas atuais e sistemas de administração de medicamentos emergentes
A metotrexato deve permanecer como medicamento de primeira linha para psoríase?
Terapias biológicas antigas e novas para psoríase
Milagres de fitomedicamentos fitoterápicos no tratamento de distúrbios cutâneos: perspectiva natural de cuidados com a saúde
Agentes antipsoríase de fontes vegetais naturais
Camomila: uma revisão de seus usos tradicionais, constituintes químicos, atividades farmacológicas e estudos de controle de qualidade
Efeitos anti-inflamatórios e de reparo da barreira cutânea da aplicação tópica de alguns óleos vegetais
Extrato metanólico de camomila mitiga a inflamação do intestino delgado e o excesso de ROS relacionado à infecção por nematoides intestinais em camundongos
Efeitos anti-inflamatórios e estabilizadores da barreira do extrato de Mirra, carvão de café e flor de camomila em um modelo de cocultura celular da mucosa intestinal
Marham-Mafasel diminui a inflamação articular e a expressão do gene IL-1β em um modelo animal de artrite reumatoide
Suposto efeito antidepressivo do extrato oral de camomila (Matricaria chamomilla L.) em indivíduos com transtorno de ansiedade generalizada comórbido e depressão
Combinação poli-herbácea para cicatrização de feridas: Matricaria chamomilla L. e Punica granatum L.
Atividades biológicas in vitro e in vivo de derivados de azuleno com potenciais aplicações na medicina
O mecanismo de ação da camomila-alemã (Matricaria recutita L.) no tratamento de eczema: baseado em farmacologia de rede com coeficiente de peso dose-efeito
Uma composição da medicina tradicional chinesa para cosméticos com proteção solar contendo calêndula
Um tipo de líquido reparador de extrato vegetal composto e seu método de preparação
Composição antiviral da medicina tradicional chinesa e sua aplicação
Óleo essencial das folhas de Abies holophylla alivia a rinite alérgica com base em farmacologia de rede
Uma abordagem integrada baseada em fitoquímica, farmacologia de rede e metabolômica revela o mecanismo de ação de Xanthium strumarium L. para rinite alérgica
Patogênese da psoríase e desenvolvimento de tratamento
Circ_0061012 contribui para a proliferação, migração e invasão induzidas por IL-22 em queratinócitos através do eixo miR-194-5p/GAB1 na psoríase
Psoríase: progresso recente em terapias direcionadas a moléculas
Gipenosídeo IX suprime a ativação da via de sinalização p38 MAPK/Akt/NFkappaB e respostas inflamatórias em astrócitos estimulados por mediadores pró-inflamatórios
A proliferação celular induzida por IL-22 é regulada pela cascata de sinalização PI3K/Akt/mTOR
Inibidores de TNF para psoríase
Rotundarpene inibe a ativação das vias Akt, mTOR e NF-kappaB induzida por TNF-alfa, e das vias JNK e p38 associadas à produção de espécies reativas de oxigênio
Efeitos do polissacarídeo de aloe, um polissacarídeo extraído de Aloe vera, na proliferação de células HaCaT induzida por TNF-alfa e no mecanismo subjacente na psoríase
Regulação negativa de IL-6, IL-8, TNF-α e IL-1β pela glucosamina em células HaCaT, mas não na presença de TNF-α
IL-33 é secretada por queratinócitos psoriásicos e induz citocinas pró-inflamatórias através da ativação de queratinócitos e mastócitos
Perfil de secreção de citocinas cinéticas da inflamação induzida por LPS em cultura de órgão de pele humana
Progresso e perspectivas no manejo da psoríase e desenvolvimentos em modalidades fitoterápicas
Fitoterapia no manejo da psoríase: uma revisão da eficácia e segurança de intervenções orais e das ações farmacológicas das principais plantas
Estratégias promissoras em tratamentos derivados de plantas para psoríase - atualização de estudos in vitro, in vivo e ensaios clínicos
Atividade anti-inflamatória do óleo essencial de Zingiber ottensii valeton em modelos animais
Eficácia anti-inflamatória, antipirética e segurança da formulação inalada de óleo essencial de Houttuynia cordata thunb.
Efeito protetor do óleo essencial de limão e seu principal componente ativo, D-Limoneno, na lesão intestinal e inflamação de camundongos desafiados com E. coli
Óleos naturais para reparo da barreira da pele: compostos antigos agora respaldados pela ciência moderna
Avaliação de massagem com óleos essenciais na reparação da barreira cutânea: compostos antigos agora respaldados pela ciência moderna
Avaliação da massagem com óleos essenciais em úlceras de perna venosas: um ensaio controlado randomizado
Avaliação do óleo de camomila e nanoemulgéis como uma opção de tratamento promissora para dermatite atópica induzida em ratos
Comprovação da eficácia do creme Kamillosan(R) no eczema atópico
Avanços na patogênese da psoríase: da perspectiva do queratinócito
Inflamação cutânea induzida pela ação sinérgica de IL-17A, IL-22, oncostatina M, IL-1{alfa} e TNF-{alfa} recapitula algumas características da psoríase
Biologia e potencial terapêutico da interleucina-10
A cornulina é induzida em lesões de psoríase e promove a proliferação de queratinócitos via vias da fosfoinositídeo 3-quinase/Akt
A sinomenina retarda a inflamação induzida por LPS por meio da regulação negativa de CCAT1 em células HaCaT
Biologia do TNF, mecanismos patogênicos e estratégias terapêuticas emergentes
Vias de sinalização induzidas pelo exercício para neutralizar processos apoptóticos cardíacos
Papel predominante da sinalização mTOR em doenças cutâneas com potencial terapêutico
Usando pele semelhante à psoríase induzida por imiquimode como modelo para medir a penetração cutânea de fármacos antipsoriásicos
Modelos murinos de psoríase e sua utilidade para a descoberta de fármacos
O potencial da Diosgenina no tratamento da psoríase: estudos em queratinócitos HaCaT e modelo murino induzido por imiquimode
Efeitos anti-inflamatórios de extratos de Matricaria chamomilla em macrófagos e linfócitos de camundongos BALB/c
Moduladores de moléculas pequenas de IL-17A/IL-17RA: uma revisão de patentes (2013–2021)
Efeitos anti-inflamatórios e de reparação da barreira cutânea da aplicação tópica de alguns óleos vegetais
O ácido rosmarínico melhorou a inflamação cutânea psoriásica em camundongos por meio da nova inibição da interação entre o receptor de interleucina-17A/interleucina-17A
Síntese de derivados de biciclo[5.3.0]azuleno
Atividades anticâncer e anti-inflamatórias de derivados de azuleno bromo- e ciano-substituídos